ZIP - Universität Freiburg

Aus der Abteilung Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie
des Instituts für Pathologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Signal Transducer and Activator of Transcription-1 (STAT-1)
und STAT-1 assoziierte Proteine (MCM3,MCM5)
in epithelialen Ovarialkarzinomen:
Expressionsanalysen und Prognostische Relevanz
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt
2006
von
Yi Shen
geboren in
Shanghai, China
Dekan:
Prof. Dr. med. Christoph Peters
1.Gutachter:
Prof. Dr. med. Martin Werner
2.Gutachter:
PD. Dr. med. Annette Hasenburg
Jahr der Promotion: 2006
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung.......................................................................................................................................... 1
2. Einleitung ........................................................................................................................................................ 2
2.1 Ovarialkarzinom......................................................................................................................................... 2
2.1.1. Epidemiologie Onkogenese................................................................................................................ 2
2.1.2 Diagnostik ........................................................................................................................................... 3
2.1.3 Therapie............................................................................................................................................... 5
2.1.4 Prognosefaktoren................................................................................................................................. 6
2.2 STAT1 Signalweg....................................................................................................................................... 8
2.2.1 Übersicht STAT Proteine..................................................................................................................... 8
2.2.2. STAT1: Proteinstruktur....................................................................................................................... 9
2.2.3. STAT1: Aktivierung ......................................................................................................................... 10
2.2.4. STAT1: Funktion ...............................................................................................................................11
2.2.5. Interaktion von STAT1 mit „Minichromosome Maintenance“ Proteinen ........................................ 12
2.3. Fragestellung und Zielsetzung................................................................................................................. 13
3. Materialien und Methoden .......................................................................................................................... 14
3.1 Materialien ............................................................................................................................................... 14
3.1.1 Patientinnen, Gewebeproben und klinische Verlaufdaten ................................................................. 14
3.1.2 Chemikalien, Reagenzien und Geräte ............................................................................................... 14
3.2 Methoden.................................................................................................................................................. 17
3.2.1 Auswahl der Gewebeproben.............................................................................................................. 17
3.2.2 RNA Extraktion................................................................................................................................. 17
3.2.2.1. Gewebevorbereitung und Mikrodissektion ............................................................................... 17
3.2.2.2 RNA Extraktion und Aufreinigung............................................................................................. 18
3.2.2.3 Messungen der RNA-Konzentration .......................................................................................... 19
3.2.3 Quantitative Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (Q-RT-PCR) ................................. 19
3.2.3.1 cDNA Synthese (RT-Schritt) ...................................................................................................... 19
3.2.3.2 Q-(RT)-PCR ............................................................................................................................... 19
Inhaltsverzeichnis
3.2.3.3 Sequenzierung ............................................................................................................................ 22
3.2.4 Immunhistochemie ........................................................................................................................ 23
3.2.4.1 Gewebearray............................................................................................................................... 23
3.2.4.2 Arbeitsschritte Proteinfärbung (Abb. 6) ..................................................................................... 24
3.2.4.3 Auswertung der Färbung ............................................................................................................ 26
3.2.5. Statistische Analyse der mRNA- und Proteinexpressionsdaten..................................................... 26
4. Ergebnisse ..................................................................................................................................................... 27
4.1 STAT1 mRNA Expressionanalyse............................................................................................................ 27
4.1.1 Etablierung der STAT1-spezifischen Q-RT-PCR .............................................................................. 27
4.1.1.1 Optimierung der Primer- und Sondenkonzentration................................................................... 27
4.1.1.2 Bestimmung der Sensitivität und Q-RT-PCR Effizienz.............................................................. 29
4.1.1.3 Bestimmung der Spezifität von Q-RT-PCR - Sequenzierung..................................................... 30
4.1.2 STAT1 mRNA Expression in Ovarialkarzinomen............................................................................. 31
4.2 STAT1, P-STAT1, MCM3 und MCM5 Proteinexpression in Ovarialkarzinomen ................................... 32
4.2.1 Etablierung der Färbungen ................................................................................................................ 32
4.2.2 STAT1 und P-STAT1 Proteinexpression in Ovarialkarzinomen........................................................ 35
4.2.3 MCM3 und MCM5 Proteinexpression in Ovarialkarzinomen .......................................................... 39
4.3 Korrelation der STAT1, PSTAT1, MCM3 und MCM5 Proteinexpression zur Histologie und den
klinischen Verlaufsdaten................................................................................................................................. 42
4.3.1 Korrelation der STAT1-, PSTAT1-, MCM3- und MCM5- Expression zu klinischen Verlaufsdaten. 42
4.3.2 Korrelation der STAT1, PSTAT1, MCM3 und MCM5 Expression miteinander............................... 44
5 Diskussion ...................................................................................................................................................... 45
5.1 Die Bedeutung des STAT1 im Signalweges in Ovarialkarzinomen ......................................................... 46
5.2 Die Bedeutung der MCM3 und MCM5 Proteinexpression in Ovarialkarzinomen .................................. 49
5.3 Fazit.......................................................................................................................................................... 51
6 Literaturangaben .......................................................................................................................................... 52
Abkürzungen
AA
Aminosäure
ABC
Avidin-Biotin-Complex(immuhistoschemische Färbungsreagenz)
ABL
Onkogen des Abelson- Leukemia-Virus
AEC
3-Amino-9-ethylcarbazol
AK
Antikörper
Aqua dest.
destilliertes Wasser
Bp
Basenpaare
BSA
Rinderserum Albumin
cDNA
complementary DNA
CT-Wert
cycle threshold (Schwellenwert)
dNTPs
2’-Desoxyribonukleosidtriphosphate(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
EGFR
Epidermal Growth Factor Rezeptor
ETOH
Ethanol
F-Primer
Vorwärts- Primer
H&E
Hämatoxylin und Eosin
IHC
Immunhistochemie
JAK
Januskinase
MCM
Minichromosome maintenance
M-MLV
Moloney Murine Leukemia Virus
NLS
Nuclear localisation Signal
dsNLS
dimer-specific NLS
OD
optische Dichte
PBS
phosphate buffered saline
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
PDGF
Platelet-derived Growth Fctor
Q-RT-PCR
Quantitative-reverse Transkription-PCR
rpm
rounds per minute
R-Primer
Rückwärts-Primer
SH2
Src-Homology2
siRNA
Small inhibitory RNA
SRC
Onkogen des Rous-Sarkom-Virus
STAT
signal transducer and activator of transcription
TAD
Transaktivierungsdomäne
VEGF
Vascular Epithelial Growth Factor
-1-
Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
Das Ovarialkarzinom ist die siebt-häufigste Krebserkrankung bei Frauen und ist, nach
dem
Mammakarzinom,
die
häufigste
Todesursache
gynäkologischer
Krebserkrankungen.
Die 5-Jahres Überlebensrate ist trotz Fortschritte in der Diagnostik und Behandlung mit
ca. 20-25% gering. Die Identifizierung molekularer Prognosemarker könnte verbesserte
und individualisierte Therapieprotokolle ermöglichen. Ziel dieser Studie war es, die
mRNA
und
transcription-1“
Proteinexpression
von
(STAT1)
„signal
transducer
und
and
STAT1-assoziierter
activator
of
Moleküle
(„minichromosome-maintenance“: MCM-3, -5) in epithelialen Ovarialkarzinomen des
Stadiums IIIc zu untersuchen und auf ihren prognostischen Wert hin zu überprüfen.
Dazu wurde auf RNA- und Protein-Ebene die Expression von STAT1 in normalen Ovarien
(n=29) und Ovarialkarzinomen (n=114) mittels quantitativer reverser transkriptase
Polymerase Kettenreaktion (Q-RT-PCR) und Immunhistochemie (IHC) bestimmt.
Zusätzlich wurde die Aktivität von STAT1 mittels eines phospho-spezifischen Antikörpers
untersucht und mit der der STAT1-assoziierten MCM3 und MCM5 Proteinexpression
korreliert. Der prognostische Wert aller untersuchten Marker wurde, neben den
bekannten klinischen Parametern, für das Rezidiv-freie und Gesamtüberleben bestimmt.
