Charakterisierung des kardiovaskulären und renalen Phänotyps von

Aus dem Pathologischen Institut
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Arndt Hartmann
Charakterisierung des kardiovaskulären und renalen Phänotyps
von BK β1 knockout Mäusen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der
Medizinischen Fakultät
der
Friedrich–Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Matthias Nußelt
aus
Dinkelsbühl
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. med. K. Amann
Korreferent:
Prof. Dr. med. K.F. Hilgers
Tag der mündlichen Prüfung: 06. Oktober 2010
Meinen Eltern in Dankbarkeit gewidmet.
4
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ...............................................................................7
1.1 Hintergrund und Ziele..........................................................................7
1.2 Methoden...............................................................................................7
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen...........................................................7
1.4 Schlussfolgerungen...............................................................................8
2. Summary..............................................................................................8
2.1 Background...........................................................................................8
2.2 Methods.................................................................................................9
2.3 Results....................................................................................................9
2.4 Conclusions............................................................................................9
3 Einleitung............................................................................................10
4 Material und Methodik......................................................................14
4.1 Versuchstiere ......................................................................................14
4.2 Haltung und Fütterung.......................................................................15
4.3 Perfusionsfixation ..............................................................................15
4.4 Gewebeaufarbeitung ..........................................................................16
4.5 Technik der Paraffinschnitte.............................................................16
4.5.1 Paraffinschnitte Niere...............................................................................16
4.5.2 Paraffinschnitte Herz und Aorta...............................................................17
4.6 Analyse.................................................................................................17
4.6.1 Analyse der Herzen und der Aorta...........................................................17
4.6.1.1 Analyse der Herzen....................................................................................17
4.6.1.2 Analyse der Aorten.....................................................................................18
4.6.2 Analyse der Nieren...................................................................................19
4.6.2.1 Schädigungsindices ...................................................................................19
4.6.2.1.1 Glomeruloskleroseindex (GSI)................................................................19
4.6.2.1.2 Tubulointerstitieller Index (TSI)..............................................................20
4.6.2.1.3 Vaskulärer Index (VSI)...........................................................................20
4.6.2.2 Glomerulusgeometrie ................................................................................21
4.6.2.2.1 Morphometrie und Stereologie................................................................21
4.6.2.2.2 Auswertung.............................................................................................22
5
4.6.2.2.2.1 Volumenfraktion von Nierenmark und Nierenrinde.............................23
4.6.2.2.2.2 Gesamtvolumen Niere und absolutes Volumen Nierenrinde ...............23
4.6.2.2.2.3 Glomeruli pro Fläche Rinde.................................................................24
4.6.2.2.2.4 Volumendichte der Glomeruli..............................................................24
4.6.2.2.2.5 Numerische Dichte der Glomeruli in der Rinde....................................25
4.6.2.2.2.6 Gesamtzahl und Gesamtvolumen der Glomeruli einer Niere................25
4.6.2.2.2.7 Mittleres glomeruläres Volumen .........................................................26
4.7 Statistik................................................................................................26
5 Ergebnisse...........................................................................................27
5.1 Allgemeine Parameter........................................................................27
5.1.1 Körpergewicht .........................................................................................27
5.1.2 Herzgewicht (HG) und relatives Herzgewicht (rHG)..............................27
5.1.3 Nierengewicht (NG) und relatives mittleres Nierengewicht (rmNG) .....28
5.2 Morphometrie.....................................................................................29
5.2.1 Morphometrie Herz – Wanddicken .........................................................29
rechter Ventrikel (RV), linker Ventrikel (LV) und Septum..............................29
5.2.2 Morphometrie intramyokardialer Arterien (IMA) ..................................30
5.2.3 Morphometrie Aorta - Wanddicke...........................................................30
5.3 Niere.....................................................................................................31
5.3.1 Semiquantitative Untersuchungen – renale Schädigungsindices.............31
5.3.2 Prozentuale Verteilung Nierenrinde und Nierenmark .............................32
5.3.3 Gesamtvolumen Niere (VN) und absolutes Volumen der Nierenrinde
(VR)...................................................................................................................32
5.3.4 Anzahl der Glomeruli pro Volumen (Nv)................................................33
5.3.5 Anzahl der Glomeruli einer Niere (NGlom)............................................33
5.3.6 Mittleres glomeruläres Volumen (VGlom ).............................................34
5.4 Übersicht der Parameter und Vergleiche zwischen den
untersuchten Gruppen.............................................................................34
5.4.1 Kardiovaskulärer Phänotyp......................................................................35
5.4.2 Renaler Phänotyp......................................................................................36
6 Diskussion...........................................................................................37
6.1 Interpretation des Phänotyps.............................................................39
6.1.1 Knockout vs. wildtyp................................................................................39
6
6.1.1.1 Kardialer Phänotyp.....................................................................................39
6.1.1.2 Vaskulärer Phänotyp..................................................................................40
6.1.1.3 Renaler Phänotyp.......................................................................................40
6.1.2 Junge vs. alte Tiere...................................................................................42
6.1.2.1 Kardialer Phänotyp.....................................................................................42
6.1.2.2 Vaskulärer Phänotyp..................................................................................43
6.1.2.3 Renaler Phänotyp.......................................................................................43
6.1.3 Alte Tiere gleichen Genotyps männlich vs. weiblich...............................44
6.1.3.1 Kardiovaskulärer Phänotyp........................................................................45
6.1.3.2. Renaler Phänotyp......................................................................................45
6.1.4 Schlussfolgerungen kardiovaskulärer Phänotyp.......................................46
6.1.5 Schlussfolgerungen renaler Phänotyp......................................................46
6.2 Zusammenfassung..............................................................................47
7 Literatur..............................................................................................48
8 Abkürzungsverzeichnis......................................................................53
9 Danksagung.........................................................................................55
10 Lebenslauf.........................................................................................56
7
1 Zusammenfassung
1.1 Hintergrund und Ziele
BK Kanäle regulieren das Membranpotential glatter Muskelzellen und spielen bei der
Regulation des Gefäßtonus eine wichtige Rolle. Die Gendeletion der β1-Untereinheit
des BK Kanals könnte zu erhöhtem Blutdruck und der Entstehung einer chronischen
Hypertonie von BK β1 knockout Mäusen führen. Ziel dieser Arbeit war es, den
kardiovaskulären und renalen Phänotyp von BK β1 knockout und wildtyp Mäusen
unterschiedlichen Alters zu untersuchen. Wir überprüften die Hypothese, dass die
Deletion der β1-Untereinheit des BK Kanals in der Maus zu einem charakteristischen
kardiovaskulären und oder renalen Phänotyp führt, der auf die fehlende Expression der
BK β1-Untereinheit während der Embryonalentwicklung zurückzuführen ist.
1.2 Methoden
Die Effekte der Deletion der BK β1-Untereinheit bei Mäusen wurde anhand des BK β1
Tiermodells studiert. Es wurden 6 Gruppen von Tieren untersucht, die sich jeweils aus
Tieren verschiedenen Alters, Geschlechts und Genotyps zusammensetzten. Nach
retrograder Perfusionsfixation wurden den Versuchstieren das Herz, die Aorta sowie
beide Nieren entnommen. Neben Organgewichten, morphometrischen Daten von Herz,
intramyokardialen Arterien und Aorta wurden spezielle renale Schädigungsindices
bestimmt.
Durch
stereologische
Methoden
war
es
zusätzlich
möglich,
aus
histologischen Schnitten der Nieren Informationen über deren dreidimensionale
Struktur zu gewinnen.
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
Signifikante Genotyp abhängige frühe Veränderungen mehrerer Parameter konnten wir
nicht nachweisen. Entgegen unseren Erwartungen konnten wir auch keine signifikante
Veränderung des kardialen Phänotyps im Sinne einer Herzhypertrophie nachweisen, wie
dies bereits für dieses Tiermodell beschrieben wurde. Der vaskuläre Phänotyp der Aorta
zeigte - hier wie erwartet - signifikante zeitabhängige Veränderungen bei den knockout
Tieren. Unsere Beobachtungen sprechen gegen einen deutlichen Einfluss der
8
Gendeletion auf den renalen Phänotyp und für eine eher zeitabhängige Veränderung
renaler Parameter. So können wir zum einen eine späte Schädigung männlicher
knockout Tiere beschreiben, zum anderen aber eine späte geschlechtsabhängige stärkere
Schädigung männlicher Tiere beiden Genotyps belegen, die den Einfluss der
Gendeletion wieder in Frage stellt und auch hier eine zeitabhängige Veränderung
vermuten lässt.
1.4 Schlussfolgerungen
Zusammenfassend sprechen unsere Ergebnisse gegen bereits früh bestehende,
signifikante kardiovaskuläre und renale Veränderungen bei BK β1 knockout Tieren und
damit gegen unsere anfangs formulierte Hypothese einer frühen embryonalen
Schädigung durch Gendeletion. Wir können lediglich für den vaskulären Phänotyp
späte, zeitabhängige Veränderungen bei den knockout Tieren beschreiben. Einen
sicheren Einfluss des Geschlechts auf den Phänotyp können wir mit unseren
Ergebnissen nicht belegen. Inwieweit geschlechtsabhängige Veränderungen des
Phänotyps stattfinden, sollte durch Einbeziehen weiblicher Tiere unterschiedlichen
Alters und Genotyps in folgenden Arbeiten genauer geprüft werden.
2. Summary
2.1 Background
BK channels regulate the membrane potential of arterial smooth muscle cells and play
an important role in regulating vascular resistance. Disruption of the gene encoding the
BK β1-subunit in mice may cause an elevation in blood pressure and lead to chronic
hypertension. This study aimed to determine the cardiovascular and renal phenotype in
mice of different age and BK β1 genotype. Our hypothesis was that the deletion of the
BK β1-subunit in mice leads to a characteristic cardiovascular and or renal phenotype,
caused by the missing expression of BK β1-subunits during embryonic development.
9
2.2 Methods
We used BK β1 knockout and control mice of both sex and different age.
We examined the heart, intramyocardial arteries, aortic rings and kidneys of each
animal. Body and organ weights, morphometric data of heart, intramyocardial arteries
und aorta were measured. Special renal indices were evaluated and stereologic methods
were used to obtain quantitative information about the renal three-dimensional structure.
2.3 Results
We could not verify significant early genotype-dependent variation of several
parameters. Contrary to expectations we also could not detect significant changes in
cardial phenotype in terms of cardiac hypertrophy, as previously described. Expectably,
the vascular phenotype of knockout animals showed significant time-dependent
changes. Our observations suggest that the gene deletion shows no clear effect on the
renal phenotype and we propose that changes in renal parameters are most likely timedependent. We can show both late impairment in male knockout animals and late
gender-dependent higher impairment in male animals of both genotype. This questions
the effect of gene deletion and argues for a time-dependent change as well.
2.4 Conclusions
In summary these results indicate that there are no early significant changes in
cardiovascular and renal phenotype in BK β1 knockout animals. This argues against our
primary hypothesis of an early embryonic impairment based on gene deletion.
Exclusively the vascular phenotype shows clearly time-dependent late changes. Our
results support the concept that there is no significant gender impact to the phenotype.
Further studies should determine the nature of gender-dependent changes in phenotype
by examining both male and female animals of different age and genotype.
10
3 Einleitung
Die arterielle Hypertonie ist eine häufig vorkommende, chronische Dysregulation des
arteriellen Blutdrucks und stellt einen wesentlichen Risikofaktor bei der Entstehung von
kardiovaskulären Erkrankungen wie Apoplex, Herzinfarkt und renalen Dysfunktionen
dar.[5] Die simple Frage, was genau zu einer pathologischen Erhöhung der
Blutdruckwerte führt, ist nur sehr schwer zu beantworten. In mehr als 90% aller Fälle
spricht man von einer essentiellen Hypertonie, deren Ursache man nicht kennt.[11]
Faktoren wie Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index und verschiedene Diät-Varianten
wurden schon früh als Determinanten einer Blutdruckerhöhung erkannt und untersucht
[17], aber auch der genetische Einfluss auf den Blutdruck ist seit Jahrzehnten bekannt.
