genetische Dissektion eines Phänotyps
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Genetisch bedingte Muskeldystrophien Manfred S. Wehnert, Maria Hoeltzenbein Institut für Humangenetik, Greifswald Zusammenfassung Die EmeryDreifuss Muskeldystrophie (EMD) ist eine seltene langsam pro grediente neuromuskuläre Erkran kung, die Xchromosomal oder auto somal dominant vererbt wird. Ursa che der Xchromosomalen EMD sind unterschiedliche Mutationen im Eme rinGen, die in etwa 95 % der Fälle zum völligen Mangel des Genproduk tes Emerin führen. Eine eindeutige Genotyp/PhänotypKorrelation fehlt, obwohl bei einer Missensmutation Pro183Thr ein signifikant milderer Phänotyp auftrat. Klinisch findet man eine große intra und interfamiliäre Variabilität. Durch Mutationsanalyse läßt sich die Xchromosomale EMD von autosomalen Formen und Phä nokopien abgrenzen. Bisher konnte eine autosomal dominante Form auf Mutationen im Lamin A/CGen, das 1q 21.221.3 kartiert, zurückgeführt werden. Genetische Heterogenität bei den autosomalen EMDFormen läßt vermuten, daß weitere dem La min und Emerin verwandte Gene dem EMDPhänotyp zugeordnet wer den können. Schlüsselwörter EmeryDreifuss Muskeldystrophie (EMD), Genetik, Phänotyp Summary EmeryDreifuss muscular dystrophy – genetic dissection of a phenotype EmeryDreifuss muscular dystrophy (EMD) is a rare, benign neuro muscular disorder of Xlinked or autosomal dominant inheritance. Xlinked EMD is associated with heterogeneous mutations of the emerin gene, leading to a virtual loss of the gene product emerin in approx. 95% of the cases. There is no straight forward genotype/ phenotype correlation, although significantly milder clinical expression was observed in a missense mutation Pro183Thr. Moreover, a wide range of intra and interfamilial clinical variability can be found. Xlinked EMD can be differentiated from autosomal forms and phenocopies by mutation analysis. So far one autosomal dominant form could be associated with mutations in the Lamin A/C gene that maps to 1q21.2q21.3. Additionally, genetic heterogeneity suggests the association of further lamin or emerin related genes to the EMD phenotype. Keywords EmeryDreifuss muscular dystrophy (EMD), genetics, phenotype Gewöhnlich manifestiert sich die Emery DreifussMuskeldystrophie (EMD) (5) bereits im Kindesalter mit leicht pro gressiver Muskelschwäche und –atro phie der oberen und unteren Extre mitäten – anfänglich mit einer hume roperonealen Verteilung. Kontraktu ren der Ellenbogen und Achillesseh nen sowie der Wirbelsäule v.a. im Be reich der Nackenmuskulatur sind ebenfalls frühe, charakteristische Er krankungsmerkmale (Abb 1), die im Gegensatz zu anderen Muskeldystro phien bereits vor der Muskelschwäche auftreten. Im Erwachsenenalter ist die Mobilität der meisten Betroffenen stark eingeschränkt (Abb 1 A,B,D). Kardiale Leitungsstörungen in Form von AVBlockierungen oder Arrhyth mien und Kardiomyopathien führen zu einem erhöhten Risiko für einen plötz lichen Herztod und erfordern eine Schrittmacherimplantation (13). In Muskelbiopsien werden gewöhnlich dystrophische Veränderungen gefun den. Die Kreatinkinase ist häufig leicht erhöht. In der Regel wird die Erkran kung Xchromosomal vererbt. Es gibt aber auch eine seltenere autosomal dominant vererbte, auch als Haupt mannTannhäuser oder Rigid Spine Syndrom beschriebene Form (12). Zum Thema EmeryDreifuss Muskeldystrophie – genetische Dissektion eines Phänotyps Xchromosomale EMD Mutationsanalyse Das mit der Xchromosomalen EMD assoziierte Gen wurde von Bione et al. (1) isoliert. Es besteht aus 6 Exons, die für ein Protein, genannt Emerin, bestehend aus 254 Aminosäuren ko dieren. Seit der Entdeckung des Gens (1) wurden weltweit bisher 90 Muta medgen 11 (1999) 513 A Typische „CowboyHaltung“ des Patienten G572 (del AT, nt908909) im Alter von 35 Jahren mit Kontrakturen im Ellenbogen und humeroperoneal betonten Muskelatrophien. B Kontrakturen der Wirbelsäule („rigid spine“) des Patienten G572. Bild nur in Druckversion C Patient