Die Daten der Studie zeigten einen signifikanten Unterschied der STAT1, PSTAT1, MCM3
und MCM5 Expression zwischen normalen Ovarien und invasiven Karzinomen. In
Patientinnen mit adjuvanter Taxol/Carboplatin Therapie war eine hohe STAT1
Proteinexpression mit einem besseren Rezidiv-freien Überleben (p = 0,0221) sowie eine
hohe STAT1 (p = 0,0019) und PSTAT1 (p = 0,0325) Proteinexpression mit einem
längeren Gesamtüberleben korreliert. Die STAT1 Expression war mit erhöhter MCM3 und
MCM5 Proteinexpression verbunden.
Der
STAT1
Signalweg
bei
Patientinnen
mit
fortgeschrittenen
epithelialen
Ovarialkarzinomen ist aktiviert, mit der Expression von MCM3 und MCM5 korreliert und
auch stellt einen neuen prognostischen Marker dar.
-2-
Einleitung
2. Einleitung
2.1 Ovarialkarzinom
2.1.1. Epidemiologie Onkogenese
Das Ovarialkarzinom ist mit einer Inzidenz von ca.15/100,000 pro Jahr in westlichen
Ländern die zweit-häufigste gynäkologische Krebserkrankung bei Frauen zwischen dem
40 und 65 Lebensjahr (Wingo et al, 1995). Da das Ovarialkarzinom in frühen Stadien
selten symptomatisch ist, wird in ca. 80% aller Frauen ein fortgeschrittenes Stadium
diagnostiziert, deren 5-Jahres Überlebensrate daher nur bei ca. 20-25% liegt
(Friedlander et al, 1998, Ozols, 2005).
Die Ätiologie des Ovarialkarzinoms ist bisher noch unklar, aber sowohl genetische als
auch individuelle Faktoren scheinen dabei eine Rolle zu spielen. So ist bekannt, dass das
Risiko ein Ovarialkarzinom zu entwickeln mit der Häufigkeit der Ovulation korreliert
(Auersperg
et
al,
2002).
Nach
der
Ovulation
proliferiert
das
oberflächliche
Ovarialepithelial stark und das Mutationsrisiko steigt an. Eine Nulliparität, frühe Menarche,
späte Menopause gelten daher als Risikofaktoren, während eine frühe Menopause,
Schwangerschaft, Stillen und hormonelle Kontrazeption mit einem deutlich geringerem
Risiko für die Entstehung eines Ovarialkarzinoms verbunden sind (Baltzer et al, 2004 ).
In ca. 10-15% der Ovarialkarzinome liegt ein hereditärer Erkrankungsweg vor (Risch et al,
2001), wobei das Risiko ein Ovarialkarzinom zu entwickeln signifikant ansteigt, wenn in
der Familie bereits Ovarialkarzinome aufgetreten sind (Boyd and Rubin, 1997, Auersperg
et al, 2002). Hierbei sind Mutationen der Gene BRCA1 (17q21, ca. 80%), BRCA2
(13q12-13, ca. 15%) und DNA Reparaturgene (MMR, ca. 1-5%) (mit)verantwortlich
(Frank et al, 1998). Die Häufigkeit von Mutationen von BRCA1 und BRCA2 liegt bei
Frauen mit positiver Familienanamnese bei 30-60% und 15%-30% (Ford et al, 1998, Prat
et
al,
2005),
während
BRCA1
und
BRCA2
Mutationen
bei
sporadischen
Ovarialkarzinomen nur selten (Stratton et al, 1997, Foster et al, 1996) zu finden sind.
-3-
Einleitung
2.1.2 Diagnostik
Klinik
Die
Diagnose
eines
Ovarialkarzinoms
beruht
auf
klinischen
Symptomen,
gynäkologischen Untersuchungen sowie ergänzender Ultraschalluntersuchung und/oder
einer Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) des
Bauchraumes.
Die endgültige Diagnose wird erst nach operativer Entfernung der „Tumor“-Gewebes
anhand pathologischer Untersuchungen gestellt, wobei hier auch die histologischen
Klassifizierung und Einteilung der Stadien erfolgt.
Pathologie / Histologie
Über 60% der Ovarialkarzinome entstehen aus Epithelzellen des Oberflächenepithels,
die das Ovar umfangen, oder aus Epithelzellen der inneren Seite der Invaginationszyste
(Godwin et al, 1992, Auersperg et al, 2002). Die aus Epithelzellen entstandenen
Ovarialkarzinome lassen sich histologisch in acht Gruppen unterteilen, wobei
serös-papilläre, muzinöse, endometroide und klarzellige Tumoren am häufigsten
auftreten(Tabelle 1). Insbesondere die serös-papillären Ovarialkarzinome machen ca.
50% aller diagnostizierten malignen epithelialen Ovarialtumoren aus.
Die Stadieneinteilung wird entsprechend den Empfehlungen der
„Federation
Internationale de Gynecologie et d'Obstetrique“ (FIGO) vorgenommen (Tavassolli und
Devilee, 2003), die die Lokalisation und Ausdehnung des Tumors kennzeichnet (Tabelle
2). Die Stadieneinteilung ist für die weitere Behandlung nach operativer Entfernung des
Primärtumors sowie für die Prognose wichtig. So bekommen Patientinnen mit
Ovarialkarzinomen des Stadiums Ia (Grad1-2) keine zusätzliche adjuvante Therapie und
haben 5 Jahres Überlebensrate von 90-95% (Cannistra, 2004). Im Gegensatz dazu liegt
bei der meisten diagnostizierten Ovarialkarzinomen ein fortgeschrittenes Stadium vor, bei
dem nach operativer Entfernung des Primärtumors meist eine anschließende
Chemotherapie. Die Überlebensrate der Patientinnen mit Ovarialkarzinomen der Stadien
III-IV haben daher auch eine 5-Jahres Überlebensrate von nur 20-25% (Wingo et al, 1995,
Ozols, 2005).
-4-
Einleitung
Histologischer
Low
Typ
Potential
Potential
(LMP)
(HMP)
Serös
Malignant High
Malignant Andere
Seröses Zystadenokarzinom
Papilläres seröses Zystadenokarzinom
Exophytisches papilläres Karzinom
Adenofibrom/Zystadenofibrom
Muzinös
Muzinöses Zystadenokarzinom
Adenofibrom/Zystadenofibrom
Endometrioid
Zystadenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom mit
Plattenepithelmetaplasie
(Adenoakanthom)
Endometriales
Stromasarkom
Mesodermaler
("Müller'scher")
Mischtumor
Klarzellig
(Adeno-) Karzinom
(mesonephroi
de)
Maligne Brenner-Tumoren
Gemischte epitheliale Tumoren
Undifferenzierte Karzinome
Unklassifizierte Karzinome
Tabelle 1: Histologische Typen der epithelialen Ovarialkarzinome
-5-
Stadium
Ausbreitung
I
Tumor auf Ovarien begrenzt
Ia
Einleitung
Tumor auf ein Ovar begrenzt; Kapsel intakt, kein Tumor auf der Oberfläche des Ovars,
keine malignen Zellen in Aszites oder bei Peritonealspülung.
Ib
Tumor auf beide Ovarien begrenzt; Kapsel intakt, kein Tumor auf der Oberfläche der
beiden Ovarien, keine malignen Zellen in Aszites oder bei Peritonealspülung. .
Ic
Tumor begrenzt auf ein oder beide Ovarien mit Kapselruptur,Tumor an Ovaroberfläche
oder maligne Zellen im Aszites oder positiver Peritoneallavage.
II
Tumor befällt ein Ovar oder beide Ovarien und breitet sich im Becken aus
IIa
Ausbreitung auf und/oder Implantate an Uterus und/oder Tuben;keine malignen Zellen in
Aszites oder bei Peritonealspülung. .
IIb
Ausbreitung auf andere Beckengewebe;keine malignen Zellen in Aszites oder bei
Peritonealspülung.
IIc
Ausbreitung im Becken(2a oder 2b)und maligne Zellen im Aszites oder bei
Peritonspülung.
