Anti-TG - Content James

ORGENTEC Diagnostika GmbH
Carl-Zeiss-Straße 49
55129 Mainz
Tel.: 06131-9258-0
Fax: 06131-9258-58
Anti-TG
ORG 102
6 x 16 Tests
Immunometrischer
Enzymimmunoassay zum
quantitativen Nachweis
von Autoantikörpern gegen
Thyreoglobulin
Gebrauchsanweisung
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis.................................................................................................................... 2
Einleitung.................................................................................................................................. 3
Methodik ................................................................................................................................... 4
Lieferumfang des Tests.......................................................................................................... 5
Technische Daten ................................................................................................................... 5
Erforderliche Laborgeräte ...................................................................................................... 5
Vorbereitung der Reagenzien ............................................................................................... 6
Probenentnahme und Probenvorbereitung......................................................................... 6
Technische Hinweise.............................................................................................................. 6
Assaydurchführung ................................................................................................................. 7
Auswertung der Ergebnisse .................................................................................................. 8
Normalwerte ............................................................................................................................. 8
Spezifität ................................................................................................................................... 8
Sensitivität................................................................................................................................ 8
Kalibrierung .............................................................................................................................. 8
Linearität................................................................................................................................... 8
Reproduzierbarkeit.................................................................................................................. 9
Literatur ..................................................................................................................................... 9
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen..................................................................................10
Kurzanleitung .........................................................................................................................11
2
EINLEITUNG
Einige Schilddrüsenerkrankungen sind wahrscheinlich aufgrund genetischer Prädisposition für eine
autoimmune Beteiligung mit dem Auftreten von differenzierten Autoantikörpern assoziiert. Diese
Autoantikörper richten sich gegen membranständige oder extrazelluläre Antigene der
Schilddrüsenzelle. Die wichtigsten Autoantigene sind neben dem TSH-Rezeptor das
Thyreoglobulin und die Schilddrüsenperoxidase TPO:
Thyreoglobulin ist ein wasserlösliches Glykoprotein mit einem Mo lekulargewicht von etwa
660.000 Dalton. Mit 75 % Anteil stellt es die Hauptproteinkomponente im Schilddrüsenkolloid.
Die Tyrosinreste des Thyreoglobulin-Moleküles werden zur oxidativen Jodierung bereitgestellt
und bilden somit die Voraussetzung für die Synthese der Schilddrüsenhormone T3 und T4.
Innerhalb der Zelle wird Thyreoglobulin durch die Mikrosomen transportiert.
Das mikrosomale Antigen der Schilddrüse ist ein integrales Membranprotein der Mikrosomen
und als das Enzym Schilddrüsen-Peroxidase (TPO) charakterisiert. Sein Molekulargewicht
beträgt ca. 110.000 Dalton.
Autoantikörper werden sowohl bei entzündlichen Erkrankungen als auch bei thyreoidalen
Autoimmunprozessen beobachtet. Verschiedene Leitsymptome für Schilddrüsenerkrankungen, wie
z. B. Struma, Schilddrüsenschmerz, Hyperthyreose sowie Hypothyreose, können von
immunogenen Prozessen, also der Beteiligung von Autoantikörpern, begleitet sein. Dies
unterstreicht die Relevanz der Autoantikörperbestimmung bei der Diagnostik von
Schilddrüsenerkrankungen.
Wichtigste Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse sind:
Hashimoto Thyreoiditis
Primäres Myxödem
Morbus Basedow Hyperthyreose (häufig begleitet von endokriner Ophtalmopathie)
und andere asymptomatische, beispielsweise postpartale, Thyreoiditen.
Das oftmals gleichzeitige Auftreten von Autoantikörpern gegen Thyreoglobulin und TPO scheint
auf dem funktionellen Zusammenhang beider Antigene zu beruhen. Bei der oxidativen Jodierung
der Aminosäurereste des Tyrosins am Thyreoglobulin als Ausgangsstruktur zur Bildung der
Schilddrüsenhormone T3 und T4 ist die Schilddrüsen-Peroxidase wahrscheinlich aktiv beteiligt.
TSH reguliert durch Stimulation die Synthese und Freisetzung der Schilddrüsenhormone unter
räumlichem Zusammenwirken aller dieser Proteine in oder auf der Zellmembran. Daher ist auch
das oftmals gleichzeitige Auftreten aller beschriebenen Antikörper plausibel.