So belegen Zwillingsuntersuchungen aus den 70er Jahren bereits eindeutig einen
genetische Einfluss.[2,10] Bei der Entstehung einer Hypertonie sind ursächlich meist
eine Vielzahl an genetischen Faktoren sowie multiple Umwelteinflüsse und deren
Interaktionen zu nennen.[32] Nach Marteau et al. [20] tragen genetische Ursachen zur
Variation des Blutdrucks zu etwa 30 – 50 % bei. Physiologische Systeme, deren
genetische Variation bei der Regulation des Blutdrucks eine Rolle spielen, sind
mannigfaltig. Herzzeitvolumen und peripherer Gefäßwiderstand, Barorezeptoren,
natriuretische
Peptide,
das
Renin-Angiotensin-Aldosteron-System,
das
Kinin-
Kallikrein-System, Adrenorezeptoren sowie Botenstoffe des Endothels wie NO oder
Endothelin wurden neben vielen anderen Variablen einzeln untersucht.[17] Da der
Blutruck aber nur im lebenden Organismus - in dem all diese Systeme komplex
interagieren - gemessen werden kann, gestaltet es sich schwierig, einzelne
Genvariationen dieser Systeme und deren Einfluss auf den Langzeitblutdruck
nachzuvollziehen.[21]
Lifton et al. [17] stellen 2001 die These auf, dass die bekannten genetischen Ursachen
einer Hypertonie immer in Änderungen der renalen Regulation des Salzhaushalts
münden und benennen die Niere als wichtigstes Organ bei der Entstehung einer
Hypertonie:
„Given the diversity of physiologic systems that can influence blood pressure, it is
striking that all Mendelian forms of hypertension and hypotension solved to date
converge on a final common pathway, altering blood pressure by changing net renal salt
balance. These findings clearly establish the role of altered salt homeostasis in blood
11
pressure variation in humans and underscore the key role of the kidney in the longterm
determination of blood pressure.“
Crowley et al. [6] konnten jedoch durch Kreuztransplantationen an Mäusen zeigen, dass
- unabhängig von der Nierenfunkion – nicht renale Gewebe, darunter vor allem die
glatte Gefäßmuskulatur (vascular smooth muscle cells; VSMC), einen bedeutenden
Einfluss auf die Regulation des Blutdrucks haben. Mendelsohn [21] formuliert
daraufhin die Hypothese, dass allein Veränderungen der VSMC langfristig direkt zu der
Entstehung einer Hypertonie führen können.
Mittlerweile gibt es mehrere Modelle transgener Tiere, bei denen die Deletion eines
Gens, das die Regulation des Gefäßwiderstands beeinflusst, langfristig zu einer
chronischen Erhöhung des Blutdrucks dieser Tiere führt.[21]
So beschreiben Brenner et al. [4] bereits 2000 das BK β1 Tiermodell, bei dem ein
Defekt
des
BK
Kanals
der
Zellmembran
glatter
Gefäßmuskelzellen
eine
Regulationsstörung der VSMCs verursacht und auch bei diesen Tieren zu einer
chronischen Hypertonie führt. Ein wesentlicher Schritt in der Entstehung der
Hypertonie ist dabei die Erhöhung des periphereren Gefäßwiderstands über einen
gesteigerten Gefäßtonus. Ein Einstrom von Kalziumionen über spannungsabhängige LTyp Kalziumkanäle (VDCC) der Zellmembran führt in VSMC zu einem globalen
intrazellulären Anstieg der Kalziumkonzentration mit Membrandepolarisation und
daraus resultierender Muskelzell- und Vasokonstriktion. Der globale Ca2 + Influx führt
weiterhin zu einem lokalen Kalzium-Efflux aus intrazellulären Speichern, so auch aus
dem
sarkoplasmatischen
Retikulum
(SR).[23]
Dieser
Kalzium
vermittelte
Kalziumstrom geschieht lokal an der Membran des SR via Ryanodin Rezeptoren (RyR).
Die entstehenden Kalziumströme werden Kalzium-Sparks genannt, welche nahe
gelegene BK Kanäle der Zellmembran aktivieren. Dies führt zu einem Kalium Efflux
am BK Kanal – sogenannte „spontaneous transient outward K+ currents“, STOCS
genannt - mit folgender Hyperpolarisation der Zellmemban und Muskelzell- und
Vasodilatation (Grafik 1). Der arterielle Gefäßtonus ist somit das Ergebnis zweier
entgegen wirkender kalziumabhängiger Prozesse.[4,17] Diese Ca2+ gesteuerte negative
Rückkoppelung via Sparks und STOCS scheint sehr wichtig für die Regulation des
Blutdrucks zu sein, denn wird der BK-Kanal durch Pharmaka blockiert oder mittels
Gendeletion in seiner Funktion gestört, so kommt es zu einer vermehrten Depolarisation
und damit zu einer gesteigerten Gefäßkontraktion in vivo. [3,16]
12
Grafik 1: Schematische Darstellung der Kalzium gesteuerten negativen Rückkoppelung
BK: BK Kanal; VDCC: spannungsabhängiger L-Typ Kalziumkanal; RyR: Ryanodin Rezeptor;
SR: sarkoplasmatischen Retikulum; Erläuterung im Text.
BK Kanäle sind heterodimere Proteine, welche aus porenformenden α- Untereinheiten
und zusätzlichen β-Untereinheiten bestehen. Jede der bisher entdeckten βUntereinheiten ist gewebespezifisch und reguliert bestimmte Eigenschaften der BK
Kanäle. BK β1 knockout Mäuse zeigen eine reduzierte Kalziumsensitivität der BK
Kanäle, eine gestörte Spark/STOCS Koppelung bei erhaltenen Sparks, einen erhöhten
arteriellen Gefäßtonus und eine milde chronische Hypertonie im Vergleich zu wildtyp
Tieren.[4,26]
Das BK β1 knockout Tiermodell ist insofern sehr interessant, als die β1-Untereinheit,
deren Fehlen für die chronische Erhöhung des Blutdrucks verantwortlich zu sein
scheint, bis 2004 nur in der Zellmembran der VSMC nachweisbar war.[23,31] Nach
Mendelsohn [21] ist deshalb das BK β1 Tiermodell ein mögliches Beispiel einer allein
durch Veränderungen der VSMC begründeten, genetischen Hypertonieform.
Allerdings wurden bis heute keine ausgiebigen histologischen Untersuchungen von
kardiovaskulären und oder renalen Zellen und Geweben an BK β1 knockout Tieren
durchgeführt. So könnte eine Deletion der β1-Untereinheit des BK Kanals schon
während der Embryonalentwicklung der knockout Tiere zu Organschäden führen, die
13
dann ihrerseits – unabhängig vom Gefäßtonus - die Entstehung einer Hypertonie
verursachten.
In der hier vorgelegten Arbeit soll die Hypothese geprüft werden, dass die Deletion der
β1-Untereinheit des BK Kanals in der Maus zu einem charakteristischen
kardiovaskulären und oder renalen Phänotyp führt, der auf die fehlende Expression der
BK β1-Untereinheit während der Embryonalentwicklung zurückzuführen ist.
Zur Überprüfung der Hypothese wurden folgende Fragestellungen formuliert:
1. Finden sich Veränderungen an Herz, Aorta und Niere bei homozygoten BK β1
knockout Mäusen im Vergleich zu wildtyp Tieren ?
2. Gibt es Unterschiede im Zeitverlauf ?
3. Finden sich geschlechtsspezifische Unterschiede ?
Ein Vergleich von jungen männlichen Tieren sollte zunächst einmal die Beurteilung von
eventuell früh bestehenden Organschädigungen ermöglichen.
Der Vergleich von jungen männlichen und alten Tieren beiden Geschlechts sollte dann
die Möglichkeit bieten, die Entwicklung im Zeitverlauf geschlechtsspezifisch zu
beurteilen.
14
4 Material und Methodik
4.1 Versuchstiere
Will man die Hypothese prüfen, ob ein Signalmolekül wie der BK Kanal eine wichtige
Rolle in einem biologischen Prozess spielt, so kann man das Gen, welches für die
Expression dieser Struktur verantwortlich ist, eliminieren und daraufhin die
funktionellen Konsequenzen evaluieren. Dieses „gene targeting“ wurde in den 90er
Jahren zu einer weit verbreiteten Methode bei der Entwicklung von knockout Tieren.
[25] Mittels eigens dafür gezüchteten knockout Tieren erforschten mehrere Gruppen die
Auswirkungen einer fehlenden BK β1-Untereinheit in vivo bei Mäusen. Auch Plüger et
al. [26] generierten via „gen targeting“ transgene BK β1 knockout Mäuse, wobei sie 129
(R1) embryonale Stammzellen verwendeten und deren DNS nach erfolgreicher Deletion
der gewünschten Allele in Blastozyten von C57BL/6J Mäusen implantierten. Diese
Zellen wurden schließlich CBAxC57BL/6J Weibchen eingesetzt. Weibliche und
männliche Nachkommen unterschiedlichen Genotyps wurden so gepaart, das
homozygote knockout und wildtyp Tiere entstanden. Zur Kontrolle des Genotyps
wurden nach Terminierung der Tiere jeweils nochmals Southern Blot Analysen der
DNS aus Mäuseschwänzen nach gängigen Standardprotokollen durchgeführt.[26]
Als Versuchstiere dienten uns Tiere dieses BK β1 Stamms aus der Versuchstierhaltung
des Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (Prof. Pongs, Prof. Ehmke).
Es wurden 6 Gruppen von Tieren untersucht, die sich jeweils aus Tieren verschiedenen
Alters, Geschlechts und Gentyps zusammensetzten. In den Gruppen 1 und 2 wurden
junge männliche, in den Gruppen 3 und 4 alte männliche und in den Gruppen 5 und 6
alte weibliche Tiere untersucht.
Gruppe Geschlecht Genotyp Anzahl Tiere
1
2
3
4
5
6
♂ jung
♂ jung
♂ alt
♂ alt
♀ alt
♀ alt
Alter in Wochen
ko
7
10
wt
7
7
ko
7
68,9 ± 9,5
wt
6
73,2 ± 10,7
ko
7
88 ± 15,4
wt
5
96,6 ± 20,8
15
4.2 Haltung und Fütterung
Die Tiere aller sechs Gruppen wurden unter identischen Bedingungen gehalten. Alle
Tiere waren im selben Raum in mehreren Käfigen untergebracht. In diesem Raum
herrschte eine kontrollierte Umgebung mit konstanter Raumtemperatur von 22 ° Celsius
und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55%. Durch künstliches Licht wurde zwischen
6:00 Uhr und 18:00 Uhr ein Tag-Nachtrhythmus aufrecht erhalten.
Über den Versuchszeitraum hatten alle Tiere freien Zugang zu Trinkwasser und
Standardfutter Altromin C 1324 (Fa. Altromin, Lange/Lippe, Deutschland) mit 20%
Protein und 0,9% Ca2 +-Gehalt.
4.3 Perfusionsfixation
Das Experiment wurde durch retrograde Perfusionsfixation beendet. Dabei wurden die
Tiere zunächst mit Hilfe einer leichten Äthernarkose narkotisiert. Anschließend wurden
sie durch die intraperitoneale Applikation von 0,25 ml einer Stammlösung
(Zusammensetzung: 0,02 ml Ketaminhydrochlorid, 0,08 ml Medetomidinhydrochlorid
und 0,9 ml PBS) narkotisiert. Nach der Gewichtsbestimmung der Tiere wurden sie nach
erreichen einer tiefen Narkose mittels vier Kanülen auf einer Styroporplatte an den
Extremitäten in Rückenlage fixiert. Im Anschluss erfolgte eine mediane Laparotomie
mittels Scherenschnitt, eine Thorakotomie parasternal links und die Punktion des linken
Ventrikels mittels einer Kanüle. So konnte über eine Infusion Dextran 40
(Rheomacrodex) unter Zusatz von 0,5% Procainhydochlorid (Novocain) intrakardial
eingeleitet und das Gefäßsystem zwei Minuten gespült werden. Dextran 40 soll hierbei
einer thrombotischen Gefäßverlegung entgegenwirken und als onkotisch wirksame
Lösung ein interstitielles Ödem verhindern. Procain führt dabei am Gefäßsystem zu
einer Dilatation und am Herzen schließlich zum Herzstillstand.
Nach durchgeführter Spülung erfolgte eine zweite mit dreiprozentigem Glutaraldehyd in
0,2 molarer Phosphatpufferlöung (Sörensenpufferlösung) unter einem Perfusionsdruck
von 110 mmHg für zwölf Minuten zur Fixation der Organe.
