Elektrophysiologie - Max-Planck-Institut für Kognitions
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Methoden der kognitiven Neurowissenschaften Elektrophysiologie Björn Herrmann; Email: [email protected]; Telefon (bevorzugt): 0341 9940 2606 Einführung Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Elektrophysiologie „Elektrophysiologie“ Teilgebiet der Physiologie, das sich mit dem Ionenfluss in biologischem Gewebe befasst und mit den elektrischen Techniken zur Messung desselben. • Klassischerweise werden eine oder mehrere Elektroden in verschiedene Gewebe-Präparationen eingeführt („invasiv“): • lebendes Gewebe, z.B. ins lebende Gehirn • entnommenes Gewebe (akut oder als „Kultur“) • einzelne Zellen des entnommenen Gewebes Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Formen der Aufzeichnung elektrischer Hirnaktivität EEG – Elektroenzephalographie ECoG – Elektrokortikographie Quelle: Humphrey 1990 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Warum einzelne Zellen ableiten und Wie? • Nur hier ist es möglich, Aussagen über die Funktionscharakteristika individueller Zellen zu machen. • Elektrische Aktivität im Gehirn ist auf Veränderungen inner- und außerhalb der Zellen zurückzuführen • Intrazelluläre Ableitungen sind zwar der sicherste Weg von nur einem Neuron abzuleiten, es besteht allerdings die Gefahr die Zelle zu beschädigen. • Dünne Elektroden werden in der Nähe der Zellmembran platziert (extrazellulär), um elektrische Veränderungen der Zelle zu messen. Die Elektrode zeichnet in diesem Fall Aktivität mehrere Neurone auf (Rückrechnung auf Einzelaktivität mit Hilfe geeigneter Software) Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Grundrisse der Zellphysiologie Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Nervenzellen Präsynaptischer Teil Postsynaptischer Teil Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Größenverhältnisse • Durchmesser Zelle: ~50-100 μm • Durchmesser Axon: 1-3 μm • Durchmesser menschliches Haar (~50-80 μm): Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Zellmembran (Konvention: Vout = 0) • Doppelschichtige Zellmembran aus Fett-Molekülen (Lipiden): • „Wasserlösliche Ionen, Proteine und andere Moleküle, die in der intra- und extrazellulären Flüssigkeit gelöst sind, können diese Barriere nicht passieren“ • Austausch zwischen intra- und extrazellulären Stoffen durch spezifische Strukturen in der Zellmembran (Ionen-Kanäle und „Pumpen“). Vout = 0 Vin = –70 mV Membranpotential Vm = Vin – Vout Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Dendriten Zellkörper Myelin Scheide Axon Elektrophysiologie ! Zellmembran: Ionen • Ionen sind elektrisch geladene Atome: • Natrium (Na+) • Kalium (K+) • Chlorid (Cl-) • Organische Anionen (A-) • Positiv geladene Ionen: Kationen • Negativ geladene Ionen: Anionen • Außerhalb der Zelle: Höhere Konzentration von Na+ und Cl• Innerhalb der Zelle: Höhere Konzentration von K+ und A- Ionen • Man unterscheidet passive Ionenkanäle und aktive Ionenkanäle (Pumpen) • Ionenkanäle sind in der Regel Ionen-spezifisch Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Relevanz von Ionenkanälen bei Signalübertragung • Ionenkanäle haben drei wichtige Eigenschaften: • Ionen-Weiterleitung • Erkennung und Selektion von spezifischen Ionen • Öffnung und Schließung auf spezifische elektrische, mechanische oder chemische Signale • Kanäle ermöglichen rapiden Austausch von Ionen durch die Zellmembran • Dies verursacht rapide Veränderung im Membranpotential Basis der elektrischen Aktivität Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Membranpotential in Ruhe • Zelle in Ruhe unterhält eine elektrische Potentialdifferenz innerhalb vs. außerhalb der Zelle • Diese Differenz in Abhängigkeit von der Zelle zwischen 40–90 mV • Extrazellular willkürlich als „Null“ definiert daher Ruhepotential = –65 mV • Reduktion des Membranpotentials (z.B. von –65 mV zu –55 mV) • = Depolarisation erhöhte Wahrscheinlichkeit für ein Aktionspotential daher als „erregend“ bezeichnet • Vergrößerung des Membranpotentials (z.B. von –65 mV zu –75 mV) • = Hyperpolarisation verringerte Wahrscheinlichkeit für ein Aktionspotential daher als „hemmend“ bezeichnet Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Ionenwanderung am Beispiel der Gliazelle • Ionenkanäle nur für K+ durchlässig • Weil höhere Konzentration an K+ innerhalb der Zelle • K+ diffundiert nach außen chemische-bedingte Wanderung • Dadurch positivere Ladung außerhalb, negativere innerhalb • Lokale Ansammlung an der Membranoberfläche (+ und – ziehen sich an) • K+ Ionen nach innen getrieben elektrisch-bedingte Wanderung Wenn K+ und K+ ausbalanciert Equilibrium (EK) = –75 mV Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Ionenwanderung beim Neuron • Viele Ionenkanäle für K+ durchlässig • Weniger Na+ Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Na+–K+ Pumpe (aktiv) • Moleküle, die Adenosintriphosphat spalten (ATP) und die daraus gewonnene Energie dazu verwenden 3 NA+ aus der Zelle heraus und 2 K+ in die Zelle hineinzupumpen. • Höhere Na+ Konzentration im extrazellulären Raum • Höhere K+ Konzentration im intrazellulären Raum • die NA+–K+ Pumpe erreicht ein Gleichgewicht der Ionenkonzentrationen und –flüsse über die Zellmembran. K+ Wanderung nach außen und Na+ Wanderung nach innen ausgeglichen Ruhepotential (VR) ~ –65 mV Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Neurone als Signalübertäger • Morphologisch definierte Regionen: • Dendriten – Hauptsächlich Signalempfang • Zellkörper (Soma) • Axon hillock (oder initial segment) – Initiierung vom Aktionspotential • Axon – Hauptsächlich Signalweiterleitung • Präsynaptisches Terminal Neurone sind getrennt durch synaptischen Spalt Hillock – Niedrigste Schwelle, weil hier höchste Dichte von Na+ sensitiven Kanälen Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Signalübertragung über vier funktionale Regionen • Signalübertragung (im Regelfall) ist unidirektional: • Von den empfangenden Regionen (meist Dendriten oder Zellkörper) • Zur Trigger-Region am Axon • Weiterleitung des Aktionspotentials entlang des Axons zum synaptischen Terminal Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Aktionspotential (Spike) • Aktionspotentiale sind vom Ruhepotential ausgehende Änderungen des Membranpotentials bis zu positiven Werten um 30 mV • Nach Auslösung laufen sie mit einem konstanten Zeitverlauf ab • Bilden sich selbsttätig zum Ruhepotential zurück • Depolarisation und Repolarisation der Nervenzellen • Ausgelöst durch Depolarisierung über eine Schwelle Öffnung von Na+ Kanälen rapider Einfluss von Na+ , der K+ Ausfluss übersteigt Steigerung der Depolarisierung Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Aktionspotential (Spike) • Die Amplitude eines AP hängt dabei nicht vom Ausmaß der Depolarisation ab (Alles-oder-Nichts Prinzip), einmal ausgelöst kann es nicht mehr aufgehalten werden • Das AP ist immer gleich stark die Frequenz/Häufigkeit nimmt zu bei stärkerem Reiz • Entscheidend für die Auslösung eines Aktionspotential: • Inhibitorische und exzitatorische Signale am Axonhügel in ihrer Gesamtbilanz (EPSP, IPSP) • AP wird durch die Summe der erregenden Signale ausgelöst (diese Summe muss grösser sein als die Summe der hemmenden Signale) Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Vom synaptischen Potential zum Aktionspotential Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Aktionspotential: Integration • Integration – Zeitliche Summation: • Signale, die in rascher Folge an derselben Synapse erzeugt werden, summieren sich. • Zwei (oder mehr) rasch aufeinanderfolgende Signale können ein Aktionspotential auslösen, auch wenn sie einzeln zu schwach wären, um das Neuron zum feuern zu bringen. • Integration – Räumliche Summation: • Zwei gleichzeitige synaptische Potentiale addieren sich • A = 1, B = 1, A + B = 2 stärkere Depolarisation • A = -1, B = -1, A + B = -2 stärkere Hyperpolarisation • A = 1, B = -1, A + B = 0 gegenseitige Auslöschung Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Aktionspotential: Refraktärzeit • Absolute Refraktärzeit: 1-2 ms nach Beginn eines Aktionspotentials ist es nicht möglich ein weiteres Aktionspotential auszulösen. • Relative Refraktärzeit: Erregungsschwelle für die Auslösung eines Aktionspotentials ist höher als normal Schwelle Refraktärzeit hauptsächlich durch Restinaktivierung von