G1677 (del 21 bp, nt 19 bis 40 ) im Alter von 6 Jahren, Z.n. Achillotomie bds., keine Kontrak turen im Ellenbogenbereich. D Schweres Krankheitsbild des Patienten G8500 (del TCTAC, nt 631635) im Alter von 35 Jahren mit ausgeprägter Muskelschwäche, die zum frühzeitigen Verlust der Gehfähigkeit im Alter von 15 Jahren und Rollstuhlpflichtigkeit führte. Stehen ist kurzzeitig nur mit Unterstützung möglich. Zu beachten ist die maxi male Flexion des Kopfes und der Wirbelsäule. Zum Thema Genetisch bedingte Muskeldystrophien Abb 1 Klinisches Bild der Xchromosomalen EMD tionen identifiziert und in einer locus spezifischen Mutationsdatenbank des EMDKonsortiums zusammengefaßt (15). Charakteristisch für eine Xchro mosomale Erkrankung, wurden 71 Mutationen bisher nur einmal nachge wiesen. Die überwiegend in Familen mit eindeutiger Xchromosomaler Ver erbung oder solchen mit zwei betrof fenen Brüdern gefundenen Mutatio nen repräsentieren meist Basensub stitutionen, kleine Deletionen oder In sertionen, die zu Nonsensmutationen, Rasterverschiebungen und fehlerhaf tem Spleißen führen. Nur drei Muta tionen beruhen auf größeren Deletio nen. Die Mutationen sind über das ganze EmerinGen verteilt, scheinen aber am 5’Ende häufiger aufzutreten. Meistens führen sie zu einem voll ständigen Fehlen des Emerins (8). Missensmutationen sind sehr selten und wurden bisher nur in drei Fällen beschrieben (14). Bei nur etwa 15% der sporadischen, klinisch aber ein deutigen EMDPatienten kann ein Emerinmangel bzw. Emeringenmuta tionen gefunden werden, was auf ge netische Heterogenität, hervorgerufen durch Mutationen in anderen Genen bei den übrigen 85% hinweist (12). 514 medgen 11 (1999) Genotyp/PhänotypKorrelation Durch die Mutationsanalyse wurde es möglich, definierte EmerinGenmuta tionen mit dem klinischen Phänotyp zu vergleichen (12; 14). Nach der Un tersuchung von 49 männlichen Pati enten mit z.T. unterschiedlichen Null Mutationen (14) treten erste Sympto me durchschnittlich im Alter von 5,6 (4,26,9) Jahren auf. Im Alter von 9,1 (6,711,5) setzen die Achillessehnen kontrakturen ein. Ellenbogenkontrak turen treten durchschnittlich etwas später mit 18,1 Jahren (10,325,9) ein. Die Muskelschwäche beginnt in den unteren Extremitäten mit 10,3 (6,8 13,9) Jahren und in den oberen Extre mitäten mit 13,7 (10,217,3) Jahren. Kontrakturen der Wirbelsäule werden mit 22.8 (17,628,1) Jahren beobach tet. Mit durchschnittlich 30,5 (25.9 35.2) Jahren setzen kardiale Probleme ein. Patienten mit NullMutationen sterben nach dieser Untersuchung im Durchschnittsalter von 53,7 (48.7 58.7) Jahren. Von den drei in dieser Studie untersuchten Missensmutatio nen, bei denen immunhistochemisch und durch Western Blotting Emerin nachgewiesen werden konnte, zeigten in der betroffenen Familie nur Patien ten mit einer Pro183Thr Mutation ei nen signifikant milderen klinischen Verlauf als Patienten mit NullMutatio nen. Ein Hemizygoter aus der Familie mit Pro183Thr Mutation war sogar völ lig erscheinungsfrei, so daß man bei dieser Missensmutation mit nach weisbarem Emerinprotein von einer in trafamiliär klinisch variablen Expressi on ausgehen muß. Daneben gibt es Berichte über eine Reihe von Patien ten z.T. mit derselben Emeringenmu tation mit bereits früher einsetzenden Symptomen und sehr schwerem Krankheitsverlauf bis hin zur Roll stuhlpflichtigkeit (6; 12). Insgesamt kann – abgesehen von der genannten Pro183Thr Missensmutation – bei der Xchromosomalen EMD jedoch keine klare Genotyp/PhänotypKorrelation festgestellt werden. Weiterhin kann man eine ausgesprochene intra und interfamiliäre klinischeVariabilität der Erkrankung beobachten. Sie reicht un abhängig von der Mutation auch in trafamiliär von nur durch kardiale Reizleitungsstörungen Betroffene, bis hin zu Patienten mit frühem Krank heitsbeginn und schweren Verlaufs formen (12). Heterozygote für EmerinGenmutatio nen haben gelegentlich Reizleitungs störungen, entwickeln aber keine Kon trakturen und Muskelschwäche bzw. atrophie. Sehr seltene Fälle können