DÜRR Matile, Leisinger - ETH E
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Research Collection Doctoral Thesis Untersuchungen an Hefevakuolen Author(s): Dürr, Mathias Publication Date: 1977 Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000108939 Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library Diss. ETH Nr. 5988 UNTERSUCHUNGEN AN HEFEVAKUOLEN ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels eines Doktors der Naturwissenschaften der EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH vorgelegt von DÜRR MATHIAS Diplomierter Naturwissenschafter geboren von am. 8. Mai 1947 Oberschan-Wartau Kanton St.Gallen Angenommen auf Antrag Prof. Prof. Dr. Dr. Th. Ph. Matile, Leisinger, 1977 von Referent Korreferent 83 ZUSAMMENFASSUNG UNTERSUCHUNGEN I. AN HEFEVAKUOLEN POLYBASEN-INDUZIERTE LYSE VON PROTOPLASTEN UND REINIGUNG DER FREIGESETZTEN VAKUOLEN wurde Es eine Methode entwickelt, lieren. Die Methode erlaubt, ist bei gewissen Kulturbediingungen die Vakuolen um Hefeprotoplasten aus Protoplasten vollständig Zellen ein der Die Methode beruht auf entscheidender Vorteil, (polykationischen Makromolekülen) basen das an Plasmalemma plasten. Anschliessend lysieren die Protoplasten. anhand dabei der das 0 C lysieren. Die Es C Ausbeute bewirken schon an niedrige welche Polybasen Dosen, die normalerweise Mit DEAE-Dextran - 6.0 optimal. duktion der Lyse 70'000 Dalton, die 30 Die Grösse zu die Protoplasten um gering. Oberhalb vollständige Lyse % 100 - der - Protoplasten. der Die isolieren. Vakuolen 11 von zu tempera¬ Protoplasten erlaubt zeitlich die Adsorption der bei die Dosen Protoplasten bei o C und sein: 0 nicht C durchgeführt wurde, lysierten Protoplasten wichtig nötig, intakten Vakuolen blieb liessen sich anschliessend 70 Lyse, 5.8 wurde Leitsubstanz für Vakuolen diente relativ hohe Polybasen-Dosen waren turabhängige Empfindlichkeit von Lyse lösliche, gespeicherte Arginin. Bei 12 als der die ausschliesslich im freigesetzten a-Glucosidase Aktivität, Cytoplasma lokalisiert ist, abgeschätzt; Poly- von intakten Proto¬ von Ausmass Das um können. zu vollständigen Adsorption raschen und der lysieren. Dies zu überhaupt Protoplasten-freie Vakuolenfraktionen isolieren iso¬ zu Struktur Bei lineares Makromolekül) von der Candida hat geringeren der von trennen. utilis zwischen pH Polybasen scheint gleicher Dosis einen zu lysieren, für die In¬ Poly-DL-Lysin (MG= Effekt als 30- DEAE-Dextran (MG= 500'000 Dalton, verzweigtes Makromolekül). KCl in hoher, und CaCl in niedriger induzierte Lyse der Protoplasten, sogar rückgängig machten. indem Konzentration hemmten die sie die Polybasen- Adsorption verhinderten Synthetische Polysäuren, wie z.B. oder Dextransulfat, 84 Dadurch verhinderten neutralisierten die Polybasen. nachfolgende Lyse Protoplasten. der (z.B. Nucleinsäuren, wurden Stoffe Auch während gesetzt, welche möglicherweise die Vakuolen II. valin A binden Vakuolen (Con A) nur, von Polybasen schützen. Saccharomyces cerevisiae binden das Lectin falls Protoplasten, Plasmalemmas und der Con A bindet hydraten. wird deshalb angenommen, bestandteile für spezifisch an dass die anderen Endomembranen auf wurde nach der innnern Oberfläche zur Organelle eröffnete, nicht Mannopyranoside Gluco- und (Glycoproteine, Glycolipide) flächen, welche in Con A äussern Oberflächen der vergrössert. Es Bindungsstellen Die Anzahl den Zugang welche von Kohlenhydrat-reichen dem Plasmalemma, dem mit dem Cytoplasma sind, enthalten Kohlen¬ Membran¬ Tonoplasten asymmetrisch angeordnet sind. Diejenigen Kontakt Concana- Tonoplast permeabel gemacht wird. Dagegen der intakte Protoplasten Con A. der Lyse und Protoplasten ASYMMETRIE DES PLASMALEMMAS UND DES TONOPLASTEN Intakte des und Cytoplasma frei¬ dem aus den vor Adsorption der Lyse der Proteine) saure sie die Membran¬ wenig Kohlen¬ hydrate, wogegen die dem Cytoplasma abgewandten Membranflächen reich damit besetzt sind. Einige Eigenschaften Abbau der Membranproteine Protoplasten mit lemmas nur untersucht. war Pronase rasch Nach einer die Aktivität der schwach vermindert. plasten durch Hingegen wurde abgebaut. Der Behandlung von Arginin-Permease die intakten Plasma¬ des Arginin-Permease des Tono¬ abgebaut. Wie mit SDS-Gelel'ektropb.orese gezeigt konnte, wurden die meisten Membranproteine werden nase Pronase isolierten Vakuolen wurden durch proteolytischen der in den Vakuolen des Tonoplasten durch Pro¬ gespeicherte Aminosäure-Pool blieb jedoch erhalten. Es wurden vakuoläre Proteasen aus isolierten Vakuolen angereichert, zu intakten Vakuolen zugegeben und inkubiert. die Proteasen Tonoplasten gelangen können, werden die Argi- von aussen an den nin-Permeasen rasch inaktiviert. reichen Membranoberflächen als einem proteolytischen Abbau Es Unter diesen wurde vermutet, Schutzschild für die wirken. dass Bedingungen, die d.h. Kohlenhydrat¬ Membranproteine vor wenn 85 ABSTRACT STUDIES ON POLYBASE-INDUCED LYSIS OF PROTOPLASTS I. A and new gentle method to is presented. Candida isolate vacuoles 0 At C (Poly-DL-Lysine, DEAE-Dextran) lysing out A VACUOLES YEAST the with treatment 70 % of Dinitrophenol, base-induced At to intact. polybases reduced lysis. KCl, CaCl or all the of II. ASYMMETRY OF THE PLASMALEMMA AND THE T0N0PLAST bound on large their amounts inner the plast that so surface. binding carry inner membrane of Con A is It sites extensive. was left reduced least at prevented or protoplasts at poly- the to such high a rate aeid pool. did not bind Concanavalin A Vacuoles able amino lysis C transported arginine retained high plasmalemma with- the protoplasts, the and a of surface Dextransulfate suseeptibility isolated vacuoles The the macromolecules subsequent lysis. Metabolie inhibitors, and the polybasic of temperatures above 12 polybases which disrupted vacuoles the adsorption the as of protoplasts. small doses adsorbed protoplasts of Saccharomyces from surface the on (Con A) surface exclusively that on both the they of the surface the made were accessible. became outer concluded unless protoplasts Intact plasmalemma plasmalemma opposite and the perme¬ but the not tono- cytoplasmic matrix. Proteases added to rapidly. surface vacuolar obtained from isolated vacuoles of isolated vacuoles. It of is the proposed a and also the degraded saccharide tonoplast protects proteases proteases. that both They the same yeast proteins from plasmalemma from attack by Pronase arginine the vacuolar layer (glycoproteins) the membrane and on attack were permease the by inner the extracellular
