Kurzprogramm AG Stöcker
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FI-Übung Molekulare Zoologie AG Stöcker SS 2005 11. – 22.April Kursprogramm AG Stöcker Reinigung und Analyse von proteolytischen Enzymen aus dem Flusskrebs Der Magensaft des Flusskrebses Astacus leptodactylus enthält eine ganze Serie von proteolytischen Verdauungsenzymen. Am besten untersucht sind die beiden Proteasen Astacin und Astacus Trypsin. Beide Enzyme werden im Hepatopankreas synthetisiert und in den Kaumagen (Cardia) sezerniert, wo sie extrazellulär als aktive Proteasen bis zur nächsten Nahrungsaufnahme gespeichert werden. Astacus Trypsin (Mr 25000) gehört wie das Trypsin der Wirbeltiere zur Klasse der Serinproteasen. Die charakteristischen Reste der katalytischen Triade des Vertebratentrypsins (His57, Asp102 und Ser195) sind auch im Astacus Trypsin konserviert. Während das Rinder-Trypsin jedoch sechs Disulfidbrücken enthält, sind im Astacus Trypsin nur drei enthalten. Insgesamt weisen die Aminosäuresequenzen beider Enzyme eine Identität von ca. 40 % auf. Die Metalloprotease Astacin (Mr 22600) ist der Prototyp der Astacin-Familie und der MetzinkinSuperfamilie, die mit ihren Mitgliedern in Vertebraten, Invertebraten und Bakterien vertreten ist. Das aus 200 AS bestehende Enzym ist eine Kollagen-spaltende Zink-Endopeptidase. Ein Zinkion im aktiven Zentrum des Astacins ist für die katalytische Funktion essentiell. Programm: In diesem Kursteil werden Sie Astacus Trypsin und Astacin aus dem Magensaft von Astacus leptodactylus isolieren. Zur Gewinnung der Proteasen wird Krebsen Magensaft entnommen. In der bräunlich gefärbten Flüssigkeit sind ca. 3 mg/ml Astacus Trypsin und ca. 1 mg/ml Astacin enthalten. Dar Magensaft wird durch Anionenaustausch-Chromatographie und der Affinitäts-Chromatographie aufgetrennt. Das Ergebnis der einzelnen Reinigungsschritte verfolgen Sie über die spezifische Spaltung von Substraten in Aktivitätstests. Die Untersuchung der katalytischen Eigenschaften von Astacus Trypsin und Astacin aus Astacus leptodactylus erfolgt mit Hilfe einer Gelatine-Zymographie, in der Sie die Gelatine-spaltende Aktivität beider Proteasen überprüfen. Sie bestimmen in kinetischen Tests das pH- und TemperaturOptimum der Enzyme. Außerdem führen Sie Inhibitionstests mit verschiedenen spezifischen Hemmstoffen durch.