je doch als Folge präferentieller X 3 205 116 80 49 Emerin (34 kd) 32,5 Abb 2 A DNA und Proteindiagnostik bei Xchromosomaler EMD Segregation einer Deletion (del TCTAC, nt 631635) mittels Heteroduplexanalyse in Stammbaum GEMD4 Die als schneller wandernde MarkerBande im Elektropherogramm bei den erkrankten Brüdern II3 und II5 auftretende Heteroduplex ist nicht bei den gesunden Brüdern II2 und II4 nachweisbar. Die Schwester II1 der Betroffenen weist die MarkerBande auch nicht auf und kann als Carrier aus geschlossen werden. Da auch die Mutter der Betroffenen die MarkerBande nicht zeigt, ist sie als Keimzellmosaik einzuordnen. 27,5 18,5 Abb 2 B DNA und Proteindiagnostik bei Xchromosomaler EMD WesternblotAnalyse von Emerin Spur 1 Molekulargewichtsmarker Spur 2 Patient G8500 (del TCTAC, nt 631635) Spur 3 Gesunde Kontrolle Chromosomeninaktivierung den voll ständigen klinischen Phänotyp aus prägen (12). Diagnostik Die Xchromosomale EMD kann diffe rentialdiagnostisch durch den Nach weis einer Emeringenmutation von an deren phänotypisch ähnlichen Erkran kungen abgegrenzt werden. Gleich zeitig sind solche Mutationen in be troffenen Familien als direkte diagno stische Marker zur präsymptomati schen Diagnostik bzw. zum Heterozy gotenausschluß geeignet (Abb 2 A). Da die übergroße Mehrheit der Eme ringenmutationen in einem vollständi gen Emerinmangel resultieren, kann durch den immunologischen Emerin nachweis mittels WesternBlotting (Fig. 2B) oder immunhistochemische Methoden eine Diagnose einfach und schnell in den verschiedensten Zell bzw. Gewebetypen gestellt werden. Allerdings schließt der Nachweis von Emerin eine Xchromosomale EMD nicht vollständig aus, da man bei etwa 5% der Patienten mit einer Missens mutation rechnen muß, die normale immunologische Befunde liefern kann (14; 12), d.h., bei Patienten mit typi schem klinischen Bild einer EMD und scheinbar normalem Emerin ist zur Absicherung des Befundes eine Mu tationsanalyse auf DNA Ebene indi ziert. Darüber hinaus läßt sich der Emerinnachweis auch nicht für Segre gationsanalysen nutzen. Proteinstudien Emerin ist in einer Vielzahl von Gewe ben, unter anderem auch im Skelett und im Herzmuskel, exprimiert (3; 9; 10). Es gehört, wie der laminbinden de Rezeptor (LBR) und zwei Gruppen laminaassozierter Proteine (LAP1 und LAP2) zu einer Familie von Typ II transmembranen Proteinen, die mit ei ner hydrophoben Domäne in der inne ren Membran von Interphasekernen verankert sind und mit einer hydrophi len Domäne in das Nukleoplasma hin einragen, (9; 10). Diese Proteine könn ten zur strukturellen Integrität der in neren Kernmembran beitragen und gleichzeitig die Verbindung zwischen dem Heterochromatin und der nu kleären Lamina herstellen (9). Die La mina ist ein Netzwerk intermediärer Fi lamente, das der inneren Kernmem bran angeschlossen ist und aus den Laminen A, B1, B2 und C besteht. Nach vorläufigen Ergebnissen von GelOverlay Experimenten wurde eine Gruppe von Proteinen identifiziert, die zu den Aminosäureresten 174–221 des Emerins binden (4; 12). Zu ihnen gehört auch das Actin, eine struktu relle Komponente des Zellkerns und des Zytoskeletts. Weiterhin scheint das Emerin in der mitotischen Zelltei lung von Bedeutung zu sein, wie die zellzyklusabhängige Phosphorylierung des Emerins (4) und seine Assoziation zu den Mikrotubuli des mitotischen Spindelapparates zeigten (7). Den noch kann zur präzisen Funktion des Emerins bisher keine Aussage getrof fen werden. Obwohl Emerin in vielen Zellen und Geweben exprimiert wird (9; 10), be einträchtigt sein Mangel in erster Linie zwei Gewebe – den Skelett und den Herzmuskel. Cartegni et al. (3) fanden das Emerin außer in den Kernmem branen auch in den interkalierten Plat ten des Herzmuskels, was eine plausi ble Erklärung für die kardialen Reizlei tungsstörungen wäre. Diese Befunde müssen nach Ergebnissen von Manilal et al. (9) jedoch bezweifelt werden. Vielmehr könnte die spezifische kar diale Beteiligung auf die Verteilung des Emerins, das nur in den Kernmembra nen