III
Tumor befällt ein oder beider Ovarien mit mikroskopische nachgewiesenen
Peritonealmetastasen außerhalb des Beckens und /oder regionären
Lymphknotenmetastasen
IIIa
Mikroskopische Peritonealmetastasen jenseits des Beckens,
IIIb
Makroskopische Peritonealmetastasen jenseits des Beckens, größte Ausdehung 2 cm
oder weniger
IIIc
Pritonealmetastasen jenseits des Beckens, größte Ausdehnung mehr als 2cm, und /oder
regionäre Lymphknotenmetastasen
IV
Fernmetastasen(ausschließlich Peritonelmetastasen)
Tabelle 2: FIGO Stadien des Ovarialkarzinoms
2.1.3 Therapie
Die primäre Therapie des Ovarialkarzinoms ist die chirurgische Entfernung der
Tumormasse mit maximaler Zytoreduktion („debulking“) und eine anschließende
-6-
Einleitung
adjuvante Chemotherapie bei späten Stadien (IIb-IV) (Greimel et al, 2006). Bei
Patientinnen, bei denen entweder keine maximale Zytoreduktion erreicht wurde, oder
bei Patientinnen, bei denen keine Primäroperation möglich ist, wird erst nach einer
Chemotherapie (2-3 Zyklen) die Operation durchgeführt (Baltzer et al, 2004). Die
Chemotherapie soll die nach einer Operation noch im Patienten verbliebenen
Tumorzellen vernichten (bei optimal debulkten Patientinnen entspricht dies einer noch
verbliebenen Tumormasse < 1 cm), bzw. deren weitere Proliferation und mögliche
Metastasierung verhindern.
Für die adjuvante Chemotherapie des Ovarialkarzinoms wird als Standard eine
Kombination von Substanzen aus der Platinum- (Carboplatin, Cisplatin) und Taxan(Paclitaxel oder Docetaxel) Gruppe angewandt (Du Bois und Pfisterer, 2005).
Substanzen der Platinumgruppe greifen in die DNA-, RNA- und Proteininteraktionen ein
und sind auf Grund ihrer „DNA cross-linking“ Eigenschaften zytotoxisch (Agarwal und
Kaye, 2003). Bei Taxanen beruht der zytotoxische Mechanismus auf der Induktion einer
Destabilisierung von Mikrotubuli, einem Zell-Zyklus Arrest und anschließender Apoptose
(Agarwal und Kaye, 2003).
2.1.4 Prognosefaktoren
Der einzigste akzeptierte prognostische Marker bei Patientinnen mit fortgeschrittenem
Stadium ist der „debulking“ Status. Patientinnen mit optimalem „debulking“(<1cm
Tumorrest) haben im Vergleich zu Patinetinnen mit nicht optimalem „debulking“ ein
signifikant besseres Überleben. Ein wichtiger klinischer Verlaufsparameter für das
epitheliale Ovarialkarzinom ist das Protein CA125, welches im Blut nachgewiesen
werden kann. Das CA125 Protein wird von epithelialen Zellen des Ovars exprimiert und
ist bei über 80% der Frauen mit epithelialen Ovarialkarzinom signifikant erhöht (Meyer
and Rustin, 2000, Cannistra, 2004). Die Bestimmung des CA125 Wertes im Serum dient
als Verlaufsparameter während der adjuvanten Behandlung und Nachsorge der
Patientinnen. Steigende CA125 Werte nach einer Oparation und adjuvanter Behandlung
sind dabei indikativ für das Auftreten eines Rezidivs (Meier et al, 1997, Meyer and Rustin,
2000, Santillan et al, 2005). Ein Nachteil des Tumormarkers CA125 ist, dass er weder in
-7-
Einleitung
frühen Stadien des Ovarialkarzinoms noch bei prämenopausalen Frauen sensitiv
nachgewiesen werden kann und sich die Werte von denen bei gutartigen Veränderungen
(z.B. Endometriose, Myome oder Entzündung) nicht eindeutig unterscheiden lassen
(Meyer and Rustin, 2000). Deshalb wird CA125 weder zur Diagnostik noch zur
Prognosebestimmung eingesetzt.
Daher werden neue, messbare und für maligne Ovarialkarzinome spezifische und
signifikant nachweisbare prognostische Tumormarker gesucht werden. Bekannte
Onkogene und Tumorsuppressorgene wurden bisher auf ihren prognostischen Wert hin
untersucht: Das bei Mammakarzinomen signifikant veränderte Onkogen HER2/neu
(ERBB2, 17q24) ist auch in 20-30% der serösen epithelialen Ovarialkarzinomen mit einer
schlechten Prognose assoziiert (Hogdall et al, 2003). Andere Studien weisen aber nur in
10% der epithelialen Ovarialkarzinome eine signifikant veränderte HER2/neu Expression
auf (Wu et al, 2004). Die Diversität der untersuchten Patientenkollektive sowie kleine
Fallzahlen und unterschiedliche Nachweismethoden limitieren den prognostische Wert
von HER2/neu bei Ovarialkarzinomen.
Ähnlich verhält es sich beim Tumorsuppressorgen p53 (17p13.1), dessen Expression mit
fortschreitendem Tumorstadium von serösen Ovarialkarzinomen ansteigt (Kupryjanczyk
et al. 1993). Eine negative oder niedrige p53 Expression ist dabei mit einer besseren
Prognose bzgl. des 5-Jahres Überlebens korreliert (Geisler et al, 2001).
Neben Onkogenen und Tumorsuppressorgenen wurden auch andere Kandidatenmarker
auf ihre prognostische Bedeutung beim Ovarialklarzinom hin überprüft. Insbesondere
wurden die Proteine analysiert, die bei der Tumor-Stroma Interaktion, bzw. im
Tumormilieu eine Rolle spielen, z.B. Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9; Lengyel et al,
2001, Demeter et al, 2005) und Vascular Epithelial Growth Factor (VEGF; Veikkola et al,
2000). Allerdings bleibt auch deren prognostischer Wert noch unklar.
Es ist zu erwarten, dass bei den neuen sgn. Ziel-gerichteten Therapien (z.B. gegen
VEGF) die Untersuchung der molekularen Zielstruktur im Primärtumor eine verbesserte
prognostische, bzw-. auch prädiktive Aussage treffen lässt.
-8-
Einleitung
2.2 STAT1 Signalweg
2.2.1 Übersicht STAT Proteine
Der „signal transducer and activator of transcription“ (STAT)-Signalweg wurde vor ca. 10
Jahren bei Arbeiten über die Interferon (IFN)-vermittelte Genexpression entdeckt. Dabei
fiel auf, dass im Gegensatz zu der Kaskaden-Signalübertragung, intrazelluläre STAT
Proteine Signale von Rezeptoren direkt in den Zellkern übermitteln können ohne die
Übertragung auf andere intrazelluläre Proteine. (Schindler et al, 1992).
Bei Säugetieren besteht die Familie der STAT Proteine aus sieben Mitgliedern, die
evolutionär hoch konserviert sind: STAT 1 bis STAT4, STAT5a, STAT5b und STAT6
(Darnell, 1997). Die STAT Proteine sind im Mittel ca. 750-850 Aminosäuren lang (Takeda
und Akira, 2000) und bestehen aus fünf funktionellen Proteindomänen (Abb. 1). STATs
sind zytoplasmatische Proteine, die mit membranständigen Rezeptoren interagieren und
externe Signale in den Zellkern weiterleiten können (Chen et al, 1998, Levy and Darnell,
2002). Durch ihre unmittelbare Rolle bei der Rezeptor-vermittelten Signalübertragung
von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Hormonen sind STAT Proteine in verschiedenen
essentiellen zellulären Prozessen involviert, wie z.B. der embryonalen Entwicklung und
Organogenese, der Zellproliferation, der Zelldifferenzierung, der angeborenen und
adaptiven Immunität und der Angiogenese, (Horvath, 2000, Buettner et al, 2002). Der
zelluläre Effekt ist dabei abhängig vom aktivierten STAT Familienmitglied: STAT3 und
STAT5 stimulieren die Zellproliferation und Angiogenese, STAT1 immunregulatorische
Prozesse und Apoptose.
Eine aberrante STAT Expression ist in verschiedenen soliden und hämatologischen
Tumoren zu beobachten (Bromberg, 2001, Calo et al, 2003). In Tumoren kann eine
erhöhte STAT Aktivität durch konstitutive Aktivierung der Tyrosinkinaserezeptoren, z.B.