16
4.4 Gewebeaufarbeitung
Bei allen Tieren wurden nach Fixation der Organe das Herz und die Aorta sowie beide
Nieren entnommen. Nach Messung der Nierengewichte wurden jeweils beide Nieren in
Glutaraldehyd 3% und 0,2 molarer Phosphatpufferlösung eingelagert. Die Aorta wurde
durch einen vertikal zum Gefäßlumen verlaufenden Schnitt tief abdominell quer
durchtrennt. Danach wurde das Gefäß direkt am Eintritt in den linken Ventrikel
abgesetzt. Nach Messung des Herzgewichtes wurden das Herz und die Aorta sodann in
10 % gepuffertem Formalin fixiert.
Da vor der Perfusion das Körpergewicht (KG) der Tiere bestimmt worden war, konnte
man unter Einbeziehung der ermittelten Nierengewichte (NG) und Herzgewichte (HG)
das jeweilige relative Gewicht dieser Organe (relatives mittleres Nierengewicht: rmNG;
relatives Herzgewicht: rHG) mittels folgenden Formeln bestimmen:
mNG = (NGlinks + NGrechts) / 2 [mg]
rmNG = mNG/KG x 100 [%]
rHG = HG/KG x 100 [%]
Da bei der späteren Verarbeitung jeweils nochmals die Organgewichte bestimmt
wurden, liegen diese Werte auch für die fixierten und gereinigten Organe vor.
4.5 Technik der Paraffinschnitte
4.5.1 Paraffinschnitte Niere
Senkrecht zu ihrer Interpolarachse wurden die Nieren in fünf 1,5 – 2 mm dicke
Scheiben geschnitten. Durch waschen in Sörensenpuffer und anschliessender
Dehydrierung in aufsteigender Ethanolreihe (30–100%-iger Ethanol), wurden die
gewonnenen Nierenscheiben für die Einbettung vorbereitet. Die Einbettung erfolgte in
Paraplast Tissue-tek II-Einbettkassetten, die mit Paraffin ausgegossen wurden. Mittels
eines Rotationsmikrotoms (RM25 von Leica) wurden im Anschluß 1 µm dicke
17
Paraffinschnitte hergestellt. Die hierdurch erhaltenen Schnitte wurden schließlich PAS
(Periocid-Acid-Schiff-Reaktion) gefärbt.
4.5.2 Paraffinschnitte Herz und Aorta
Die Herzen wurden horizontal so gedrittelt, dass die entstehenden Teilstücke eine
nahezu gleich große Dicke aufwiesen. Sowohl die Aorten als auch die 3 Herzanteile
wurden 24 Stunden gewässert und anschliessend durch eine aufsteigende Alkoholreihe
(30-100 % Ethanol) dehydriert. Es erfolgte die Einbettung mittels Paraplast in Tissuetek II Einbettkassetten, die mit Paraffin ausgegossen wurden. Im Anschluß wurden mit
Hilfe des Rotationsmikrotoms 1 μm dicke Paraffinschnitte angefertigt. Zur Auswertung
morphometrischer Parameter erfolgte abschließend die Färbung der Präparate mit
Hämatoxylin und Eosin.
4.6 Analyse
4.6.1 Analyse der Herzen und der Aorta
Die morphometrische Auswertung der Herzmaße, der intramyokardialen Arterien und
der Aorta erfolgte mit Hilfe eines halbautomatischen Bildanalyse-Systems (Analysis
PRO, SIS, Münster, Deutschland), wie vorausgehend detailliert beschrieben.[22] Alle
Messungen und Auswertungen erfolgten geblindet, d.h. der Auswertende hatte keinerlei
Kenntnisse über die Gruppenzugehörigkeit der Präparate.
4.6.1.1 Analyse der Herzen
Zur Beurteilung der Herzen wurden folgende Parameter untersucht:
Linker Ventrikel, LV (μm):
Dicke des linken Ventrikels
Septum, S (μm):
Dicke des Septums
Rechter Ventrikel, RV (μm):
Dicke des rechten Ventrikels
Die
Messung
der
Parameter
erfolgte
mit
Hilfe
eines
halbautomatischen
Bildanalysesystems (SIS, Münster, Deutschland) bei 4-facher (linker Ventrikel und
18
Septum), bzw. 20-facher (rechter Ventrikel) Vergrößerung. Aus jeweils 10 gleichmäßig
verteilten Messungen pro Tier wurden die Durchschnittswerte berechnet.
Zur Beurteilung der intramyokardialen Gefäße wurden folgende Parameter gemessen
und berechnet:
Wanddicke, WD (μm, berechnet):
Dicke der Gefäßwand
Wand-Lumen-Ratio, WLR (μm/μm):
Quotient aus Wanddicke und
Lumendiameter
In die Messungen wurden pro Tier zwischen 6 und 10 intramyokardiale Arterien
einbezogen. Alle Messungen erfolgten mittels Analysis-System bei 400-facher
Vergrößerung. Die Ermittlungen der Werte wurden so durchgeführt, dass bei den meist
nicht
senkrecht
angeschnittenen
Gefäßen
jeweils
der
kürzeste
messbare
Lumendurchmesser und - in direkt darauf liegender Projektion - der kleinste
Gesamtdurchmesser
markiert
und
gemessen
wurde.
Dann
wurde
der
Lumendurchmesser vom Gesamtdurchmesser subtrahiert und das Ergebnis durch zwei
dividiert und so die Wanddicke des Gefäßes bestimmt. Dieses Vorgehen diente der
Minimierung möglicher Fehlerquellen (Schnittwinkelartefarkte, Messfehler bei sehr
kleinen Messstrecken), so dass die Messwerte den wahren Werten der Gefäße am
nahsten kommen. Die Wand-Lumen-Ratio ergab sich aus dem Quotienten aus einfacher
Wanddicke und Lumendiameter.
4.6.1.2 Analyse der Aorten
Zur Beurteilung der Aorten wurden folgende Parameter untersucht:
Wanddicke, WD (μm, berechnet):
Dicke der Media
Die Wanddicke der Aorta wurde nicht wie bei den Arteriolen berechnet, sondern als
Mittelwert aus 10 willkürlichen Messungen der Mediadicke der thorakalen Aorta
ermittelt.
19
4.6.2 Analyse der Nieren
4.6.2.1 Schädigungsindices
4.6.2.1.1 Glomeruloskleroseindex (GSI)
Eine Methode zur Beurteilung einer glomerulären Schädigung ist die Bestimmung der
Proliferation des Mesangiums und die Vermehrung der mesangialen Matrix. Mit Hilfe
eines Lichtmikroskopes wurden die PAS gefärbten Paraffinschnitte in 400 facher
Vergrößerung mäanderförmig durchfahren, wobei pro Präparat 50 Glomeruli beurteilt
wurden. Dabei wurde die Schädigung gemäß der Methode von El Nahas et al. [9] in
folgende Stadien eingeteilt:
Stadium histologische Veränderungen
0
1
Anteil der Veränderung
des Konvolutes
normales Glomerulum
0%
mesangiale Verdickung mit und ohne
< 25 %
Proliferation von Mesangiumzellen; keine
2
Kapillarbeteiligung
mesangiale Proliferation
partieller
25 bis 50 %
3
Gefäßwandbeteiligung, segmentale Sklerose
große Teile der Kapillaren mit Obliteration
50 bis 75 %
4
oder Narbenformation, diffuse Sklerose
totale Obliteration der Kapillaren mit und
> 75 %
mit
ohne Kapillarthrombose, globale Sklerose
mit Kapillarkollaps
Der Glomeruloskleroseindex ließ sich folgendermaßen berechnen:
GSI = ( 0 x n0 + 1 x n1 + 2 x n2 + 3 x n3 + 4 x n4 ) / n0 + n1 + n2 + n3 + n4
( n0, n1, n2, n3, n4 : Anzahl der Glomeruli mit Stadium 0 bis 4 )
20
4.6.2.1.2 Tubulointerstitieller Index (TSI)
Um die tubuläre und interstitiellen Veränderungen zu beurteilen, wurden die PAS
gefärbten Paraffinschnitte lichtmikroskopisch mit 200 facher Vergrößerung untersucht.
Die Präparate wurden dabei mäanderförmig durchfahren. Pro Niere wurden jeweils 20
Gesichtsfelder beurteilt und nach folgendem Schema in Stadien eingeteilt.[33]
Schweregrad
Histologische Veränderungen
Anteil der
tubulointerstitiellen Schädigung
0
1
am Gesichtsfeld
0%
< 25 %
normales Tubulussystem
Zeichen einer interstitiellen
Entzündung und Fibrose,
2
tubuläre Atrophie
Zeichen einer interstitiellen
25 – 50 %
Entzündung und Fibrose,
tubuläre
3
Atrophie
und
Dilatation
Zeichen einer interstitiellen
> 50 %
Entzündung und Fibrose,
tubuläre
Atrophie
und
Dilatation
Der Index der tubulointerstitiellen Veränderungen setzt sich wie folgt aus den 20
Einzelmessungen zusammen:
TSI = ( 0x n 0 ) + ( 1x n 1 ) + ( 2x n 2 ) + ( 3x n 3 ) / n 0 + n 1 + n 2 + n 3
( n 0, n 1, n 2, n 3 : Anzahl der Glomeruli mit Stadium 0 bis 3 )
4.6.2.1.3 Vaskulärer Index (VSI)
Für die Beurteilung von Nierenschäden spielen neben glomerulären, tubulären und
interstitiellen Veränderungen auch vaskuläre Veränderungen eine entscheidende Rolle.
Insbesondere
richtet
man
dabei
sein
Augenmerk
auf
das
Ausmaß
der
21
Gefäßwandverdickung und der fibrinoiden Nekrose der afferenten Arteriolen,
interlobulären Gefäße und kleinen Arterien. Dazu wurden 20 Gesichtsfelder pro Niere
in 200 facher Vergrößerung mit dem Lichtmikroskop untersucht und in folgende
Stadien eingeteilt.[33]
Stadium
0
1
2
Histologische Veränderungen
Normale Gefäße
Geringe Gefäßwandverdickung
Moderate Gefäßwandverdickung
3
4
Schwere Gefäßwandverdickung
Fibrinoide Nekrose der Gefäße
Gefäßwandverdickung
0%
< 25 %
25-50 %
>50 %
Der Index der Gefäßveränderungen wurde aus dem Mittelwert der Einzelbestimmungen
berechnet:
VSI = ( 0x n 0 ) + ( 1x n 1 ) + ( 2x n 2 ) + ( 3x n 3 ) + ( 4x n 4 ) / n 0 + n 1 + n 2 + n 3 + n 4
( n 0, n 1, n2, n 3, n 4 : Anzahl der Glomeruli mit Stadium 0 bis 4 )
4.6.2.2 Glomerulusgeometrie
4.6.2.2.1 Morphometrie und Stereologie
Morphometrie und Stereologie sind Begriffe aus der Naturwissenschaft und umfassen
Verfahren zur Beschreibung räumlicher Anordnungen von Strukturen.[8] Zur
quantitativen
Erfassung
von
Strukturelementen
und
Partikeln
benutzt
man
morphometrische Methoden.[24] Durch stereologische Methoden kann man aus
zweidimensionalen Abbildungen Informationen über dreidimensionale Strukturen
gewinnen.[35,36] Ermöglicht wird dies durch geometrische Wahrscheinlichkeiten, nach
denen
sich
eine
dreidimensionale
Struktur
in
ihren
zufällig
getroffenen
zweidimensionalen Abschnitten abbildet. Bezogen auf histologische Schnittpräparate ist
es dadurch möglich, Aussagen über die räumliche Struktur des untersuchten Gewebes
treffen zu können.
Delesse [7] beschreibt ein Verfahren, um das Volumen einer Struktur im histologischen
Schnitt zu bestimmen. Danach ist die volumetrische Zusammensetzung eines Organs
22
direkt aus der Flächenzusammensetzung der Schnittflächen abzuleiten. Um nun den
Volumenanteil einer Struktur zu bestimmen wird das sogenannte Punkte-ZählVerfahren genutzt.
Hierfür wurde ein Mikroskop genutzt, dessen 10er Okular mit einer Integrationsplatte
ausgestattet war, auf dem sich ein quadratisches Gitter mit symmetrisch verteilten
Testpunkten befand. Diese Punkte projizierten sich direkt via Okular auf den jeweiligen
histologischen Schnitt. Die Formel: VV = AA besagt, dass die volumetrische
Zusammensetzung eines Gewebes im histologischen Schnitt unabhängig von seiner
räumlichen Orientierung direkt in der Flächenzusammensetzung der Schnittflächen
repräsentiert ist. Der Volumenanteil VV eines Objekts ist gleich dem Flächenanteils AA.