Na+ Kanälen und verstärkte Öffnung von K+ Kanälen Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Aktionspotential: Fortleitung Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Methoden der Elektrophysiologie Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Ableitung der elektrischen Aktivität Mikroelektroden: • Glaspipetten-Elektroden • Metallmikroelektroden: Aus Wolfram (engl. Tungsten), Stahl, Platin. • Kohlenfaserelektrode: haben keine toxische Wirkung bei Langzeitableitungen. • Mehrkanalelektroden: Bündel verschiedener Kapillaren, erlauben zusätzliche Interventionen wie die Injektion von Transmittern etc. • Büschelelektroden: Breit gestreutes Bündel von Kapillaren um die Aktivität vieler Neuronen abzuleiten. • Unterschiedliche Elektroden messen nicht exakt das gleiche • Größe der Elektroden hat einen Einfluss auf die Sensitivität der Ableitung, aber auch der Lokalisationsgenauigkeit Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Formen der Einzelzellableitung • in vitro (außerhalb lebender Organismen / künstliche Umgebung): • an Gewebeschnitten (häufig: Hippocampus) • an vereinzelten Zellen (z.B. das Riesenaxon von Tintenfischen) • in vivo (im lebendigen Organismus): • am wachen Versuchstier: Implantate (“chronisch”) • am anästhetisierten Versuchstier (“akut” oder “chronisch”) • beim Mensch vor Tumor- oder Epilepsieoperationen • ex vivo (entnommenes lebendes biologisches Material): • Lebendes Gewebe wird entnommen und kann eine begrenzte Zeit kultiviert werden Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Chronisch vs. Akut Akut: Elektroden nicht fest implantiert Vor der Messung wird die Elektrode wird ins Gewebe eingeführt • Kompression des Gewebes muss beachtet werden • Chronische Elektrodenimplantierung • Gut für Aufzeichnungen von sich bewegenden Tieren Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Intrazelluläre Ableitung positiver innerhalb negativer innerhalb Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Intrazelluläre Ableitung • Auch „subthreshold“ Aktivität messbar Quelle: Chorev et al. 2009 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Intrazelluläre Ableitung: Beispiel-Studie • Schwelle fürs Auslösen eines AP ist dynamisch (visueller Kortex, in vivo) AP-Zeitpunkt Elektrische Stimulation Membranpotential (Vm) AP-Schwelle Visuelle Stimulation Variabilität der AP-Schwelle AP-Schwelle Anstieg in Vm innerhalb von 10 ms vor AP Schwelle am niedrigsten, wenn Vm rapide depolarisiert neuronale Synchronität Quelle: Azouz & Gray 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Häufigste Ableitung in vivo – extrazellulär Quelle: Perrodin / Kayser MPI Tübingen Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Extrazelluläre Ableitung Mögliches Problem: Selektive Aufzeichnung bestimmter Zellen • Große Zellen (größeres Aktionspotential) • Sehr aktive Zellen Abstand von der zu beobachteten Zelle sollte < 50 μm sein, da sich kurze Aktionspotentiale (0.5-2 ms) über die Zeit nicht aufsummieren, und deshalb nur lokal beobachtbar sind (im Gegensatz zu LFPs, siehe unten) Quelle: Lewicki 1998 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Patch Clamp • Als erstes von Neher und Sakmann 1976 beschrieben (Nobelpreis 1991) • Mikropipetten wird auf der Zellmembran aufgesetzt und ein leichter Unterdruck erzeugt • Position wird so gewählt, dass es gelingt einen einzelnen Ionenkanal zu isolieren. • Verhalten der Zelle kann so über diesen einen Ionenkanal gemessen werden. Quelle: Kandel et al. 2000 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Stereotaxie / stereotaktischer Atlas Stereotaktische Methode: • Neurochirurgische Operation, bei der die zu operierende Struktur nicht operativ freigelegt wird. Der Eingriffsort wird stattdessen mit geometrischen Methoden berechnet. • Minimalinvasives Verfahren bei denen der Kopf des Patienten und die medizinischen Instrumente in einem fest verschraubten Rahmen fixiert sind, um höchste Genauigkeit zu erreichen. • Heute: oft Echtzeitbildgebung mittels Computertomographie und Kernspintomographie, sowie computergestützte Instrumentenführung. • Bildgesteuerte, computerassistierte Berechnung der Wege und