EGF, oder durch eine konstitutive Aktivität intrazellulärer Tyrosinkinasen, z.B. BCR-ABL,
erfolgen (Danial and Rothman, 2000, Yu and Jove, 2004, Levy and Darnell, 2002). Die
konstitutive STAT Aktivierung stimuliert die Transkription von Zielgenen, die das
Zellwachstum, die Zellproliferation und die Angiogense fördern (Yu und Jove, 2004, Calo
et al 2003, Buettner et al 2002). Die detaillierte Kenntnis der STAT Proteine und deren
-9-
Einleitung
Funktionen gewinnen daher an prognostischer Bedeutung.
2.2.2. STAT1: Proteinstruktur
Die Struktur und Funktion der einzelnen Proteindomänen von STAT1 ist in Abbildung 1
gezeigt:
NH2-Terminale
Coiled-coil
DNABindungsdomäne Linker
TAD
SH2
PY PS
N
134
317
488
576
683
C
701 727
Abbbildung 1: Die STAT1 Proteinstruktur. Gezeigt sind die funktionellen Domänen von STAT1. Die
NH2-terminale Region (AA 1-134) stellt eine Protein-Protein-Interaktionsdomäne dar, die für die Bildung
von STAT Dimeren zur Aktivierung notwendig sind (Vinkemeier et al, 1996). Die sgn. coiled-coil-Domäne
(AA 135- 317) besteht aus vier Helixbündeln und ist an der Interaktion mit regulatorischen Proteinen und
Transkriptionsfaktoren beteiligt (Horvath, 2000). Die DNA-Bindungsdomäne (AA318-488) befindet sich im
Zentrum des Moleküls und reguliert die spezifische Bindung von STAT an Promotorregionen der
DNA(Horvath, 2000). Die Funktion der Linker-Region (AA 489-576) ist bislang noch unklar. Allerdings
führen Mutationen in dieser Domäne zu einem Stabilitätsverlust der Binding von STAT an die DNA und zu
einer Verminderung der Genaktivierung (Yang et al, 2002). Die Src-Homology2 (SH2) Domäne (AA
577-683) bestimmt die STAT1 Bindungs-Spezifität und vermittelt die Rekrutierung von STAT1 Monomeren
an die phosphorylierten Abschnitte von membranständigen Rezeptoren oder
intrazelllulärer
Tyrosinkinasen (Shuai et al, 1994, Becker et al, 1998), wie in Abbildung 2 gezeigt. Die sgn.
“Transaktivierungsdomäne“ (TAD) (AA684-750) liegt am Carboxy-Terminalen Ende und ist zwischen
38-200 Aminosäuren lang. Die Interaktion der TAD mit nukleären Proteinen trägt zur spezifischen
Aktivierung von Zielgenen im Zellkern bei. Für STAT1 ist die TAD Domäne eine wichtige Andockstelle für
die minichromosome maintenance (MCM) Proteine 3 und 5. Zudem liegen in der TAD Domäne auch die
kritischen Aminosäuren Tyrosin-701 und Serin-727, die die STAT1 Aktivität maßgeblich regulieren (Calo et
al, 2003, Buettner et al, 2002, Zhang et al, 1998, Bromberg, 2001, Yu and Jove, 2004).
- 10 -
Einleitung
2.2.3. STAT1: Aktivierung
Die Aktivierung der STAT1 Proteine erfolgt durch Phosphorylierung der Aminosäure
Tyrosin-701,
wobei
eine
zusätzliche
Phosphorylierung
der
Aminosäure
Serin-727(TAD-Domäne, Abb 1) die Transkriptionsaktivität von STAT1 noch steigern
kann (Shuai et al 1994, Wen et al 1995). Letzteres ist zwischen den beiden STAT1
Spleißvarianten, STAT1α und STAT1β, unterschiedlich reguliert: STAT1β besitzt eine
verkürzte TAD Domäne und hat somit keine Transkriptionsaktivität (Bromberg et al, 1996,
Schindler et al, 1992).
Die STAT1 Aktivierung kann über drei verschiedene Wege hervorgerufen werden und
bestimmt gleichzeitig die zellulären Effekte (Abb. 2, Buettner et al, 2002):
Wachstumsfaktorrezeptor
Zytokinrezeptor
Extrazellulär
RTK RTK
C
SR
STAT
R
JAK
STAT
JAK
R
JAK
STAT
Intrazelluläre
Tyrosinkinasen
STAT
C
SR
STAT
AB
L
STAT
Zytoplasma
T
STA
T
STA
Pro-apoptose,
Anti-Proliferation
Zellkern
AT
ST
P21/WAF1,Fas,
P53,Caspase I
Abbildung 2: Aktivierung des STAT-Signalweges. Das Schema (modifiziert von Buettner et al, 2002)
zeigt die drei wichtigsten Aktivierungsmechanismen von STAT1, wie im Text beschrieben. Die durch
STAT1-induzierten Gene, bzw. zellulären Funktionen sind angegeben.
- 11 -
Einleitung
Zytokin-Rezeptor vermittelte STAT Aktivierung
Zytokinrezeptoren besitzen keine intrinsische Tyrosinkinaseaktivität können aber über
die Rekrutierung von Janus Kinasen (JAK) die Konformation ihrer zytoplasmatische
Domäne so ändern, dass Andocksstellen für die STAT-spezifischen SH2 Domänen
entstehen (Ihle, 2001). Daran können STAT Monomere binden und durch JAK-induzierte
Phosphorylierung der Aminosäure Tyrosin-701 aktiviert werden. Danach erfolgt die
Bildung von STAT Homo- oder Hetero-Dimeren, die Translokation in den Zellkern und die
Gen-spezifische Aktivierung (Yu and Jove, 2004, Buettner et al, 2002, Bromberg, 2001).
Membranständige Rezeptortyrosinkinasen-vermittelte STAT Aktivierung
Wachstumsfaktor Rezeptoren wie Epidermal Growth Faktor (EGFR) und Platelet-derived
growth factor (PDGF) besitzen eine intrinsische Tyrosinkinasenaktivität in ihrer
zytoplasmatischen Domäne. Die Aktivierung von STAT Proteinen erfolgt direkt nach
Bindung von Wachstumsfaktoren (z.B. EGF oder PDGF) oder zusätzlich durch
assoziierte Janus Kinasen (Yu and Jove, 2004).
Intrazelluläre Tyrosinkinasen-vermittelte STAT Aktivierung
Intrazelluläre Tyrosinkinasen, wie die Onkogene SRC und ABL, können entweder über
Wachstumsfaktorrezeptoren oder aber direkt zu einer Aktivierung von STAT Proteinen
führen (Parsons, 1997).
2.2.4. STAT1: Funktion
STAT1 hat eine primäre Rolle in Zytokin-vermittelten Signalwegen (Darnell et al 1994),
z.B. Interferon gamma (IFNγ) oder Interleukin-6 (IL6). Durch Bindung der Zytokine und
ihrer Rezeptoren und der dadurch induzierten Rekrutierung von Janus Kinasen, werden
STAT1-Proteine phosphoryliert (P-STAT1), die dann Dimere bilden und in den Zellkern
wandern. Dort binden sie an DNA-Sequenzen (z.B. die IFN-γ-assoziierte GAS Sequenz,
Decker et al 1997) und induzieren die Transkription der STAT1-assoziierten Zielgene
P21(bei
IFNγ-Stimulation)
oder
Caspase-1(bei
IL-6
Stimulation).
Durch
die
IFNγ-vermittelten Signale, spielt STAT1 eine entscheidende Rolle bei anti-viralen,
anti-bakteriellen Immunantworten und bei der immunologischen Tumorüberwachung. So
- 12 -
Einleitung
sind z.B. STAT1-knock out Mäuse durch eine defekte zelluläre Antwort auf IFNγ
Stimulation anfällig für virale und bakterielle Infekte (Durbin et al 1996, Meraz et al 1996)
und im Vergleich zu Wild-Typ Mäusen auch anfälliger für die chemische Induktion von
Tumoren (Kaplan et al 1998).