Des Weiteren ist die Anzahl der Punkte, die sich zufällig auf eine zu messende Struktur
projiziert, auch gleich dessen Flächenanteil: PP = AA . Dabei steht PP für die Anzahl der
gezählten Punkte, die auf das zu messende Gewebe fallen im Verhältnis zur Gesamtzahl
der Punkte des Punktegitters. Daraus ergibt sich dann: VV = PP , was bedeutet, dass der
Volumenanteil VV dem Anteil der Trefferpunkte, bezogen auf die Gesamtpunktzahl des
Messgitters entspricht.
Voraussetzung für die genannte Methode der Volumenbestimmung ist die
Unabhängigkeit des Delesse `schen Prinzips von der räumlichen Orientierung der
betreffenden Objekte. Nach Weibel [35,36] ist diese Voraussetzung erfüllt.
Die Fläche des Punktegitters wurde in den jeweiligen Vergrößerungen mittels eines
kalibrierten Objektmikrometers bestimmt und so die Flächen des Messgitters berechnet.
Dazu wurde dessen bekannter Maßstab mit der Skala des Okulargitters zur Deckung
gebracht und die Punktabstände bzw. die Seitenlängen des Quadrats ausgemessen.
4.6.2.2.2 Auswertung
Alle Messungen wurden von einer Person ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit der
zu untersuchenden histologischen Präparate durchgeführt.
Die Untersuchungen der Nierenschnitte wurden mit einem Lichtmikroskop (Fa.
Olympus BH- 2) mit 10er Okular und je nach zu bestimmendem Parameter mit einem
10er, 20er, 40er oder 100er Objektiv (mit Immersionsöl) durchgeführt.
Die
Beurteilung
der
Nieren
wurden
an
PAS
gefärbten
Paraffinschnitten
lichtmikroskopisch (Objektive 10, 20, 40) vorgenommen. Für die Untersuchungen
23
wurde die beschriebene Punkte- Zähl- Methode angewendet und dabei folgende Größen
bestimmt:
Punkte auf Nierenmark
Punkte auf Nierenrinde
Punkte auf Glomeruli
Anzahl Glomerli
4.6.2.2.2.1 Volumenfraktion von Nierenmark und Nierenrinde
In 100 facher Vergrößerung wurde mit Hilfe des beschriebenen Punkte- ZählVerfahrens die Volumenfraktion von Nierenrinde (VVR) und Nierenmark (VVM)
bestimmt.
Dabei galten folgende Formeln:
Punkte auf Nierenrinde
VVR = ———————————
x 100 %
[% ]
x 100 %
[% ]
Punkte auf Niere
Punkte auf Nierenmark
VVM = ———————————
Punkte auf Niere
4.6.2.2.2.2 Gesamtvolumen Niere und absolutes Volumen Nierenrinde
Mit folgender Formel wurde aus dem gemessenen
Gesamtvolumen der jeweiligen Niere VN berechnet:
VN = m / rho x 1000
[ mm 3]
rho : Dichte der Niere, empirischer Wert 1,04 g/ cm 3
m : Nierengewicht in g
Nierengewicht m das
24
Mit Hilfe des Gesamtnierenvolumens konnte nun das absoluten Volumen der
Nierenrinde VR berechnet werden:
VR = VVR x VN / 100
[ mm 3 ]
4.6.2.2.2.3 Glomeruli pro Fläche Rinde
In 100 facher Vergrößerung konnte über eine Bestimmung der Fläche der
Integrationsplatte mit Hilfe einer Eichskala die Nierenrindenfläche (AR) und damit dann
die Anzahl der Glomeruli pro Fläche Rinde (NA) berechnet werden. Die Fläche der
Integrationsfläche (10 x 10 Punkte) betrug dabei 0,7832 mm
2
. Somit ergaben sich
folgende Formeln:
AR = Punkte Rinde x 0,7832 / 100
[ mm 2 ]
Zahl der Glomeruli
NA = ——————————
[1/ mm2 ]
AR x ( 1,08 ) 2
( 1,08 ) 2 entspricht dabei dem Schrumpfungsindex der Niere durch die Organfixation.
[24]
4.6.2.2.2.4 Volumendichte der Glomeruli
Die Volumendichte der Glomeruli in der Nierenrinde (VVGlom) wurde nach folgender
Formel berechnet:
Punkte Glomeruli
VVGlom =
—————————
Punkte Nierenrinde
x 100 %
[%]
25
4.6.2.2.2.5 Numerische Dichte der Glomeruli in der Rinde
Aus der Anzahl der Glomeruli pro Fläche Rinde (NA) und der Volumendichte der
Glomeruli (VVGlom ) ergab sich dann die Anzahl der Glomeruli pro Volumen (Nv) :
k
Nv = —— x NA 3/2 / (VVGlom x 0,01 ) 0,5
[ 1/ mm 3 ]
ß
k entspricht dem sogenannten Größenkoeffizienten der untersuchten Teilchen und hat
abhängig von der Form und Volumendichte den Wert 1,04. Der Koeffizient ß beschreibt
als Formfaktor die Gestalt der gemessenen Objekte und beträgt für die annähernd
sphärische Form der Glomeruli 1,38.[1] Denn nach Weibel und Gomez [34] gilt: Das
Verhältnis zwischen der Teilchenzahl in der Volumeneinheit und der Querschnittszahl
in der Fläche einer angeschnittenen Oberfläche ist unabhängig von einer
Größenänderung der Teilchen, vorausgesetzt, ihre Gestalt ist geometrisch ähnlich, was
für Glomeruli angenommen werden kann.
4.6.2.2.2.6 Gesamtzahl und Gesamtvolumen der Glomeruli einer Niere
Mit nachfolgender Formel ließ sich dann die absolute Anzahl der Glomeruli einer Niere
(NGlom) berechnen:
NGlom = Nv x VR
Für das Gesamtvolumen der Glomeruli einer Niere (VNGlom) galt dann entsprechend:
VNGlom = VR x VVGlom / 100
[ mm3 ]
26
4.6.2.2.2.7 Mittleres glomeruläres Volumen
Aus den oben dargestellten Formeln ließ sich dann das mittlere glomeruläre Volumen
(VGlom) folgendermaßen berechnen:
VGlom = VNGlom / NGlom x 106
[µm 3 ]
4.7 Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte mittels SPSS, Version 10. Dabei wurden alle Daten
zunächst auf Normalverteilung der Werte und Homogenität der Varianzen geprüft.
Da es sich bei unseren Daten um unabhängige Variablen handelte, wurden
normalverteilte,
homogene
anschliessender
Testung
Stichproben
durch
mittels
Bonferroni
einfaktorieller
auf
ANOVA
Unterschiede
und
untersucht.
Normalverteilte, nicht homogene Stichproben wurden zunächst dem Test nach Brown
Forsythe unterzogen und schliesslich mittels Tamhane untersucht. Signifikanz wurde
dann angenommen, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit p kleiner als 0,05 war.
27
5 Ergebnisse
Alle Parameter werden als Mittelwerte mit Standardabweichungen der einzelnen
Gruppen angegeben.
5.1 Allgemeine Parameter
5.1.1 Körpergewicht
Tabelle 1
1
Gruppe Genotyp
♂ jung
ko
Körpergewicht [g]
26,9 ± 4,0
2
♂ jung
wt
23,8 ± 1,5
3
♂ alt
ko
29,9 ± 2,8
4
♂ alt
wt
31,2 ± 2,8
5
♀ alt
ko
31,5 ± 3,3
6
♀ alt
wt
ANOVA: p<0,01
Bonferroni: 2 vs. 4 p<0,01
30,3 ± 2,3
Bei den Körpergewichten zeigt sich ein signifikant niedrigerer Wert der jungen wildtyp
Tiere gegenüber den älteren männlichen wildtyp Tieren.
5.1.2 Herzgewicht (HG) und relatives Herzgewicht (rHG)
Tabelle 2
1
Gruppe Genotyp
♂ jung
ko
HG [mg]
162,4 ± 17,8
2
♂ jung
wt
129,7 ± 11,4
3
♂ alt
ko
185,6 ± 11,7
4
♂ alt
wt
187,5 ± 19,2
5
♀ alt
ko
169,0 ± 20,6
6
♀ alt
wt
ANOVA: p<0,01, Bonferroni:
2 vs. 1 p<0,05; 2 vs. 4 p<0,001;
161,8 ± 19,1
28
Tabelle 3
1
Gruppe Genotyp
♂ jung
ko
rHG [mg/gKG]
6,1 ± 0,5
2
♂ jung
wt
5,4 ± 0,2
3
♂ alt
ko
6,2 ± 0,5
4
♂ alt
wt
6,0 ± 0,5
5
♀ alt
ko
5,4 ± 0,7
6
♀ alt
wt
5,3 ± 0,4
Brown Forsythe: p<0,01; Tamhane: n.s.
Hier zeigt sich ein signifikant niedrigeres Herzgewicht der jungen wildtyp Tiere
gegenüber den jungen knockout Tieren und den alten wildtyp Tieren. Die Werte der
relativen Herzgewichte sind bei den knockout Tieren jeweils höher als in den
zugehörigen wildtyp Gruppen, die Unterschiede sind jedoch nicht signifikant.
5.1.3 Nierengewicht (NG) und relatives mittleres Nierengewicht (rmNG)
Tabelle 4: Nierengewicht
Gruppe Genotyp
1
♂ jung
ko
NG Einzelniere [mg]
187 ± 42
2
♂ jung
wt
158 ± 12
3
♂ alt
ko
239 ± 27
4
♂ alt
wt
272 ± 49
5
♀ alt
ko
199 ± 29
6
♀ alt
wt
197 ± 44
ANOVA: p <0,01
Bonferroni: 2 vs. 4 p<0,001; 4 vs. 6 p<0,05
Tabelle 5: mittleres Nierengewicht
Gruppe Genotyp
1
♂ jung
ko
mNG [mg]
197,1 ± 38,1
2
♂ jung
wt
173,1 ± 17,6
3
♂ alt
ko
238,6 ± 29,4
4
♂ alt
wt
219,4 ± 39,1
5
♀ alt
ko
233,8 ± 30,5
wt
230,8 ± 47,9
6
♀ alt
ANOVA: p <0,05
Bonferroni: n.s.
29
Tabelle 6: relatives mittleres Nierengewicht
Gruppe Genotyp
rmNG [mg/gKG]
1
♂ jung
ko
7,3 ± 0,7
2
♂ jung
wt
7,3 ± 0,6
3
♂ alt
ko
8,0 ± 1,2
4
♂ alt
wt
7,0 ± 0,7
5
♀ alt
ko
7,4 ± 0,8
6
♀ alt
ANOVA: n.s.
wt
7,6 ± 1,2
Anhand der nach Versuchende bestimmten mittleren Nierengewichte der Tiere
kann dargestellt werden, dass jeweils bei den knockout Tieren höhere mittlere
Nierengewichte im Vergleich zu den jeweiligen wildtyp Tieren vorliegen. Signifikant
unterscheiden sich die mittleren Nierengewichte innerhalb der Gruppen aber nicht.
Bei Betrachtung der relativen mittleren Nierengewichte fallen bei den jungen
männlichen Tieren annähernd gleiche Werte, bei den alten männlichen höhere Werte
der knockout Tiere, bei den alten weiblichen jedoch niedrigere Werte der knockout
Tiere auf. Diese Unterschiede sind jedoch nicht signifikant.
5.2 Morphometrie
5.2.1 Morphometrie Herz – Wanddicken
rechter Ventrikel (RV), linker Ventrikel (LV) und Septum
Tabelle 7
Gruppe Genotyp
1
♂ jung
ko
RV[µm]
204 ± 53
LV[µm] Septum[µm]
513 ± 106 348 ± 103
2
♂ jung
wt
256 ± 35
456 ± 94
296 ± 80
3
♂ alt
ko
223 ± 68
443 ± 101
298 ± 81
4
♂ alt
wt
223 ± 34
456 ± 94
372 ± 115
5
♀ alt
ko
175 ± 17
434 ± 107
284 ± 42
6
♀ alt
wt
192 ± 16 384 ± 136
RV: Brown-Forsythe p<0,05; Tamhane: n.s.
