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Research Collection Doctoral Thesis Lipoprotein maturation is required for virulence of Mycobacterium tuberculosis and is essential for correct lipoprotein localization Author(s): Rezwan, Mandana Publication Date: 2006 Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-005187265 Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library Diss. ETH No. 16510 Lipoprotein maturation is required for virulence of Mycobacterium tuberculosis and is essential for correct lipoprotein localization A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the degree of DOCTOR OF NATURAL SCIENCES presented by MANDANA REZWAN Dipl. Natw. ETH born August 20th, 1977 citizen of Wolhusen, Switzerland accepted on the recommendation of Prof. Dr. Wolf D. Hardt, examiner Prof. Dr. Annette Oxenius, co-examiner PD Dr. Peter Sander, co-examiner Prof. Dr. Erik C. Böttger, co-examiner Zürich, 2006 Summary Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis. It is one of the most devastating pathogens claiming two million deaths every year. M. tuberculosis belongs to the group of slow-growing mycobacteria with a generation time of approximately 24 hours. Secreted mycobacterial proteins are putative virulence factors. The aim of this study was the investigation of two protein secretion pathways in mycobacteria, i.e. the biosynthesis, transport and localization of lipoproteins and the characterization of the twin-arginine translocation (TAT) system. Mycobacterial lipoproteins are secreted, immunodominant proteins. Common to all lipoproteins is the lipobox, a consensus sequence consisting in four amino acids. Lipoprotein biosynthesis is mediated by the consecutive activity of pre-prolipoprotein diacyl glycerol transferase (Lgt) and prolipoprotein signal peptidase (LspA). Lgt transfers a diacyl glycerol residue on the universally conserved cysteine at the +1 position. LspA cleaves off the Nterminal signal peptide. The gene lspA, encoding the second enzyme in lipoprotein biosynthesis, was inactivated by allelic replacement techniques in M. tuberculosis. A M. tuberculosis lspA::aph mutant showed a severely attenuated phenotype with a 3-4 log reduced number of colony forming units and absence of lung pathology in aerosol infected BALB/c mice. Likewise, a replication reduction of lspA::aph was observed in mouse macrophages. These results suggest that LspA is a major determinant of M. tuberculosis virulence. In order to dissect lipoprotein synthesis and transport, mutants deficient in Lgt and LspA were generated in M. smegmatis, the mycobacterial model organism. Lipoprotein maturation was investigated by heterologous expression of the reporter lipoprotein Mpt83, a lipoprotein of M. tuberculosis with unknown function. In M. smegmatis wild-type extracts, the recombinant expressed Mpt83 was found in the cell wall. In contrast, in M. smegmatis lspA::hyg extracts, Mpt83 was found in the cytoplasmic membrane and in lgt::aph extracts, Mpt83 was secreted into culture supernatant. These results indicate a lipid-dependent transport of mycobacterial proteins. In order to investigate the role of TAT- transported proteins for mycobacterial physiology, the TAT pathway should be inactivated by deleting tatC, which encodes the translocase of the TAT system. However, it was not possible to disrupt tatC in M. tuberculosis indicating that tatC is essential in mycobacteria. - 11 - - 12 - Zusammenfassung Das Bakterium Mycobacterium tuberculosis ist der Erreger der Tuberkulose. Jährlich sterben etwa zwei Millionen Menschen an der Tuberkulose. Damit ist die Tuberkulose die häufigste Todesursache durch einen einzelnen bakteriellen Erreger. M. tuberculosis gehört zur Gruppe der langsam wachsenden Mykobakterien und hat eine Generationszeit von etwa 24 Stunden. Sekretierte mykobakterielle Proteine stellen mögliche Virulenzfaktoren dar. Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung von zwei mykobakteriellen Proteinsekretionssystemen. Einerseits soll die Biosynthese, der Transport und die Lokalisation von Lipoproteinen und andererseits die Charakterisierung des Twin-Arginine Translokations Systems (TAT) untersucht werden. Mykobakterielle Lipoproteine sind sekretierte, immunodominante Proteine. Die Gemeinsamkeit aller Lipoproteine ist die Lipobox, eine Konsensus Sequenz, welche aus vier Aminosäuren besteht. Die Biosynthese von Lipoproteinen wird durch die aufeinander folgenden Aktivitäten der Pre-prolipoprotein Transferase (Lgt) und der Prolipoprotein Signal Peptidase (LspA) katalysiert. Lgt überträgt einen Diacyl-glycerol Rest auf das universal konservierte Cystein an der +1 Position. LspA schneidet das N-terminale Signalpeptid ab. Das Gen lspA, welches das zweite Enzym der Lipoprotein Biosynthese kodiert, wurde in M. tuberculosis durch gezielten Genaustausch inaktiviert. Die M. tuberculosis lspA::aph Mutante zeigte einen stark abgeschwächten Phänotyp in mit Aerosolen infizierten BALB/c Mäusen, das heisst, die Anzahl der Bakterien war 3-4 log reduziert und es wurden keine pathologisch veränderten Lungen beobachtet. Entsprechend wurde eine reduzierte Vermehrung der lspA::aph Mutante in Maus-Makrophagen beobachtet. Diese Resultate weisen darauf hin, dass LspA eine wichtige Determinante der Virulenz von M. tuberculosis ist. Um die Synthese von Lipoproteinen und deren Transport zu untersuchen, wurden Lgt- und LspA- defiziente M. smegmatis Mutanten generiert. M. smegmatis ist ein Organismus, der als Modellsystem für M. tuberculosis dient. Die Reifung von Lipoproteinen wurde durch die heterologe Expression von dem Reporter-Lipoprotein Mpt83, ein Lipoprotein von M. tuberculosis mit unbekannter Funktion, untersucht. In Extrakten vom Wildtypstamm von M. smegmatis wurde das rekombinant exprimierte Mpt83 in der Zellwand lokalisiert. Im Gegensatz dazu, wurde das Mpt83 in Extrakten von der M. smegmatis lspA::hyg Mutante in der cytoplasmatischen Membran und in Extrakten von der M. smegmatis lgt::aph Mutante im Kulturüberstand gefunden. Diese Resultate weisen auf mykobakteriellen Proteinen hin. - 13 - einen Lipid-abhängigen Transport von Um die Rolle von TAT-transportierten Proteinen in der Physiologie von Mykobakterien zu untersuchen, sollte das TAT-System durch die Deletion des Gens tatC, welches die Translokase des Systems kodiert, inaktiviert werden. Jedoch konnte das tatC von M. tuberculosis nicht deletiert werden. Dies weist darauf hin, dass das tatC von Mykobakterien essentiell ist. - 14 -