Trotzdem ist in humanen Tumoren und Tumorzelllinien eine erhöhte Expression von
STAT1 beobachtet worden (Bromberg et al 1996, Buettner et al 2002). Dies könnte die
Immunantwort auf das Tumorgeschehen widerspiegeln und es ist anzunehmen, dass
Tumoren mit stark erhöhter STAT1 Expression eine bessere Prognose aufweisen als
Tumoren mit schwächerer STAT1 Expression. Beispielhaft konnte dies schon für das
Mammakarzinom gezeigt werden (Widschwendter 2002). Auch ist bekannt, dass die
chemotherapeutische Substanz Doxorubin die Expression von STAT1 in vitro erhöht und
dadurch zu einer vermehrten Apoptose von Tumorzelllinien führen kann (Thomas et al,
2004). STAT1 reguliert die pro-apoptotischen Proteine Caspase-1, Fas und P21 (Battle
und Frank, 2002, Kumar et al, 1997, Chin et al, 1996) sowie das Onkogen MYC (Ramana
et al, 2000).
2.2.5. Interaktion von STAT1 mit „Minichromosome Maintenance“ Proteinen
Die Transkriptionsaktivität von STAT1 wird durch die Transaktivierungsdomäne (TAD)
(Darnell et al, 1994) und zusätzlich durch die Interaktion mit nukleären Kofaktoren, z.B.
Minichromosome Maintenance Proteinen 3 und 5 (MCM3,-5), bestimmt (Horvai et al
1997, Zhang et al, 1998).
Die evolutionäre konservierte MCM Proteinfamilie hat in Säugetieren sechs Mitglieder MCM2 bis MCM7, die hauptsächlich als DNA-Helikasen bei der DNA Replikation
fungieren (Ishimi 1997, Levy und Darnell 2002) und auch eine wichtige Rolle bei der
DNA-Transkription, DNA Reparatur und Chromatin-Regulation spielen (Forsburg, 2004,
Newlon, 1997). MCM3 und MCM5 können einen Komplex bilden (Richter und Knippers
1997, Prokhorova und Blow 2000), der für die transkiptionelle Aktivität von STAT1 wichtig
ist (Synder et al, 2005). Dabei vermitteln die Aminosäuren R732 und K734 des MCM5
Proteins die Verbindung zu STAT1 (Zhang et al, 1998). Eine abnorme MCM Expression
kann zur DNA-Schädigung und genetischer Instabilität, einem Hauptmerkmal invasiver
- 13 -
Einleitung
solider Tumoren, führen (Tye, 1999, Lei 2005). Die Ko-Expression von STAT1 und MCM
Proteinen in Tumoren wurde bislang noch nicht untersucht.
2.3. Fragestellung und Zielsetzung
Die Bedeutung des STAT1 Signalweges beim Ovarialkarzinom wurde bislang noch nicht
untersucht. Daher stellt sich die Frage, ob die STAT1 Expression, bzw. die STAT1
Aktivität sowie die STAT1-assoziierten Proteine MCM3 und MCM5 mögliche neue
molekulare Prognosemarker bei Patientinnen mit fortgeschrittenen Ovarialkarzinomen
darstellen können.
Ziel dieser Studie war es daher, die mRNA- und Proteinexpression sowie Aktivität von
STAT1 in Ovarialkarzinomen des Stadiums IIIc zu bestimmen und auf ihren
prognostischen Wert hin zu überprüfen.
Zusätzlich sollte die Expression von STAT1 mit den STAT1-assoziierten Markern MCM3
und MCM5 in epithelialen Ovarialkarzinomzellen korreliert und der mögliche
prognostische Wert überprüft werden.
- 14 -
Materialien und Methoden
3. Materialien und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Patientinnen, Gewebeproben und klinische Verlaufdaten
Insgesamt
wurden
Tumorgewebe
von
114
Patientinnen
mit
epithelialen
Ovarialkarzinomen und normale Ovarien von 29 Patientinnen untersucht. Die
Patientinnen wurden zwischen 1998 -2005 an der Frauenklinik primär operiert. Die
Gewebe waren alle Formalin-fixiert und Paraffin-eingebettet und stammten aus dem
Archiv des Pathologischen Institutes, Universitätsklinikum, Freiburg (Ethikvotum #97/05,
Ethik-Kommissionn,
Albert-Ludwigs-Universität,
Freiburg).
Die
histologische
Klassifizierung der Gewebe erfolgte nach den internationalen, diagnostischen
Standardkriterien der WHO (Tavassoli und Devilee 2003). Die klinischen Verlaufsdaten
wurden von der Frauenklinik, Universitätsklinikum Freiburg bereitgestellt und umfassten
folgende Informationen: Debulking Status nach Operation, adjuvante Chemotherapie
(Schema, Zyklen, Abbruch) und das Rezidiv-freie und Gesamtüberleben. Alle
Studiendaten wurden anonymisiert behandelt. Tabelle 3 fasst das Patientenkollektiv
zusammen.
3.1.2 Chemikalien, Reagenzien und Geräte
Laborchemikalien, wie z.B. Xylol, Ethanol etc., und Reagenzien wurden von gängigen
Laborlieferanten (Sigma-Aldrich) bezogen. Reagenzien für die molekularen Analysen der
mRNA Expression umfassten das „Masterpure RNA Kit“ (Epicenter/Biozym), MMLV
Reverse Transcriptase (Invitrogen), Hexanucleotide (Roche), Hefe-RNA (Ambion) sowie
Reagenzien für die quantitative RT-PCR und Sequenzierungen (Appliedbiosystems).
Reagenzien für die immunhistochemischen Untersuchungen schlossen Primärantikörper
von verschiedenen Herstellern (Tabelle 4), Sekundärantikörper und -reagenzien
(DAKOCytomation) ein. Alle benutzten Geräte sind in Tabelle 5 aufgelistet. Für alle
sonstige Analyse wurden standardisierte Puffer und Lösungen des Pathologischen
Institutes Freiburg verwendet.
- 15 -
n
Materialien und Methoden
%
Histologie
Stadium
1a
7
6,1
1c
2
1,8
2a
1
0,9
2b
1
0,9
2c
2
1,8
3b
5
4,4
3c
96
84,2
Serös-papillär
85
59,9
Serös
9
6,3
Papillär
16
11,3
Muzinös
3
2,1
Endometrioid
1
0,7
1
4
3,5
2
39
34,2
3
69
60,5
4
2
1,8
Histologie
Differenzierungs Grad
Klinik
Debulking
<1 cm
85
75,9
>1 cm
27
24,1
Keine
11
9,8
Taxol/carboplatin
68
60,7
Carboplatin/Topotecan
15
13,4
Carboplatin/Cyclophosphamid
3
2,7
Carboplatin mono
10
8,9
Caelyx
1
0,9
Andere
4
3,6
Rezidiv
61
62,2
Chemotherapie
Rezidiv-freies
Überleben
15 Monate (0,5 – 47)
(Median)
Gesamtüberleben (Median)
23 Monate (range 1 – 82)
Tabelle 3: Patientenkollektiv – Zusammenstellung der histopathologischen und klinischen
Parameter
- 16 -
Antikörper
Materialien und Methoden
Klonalität, Tierquelle
Hersteller
Cell Signaling Technology
STAT 1
Inc.(Beverly,MA,USA)
monolonal, Maus
Zymed Laboratories (South San
Phospho-STAT1(Tyr701)
Francisco, USA)
monolonal, Maus
Stressgen Bioreagents (Victoria, BC
Anti-MCM3
monolonal, Maus
Canada)
Anti-MCM5
monolonal, Maus
Novus Biologicals, Inc.