Die fortdauernde Inhibierung der Peroxidase-Aktivität durch spezifische Autoantikörper (anti-TPO)
führt zu einer verminderten Synthese der Schilddrüsenhormone und damit zur Hypothyreose.
Besonders am Ende einer Schwangerschaft kann der Nachweis von Schilddrüsen-Autoantikörpern
wertvolle Hinweise auf eine spätere postpartale Hypothyreose geben (Hashimoto's post partum
depression). Bei der Hashimoto Thyreoiditis findet man häufig sehr stark erhöhte AutoantikörperKonzentrationen, wobei die gegen Thyreoglobulin gerichteten Autoantikörper meist stärker erhöht
sind als die anti-TPO Antikörper.
Die Verteilung der dargestellten Autoantikörper bei Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen ist in
der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Krankheisbild (vereinfacht)
Hashimoto Thyreoiditis
Morbus Basedow (immunogen)
Endokrine Orbitopathie
Dissiminierte Autonomie (nicht immunogen)
Regionale Autonomie (autonomes Adenom)
TM(TPO)
xxx
xx
xx
x
x
AntiTG
xxx
x
x
(x)
(x)
TSHRezeptor
x
xxx
xx
-
3
Im Wesentlichen ergeben sich für die Bestimmung der Autoantikörper gegen Antigene der
Schilddrüse folgende Indikationen:
Morbus Basedow (immunogen)
Hashimoto Thyreoiditis
Endokrine Orbitopathie
Hyper- bzw. Hypothyreose ungeklärter Genese
Schilddrüsenautomien
Postpartale Thyreoiditen
METHODIK
Das vorliegende Testbesteck ist ein indirekter Enzymimmunoassay zum gleichzeitigen
quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Thyreoglobulin (TG) im Pinplattenformat. Die
Pinplatte ist mit humanem Thyreoglobulin beschichtet. Die drei Reaktionsschritte stellen sich wie
folgt dar:
1. Reaktionsschritt
In die erste Mikrotiterplatte werden Standards, Kontrollen und Patientenproben vorgelegt. Durch
das Eintauchen der Pins, die mit dem Antigen beschichtet sind, wird die Reaktion gestartet. In der
Probe vorhandene Antikörper werden an das immobilisierte Antigen an den Pins gebunden.
2. Reaktionsschritt
Die Pins werden in eine zweite Mikrotiterplatte überführt, in der das Enzymkonjugat (anti-humanIgG-Meertettich-Peroxidase) vorgelegt wurde. Dabei erkennt das Konjugat spezifisch die an die
Pins gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe.
3. Reaktionsschritt
Die Pins werden in eine dritte Mikrotiterplatte überführt, in der das Enzymsubstrat vorgelegt wurde.
Die gebundene Peroxidase setzt das Substrat in ein gefärbtes Produkt um.
Auswertung
Die Pins werden aus der Mikrotiterplatte enfernt. Nach Abstoppen der Reaktion wird die optische
Dichte in einem ELISA-Photometer bei 450 nm gemessen. Die Farbentwicklung ist direkt
proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration.
4
LIEFERUMFANG DES T ESTS
Teilbare Pinplatte mit 96 Pins (in einer modularen Mikrotiterplatte verpackt)
1
die mit humanem Thyreoglobulin (TG) beschichtet ist.