Abstände Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Stereotaktische Methode Quelle: Birbaumer & Schmidt 2003; Perrodin et al. 2011 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Unit-Aktivität Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Single vs. Multi-Unit Aktivität Single-Unit: • Ein einzelnes entladendes Neuron, dessen Spike klar isoliert werden kann Multi-Unit: • Die Gesamtheit der Aktivität einer unbekannten Anzahl von Neuronen in der Nähe der aufzeichnenden Elektrode Quelle: Humphrey & Schmidt 1990; Supér & Roelfsema, 2005 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Local field potential (LFP) Local field potential (LFP): Die vielen tausend synaptischen Inputs zu einem Neuron kommen nicht zeitgleich an Veränderung des Membranpotentials über mehrere Sekunden. Extrazellulärer Ionenfluss stößt auf Widerstand Spannung Quelle: Kandel et al. 2000; Zschocke 2002 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Trennung von Unit-Aktivität und LFP Filterparameter von Lakatos et al. 2007 Unit-Aktivität • Hochfrequente Aktivität: Band-pass Filter 300– 5000 Hz Local field potential: • Niederfrequente Aktivität: 0.1–300 Hz Spike-Schwelle Quelle: Quian Quiroga & Panzeri 2009; z.B. Lakatos et al. 2007 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Dipolstruktur (extra-zell.): Quelle und Senke • Durch Na+ Einfluss an Dendriten • Negativer an Dendriten • Positiver am Soma • Stromfluss von POSITIV (Quelle) zu NEGATIV (Senke) = Dipol Quelle: Birbaumer & Schmidt 2003 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Spike-Sorting Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Spike sorting • Individuale Spikes werden nicht direkt in neurophysiologischen Experimenten aufgezeichnet • Die an einer Elektrode aufgezeichneten extrazellulären Potentiale repräsentieren die simultane elektrische Aktivität einer unbekannten Anzahl von Neuronen • Von diesen Aufzeichnungen muss folgendes identifiziert werden: • Spike-Events oder Aktionspotentiale • Die Anzahl der aufgezeichneten Neurons • und jeder Spike muss dem Neuron zugeordnet werden, welches es produzierte Dreistufiger Prozess „spike sorting“ Quelle: Brown et al., 2004 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Isolierung von Neuronen über Schwelle Quelle: Quian Quiroga & Panzeri 2009 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Isolierung von Neuronen über Schwelle Überlagerung der Aktivität mehrere Neuronen Gut isoliertes Neuron Schwelle Schlecht isoliertes Neuron Schwelle 2 1 Quelle: Lewicki 1998 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Spezielle Elektrodenkonfiguration: Tetroden • Tetrode: Elektrode mit mehreren (hier: vier) electrode tips • Aufgrund der räumlichen Anordnung der tips zu den umliegenden Neuronen bildet sich jedes Neuron leicht anders auf den vier tips ab • erlaubt u.U. die bessere Trennung von Neuronen (spike-sorting) Quelle: Buzsáki 2004 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Modernes Spike Sorting Quelle: Einevoll et al. 2012 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Darstellungsformen Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Spike-Train • Membranpotential über die Zeit Spike rapider Na+ Einfluss Depolarisierung Hyperpolarisierung Quelle: Wallisch et al. 2009 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Peri-stimulus time histogram (PSTH) PSTH Spike rate Stimulusnummer Raster-Plots • Raster-Plot: Spikes in jedem Trial über die Zeit • Peri-stimulus = alle Trials/Zeitepochen werden auf ein bestimmtes Event/Stimulus zentriert • Time histogram = Teile die Zeitepoche in eine Serie von bins (kleinere Zeitabschnitte) und zähle wie viele Spikes in jedes bin fallen Quelle: Wallisch et al. 2009 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Inferior colliculus neuron einer Ratte: Auditive Stimulation (Ton alle 3 s) track13−1460um−rts1−4k−50db No. events 80 40 20 Amplitude (μV) Firing rate (spikes/s) −0.1 Leipzig • Mai 2014 Rasterplot 60 −0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 200 PSTH 100 0 −0.1 −0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 5 0 −5 −10 −0.1 LFP −0.05 0 0.05 Time (sec.) 0.1 0.15 0.2 Elektrophysiologie Frequency response