Polyklonal Ziege
Dako Cytomation (Glostrup Dänemark)
Goat Anti-Mouse IgG
(Biotinyliert)
Tabelle 4: Übersicht der immunhistochemischen Antikörper
Gerät und Software-Produkte
Hersteller
Entparaffinierungsgerat
Medite
Mikroskop,Kamera
Zeiss
Mikrowelle
Siemens
Gewebearray: Multi-Tissue-Arrayer
Beecher Instruments, Inc.
pH-Meter 211
Hanna Instruments
Photometer: ND1000
PeqLab, Erlangen
PCR: PTC-200,Peltier Thermal Cycler
MJ Research
Thermomixer comfort, 1,5ml
Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge 5417R
Eppendorf (Hamburg)
310 Genetic Analyzer (Kapillar-Sequenzer) +
Applied Biosystems
310 Data Collection Software-Version 3.0.0
Q-RT-PCR: 7000 Sequence Detection System +
Applied Biosystems
ABI Prism 7000 SDS Software
Primer Express Software V1.0
Applied Biosystems
Sequencing Analysis Version 3.7
Applied Biosystems
Tabelle 5: Übersicht der Geräte und Software-Produkte
- 17 -
Materialien und Methoden
3.2 Methoden
3.2.1 Auswahl der Gewebeproben
Basierend auf den pathologischen Befunden, wurden repräsentative Gewebeblöcke
(normale
Ovarien
oder
Ovarialkarzinome,
alles
Formalin-fixierte
und
Paraffin-eingebettete Gewebe) aus dem Archiv des Pathologischen Institutes selektiert.
Um einen direkten Vergleich der Morphologie mit den Studiendaten zu erhalten, wurden
pro Gewebeblock erneut je ein 2 μm dicker Paraffinschnitt für eine Hämatoxylin-Eosin
Färbung 1 sowie zwei 10 μm Schnitte für die molekulare Ananlyse angefertigt. Die
epithelialen Tumorareale, bzw. normalen Ovarialgewebe wurden von Pathologen für die
weiteren Analysen markiert.
3.2.2 RNA Extraktion
Bei dieser Arbeit lagen bereits isolierte RNA’s von 105 Gewebeproben vor, so dass die
RNA Extraktion an 37 Gewebeproben eigenständig nach dem Protokoll des MasterPure
RNA Extraktions Kit durchgeführt wurde.
3.2.2.1. Gewebevorbereitung und Mikrodissektion
Von allen Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebeblöcken wurden jeweils zwei
10μm dicke Gewebeschnitte hergestellt und bei 60°C für mind. eine Stunde getrocknet.
Anschließend erfolgte eine Entparaffinierung der Gewebeschnitte mit Inkubation in 2x/20
min in Xylol, 2x/10min 100% Alkohol und je 5min in einer absteigenden Alkoholreihe
(95% bis 50%) und zuletzt Aqua dest.. Danach wurden die Gewebeschnitte kurz in
Instant-Hämatoxylin (15s) gefärbt, so dass die Zellmorphologie für die Mikrodissektion
sichtbar wurde. Mittels feiner, steriler Nadeln wurden die vom Pathologen ausgewählten
Tumorareale manuell mikrodissektiert und in ein mit Lyse-Puffer (300 µl Tissue and Cell
Lysis Solution mit 1 µl Proteinase K-50µg/µl) vorbereitetes 1,5ml Eppendorfgefäß
übertragen.
1
H&E.-Färbung: Hämatoxylin färbt säure Gewebebestandteile blau-violett z.B. Nukleinsäuren, die Zellkern
und Ribosomen; Eosin färbt zahlreiche Strukturen rot z.B. Kollagenfasern
- 18 -
Materialien und Methoden
3.2.2.2 RNA Extraktion und Aufreinigung
Die in den Lyse-Puffer mikrodissektierten Gewebeareale wurden in einem Thermomixer
bei 65°C mit 350rpm übernacht, bzw. bis zur vollständigen Lyse (bei Bedarf Zugabe von
extra 150 µl Lyse-Puffer und 1 µl Proteinase K am 2. Tag) geschüttelt.
Zur RNA Isolierung wurden die Prober anschließend für 3-5 min auf Eis gestellt. Danach
wurde zu jeder Probe 225 µl MPC Protein Precipitation Reagent gegeben, für 10s kräftig
vortext und 10 min bei 4° C (Raumtemperatur) und 8000rpm zentrifugiert. Danach erhielt
man ein Pellet, bestehend aus gefällten Proteinen, und eine wässige Phase, die die
gelöste Nukleinsäuren enthielt. Die obere Phase wurde vorsichtig in ein neues 1,5ml
Eppendorfgefäß überführt und mit 750µl 100% Isopropanol gemischt. Für die RNA
Fällung, wurde das RNA/Isopropanol-Gemisch bei 4°C und 13000rpm für 10 min
zentrifugiert. Der dabei entstandene Überstand wurde vorsichtig abgenommen und
verworfen und das RNA-Pellet mit 450µl 70% Ethanol gewaschen und dann bei
Raumtemperatur kurz getrocknet.
Um eventuelle kontaminierende Reste von DNA aus dem RNA-Pellet zu entfernen wurde
ein DNase-Verdau durchgeführt: Zum getrockneten RNA-Pellet wurden 150µl DNase I
Puffer mit 5µl DNase I (1U/µl) zugegeben, das RNA-Pellet komplett gelöst und bei 37°C
für 30 min inkubiert. Anschließend erfolgte eine erneute RNA-Aufreinigung durch Zugabe
von 200µl Tissue and Cell Lysis Solution und 200µl MPC Protein Precipitation Reagent.
Das Gemisch wurde kurz gemischt, für 5 min auf Eis gestellt und dann bei
Raumtemperatur und 8000rpm für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig in
ein neues 1,5ml Eppendorfgefäß überführt, mit 500μl Isopropanol gemischt und erneut
bei 4°C und 13000rpm für 30 min zentrifugiert. Das dabei entstandene RNA-Pellet wurde
noch 2x mit 70% Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur für 10 min getrocknet.
Das getrocknete RNA- Pellet wurde abschließend in 20µl TE Puffer gelöst und bei -20° C
gelagert, bzw. gleich für die Folgeuntersuchungen eingesetzt.
- 19 -
Materialien und Methoden
3.2.2.3 Messungen der RNA-Konzentration
Zur Bestimmung der RNA Konzentration wurde 1 µl der gelösten RNA auf einem
NanoDrop (ND-1000 Spectrophotometer) Photometer gemessen. Das Prinzip der
Messung ist die spezifische optische Dichte der RNA bei einer Wellenlänge von 260nm.
Die
RNA
Konzentration
wurde
RNA-Konzentration(ng/μl)=OD260*40(Faktor
für
wie
RNA).
folgt
Um
die
bestimmt:
Reinheit
der
RNA-Präparation zu überprüfen wurde die Ratio OD260 / OD280 gemessen, wobei eine
pure RNA-Lösung zwischen 1,8 und 2 liegt.
3.2.3 Quantitative Reverse Transkriptase
(Q-RT-PCR)
Polymerase
Kettenreaktion
3.2.3.1 cDNA Synthese (RT-Schritt)
Für jede RNA-Probe wurde cDNA in einem 20µl Ansatz mit der Reverse Transkriptase
aus dem Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) hergestellt. Dafür wurden zunächst 1
µg RNA, 1µl Yeast RNA (10ng/µl), 2µl Hexanucleotide (10x, 50µg/µl) und Wasser add 9 µl
gemischt, bei 70°C für 2 min inkubiert (Verminderung der RNA-Sekundärstrukturen) und
anschließend bei Raumtemperatur für 10 min abgekühlt. Zusätzlich wurde eine
RT-Negativkontrolle nur mit Wasser angesetzt und auf gleiche Weise behandelt. Zu jeder
Probe wurde anschließend 11 µl des bereits vorgefertigten Reaktionsmixes (je Probe: 3
µl Wasser, 4µl 5x-Puffer, 1µl dNTP [10nM], 2µl DTT [0,1M] und 1µl M-MLV[200U/µl])
gegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde danach mit einer
Inkubation bei 95°C für 5 min gestoppt. Die cDNA-Proben wurden anschließend kurz auf
Eis gestellt und dann bei -20°C bis zur weiteren Analyse aufbewahrt.
3.2.3.2 Q-(RT)-PCR
Bei der quantitativen RT-PCR werden Gensequenzen (hier mRNA) mittels spezifischen
Primern durch das Enzym Taq-Polymerase vermehrt und so sichtbar gemacht. Dies wird
durch den Einsatz einer fluoreszierenden, Gen-spezifischen „Sonde“ möglich, die
- 20 -
Materialien und Methoden
während der Vermehrung kontinuierlich gemessen werden kann (Abb. 3).