LV: ANOVA: n.s.
Septum: ANOVA: n.s.
335 ± 87
Der Vergleich von Herzsepten (Septum), rechten (RV) und linken Ventrikeln (LV)
ergab keine signifikanten Unterschiede.
30
Die Wandstärken der linken Ventrikel und der Herzsepten sind bei den jungen
männlichen Tieren in der knockout Guppe jeweils höher, bei den alten männlichen
Tieren sind diese Werte allerdings in der wildtyp Gruppe jeweils höher. Bei den alten
weiblichen Tieren sind die LV Wandstärken in der knockout Gruppe, die Septum
Wandstärken dagegen in der wildtyp Gruppe höher.
5.2.2 Morphometrie intramyokardialer Arterien (IMA)
Tabelle 8: Wanddicke und Wall-Lumen-Ratio
Wanddicke [µm]
6,6 ± 1,1
Wall-LumenRatio [µm/µm]
0,110 ± 0,01
1
Gruppe Genotyp
♂ jung
ko
2
♂ jung
wt
6,3 ± 1,1
0,137 ± 0,03
3
♂ alt
ko
8,4 ± 1,0
0,150 ± 0,03
4
♂ alt
wt
8,9 ± 2,1
0,170 ± 0,07
5
♀ alt
ko
7,4 ± 1,4
0,105 ± 0,02
6
♀ alt
wt
7,0 ± 0,5
0,099 ± 0,01
Wanddicke: ANOVA: p<0,05; Bonferroni: 2 vs. 4 p<0,05
Wall-Lumen-Ratio: Brown Forsythe: p<0,05; Tamhane: n.s.
Bei den intramyokardialen Arterien zeigte sich eine signifikant niedrigere Wanddicke
der jungen wildtyp Tiere gegenüber den alten männlichen wildtyp Tieren. Im Vergleich
der Wall-Lumen-Ratio zeigten sich keine signifikanten Unterschiede.
5.2.3 Morphometrie Aorta - Wanddicke
Tabelle 9
Gruppe Genotyp
1
♂ jung
ko
Wanddicke [µm]
37,9 ± 4,9
2
♂ jung
wt
37,9 ± 1,6
3
♂ alt
ko
54,4 ± 8,5
4
♂ alt
wt
46,0 ± 4,4
5
♀ alt
ko
48,7 ± 3,9
6
♀ alt
wt
38,2 ± 0,8
Wanddicke Aorta: Brown Forsythe: p<0,001
Tamhane:
1 vs. 3 p<0,05
5 vs. 6 p<0,05
Junge männliche knockout Tiere zeigen eine signifikant geringere Wanddicke der Aorta
als alte männliche knockout Tiere. Bei den älteren weiblichen Tieren finden sich in der
31
knockout Gruppe ebenfalls signifikant höhere Werte im Vergleich zu den wildtyp
Tieren. Bei den älteren männlichen Tieren sind die Werte der knockout Tiere ebenfalls
höher als bei den wildtyp Tieren, die Werte der jungen Tiere sind allerdings annähernd
gleich und diese Unterschiede sind zudem nicht signifikant.
5.3 Niere
5.3.1 Semiquantitative Untersuchungen – renale Schädigungsindices
Tabelle 10
1
Gruppe Genotyp
♂ jung
ko
GSI
0,38 ± 0,13
TSI
0,76 ± 0,27
VSI
0,11 ± 0,09
2
♂ jung
wt
0,22 ± 0,08
0,33 ± 0,18
0,17 ± 0,05
3
♂ alt
ko
0,37 ± 0,08
0,85 ± 0,36
0,21 ± 0,1
4
♂ alt
wt
0,25 ± 0,07
0,39 ± 0,14
0,18 ± 0,06
5
♀ alt
ko
0,49 ± 0,16
0,68 ± 0,33
0,29 ± 0,13
6
♀ alt
wt
0,38 ± 0,19
0,32 ± 0,15 0,18 ± 0,09
GSI: Brown Forsythe: p<0,05; Tamhane: n.s.
TSI: ANOVA: p< 0,05; Bonferroni: 1 vs. 2 p<0,05 und 3 vs. 4 Tendenz p=0,055
VSI: ANOVA: p< 0,05; Bonferroni: n.s.
Ein Vergleich des Glomeruloskleroseindex (GSI) zur Beurteilung einer glomerulären
Schädigung ergibt zwar jeweils höhere Werte der knockout Tiere im Vergleich zu den
wildtyp
Tieren,
aber
aufgrund
der
Standardabweichung
keine
signifikanten
Unterschiede.
Die tubulären und interstitiellen Veränderungen (TSI) sind bei den jungen männlichen
knockout Tieren signifikant höher als bei den altersgleichen wildtyp Tieren. Bei den
älteren männlichen knockout Tieren zeigen sich tendenziell höhere Werte im Vergleich
zur wildtyp Gruppe und auch bei den älteren weiblichen Tiere sind die Werte der
knockout Gruppe höher als die der wildtyp Tiere.
Bei den alten Tieren beiden Geschlechts sind die VSI Werte der knockout Tiere jeweils
höher als die der wildtyp Tiere, nur bei den jungen männlichen Tieren sind die Werte
der wildtyp Tiere höher, diese Unterschiede sind jedoch nicht signifikant.
32
5.3.2 Prozentuale Verteilung Nierenrinde und Nierenmark
Volumenfraktion von Nierenrinde (VVR) und Nierenmark (VVM)
Tabelle 11
Gruppe
1
♂ jung
Genotyp
ko
VVM [%]
31,7 ± 2,7
VVR [%]
68,3 ± 2,7
2
♂ jung
wt
40,4 ± 5,2
59,6 ± 5,2
3
♂ alt
ko
40,8 ± 9,9
59,2 ± 9,9
4
♂ alt
wt
45,4 ± 8,4
54,6 ± 8,4
5
♀ alt
ko
43,7 ± 10,6
56,3 ± 10,6
6
♀ alt
wt
48,4 ± 9,3
VVM: ANOVA: p< 0,05; Bonferroni: n.s.
VVR: ANOVA: p< 0,05; Bonferroni: n.s.
51,6 ± 9,3
Hier zeigen sich keine signifikanten Unterschiede. Es fällt jedoch auf, dass die knockout
Tiere innerhalb der Gruppen jeweils niedrigere Volumenfraktionen des Nierenmarks
und damit jeweils höhere Volumenfraktionen der Nierenrinde aufweisen.
5.3.3 Gesamtvolumen Niere (VN) und absolutes Volumen der Nierenrinde (VR)
Tabelle 12
Gruppe Genotyp
1
♂ jung
ko
VN [ mm 3 ]
180 ± 40
VR [ mm 3 ]
123 ± 29
2
♂ jung
wt
152 ± 11
91 ± 11
3
♂ alt
ko
230 ± 26
136 ± 31
4
♂ alt
wt
262 ± 48
143 ± 31
5
♀ alt
ko
191 ± 28
106 ± 14
6
VN:
♀ alt
wt
189 ± 43
100 ± 35
ANOVA: p<0,05
Bonferroni:.2 vs. 4 p<0,001 und 4 vs. 6 p<0,05
VR:
ANOVA: p<0,05
Bonferroni: 2 vs. 4 p<0,05
Im Vergleich der Gesamtvolumina der Nieren kann ein signifikant höheres
Gesamtnierenvolumen bei den alten männlichen wildtyp Tieren im Vergleich zu jungen
männlichen und alten weiblichen wildtyp Tieren gezeigt werden. Weiterhin haben junge
männliche wildtyp Tiere ein signifikant kleineres absolutes Volumen der Nierenrinde
im Vergleich zu alten männlichen wildtyp Tieren.
33
5.3.4 Anzahl der Glomeruli pro Volumen (Nv)
Tabele 13
Gruppe
1
♂ jung
Genotyp
ko
NV [ 1/ mm 3 ]
193 ± 30
2
♂ jung
wt
201 ± 40
3
♂ alt
ko
128 ± 17
4
♂ alt
wt
148 ± 41
5
♀ alt
ko
221 ± 38
265 ± 39
6
♀ alt
wt
NV: ANOVA: p<0,01; Bonferroni:
1 vs. 3 p<0,05
3 vs. 5 p<0,05
4 vs. 6 p<0,01
Hier zeigt sich eine signifikant niedrigere Anzahl der Glomeruli pro Volumen bei den
alten männlichen knockout Tieren im Vergleich zu den jungen männlichen und alten
weiblichen knockout Tieren. Allerdings zeigen auch die alten männlichen wildtyp Tiere
signifikant niedrigere Werte im Vergleich zu den alten weiblichen wildtyp Tieren.
5.3.5 Anzahl der Glomeruli einer Niere (NGlom)
Tabelle 14
Gruppe Genotyp
1
♂ jung
ko
NGlom
23506 ± 5678
2
♂ jung
wt
18010 ± 2910
3
♂ alt
ko
17118 ± 3010
4
♂ alt
wt
20201 ± 5060
5
♀ alt
ko
23380 ± 5056
wt
26867 ± 11965
6
♀ alt
ANOVA: n.s.
Bei der Anzahl der Glomeruli einer Niere zeigen sich keine signifikanten Unterschiede.
34
5.3.6 Mittleres glomeruläres Volumen (VGlom )
Tabelle 15
Gruppe Genotyp
1
♂ jung
ko
VGlom [ µm 3 ]
243 ± 39
2
♂ jung
wt
242 ± 45
3
♂ alt
ko
302 ± 72
4
♂ alt
wt
338 ± 146
5
♀ alt
ko
293 ± 63
wt
311 ± 67
6
♀ alt
ANOVA: n.s.
Auch beim mittleren glomerulären Volumen zeigen sich keine signifikanten
Unterschiede.
5.4 Übersicht der Parameter und Vergleiche zwischen den untersuchten Gruppen
Wir haben sowohl für die kardiovaskulären als auch die renalen Parameter mehrere
Gruppenvergleiche durchgeführt. Dabei wurden zunächst knockout vs. wildtyp Tiere
direkt gegenübergestellt (Tabellen 16 und 19).
Daraufhin verglichen wir junge männliche knockout Tiere mit alten männlichen
knockout Tieren, sowie junge männliche wildtyp Tiere mit alten männlichen wildyp
Tieren (Tabelle 17 und 20).
Schliesslich wurden dann alte männliche und alte weiblichen Tiere beiden Genotyps
gegenübergestellt (Tabelle 18 und 21).
Zur besseren Übersicht folgen nun Tabellen, die jeweils die Werteentwicklung der
Parameter
bei
diesen
Gruppenvergleichen
veranschaulichen
und
signifikante
Unterschiede nochmals hervorheben. Erläuterungen und Interpretation dazu folgen dann
in der Diskussion unter Punkt 6.
35
5.4.1 Kardiovaskulärer Phänotyp
Tabelle 16: Knockout vs. wildtyp Tiere, Veränderungen nach Alter und Geschlecht im Zeitverlauf.
ko vs. wt
KG
HG
jung ♂
(1-2)
▲
alt ♂
(3-4)
alt ♀
(5-6)
relHG
RV
LV
S
WD IMA
WLR IMA WD Aorta
▲ sign. ▲
▼
▲
▲
▲
▼
-
▼
▼
▲
-
▼
▼
▼
▼
▲
▲
▲
▲
▼
▲
▼
▲
▲
▲
sign.
▲ knockout Tiere zeigen höhere Werte
▼ kockout Tiere zeigen niedrigere Werte
- Werte annähernd gleich
sign.: Werte signifikant verändert
Tabelle 17: Junge vs. alte männliche Tiere, Veränderungen nach Genotyp im Zeitverlauf.
jung vs. alt
KG
HG
relHG
RV
LV
S
WD IMA
WLR IMA WD Aorta
jung ♂ ko
vs.
alt ♂ ko
(1-3)
▲
▲
▲
▲
▼
▼
▲
▲
▲
sign.
jung ♂ wt
vs.
alt ♂ wt
(2-4)
▲
sign.
▲
sign.
▲
▼
-
▲
▲
sign.