Probenpuffer, Konzentrat, (gelb) .................................................................1 Fläschchen, 20 ml
Waschpuffer, Konzentrat .............................................................................1 Fläschchen, 20 ml
Konjugat .......................................................................................................1 Fläschchen, 15 ml
anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, gebrauchsfertig (rosa),
TMB Substratlösung, 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig ......1 Fläschchen, 15 ml
Stopplösung, 1M HCl, gebrauchsfertig........................................................1 Fläschchen, 15 ml
Kontrollen, gebrauchsfertig..........................................................................je 1 Fläschchen, 0,75 ml
- Kontrolle 1
Positivkontrolle
- Kontrolle 2
Negativkontrolle
Standards A bis F, gebrauchsfertig mit den Konzentrationen: ...................je 1 Fläschchen, 0,75 ml
Anti-TG: 0 - 100 - 300 - 1000 - 3000 - 9000 IU/ml
Arbeitsanleitung/Qualitätskontroll-Zertifikat
Wiederverwendbare Waschwanne
2 Mikrotiterplatten
TECHNISCHE DATEN
Untersuchungsmaterial:
Serum oder Plasma
Erforderliche Probenmenge: 10 µl Probe für eine 1 : 100 Probenvorverdünnung
100 µl verdünnte Probe pro Einzelbestimmung
Gesamt-Inkubationszeit:
25 Min. bei Raumtemperatur (20 - 28 °C)
Meßbereich:
Anti-TG:
0 bis 9000 IU/ml
Meßwellenlänge:
450 nm
Empfindlichkeit:
Anti-TG:
10 U/ml
Lagerung:
bei 2 - 8 °C im Kühlschrank
Haltbarkeit:
12 Monate ab Herstellung bzw. bis zum aufgedruckten Verfallsdatum
Packungsgröße:
6 x 16 Tests
ERFORDERLICHE LABORGERÄTE
Geräte/Reagenzienvorbereitung
- Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm
(ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm)
- Wirbelmischer (Vortex)
- Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl und 1000 µl, evtl. Multipette
- destilliertes Wasser
- Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml
- Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung
5
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
Alle Komponenten dieses Testbesteckes liegen bis auf den Probenpuffer und den Waschpuffer
gebrauchsfertig vor. Die Lösungen sind nach dem Öffnen der Fläschchen und bei Lagerung im
Kühlschrank bei 2 - 8 °C bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar.
Waschlösung
Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von
destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte
Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2 - 8 °C mindestens 30 Tage haltbar.
Zum Waschvorgang der Pinplatte/PinStrips:
Die beigefügte Waschwanne wird mit etwa 60 ml Waschlösung bis unter den ersten Rand gefüllt.
Pinplatte/PinStrips eintauchen und etwa 5 Sekunden kräftig auf und ab bewegen. Die Pins sollten
dabei gut vom Waschpuffer umspült sein. Waschvorgang ein zweites Mal mit frischem
Waschpuffer wiederholen. Danach die Pinplatte/PinStrips kräftig abschleudern, um
überschüssigen Waschpuffer zu entfernen. Es dürfen keine Tropfen der Waschlösung an den Pins
zurückbleiben. Die beigefügte Waschwanne ist für spätere Testansätze wiederverwendbar.
Weitere Waschwannen können von ORGENTEC Diagnostika GmbH jederzeit bezogen werden.
Probenpuffer
Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von
destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer
ist bei einer Lagerung bei 2 - 8 °C mindestens 30 Tage haltbar.
PROBENENTNAHME UND PROBENVORBEREITUNG
Die Bestimmung der TG-Antikörper wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw.
Plasmaproben werden vor der Messung 1 : 100 mit Probenpuffer verdünnt.
10 µl Probe plus 990 µl Probenpuffer
Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2 - 8 °C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine
längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 °C tiefgefroren werden.
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Seren und Plasmen mit erhöhten
Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht.
TECHNISCHE HINWEISE
Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu
überprüfen.
6
ASSAYDURCHFÜHRUNG
Vor Testbeginn müssen alle Reagenzien sowie die Patientenseren Raumtemperatur angenommen
haben.
1.
Eine ausreichende Anzahl an PinStrips und Mikrotiterplatten-Modulen zum Ansatz von
Standards, Kontrollen und Patientenproben vorbereiten.
2.
Jeweils 100 µl Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend
der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren.
Vorschlag für ein Pipettierschema:
A
B
C
D
E
F
G
H
3.
1
SA
SA
SB
SB
SC
SC
SD
SD
2
SE
SE
SF
SF
K1
K1
K2
K2
3
P1
P1
P2
P2
P3
P3
P4
P4
4
P5
P5
P..
P..
5
6
SA - SF:
P1, P2...
K1:
K2:
Standards A bis F
Pantientenprobe 1, 2 ...
Positivkontrolle
Negativkontrolle
Pinplatte/PinStrips eintauchen.
1. Inkubation: 10 Minuten bei Raumtemperatur (20 - 28 °C)
4.
5.
6.
Während der ersten Inkubation jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung entsprechend der
Plattenbelegung in die Kavitäten der zweiten Mikrotiterplatte pipettieren.
Pinplatte/PinStrips nach Beendigung der ersten Inkubation aus der Mikrotiterplatte
herausnehmen und 2 Mal mit Waschlösung waschen.