area (FRA) • Unit-Aktivität von Neuronen in auditorischen Kortizes Tonfrequenz × Lautstärke Quelle: Sadagopan & Wang 2010; Wang et al. 2002 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Laminar profiles Laminar profiles Auditorischer Kortex Tone onset Quelle: Kajikawa & Schroeder 2011 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Ethik Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Ethik Bei jedem Tierversuch fordert das Tierschutzgesetz: Es muss immer die sinnesphysiologisch am niedrigsten entwickelte Tierart eingesetzt werden, die erlaubt, die entsprechende Frage zu beantworten … Quelle: http://hirnforschung.kyb.mpg.de/tiere.html Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Ethik (ff.) “Rhesusaffen werden deshalb so oft für Versuche genommen, da sie ein äußerst differenziertes Sozialverhalten aufweisen und viele kognitive Leistungen erbringen, die denen des Menschen sehr ähnlich sind. Außerdem besteht aufgrund ihrer jahrelangen Erforschung ein breit umfassendes Detailwissen über Aufbau und Funktion ihres Gehirns. Für die Versuche am Max-Planck-Institut werden in der Regel erwachsene Affen im Alter zwischen 5 und 15 Jahren eingesetzt. Die meisten Experimente bestehen aus recht komplexen kognitiven Aufgaben. Damit sie die Aufgaben lösen können, müssen die Tiere bereit sein, konzentriert mitzuarbeiten. Dies gelingt nur, wenn sie gesund sind und sich in ihrer Umgebung wohl fühlen.” Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Ethik • Forschung mit Tieren ist durch die Forschungsinstitution und durch staatliche Institutionen stark reglementiert. • Jede Studie muss vorab geprüft und genehmigt werden. • Auch bei Experimenten mit bspw. Mäusen muss die Verwendung jedes Tieres vorab gerechtfertigt werden Wichtiger aber: “Nur Tiere, die richtig gehalten werden, eignen sich für die Forschung. Die richtige Haltung und Pflege von Versuchstieren ist daher nicht einfach nur ein Ausdruck einer humanen Einstellung zivilisierter Leute – sie liegen auch im gesunden Eigeninteresse des Wissenschaftlers. Die Fürsorge für unsere Tiere schützt auch die Zuverlässigkeit unserer wissenschaftlichen Daten. Nur sich wohl fühlende Tiere kooperieren in den Experimenten und erlauben verlässliche Aussagen über den Zusammenhang von Funktion und Struktur des Gehirns.” Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Ethik • Die Entscheidung darüber, ob Experimente am Tier und an welchen Tieren ethisch vertretbar sind, ist eine gesamtgesellschaftliche Entscheidung und keine von einem einzelnen Individuum • Sie folgt also aus staatlichen sowie demokratischen Praktiken und Diskursen; Regeln für Experimente am Tier werden dort bestätigt oder geändert, und können dort eingefordert werden • Einzelne Individuen können sich aber entscheiden, ob Sie als Forscher Experimente am Tier durchführen wollen oder nicht Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Zusammenfassung Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Probleme der Einzelableitungen • Einzelzellableitungen geben wenig Information über die Dynamik in neuronalen Netzwerken. • Geringe Anzahl Zellen versus ca. 100 Milliarden Zellen • Systematische Verzerrung möglich Aufzeichnung der Aktivität großer Zellen (stärkeres AP) und von Zellen, die häufig feuern • Invasive Methode, d.h. am Mensch kaum möglich • Sehr aufwändige Forschung, speziell in komplexen Organismen (Bei Affen häufig die Populationsgröße N = 2) Training sehr aufwändig • wie verallgemeinerbar / replikabel? Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie ! Nutzen von Einzelableitungen • Funktionen von Hirnarealen können sehr genau bestimmt und lokalisiert werden (Tonotopie, Retinotopie etc. ) • Aktionspotentiale messbar, auch „subthreshold“ Aktivität • Sehr hohe räumliche Trennung von Aktivitätsherden (im Vergleich zum EEG / MEG bspw.) • Direktes Verständnis der biologischen Mechanismen • EEG, MEG, fMRI, TMS sind nicht zu verstehen ohne das einzelne Neuron Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie Ende – Elektrophysiologie Video angesehen? Björn Herrmann; Email: [email protected]; Telefon (bevorzugt): 0341 9940 2606 Leipzig • Mai 2014 Elektrophysiologie