▲
▲
▲ alte Tiere zeigen höhere Werte
▼ alteTiere zeigen niedrigere Werte
- Werte annähernd gleich
sign.: Werte signifikant verändert
Tabelle 18: Alte Tiere, männlich vs. weiblich, Veränderungen nach Geotyp.
alt ♂
vs.
alt ♀
KG
HG
relHG
RV
LV
S
WD IMA WLR
IMA
WD
Aorta
ko vs. ko
(3-5)
▲
▼
▼
▼
▼
▼
▼
▼
▼
wt vs. wt
(4-6)
▼
▼
▼
▼
▼
▼
▼
▼
▼
▲ weibliche Tiere zeigen höhere Werte
▼ weiblicheTiere zeigen niedrigere Werte
- Werte annähernd gleich
sign.: Werte signifikant verändert
36
5.4.2 Renaler Phänotyp
Tabelle 19: Knockout vs. wildtyp Tiere, Veränderungen nach Alter und Geschlecht im Zeitverlauf.
ko vs. wt mNG
rmNG
GSI
TSI
jung ♂
(1-2)
▲
-
▲
alt ♂
(3-4)
▲
▲
▲
VVM
VVR
VN
VR
NV
NGlom
VGlom
▲ sign. ▼
▼
▲
▲
▲
▼
▲
▲
▲
▲
Tendenz
▼
▲
▼
▼
▼
▼
▼
▼
▲
▲
▲
▼
▼
▼
alt ♀
▲
▼
▲
▲
(5-6)
▲ knockout Tiere zeigen höhere Werte
VSI
▲
▼ kockout Tiere zeigen niedrigere Werte
- Werte annähernd gleich
sign.: Werte signifikant verändert
Tabelle 20: Junge vs. alte männliche Tiere, Veränderungen nach Genotyp im Zeitverlauf.
rmNG
GSI
TSI
VSI
VVM
VVR
VN
VR
NV
NGlom
VGlom
jung ▲
♂ ko
vs. alt
♂ ko
(1-3)
▲
▼
▲
▲
▲
▼
▲
▲
▼
sign.
▼
▲
jung ▲
♂ wt
vs. alt
♂ wt
(2-4)
▼
▲
▲
▲
▲
▼
▲
sign.
▲
sign.
▼
▲
jung
vs.
alt
mNG
▲
▲ alte Tiere zeigen höhere Werte
▼ alteTiere zeigen niedrigere Werte
- Werte annähernd gleich
sign.: Werte signifikant verändert
Tabelle 21: Alte Tiere männlich vs. weiblich, Veränderungen nach Geotyp.
alt ♂
vs.
alt ♀
mNG
rmNG
GSI
TSI
VSI
VVM
VVR
VN
VR
NV
NGlom
VGlom
ko
(3-5)
▼
▼
▲
▼
▲
▲
▼
▼
▼
▲
sign.
▲
▼
-
▲
▼
▼
sign.
▼
▲
sign.
▲
▼
wt
▲
▲
▲
▼
(4-6)
▲ weibliche Tiere zeigen höhere Werte
▼ weiblicheTiere zeigen niedrigere Werte
- Werte annähernd gleich
sign.: Werte signifikant verändert
37
6 Diskussion
Der BK Kanal der Zellmembran glatter Gefäßmuskelzellen (VSMCs) wurde bereits
1992 von Brayden et al. [3] als wichtige Determinante des Vasotonus und damit des
arteriellen Blutdrucks beschrieben. BK Kanäle sind mit BK β-Untereinheiten besetzt,
welche die porenbildende BK α-Einheit gewebespezifisch in deren Eigenschaften
beeinflussen. Die BK β1-Untereinheit, kodiert durch das KCNMB1 Gen [4], in VSMCs
trägt dazu bei, intrazelluläre Kalziumströme und auswärts gerichtete Kaliumströme der
Zellmembran zu koppeln und ist daher maßgeblich an der Regulation der Kontraktilität
dieser Zellen beteiligt. Damit vereinbar zeigen Mäuse mit einer Deletion dieser BK β1Untereinheit typische Veränderungen der Eigenschaften von BK Kanälen und
entwickeln eine milde, aber signifikante arterielle Hypertonie.
Brenner et al. [4] konnten 2000 eine reduzierte Kalziumsensitivität der BK β1 knockout
Kanäle und damit eine deutliche Störung der physiologischen negativen Rückkopplung
der Vasokonstriktion in vitro nachweisen. Weiterhin fanden sie bei BK β1 knockout
Tieren eine deutlich vermehrte Kontraktion zerebraler Arterien und in Untersuchungen
in vivo zeigten sie dann, dass BK β1 knockout Mäuse eine milde arterielle Hypertonie
entwickeln, die etwa 14 – 20 mmHg über den Werten von 129svj wildtyp Tieren liegt.
Daraus schlossen sie, dass BK β1 knockout Tiere über einen gesteigerten arteriellen
Gefäßtonus eine arterielle Hypertonie entwickeln.[4,18,28] Letztlich bewerteten sie das
BK β1 Tiermodell als außergewöhnliche Möglichkeit, bei bekanntem, klar definiertem
molekularen Defekt, die sekundären Effekte einer Hypertonie zu erforschen. Sie
beschreiben beispielsweise ein im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höheres
relatives Herzgewicht von BK β1 knockout Tieren als Herzhypertrophie im Rahmen der
milden Hypertonie der BK β1 knockout Tiere.[4]
Plüger et al. [26] zeigten 2000 bei BK β1 knockout Tieren eine gestörte intrazelluläre
Signalübermittlung
in
VSMCs,
eine
gesteigerte
Kontraktilität
thorakaler
Aortenpräparate und ebenfalls eine chronische Erhöhung des Blutdrucks dieser Tiere.
Löhn
et
al.
[18]
beschreiben
2001
ebenfalls
eine
gestörte
intrazelluläre
Signalübermitlung bei BK β1 knockout Tieren sowie eine chronische Hypertonie im
Tiermodell, allerdings lassen sie die Gründe für die Entstehung des Hypertonus offen.
38
Brenner et al. [4] und Plüger et al. [26] heben jeweils das gewebespezfische
Vorkommen der BK β Untereinheiten hervor und betonen, dass BK β1-Untereinheiten
überwiegend in VSMCs vorkommen. Auch Nelson et al. [23] gehen davon aus, dass die
β1-Untereinheit der BK Kanäle exklusiv in glatten Muskelzellen vorkommt und die
Hypertonie bei BK β1 knockout Tieren rein vaskulären Ursprungs ist.
Pluznick et. al. [28] beschrieben 2003 zunächst, dass die BK β1-Untereinheit des BK
Kanals überwiegend in glatten Gefäßmuskelzellen vorzufinden ist, dort die
Kalziumsensitivität der Zellen moduliert und damit für die Regulation des Gefäßtonus
eine wichtige Rolle spielt. Da damals aber schon bekannt war, dass BK α-Einheiten in
verschiedenen Regionen der Niere vorkommen, untersuchten sie bereits renale
Auswirkungen einer BK β1 Gendeletion und fanden signifikante Unterschiede der
glomerulären Filtrationsrate, sowie der Natrium- und Kaliumausscheidung unter akuter
Volumenbelastung.
Anhand weiterer Studien konnten Pluznick et al. und Grimm et al. [12,27,28,29]
belegen, dass eben auch andere Gewebe, darunter auch Strukturen der Niere, β1Untereinheiten enthalten. Aus dem Nachweis signifikanter Veränderungen von
glomerulärer Filtrationsrate und der Kaliumausscheidung unter Volumenbelastung
schlossen sie, dass ein renal bedingter Aldosteronismus der BK β1 knockout Tiere die
Hauptursache des Hypertonus dieses Tiermodells ist.[12] Damit wurde erstmals die
These der rein vasogen bedingten Hypertonie dieser Tiere in Frage gestellt. Zur Klärung
der Ursache einer Erhöhung des Langzeitblutdrucks im Tiermodell sind daher nun vor
allem renale, hormonelle und myogene Einflussfaktoren zu bedenken. Nachdem man
lang vom gewebespezfischen Vorkommen der BK β1-Untereinheit in VSMCs ausging
und damit die glatte Gefäßmuskulatur als Hauptdeterminante untersuchte, ist nun die
Nieren- und Nebennierenfunktion im Fokus der Forschung.
Bis heute wurden allerdings nur wenige Daten zu Veränderungen der histologischen
Struktur von Herz, Gefäßen und renalem Gewebe veröffentlicht.[4,26,27]
Brenner et al. [4] beschrieben strukturelle Veränderungen am Herzen als
Endorganschaden der milden Hypertonie homozygoter BK β1 knockout Tiere. Auch
beim Menschen führt ein länger bestehender, essentieller Bluthochdruck langfristig zu
einer Herzvergrößerung mit linksventrikulärer Hypertrophie. [37] Eine Gendeletion bei
BK β1 knockout Tieren könnte aber per se den histologischen Phänotyp dieser Tiere
verändern.
39
Die vorliegende Arbeit sollte klären, ob bei BK β1 knockout Tieren im Vergleich zur
gesunden Kontrollpopulation ein veränderter kardialer und oder renaler Phänotyp
nachzuweisen ist und in welcher Weise das Alter und das Geschlecht der Tiere den
Phänotyp beeinflusst. Zur Überprüfung der anfangs formulierten Hypothese wurden
Herzen,
Gefäße
und
Nieren
bei
homozygoten
BK
β1
knockout
Mäusen
unterschiedlichen Alters und Geschlechts im Vergleich zu wildtyp Tieren untersucht.
6.1 Interpretation des Phänotyps
6.1.1 Knockout vs. wildtyp
Um Auswirkungen der BK β1 Gendeletion beschreiben zu können verglichen wir
jeweils
(i) junge männliche knockout Tiere mit jungen männlichen wildtyp Tieren,
(ii) alte männliche knockout Tiere mit alten männlichen wildtyp Tieren und
(iii) alte weibliche knockout Tiere mit alten weiblichen wildtyp Tieren.
6.1.1.1 Kardialer Phänotyp
Wäre nach Brenner et al. [4] eine kardiale Hypertrophie und damit eine signifikante
Erhöhung der relativen Herzgewichte zumindest der alten knockout Tiere als (Spät)Folge des Hypertonus zu erwarten, so zeigten unsere Ergebnisse keine signifikanten
Unterschiede, lediglich die absoluten Werte der relativen Herzgewichte waren jeweils in
allen knockout Gruppen höher. Zur genaueren Beurteilung haben wir neben den
relativen Herzgewichten auch die Werte der Wandstärken der linken Ventrikel
verglichen. Aber auch diese zeigten keine signifikanten Unterschiede im Sinne einer
Herzhypertrophie der knockout Tiere. Dies ist um so erstaunlicher, als die knockout
Tiere in Brenners Arbeit [4] alle männlich und ca. 15 Wochen alt, die alten Tieren in
unserer Arbeit dagegen zwischen 68 und 96 Wochen und damit deutlich älter waren. Im
Gegensatz zu Brenner et al.[4], die nur junge männliche Tiere in ihre Messungen
miteinbezogen, können wir zwar eine Zunahme der relativen Herzgewichte auch bei
alten knockout Tieren beiden Geschlechts beobachten, aber eben keine signifikante
Hypertrophie beschreiben. Die linksventrikuläre Wandstärke der alten männlichen
knockout Tiere war sogar nicht signifikant niedriger als in der wildtyp Gruppe. So
können wir mit unseren Zahlen weder die Ergebnisse von Brenner bestätigen, noch
40
einen signifikanten alters- oder geschlechtsabhängigen Unterschied beschreiben.
Sausbier et al. [30] konnten bei 16 bis 24 Wochen alten BK α knockout Tieren ebenfalls
keine signifikante kardiale Hypertrophie nachweisen, obwohl deren knockout Tiere eine
signifikante Hypertonie entwickelten. Die Autoren begründeten ihre Ergebnisse mit
geringeren Blutdruckwerten ihrer Versuchstiere im Vergleich zu Brenners BK β1
knockout Tieren. Blutdruckmessungen wurden an unseren Tieren nicht durchgeführt.
Um den kardialen Phänotyp noch genauer zu beurteilen, wurden neben relativen
Herzgewichten und Wandstärken der linken Ventrikel die Wandstärken und die WallLumen-Ratio von intramyokardialen Arterien gemessen. Auch hier zeigten sich aber
keine signifikanten Unterschiede. Da der Genotyp unserer Versuchstiere dem der Tiere
entspricht, die Plüger et al. [26] untersuchten, nehmen wir an, dass der Blutdruck in
unseren knockout Gruppen ebenfalls signifikant erhöht war. Unklar bleibt die
Werteentwicklung der älteren knockout Tiere, bei denen keine signifikante Veränderung
des kardialen Phänotyps nachzuweisen war. Unsere Ergebnissen sprechen aber
zumindest gegen eine bereits früh bestehende, signifikante Veränderung des kardialen
Phänotyps und damit gegen unsere anfangs formulierte Hypothese.