Pinplatte/PinStrips in die vorgelegte Enzymkonjugatlösung der zweiten Mikrotiterplatte
eintauchen.
2. Inkubation: 10 Minuten bei Raumtemperatur (20 - 28 °C)
7.
8.
9.
Während der zweiten Inkubation jeweils 200 µl Substratlösung in die Kavitäten der dritten
(Flachboden-) Mikrotiterplatte pipettieren.
Pinplatte/PinStrips nach Beendigung der zweiten Inkubation aus der Mikrotiterplatte
herausnehmen und 2 Mal mit Waschlösung waschen.
Pinplatte/PinStrips in die vorgelegte Substratlösung der dritten Mikrotiterplatte eintauchen.
3. Inkubation: 5 Minuten bei Raumtemperatur (20 - 28 °C)
10.
11.
12.
Nach Beendigung der dritten Inkubation Pinplatte/PinStrips verwerfen.
100 µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen.
Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 60 Minuten
bei einer Wellenlänge von 450 nm.
Bitte beachten Sie:
Alle angegebenen Inkubationszeiten müssen eingehalten werden. Alle Pipettierschritte sind bei
allen Inkubationen in einheitlicher Reihenfolge und einheitlichem Zeittakt durchzuführen.
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AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die
vorgegebene Standardkonzentration.
NORMALWERTE
Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichsstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit
dem Anti-TG-Kit die folgenden Werte ermittelt:
Anti-TG
IU/ml
normal
< 100
grenzwertig
100-250
erhöht
> 250
SPEZIFITÄT
Die Pinplatte ist mit hochgereinigtem Thyreoglobulin, isoliert aus humanem Schilddrüsengewebe,
beschichtet. Der Anti-TG Assay erfaßt spezifisch die gegen das humane Thyreoglobulin-Molekül
gerichteten Autoantikörper der IgG-Klasse.
SENSITIVITÄT
Die untere Nachweisgrenze für Anti-TG beträgt 10 IU/ml.
KALIBRIERUNG
Das quantitative Meßsystem Anti-TG ist gegen die WHO Referenzpräparation 65/93 für
Thyreoglobulin-Antikörper kalibriert. Dabei entspricht die Referenzpräparation 1000 IU/ml.
LINEARITÄT
Für die Verdünnungsexperimente wurden Seren/Plasmen mit hohen Antikörperkonzentrationen in
steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer). im Assay eingesetzt. Die
Ergebnisse sind über den gesamten Meßbereich linear.
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REPRODUZIERBARKEIT
In der untenstehenden Tabelle sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die
Inter-Assay-Varianzen des Anti-TG und des Anti-TPO Kits ermittelt wurden, aufge-führt.
Zur Ermittlung der Intra-Assay-Varianzen wurden drei Seren mit unterschiedlichen anti-TG bzw.
anti-TPO Konzentrationen jeweils 24-fach auf einer Platte gemessen.
Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianzen wurden drei Proben mit unterschiedlichen anti-TG
bzw. anti-TPO Konzentrationen auf fünf Platten jeweils sechsfach gemessen.
Intra-Assay
Proben
Nr.
1
2
3
Mittelwert
[IU/ml]
588
1610
5375
Inter-Assay
Variationskoeffizient (%)
Proben
Nr.
3,5
2,4
6,2
1
2
3
Mittelwert
[IU/ml]
601
1668
6073
Variationskoeffizient (%)
7,4
4,2
1,5
LITERATUR
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HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-Diagnostik verwendet
werden.
Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des Tests ist unbedingt
erforderlich. Die Richtlinien zur Durchführung der Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien
sind zu beachten (Mitführen von Kontrollen, Poolseren).
Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht
werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen
Verfallsdaten sind zu beachten.
Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt
sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1,
HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter
wurden für negativ befunden.
Für den Umgang mit Kitreagenzien, Kontroll- und Serumproben sind die Vorschriften zur
Unfallverhütung für den Gesundheitsdienst beim Umgang mit potentiell infektiösem Material
einzuhalten.
Das Untersuchungsmaterial ist stets als potentiell infektiös einzustufen. Unter den gleichen
Sicherheitsvorkehrungen sind ebenso Kitreagenzien und Kontrollproben zu handhaben.
Die Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum
Konservierungsmittel; daher ist die Berührung mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden.
Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Berührung
mit der Haut. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen.
Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme
Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen.
Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt
unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich
reinigen.
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KURZANLEITUNG
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