1
2
VorwärtsR
Primer
VorwärtsPrimer
Q
5‘
3‘
3‘
5‘
R
Q
Taq
3‘
5‘
3‘
5‘
RückwärtsPrimer
RückwärtsPrimer
3
VorwärtsPrimer
3‘
4
R
VorwärtsPrimer
Q
Taq
5‘
3‘
5‘
R
Q
Taq
3‘
5‘
3‘
5‘
RückwärtsPrimer
RückwärtsPrimer
Abbildung 3: Prinzip der Q-RT-PCR. Zum Beginn jedes PCR-Zyklus (1) ist die Reporterfluoreszent (R)
der Sonde ist durch den Quencher (Q) unterdrückt. Bei fortschreitender Amplifikation (2-4) wird die Sonde am
5‘-Ende von der Taq-Polymerase (Taq) verdrängt. Die Reporter-Fluoreszenz kann daher am Ende jedes
PCR-Zyklus gemessen werden.
Die Messwerte der Q-RT-PCR können anschließend für eine absolute (Korrelation zu
Standardkurve) oder relative (Korrelation zu einer positiv Kontrolle) Bestimmung der
Gensequenz-Menge
herangezogen
werden.
Dies
erfolgt
mittels
des
sgn.
Schwellenwertes („threshold Cycle“-, CT-Wert), bei dem ein exponentieller Anstieg der
Gen-spezifischen Vermehrung auftritt. Für jede Probe wird der CT-Wert des Zielgens
sowie der eines „Kontrollgens“ bestimmt und miteinander wie folgt verrechnet: ΔCTProbe
=CT ( ZielgenProbe )-CT ( ReferenzgenProbe). Um den „x-fachen“ Anstieg relativ zu einer
Kontrolprobe zu bestimmen, wird anschließend die Differenz der ΔCT-Werte zwischen
Probe und Kontrolle (ΔCTProbe - ΔCTKontrolle) = ΔΔCT gebildet. Der „x-fache Anstieg
berechnet sich dann: x-fach = 2- ΔΔCT.
Für diese Studie wurde für die Q-RT-PCR das „ABI7000“ Gerät (Firma Applied
Biosystems) mit entsprechender Software (ABI Prism 7000 SDS) benutzt und die STAT1
mRNA mittels spezifischer Primern und Sonde und relativer Quantifizierung bestimmt.
- 21 -
Materialien und Methoden
Die Methodik war im Labor bereits standardisiert und musste nur für die
STAT1-spezifische Messung etabliert werden.
Das Design der STAT1-spezifischen Primer und Sonde erfolgte anhand der STAT1
Gensequenz (Ensmbl #BC002704) und einer speziellen Software (Primer Express 1.0,
Applied Biosystems), wobei die Primer- und Sondenkombination so ausgewählt wurde,
dass ein kurzes Fragment (124 bp) der STAT1 mRNA , nicht jedoch DNA gemessen
werden konnte (Abb. 4). Die Primer- und Sondensequenzen waren: Vorwärts-Primer:
5′-GAG CAG GTT CAC CAG CTT TAT GAT-3′, Rückwärts-Primer: 5′-AAC GGA TGG TGG
CAA ATG-3′ , Sonde: 6-FAM-AAA-GCA AGA CTG GGA GCA CGC TGC-TAMRA.
E1
E3
E2
E4
5’......
Prä-mRNA
5’-Cap ......
mRNA
E5
......3’
...... 3’-PolyA
Q-RT-PCR Produkt
Protein
N
NH2-Terminale
PY PS
Coiled-coil
DNABindungsdomäne Linker SH2
C
TAD
Abbildung 4: Auswahl der STAT1-spezifischen Primer und Sonde für die Q-RT-PCR. Die Vorwärts- und
Rückwärts- Primer(schwarzer Pfeil) liegen separat an Exon(E) 3 und Exon 4. Die Sonde liegt an zwei
nachbarliche Exon. Das amplifizierte Produkt zieht sich von NH2-Terminale bis Coil-coil Domäne hin.
Für diese Studie wurde ein im Labor standardisierter Q-RT-PCR Ansatz und
PCR-Programm verwendet (Tabelle 6). Dafür wurden die Reagenzien laut Tabelle 6
gemischt, in eine 96-Lochplatte überführt, mit Folie bedeckt und im TaqMan System mit
entsprechendem PCR-Programm (50°C/2min; 95°C/10min und 40 Zyklen mit
95°C/15sec, 60°C/1min) inkubiert. Die Konzentrationen der Primer und Sonden mussten
noch etabliert werden (siehe Ergebnisse).
- 22 -
Reagenz
Materialien und Methoden
Einsatzmenge (µl)
TaqMan Mix
15
Vorwärtsprimer
3
Rückwärtsprimer
3
Sonde
3
H2O
3
cDNA
3
Tabelle 6: Q-(RT)-PCR Ansatz
3.2.3.3 Sequenzierung
Um die Spezifität der STAT1 Q-RT-PCR zu überprüfen, wurde bei 4 Proben das nach der
Q-RT-PCR erhaltene Produkt sequenziert. Dazu wurden zunächst die PCR Produkte
mittels eines kommerziellen Kits nach Angaben des Herstellers (Qiagen PCR Purification
Kit, Qiagen) aufgereinigt und anschließend einer Sequenzierungs-PCR, in der
fluoreszenz-markierte dNTP’s eingebaut werden, zugeführt. Dies wurde jeweils einmal
für den Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit dem BigDye Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems) durchgeführt. Der Pipettieransatz sowie das PCR Programm sind in Tabelle
7 aufgelistet. Nach Abschluß der Sequenzierungs-PCR wurden die PCR-Produkte mittels
Fällung aufgereinigt: Hierzu wurde das PCR Produkt (20 µl) mit 50μl 100% Ethanol, 2μl
125mM EDTA, 2μl 3M Natriumacetat gemischt, 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und
dann für 30 min bei 13000rpm zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde anschließend in 70μl
70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 17 µl Sequenzierungs-Puffer („TSR“, Applied
Biosystems) aufgenommen.
Es folgte die Analyse in einem Kapillarsequenzer (ABI310) nach Standardprotokollen des
Labors. Die erhaltene Gensequenz (Abb. 8) wurde mit den entsprechenden
Datenbanken korreliert und ergab eine 100% Übereinstimmung.
- 23 -
Reagenz
Materialien und Methoden
Einsatzmenge Einsatzmenge
(µl, Probe)
(µl, pGEM)
DNA
1
1
Primer
3,2
1
BigDye Mix
4
4
5x Puffer
4
4
H2O
7,8
10
1. 92°C
25s
2. RAMP 1.0°C/s zu 50°C
3. 50°C
15s
4. 60°C
4min
5. zum Schritt 1 24 Zyklen
6. 10°C
immer
Tabelle 7: Ansatz und Programm für die Sequenzierungs-PCR
3.2.4 Immunhistochemie
Bei der Immunhistochemie können Proteine in situ an Gewebeschnitten dargestellt
werden. Für diese Studie wurden für die Proteinfärbungen von STAT1, PSTAT1, MCM3
und MCM5 Schnitte von sgn. Gewebearrays (Abb.5) verwendet und manuell angefärbt.
3.2.4.1 Gewebearray
Die Technik der Gewebearrays ermöglicht die gleichzeitige immunhistochemische
Analyse von multiplen Gewebeproben und wurde daher für die Analysen der 143
Gewebeproben dieser Studie eingesetzt. Dazu wurden die vom Pathologen markierten,
repräsentativen Tumorareale (bzw. normalen Ovarialgewebe) in Gewebearrays
übertragen (Abb. 5): Mittels zweier Nadeln wurden aus den Spenderblöcken die
entsprechenden Gewebe-Stanzzylinder (Nadel A, Durchmesser = 0,2 µm) in einen zuvor
mit
Hohl-Stanzen
(NADEL
B)
versehenen
„Empfängerblock“
überführt.
Die
Empfängerblöcke wurden nach Einbringung der Gewebestanzen bei 60°C für 15 min zur
Verschmelzung des Gewebes mit dem Paraffin des Empfängerblocks erwärmt. Von den
Gewebearrays wurde vor den immunhistochemischen Färbungen noch eine H&E
Färbung zur Kontrolle der gestanzten Gewebeareale angefertigt.