6.1.1.2 Vaskulärer Phänotyp
Die Wandstärken der Aorta der jungen männlichen Tiere unterschieden sich kaum,
sowohl alte männliche als auch alte weibliche knockout Tiere hatten jeweils dickere
Wandstärken als die zugehörige Kontrollgruppe, die Werte der alten weiblichen
knockout Tiere waren sogar signifikant höher. Diese Zunahme der Aortenwandstärken
bei älteren knockout Tieren beiden Geschlechts deuten auf eine zeitabhängige vaskuläre
Veränderung der knockout Tiere hin, die sich sowohl mit der von Plüger et al.[26]
gefundenen erhöhten Kontraktilität thorakaler Aortenringe bei BK β1 knockout Tieren
als auch mit der milden Hypertonie dieser Tiere erklären ließe. Der nicht signifikante
Unterschied bei den alten männlichen knockout Tieren könnte mit dem geringeren
mittleren Alter im Vergleich zu den alten weiblichen Tieren begründet werden.
6.1.1.3 Renaler Phänotyp
Die Schädigungsindices GSI, TSI und VSI ergaben bei allen älteren knockout Tieren
jeweils höhere Werte als bei den zugehörigen wildtyp Tieren. Niedrigere VSI Werte der
41
jungen knockout Tiere bei gleichzeitig jeweils höheren VSI Werten der älteren
knockout Tiere wären ebenfalls mit einer zeitabhängigen renovaskulären Schädigung
vereinbar, die wir so auch bei den Aortenwandstärken beschreiben konnten; die
Unterschiede sind hier jedoch statistisch nicht signifikant. Eine zeitabhängige
renovaskuläre Schädigung spräche auch gegen die Ergebnisse von Magnusson et al.
[19], die dem BK Kanal keine wichtige Rolle bei der Steuerung des renalen Vasotonus
zuschreiben. Sie könnte aber mit der sich entwickelnden Hypertonie dieser Tiere in
Verbindung gebracht werden.
Signifikant höhere TSI Werte der jungen knockout Tiere und tendentiell höhere Werte
der alten männlichen knockout Tiere sowie nicht signifikant höhere TSI Werte der alten
weiblichen knockout Tiere könnten als (bereits früh beginnende) tubuläre Veränderung
gedeutet werden. Es stellt sich jedoch die Frage, warum sich die Signifikanz der
Veränderung bei den jungen nicht bei den älteren Tiere fortsetzt. Zu bedenken ist, dass
die Werte der erhobenen Schädigungsindices alle unter 1,0 lagen. Bei theoretisch
möglichen Werten von 0 bis 4 für GSI und VSI und 0-3 für TSI spricht dies allein schon
für sehr geringe Unterschiede und stellt die meist nicht signifikanten Veränderungen
damit bezüglich deren Aussagekraft zumindest teilweise in Fage.
Auffällig ist die Werteentwicklung der älteren Tiere für die absolute Anzahl der
Glomeruli einer Niere (NGlom) und das mittlere glomeruläre Volumen (VGlom). Diese
Werte waren bei den jungen männlichen knockout Tieren höher, bei den alten Tieren
beiden Geschlechts aber jeweils in der knockout Gruppe niedriger. Die geringere
Anzahl der Glomeruli pro Niere bei den alten knockout Tieren könnte als zeitabhängige
Schädigung zu werten sein. Gleichzeitig war aber das mittlere glomeruläre Volmen
VGlom jeweils bei den alten knockout Tieren erniedrigt. Dies entspricht nicht der
Erwartung einer sich entwickelnden glomerulären Schädigung, bei der VGlom höhere
Werte ergeben müsste.
Die absoluten Werte für GSI, Volumenfraktionen der Nierenrinde (VVR) und das
mittlere Nierengewicht waren bei allen knockout Tieren jeweils höher, die Anzahl der
Glomeruli pro Volumen (Nv) jeweils niedriger als bei den wildtyp Tieren. Diese Zahlen
belegen bei fehlender Signfikanz nur sehr geringe Veränderungen des renalen
Phänotyps,
sprechen
aber
zumindest
gegen
eine
signifikante
frühe
und
geschlechtsabhängige Veränderung des renalen Phänotyps.
Die Werte für das Gesamtvolumen Niere (VN) und das absolute Volumen der
Nierenrinde (VR) zeigten bei den alten Tieren eine unterschiedliche Entwicklung. Bei
42
den alten männlichen knockout Tieren waren die absoluten Zahlen erniedrigt, bei den
alten weiblichen knockout Tieren erhöht (jeweils im Vergleich zu den wildtyp
Gruppen). Da die Werteentwicklung bei den männlichen Tieren nicht mit einem
höheren mittleren Alter der männlichen Tiere erklärt werden kann, könnte man dies –
bei fehlender Signifikanz - als mögliche geschlechtsabhängige Veränderung des renalen
Phänotyps deuten, (vergleiche dazu auch Punkt 6.1.2.3 und 6.1.3.2).
6.1.2 Junge vs. alte Tiere
Um die Entwicklung der Tiere im Zeitverlauf genauer beurteilen zu können, verglichen
wir
(i) junge männliche knockout Tiere mit alten männlichen knockout Tieren,und
(ii) junge männliche wildtyp Tiere mit alten männlichen wildtyp Tieren.
6.1.2.1 Kardialer Phänotyp
Die Wanddicke der intramyokardialen Arterien war bei den älteren wildtyp Tieren
signifikant größer, woraus man eine rein zeitabhängige Veränderung des kardialen
Phänotyps bei den männlichen wildtyp Tieren ableiten könnte. Dies passt nicht zu den
Ergebnissen der Abeitsgruppe um Brenner [4,31,14], die zeigen konnte, dass keine
Korrelation zwischen zunehmenden Alter und den relativen Herzgewichten von
gesunden Tieren besteht. Die Werte der knockout Tiere zeigten hier keinen
signifikanten Unterschied, bei einem rein zeitäbhängigen Faktor wären auch hier
signifikante Unterschiede zu erwarten.
Im Vergleich der knockout Tiere fallen ein höheres relatives Herzgewicht, sowie höhere
Werte bei den Wandstärken der rechten Ventrikel bei den älteren Tieren auf - was die
These der zeitabhängigen Veränderungen unterstreichen würde. Allerdings waren die
Wandstärken der linken Ventrikel und die der Herzsepten bei den alten Tieren niedriger.
Dies spricht gegen die These einer im Zeitverlauf zunehmenden, späten Veränderung
des kardialen Phänotyps, zu bedenken ist aber die fehlende Signifikanz all dieser
Unterschiede.
Abgesehen von den Wandstärken der rechten Ventrikel und der Herzsepten waren alle
erhobenen Parameter in knockout und wildtyp Gruppen gleich gerichtet verändert. So
43
zeigten sich zum Beispiel sowohl in der knockout als auch der wildtyp Gruppe jeweils
höhere Werte der relativen Herzgewichte bei den älteren Tieren.
Eine zeitabhängige Veränderung des kardialen Phänotyps in beiden Gruppen kann
weder durch signifikante Unterschiede belegt, noch ausgeschlossen werden. In der
Summe sprechen unsere Ergebnisse aber zumindest gegen einen deutlichen Einfluss des
Genotyps auf zeitabhängige Veränderungen des kardialen Phänotyps männlicher Tiere.
6.1.2.2 Vaskulärer Phänotyp
Die Werte der Aortenwandstärken weisen auch bei diesem Vergleich auf eine
zeitabhängige Schädigung/Veränderung hin, da sowohl alte knockout als auch alte
wildtyp Tiere jeweils höhere Aortenwandstärken aufwiesen verglichen mit jungen
männlichen Tieren gleichen Genotyps. Signifikant unterschieden sich jedoch nur die
knockout Tiere voneinander. Dies unterstreicht die unter 6.1.1.2 genannte These, dass
zeitabhängige vaskuläre Veränderung bei BK β1 knockout Tieren stattfinden. Dies
spricht eher gegen eine bereits früh embryonal bestehende vaskuläre Schädigung durch
die Gendeletion. Zukünftige Arbeiten könnten die Ätiologie der Wandstärkenzunahme
klären. In diesem Zusammenhang kommen die von Plüger et al.[26] gefundene erhöhte
Kontraktilität thorakaler Aortenringe und die sich entwickelnde Hypertonie dieser Tiere
in Frage.
6.1.2.3 Renaler Phänotyp
Die relativen mittleren Nierengewichte der alten knockout Tiere waren höher, die der
alten wildtyp Tiere niedriger, bei der Anzahl der Glomeruli einer Niere (NGlom) und dem
GSI Wert verhielt es sich genau umgekehrt. Abgesehen von diesen drei Parametern war
die Werteentwicklung aber sowohl in wildtyp als auch knockout Gruppe gleich.
Bei höheren Werten der älteren knockout als auch wildtyp Tiere kann eine rein
zeitabhängige,
genotypunabhängige
Veränderung
nicht
ausgeschlossen
weden,
beziehungsweise anders ausgedrückt, keine Veränderung beschrieben werden, die
eindeuig durch Gendeletion erklärbar ist.
Diese Aussage gilt für VSI, TSI, das Gesamtvolumen Niere (VN), das absolute
Volumen der Nierenrinde (VR) und das mittlere glomeruläre Volumen (VGlom).
44
Die höheren VSI Werte der älteren knockout als auch wildtyp Tiere deuten - wie für die
knockout Tiere bereits in 6.1.1.3 beschrieben – ebenfalls auf eine zeitabhängige
Veränderung hin.
Das Gesamtvolumen der Niere (VN) und das absolutes Volumen der Nierenrinde (VR )
zeigten beim Vergleich wildtyp vs. knockout (siehe 6.1.1.3) eine geschlechtsabhängige
Werteentwicklung mit höheren Werten bei den weiblichen, niedrigeren bei den
männlichen Tieren. Hier vergleichen wir nur männliche Tiere gleichen Genotyps, aber
unterschiedlichen Alters. Nach den Ergebnissen unter 6.1.1.3 wären niedrigere Werte
zumindest der älteren knockout Tiere zu erwarten. Tatsächlich fanden wir aber höhere
Werte in dieser Gruppe. Ganz unerwartet fanden wir sogar signifikant höhere Werte für
VN und VR bei den alten wildtyp Tieren.
Damit lässt sich der in 6.1.1.3. vermutete geschlechtsabhängige Unterschied der
knockout Tiere nicht bestärken, wir müssen uns vielmehr fragen, wie die signifikant
höheren Werten der alten wildtyp Tiere im Vergleich zu den jungen wildtyp Tieren zu
erklären sein könnten. Leider fehlt uns hier ein Vergleich von jungen weiblichen Tieren
mit alten weiblichen Tieren.
Das mittlere glomeruläre Volumen (VGlom) ist bei den älteren Tieren in absoluten Zahlen
erhöht, was im Vergleich wildtyp vs knockout - wie in 6.1.1.3.beschrieben - für die
alten knockout Tiere nicht der Fall war und so nicht in das Bild einer sich
entwickelnden Nierenschädigung passt.
Bei niedrigeren Werten der älteren knockout als auch wildtyp Tiere kann eine rein
zeitabhängige, genotypunabhängige Veränderung ebenfalls nicht ausgeschlossen weden.
Diese Aussage gilt für die Glomeruli pro Volumen, die alten knockout Tiere zeigten
hier allerdings signifikant niedrigere Werte, was bei nicht signifikant niedrigeren
Werten der alten wildtyp Tiere dann eben doch für eine Genotyp- und zeitabhängige
renale Schädigung sprechen könnte.
6.1.3 Alte Tiere gleichen Genotyps männlich vs. weiblich
Um die Entwicklung der Tiere im Zeitverlauf abhängig vom Geschlecht beurteilen zu
können, verglichen wir
(i) alte männliche knockout Tiere mit alten weiblichen knockout Tieren, und
(ii) alte männliche wildtyp Tiere mit alten weiblichen wildtyp Tieren.