von Kardiomyozyten jedoch nicht in denen von „NichtKardiomyozyten“ auftritt, erklärt werden. Für die Beteili gung des Skelettmuskels bei EMD gibt es bisher keine plausible molekularpa thologische Erklärung. Genetisch bedingte Muskeldystrophien 2 Zum Thema 1 kd Autosomal dominante EMD Die autosomal dominante Form der EMD scheint sehr selten und ähnlich wie die Xchromosomale EMD klinisch sehr variabel zu sein (12). So wiesen von 17 Betroffenen eines umfangrei chen Stammbaumes nur fünf das voll ständige Spektrum der klinischen Merkmale auf. Die übrigen 12 Patien ten hatten ausschließlich kardiale Symptome, die zur Schrittmacherim plantation und sogar zur Herztrans plantation führten (2; 12). Die Kopp lungsanalyse lokalisierte die Erkran kung dieser Familie zu einem Locus im Intervall 1q11q23 (2). Dasselbe Inter vall wurde bereits früher bei der Linka geAnalyse in drei Familien mit auto somal dominanter Gliedergürtel Mus keldystrophie und kardialer Beteiligung medgen 11 (1999) 515 Genetisch bedingte Muskeldystrophien Zum Thema für den LGMD1BLocus gefunden (11). Wenn man die klinische Variabilität beider Erkrankungsentitäten insbe sondere der EMD und die Kopplungs daten berücksichtigt, wäre denkbar, daß es sich hier um allelische Mutatio nen desselben Gens handeln könnte. Auf dem Hintergrund des sich ab zeichnenden, weiter oben bereits er wähnten, funktionellen laminaassozi ierten Komplexes, in den das Emerin integriert zu sein scheint, kommen als Kandidaten für die autosomal domi nante EMD weitere dem Emerin ver wandte, transmembrane Typ II Protei ne, z.B. LBR, LAP1 und LAP2, infrage. Aber auch alle mit diesen Proteinen interagierende Partner, wie beispiels weise die Lamine und Actin sind po tentielle Kandidaten. Beobachtungen, daß Lamin A eine ähnliche zelltyp spezifische Verteilung wie das Emerin, d.h. im Herzen ausschließlich in Kar diomyozyten jedoch nicht in „Nicht kardiomyozyten“, besitzt (9) und La min A/CGen zu 1q21.2q21.3 kartiert, machten es zu einem außerordentlich starken Kandidaten für die in dieses Intervall kartierende autosomale Form der EMD (2). Tatsächlich cosegre gierte die autosomal dominante EMD in fünf Familien mit einer Nonsens bzw. drei Missensmutationen im La min A/CGen. Die mutierten Lamine sind wahrscheinlich in ihrer Wechsel wirkung zum Chromatin bzw. mit den integrierten Membranproteinen oder in der Filamentbildung gestört (2). Berücksichtigt man alle bisher be kannten, am laminaassoziierten Kom plex beteiligten Proteine und deren po tentielle Wirkung, kann damit gerech net werden, daß wenn einzelne Pro teinkomponenten ausfallen, EMDähn liche Phänotypen auftreten könnten. Tatsächlich gibt es erste Hinweise auf genetische Heterogenität bei der auto somal dominanten EMD (12). Sicher lich ist aber mit noch weiteren gene tisch heterogenen Formen zu rechnen, wofür u.a. das bereits erwähnte zu sel tene Auftreten von Emeringenmutatio nen bei sporadischen EMDPatienten spricht. Man kann also davon ausge hen, daß solche heterogenen EMD Formen durch genetische Dissektion in nicht zu ferner Zukunft entsprechen den Kandidatengenen zugeordnet 516 medgen 11 (1999) werden können. Damit werden sie so wohl zur Funktionsaufklärung des la minaassoziierten Komplexes beitra gen als auch helfen, die bisher noch im Dunklen liegende molekulare Pa thologie dieser Gruppe von Muskeldy strophien zu verstehen, um davon ef fiziente Verfahren zur Diagnostik und kausalen Behandlung abzuleiten. Literatur 1. Bione S, Maestrini E, Rivella S, Mancini M, Re gis S, Romeo G, Toniolo D (1994) Identification of a novel Xlinked gene responsible for Emery Dreifuss muscular dystrophy. Nature Genet 8 323327 2. Bonne G, Di Barletta MR, Varnous S, Bécan H M, Hammouda EH, Merlini L, Muntoni F, Green berg CR, Gary F, Urtizberea JA, Duboc D, Far deau M, Toniolo D, Schwartz K (1999). Mutations in the gene encoding lamin A/C cause autosomal dominant EmeryDreifuss muscular dystrophy. Nature Genet 21 285288 3. 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