45
6.1.3.1 Kardiovaskulärer Phänotyp
Es fanden sich bei den männlichen Tieren für alle erhobenen kardiovaskulären
Parameter jeweils höhere absolute Werte im Vergleich zu den weiblichen Tieren, alle
Veränderungen zeigten keine Signifikanz und waren für knockout und wildtyp Tiere
jeweils gleich gerichtet verändert.
Hier können wir eine stärkere Schädigung der alten männlichen Tiere beiden Genotyps
beschreiben, bei fehlender Signifikanz ist eine Interpretation allerdings schwierig.
Gerade beim vaskulären Phänotyp waren die alten weiblichen knockout Tiere die
signifikant stärker geschädigte Gruppe (6.1.1.2). Ein Vergleich von jungen männlichen
knockout Tieren mit alten weiblichen knockout Tieren zeigte ebenfalls signifikant
höhere Aortenwandstärken bei den alten weiblichen Tieren.
Zur
Klärung
des
Geschlechtseinflusses
wäre
es
sinnvoll,
in
zukünftigen
Untersuchungen junge weibliche Tiere einzubeziehen und diese mit alten weiblichen
Tieren zu vergleichen, wie wir das für männliche Tiere unter 6.1.2 getan haben.
6.1.3.2. Renaler Phänotyp
Bei diesem Vergleich zeigten alle Werte ausser den Nierengewichten und VSI bei den
alten Weibchen in wildtyp und knockout Gruppen gleichartige Werteentwicklungen.
Auffällig sind hier die signifikant höheren Glomeruli pro Volumen (Nv) Werte alter
weiblicher wildtyp und knockout Tiere.
Die Anzahl der Glomeruli pro Volumen (Nv) war bei den weiblichen Tieren signifikant
größer, was für einen stärkere zeitabhängige Schädigung der männlichen Tiere spricht,
zumal eine höhere Anzahl der Glomeruli einer Niere (NGlom) und ein niedrigeres
mittleres glomeruläres Volumen (VGlom) der weiblichen Tiere - wenn auch nicht
signifikant - ebenfalls in diese Richtung deuten.
TSI ist bei den weiblichen Tieren kleiner, was für eine zeitabhängige stärkere
Schädigung der männlichen Tiere spricht, dies passt auch zu den Ergebnissen beim
Vergleich jung vs. alt. Der GSI ist bei den weiblichen Tieren jeweils größer, was für
eine zeitabhängige stärkere Schädigung der weiblichen Tiere sprechen könnte. Offenbar
ergibt sich bezüglich der renalen Schädigungsparameter der alten Tiere im
Geschlechtsvergleich kein klares Muster.
46
6.1.4 Schlussfolgerungen kardiovaskulärer Phänotyp
Nach den Ausführungen von Brenner et al. [4] und Sausbier et al. [30] hätten wir bei
deutlich älteren Tieren in unserem Versuchsaufbau eine signifikante Veränderung des
kardialen Phänotyps im Sinne einer Herzhypertrophie erwartet. Unklar bleibt, warum
wir
keine
signifikanten
Veränderung
der
relativen
Herzgewichte
und
der
linksventrikulären Wandstärken nachweisen konnten. Eindeutig genotypabhängige
Veränderungen des kardialen Phänotyps im Zeitverlauf konnten wir nicht nachweisen.
Bei unserem Vergleich junge vs. alte Tiere fanden wir lediglich unerwartet signifikant
höhere Wandstärken der intramyokardialen Arterien bei älteren männlichen wildtyp
Tieren, nicht jedoch bei den knockout Tieren.
Der vaskuläre Phänotyp zeigt – wie erwartet - signifikante zeitabhängige
Veränderungen bei den alten weiblichen knockout Tieren. Dies unterstreicht die
Beobachtungen von Plüger et al. [26], die bereits eine gesteigerte Kontraktilität von
Aortenpräparaten nachweisen konnten. Im Zeitverlauf zeigten auch alte männliche
knockout Tiere signifikant höhere Werte als junge knockout Tiere. Wie es scheint, sind
die Aorten (im Vergleich zu den kardialen Parametern) entweder vulnerabler, bezogen
auf die Auswirkungen einer sich entwickelnden Hypertonie, oder aber durch die
Gendeletion per se im Zeitverlauf stärker betroffen. Einen sicheren Einfluss des
Geschlechts auf den vaskulären Phänotyp können wir mit unseren Ergebnissen nicht
belegen.
6.1.5 Schlussfolgerungen renaler Phänotyp
Im direkten Vergleich knockout vs. wildtyp konnten wir nur signifikant erhöhte TSI
Werte der jungen männlichen knockout Tiere beobachten. Diese Entwicklung war bei
den alten Tieren beiden Geschlechts aber schon nicht mehr signifikant verändert und
kann so nur schwer als bereits früh bestehende tubuläre Schädigung gedeutet werden.
Alle anderen renalen Parameter waren nicht signifikant verändert und zeigten zudem
auch widersprüchliche Tendenzen, so dass auch eine späte Veränderung des renalen
Phänotyps nicht sicher beschrieben werden kann. Die Werteentwicklung für VSI könnte
in Richtung zeitabhängige renovaskuläre Schädigung bei knockout Tieren gedeutet
werden, die für das Gesamtvolumen Niere (VN) und das absolute Volumen der
Nierenrinde (VR) deutet auf eine geschlechtsabhängige Veränderung hin. Insgesamt
47
sprechen die Ergebnisse aber gegen bereits frühe Veränderungen des renalen Phänotyps
und damit auch hier gegen unsere anfangs formulierte Hypothese.
Bis auf wenige Parameter zeigen sowohl wildtyp als auch knockout Tiere im Vergleich
junge vs. alte Tiere gleichgerichtete Werteentwicklungen. Auffällig sind signifikant
höhere Werte bei den alten wildtyp Tieren für das Gesamtvolumen Niere (VN) und das
absolute Volumen der Nierenrinde (VR). Leider haben wir den Vergleich alt vs. jung nur
für männliche Tiere erhoben und keine Blutdruckmessungen durchgeführt, trotzdem
sprechen unsere Beobachtungen gegen einen deutlichen Einfluss der Gendeletion auf
den renalen Phänotyp und für eine eher zeitabhängige Veränderung unabhängig vom
Genotyp. Lediglich für die Anzahl der Glomeruli pro Volumen (Nv) passt die sinifikante
Werteentwicklung zum Bild einer genotyp- und zeitabhängigen renalen Schädigung
männlicher Tiere. Gegen die Genabhängigkeit und für die Geschlechts- und
zeitabhängige Veränderung spricht, dass die Anzahl der Glomeruli pro Volumen (N v)
schliesslich beim Vergleich alter männlicher vs. alter weiblicher Tiere bei den
weiblichen Tieren beiden Genotyps signifikant größer war. Dies spricht für eine stärkere
rein zeitabhängige Schädigung der männlichen Tiere, zumal eine höhere Anzahl der
Glomeruli einer Niere (NGlom) und ein niedrigeres mittleres glomeruläres Volumen
(VGlom) der weiblichen Tiere - wenn auch nicht signifikant verändert - ebenfalls in diese
Richtung deuten. Die teils signifikante Werteentwicklung der Anzahl der Glomeruli pro
Volumen (Nv) ist also nicht eindeutig, wir können zum einen eine späte Schädigung
männlicher
knockout
Tiere
beschreiben,
zum
anderen
aber
eine
späte
geschlechtsabhängige stärkere Schädigung männlicher Tiere beiden Genotyps belegen,
die den Einfluss der Gendeletion wieder in Frage stellt.
6.2 Zusammenfassung
Zusammenfassend sprechen unsere Ergebnisse gegen eine bereits früh bestehende,
signifikante Veränderung des kardiovaskulären und renalen Phänotyps bei BK β1
knockout Tieren und damit gegen unsere anfangs formulierte Hypothese einer frühen
embryonalen Schädigung der kardiovaskulären und renalen Systeme durch Gendeletion.
Inwieweit geschlechtsabhängige Veränderungen des Phänotyps stattfinden, sollte durch
Einbeziehen weiblicher Tiere unterschiedlichen Alters und Genotyps in folgenden
Arbeiten genauer geprüft werden.
48
7 Literatur
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using sections--an historical perspective with special reference to the stereology
of glomeruli. J Microsc 153:93-102.
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in 558 adopted children. Can Med Assoc J 115: 773–774.
3. Brayden JE, Nelson MT (1992) Regulation of arterial tone by activation of
calcium-dependent potassium channels. Science 256:532-535.
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calcium-activated potassium channel. Nature 407:870–876.
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8 Abkürzungsverzeichnis
AA
Flächenanteil
AR
Nierenrindenfläche
Ca2 +
Kalziumion
DNS
Desoxyribonukleinsäure
GSI
Glomeruloskleroseindex
HG
Herzgewicht
IMA
Intramyokardiale Arterien
KG
Körpergewicht
ko
knockout
LV
linker Ventrikel
mNG
mittleres Nierengewicht
NG
Nierengewicht
NO
Stickstoffmonoxid
NA
Anzahl der Glomeruli pro Fläche Nierenrinde
NGlom
Anzahl der Glomeruli einer Niere
Nv
Anzahl der Glomeruli pro Volumen
n.s.
nicht signifikant
p
Irrtumswahrscheinlichkeit
PP
Anzahl der gezählten Punkte
PAS
Periocid-Acid-Schiff-Reaktion
PBS
Phosphate-Buffered Saline
relHG
relatives Herzgewicht
rmNG
relatives mittleres Nierengewicht
RyR
Ryanodin Rezeptor
RV
rechter Ventrikel
S
Septum (Herzseptum)
sign.
signifikant
SR
Sarkoplasmatischen Retikulum
STOCS
spontaneous transient outward K+ currents
TSI
Tubulointerstitieller Index
VDCC
voltage dependant calcium channel, spannungsabhängiger
Kalziumkanal
54
VSI
Vaskulärer Index
VSMC
vascular smooth muscle, glatte Gefäßmuskulatur
VGlom
Mittleres glomeruläres Volumen
VN
Gesamtvolumen der Niere
VNGlom
Gesamtvolumen der Glomeruli einer Niere
VR
Absolutes Nierenrindenvolumen
VV
Volumenanteil
VVGlom
Volumendichte der Glomeruli in der Nierenrinde
VVM
Volumenfraktion Nierenmark
VVR
Volumenfraktion Nierenrinde
WD
Wanddicke
WLR
Wand-Lumen-Ratio
wt
wildtyp
55
9 Danksagung
Mein Dank gilt Herrn Professor Dr. med. Arndt Hartmann, Direktor des Pathologischen
Institutes für die Überlassung des Themas der Arbeit und die Möglichkeit, diese in
seiner Abteilung durchführen zu dürfen.
Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei meiner persönlichen Betreuerin, Frau
Professor Dr. med. Kestin Amann, die mich mit beispielloser Geduld, motivierender
Energie und hervorragenden Sachverstand schließlich doch zum Abschluss dieser
Arbeit geführt hat.
Großer Dank gilt meinem Komilliton und Freund Herrn Sergej Kronewald sowie den
medizinisch-technischen Laborassistentinnen und Assistenten, allen voran Frau Monika
Klewer und Herrn Stefan Söllner, für ihren unermüdlichen Beistand bei den
Laborarbeiten.
Mein inniger Dank gilt meiner lieben Frau Stephanie für ihre emotionale Unterstützung
und dauerhafte verständnisvolle Motivation.
Diese Arbeit möchte ich meiner Mutter Karin und meinem Vater Karl widmen, ohne
deren Liebe, Fürsorge und Weitsicht meine akademische Laufbahn nicht möglich
gewesen wäre.
56
10 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Nußelt
Vorname:
Matthias
Geburtsdatum und -ort:
09.01.1977 Dinkelsbühl
Konfession:
evangelisch
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Familienstand:
verheiratet
Schulbildung
1983 – 1987
Grundschule Dinkelsbühl
1978 – 1988
Hauptschule Dinkelsbühl
1988 – 1997
Gymnasium Dinkelsbühl
1997
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Zivildienst
07/1997 – 07/1998
Kreiskrankenhaus Feuchtwangen
Hochschulbildung
1999 – 2005
Studium der Humanmedizin an der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg
2001
Ärztliche Vorprüfung
2002
Erster Abschnnitt der Ärztlichen Prüfung
2004
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2005
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
29.04.2005
Approbation als Arzt
Berufliche Weiterbildung
Seit Juli 2005 Facharztweiterbildung Anästhesiologie am Klinikum Fürth.