- 24 -
Materialien und Methoden
A
B
Abbildung 5: Herstellung von Gewebemikroarrays. Die Graphik zeigt den Manual-Tissue-Arrayer mit
Gewebe-Stanzzylinder (A) und Hohl-Stanzzylinder (B) wie im Text beschrieben und den angefertigten
Gewebearray-Block.
3.2.4.2 Arbeitsschritte Proteinfärbung (Abb. 6)
Gewebevorbereitung: Für die Färbungen wurden 4μm dicke Gewebeschnitte von den
Gewebearray-Blöcken angefertigt, bei 60°C für mind. 1 Stunde getrocknet und dann 2x
10 min in Xylol und 2x 5min in 100% Alkohol entparaffiniert. Blockierung I: Zur
Blockierung der endogenen Peroxidase wurden die entparaffinierten Gewebeschnitte in
einem Gemisch aus 500μl 30% Wasserstoffperoxid und 50 ml Methanol für 20 min
inkubiert
und
danach
in
Wasser
gespült.
Antigendemaskierung:
Um
die
Antigenbindungsstellen für die Antikörper zugänglich zu machen, ist bei fixierten Gewebe
eine spezifische Vorbehandlung notwenig, die durch Hitze-induzierte Inkubation und/oder
Proteinandau
durchgeführt
werden
kann.
Diese
„Antigendemaskierung“
(bzw.
„Epitope-Retrieval“) sollte für jeden Antikörper optimiert werden. Hier wurden das
Erhitzen der Gewebeschnitte in (Mikrowelle) in a) Zitrat Puffer bei pH 6,0 oder b) Tris
Puffer bei pH 10 getestet. Danach wurden die Gewebeschnitte in 1x PBS gespült.
Blockierung II: Die Gewebeschnitte wurden mit 200μl 2,2%igem Rinderserumalbumin
(BSA) zur zusätzlichen Blockierung für 15 min inkubiert. Danach wurde die BSA-Lösung
vorsichtig abgeklopft. Primärantikörper: Die Gewebeschnitte wurden anschließend mit
200μl der verdünnten Primärantikörper (Verdünnungen siehe Resultate) bedeckt, in einer
- 25 -
Materialien und Methoden
feuchten Kammer für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und danach 3x für je 2
min in 1xPBS gewaschen. Sekundärantikörper: Die Gewebeschnitte wurden mit 200μl
einer 1:200 Verdünnung des biotinylierten Sekundärantikörpers bedeckt, 30 min bei
Raumtemperatur inkubiert und danach erneut 3x für je 2 min in 1xPBS gewaschen.
ABC-Komplex: Der ABC Komplex besteht aus einer Mischung von Avidin und
biotinylierter
Meerrettichperoxidase
in
PBS,
die
30
min
vor
Gebrauch
laut
Herstellerangaben (DAKO) angesetzt wurde. Dieses Gemisch (100µl) wurde auf die
Gewebeschnitte
gegeben
und
für
30min
bei
Raumtemperatur
inkubiert.
AEC-Färbereaktion: Die Anfärbung der Gewebeschnitte erfolgte mittels AEC (3-Amino
-9-ethylcarbazol) Substrat-Chromogenlösung, die auf die Gewebeschnitte getropft wurde,
10 min inkubiert wurde und dann unter fließendem Wasser für 5 min abgespült wurde.
Gegenfärbung (Zellkern) und Abdecken: Dies erfolgte mittels Hämalaun (3 min),
Waschen in fließendem Wasser und Eindeckeln mit Aquatex und einem Deckglas.
1
2
biotinylierter
Sekundärantikörper
3
4
Primärantikörper
AEC:
Enzymsubstrat
biotinylierter
Meerrettichperoxidase
Avidin
Auswertung
Abbildung 6: Immunhistochemie (ABC-Methode). 1) Der Primärantiköprer bindet spezifisch an Gewebe,
2) der biotinylierte Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper, 3) Avidin und biotinylierte
- 26 -
Materialien und Methoden
Meerrettichperoxidase (ABC-Komplex) bindet an den Sekundärantikörper, 4) Peroxidase oxidiert
Enzymsubstrat (AEC) und färbt Gewebe spezifisch an.
3.2.4.3 Auswertung der Färbung
Die Färbungen wurden semi-quantitativ ausgewertet. Für STAT 1 wurde die
zytoplasmatische Anfärbung in Stroma- und Tumorzellen bewertet mit 0 = negativ,
1=Stromazellen gefärbt, 2=Tumorzellen gefärbt, 3=Stroma- und Tumorzellen gefärbt. Für
P-STAT1 wurde ausschließlich die Anfärbung der Tumorzellen bewertet und zwar mit 0 =
negativ, 1= Zytoplasma gefärbt, 2=Zellkern und Zytoplasma gefärbt, 3=Zellkern gefärbt
in mehr als 2 „Tumorzellnestern“. Bei MCM3 wurde die Häufigkeit der nukleär positive
Tumorzellen prozentual bewertet: 1 =1-25%, 2=26-50%, 3= 51-75%, 4=75-100%. Für
MCM5 wurde die Tumorzellexpression mit 0 = negativ, 1= Zytoplasma gefärbt, 2=Zellkern
gefärbt, 3= Zellkern und Zytoplasma gefärbt, gewertet.
3.2.5. Statistische Analyse der mRNA- und Proteinexpressionsdaten
Die Studiendaten wurden von Frau Dr. Uta Jütting, Institut für Biomathematik und
Biometrie, GSF-Forschungszentrum, München ausgewertet.
Dabei wurden mittels des Pearsons Korrelations-Koeffizienten und T-Tests die
Korrelation der Marker untereinander und mittels Kaplan-Meier Kurven die prognostische
Relevanz der Marker geprüft.
- 27 -
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1 STAT1 mRNA Expressionanalyse
Um die mRNA Expression von STAT1 in normalen Ovarien und in mikrodissektierten
invasiven Tumorzellen von Patientinnen mit Ovarialkarzinom zu bestimmen, wurde RNA
aus entsprechenden Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Gewebeproben
isoliert, in cDNA umgeschrieben und mittels quantitativer RT-PCR gemessen (Material
und Methoden 3.2.2., 3.2.3.).
Während die Reaktionsbedingungen für das mitzuführende Kontrolgen (TBP) bereits im
Labor
etabliert
waren,
mussten
für
diese
Arbeit
zunächst
noch
die
Reaktionsbedingungen für die STAT1-spezifische Q-RT-PCR bestimmt werden. Danach
wurden die bereits im Labor vorhandenen cDNA Proben von 105 Patientinnen sowie die
für diese Arbeit speziell angefertigten RNA Extrakte, bzw. cDNA Proben (n=37) in die
etablierten STAT1-spezifische Q-RT-PCR eingesetzt.
4.1.1 Etablierung der STAT1-spezifischen Q-RT-PCR
Für die STAT1-spezifische Q-RT-PCR wurden anhand der Gensequenz (ensmbl
#BC002704) mit Hilfe einer speziellen Primer-Software (Primer Express V1.0, Applied
Biosystems) Primer und eine Intron-überspannend Hybridisierungssonde gewählt (Abb.
4, Material und Methode 3.2.3.2). Die Auswahl der Intron-überspannend Sonde
gewährleistet die Amplifikation von ausschließlich mRNA.
Zur Etablierung der STAT1-spezifischen Q-RT-PCR gehörte die Bestimmung der
geeigneten Primer- und Sondenkonzentrationen, der PCR Sensitivität und Effizienz (um
die vergleichbare Amplifikation des Kontrollgens und von STAT1 zu validieren) sowie die
Sequenzierung des STAT1 Q-RT-PCR Produktes (Spezifität). Für diese Testreihe wurde
eine separate Gewebeprobe, bzw. RNA verwendet.
4.1.1.1 Optimierung der Primer- und Sondenkonzentration
Für diese Versuche wurden zunächst aus dem RNA-Extrakt der Kontrolgewebeprobe
300µl cDNA hergestellt (Material und Methoden 3.2.3.1), um für alle zu testenden
- 28 -
Ergebnisse
Bedingungen die gleiche Probe vorliegen zu haben.
Zur Bestimmung der optimale Primerkonzentration wurde die Konzentration von Sonde
(250 nM) und cDNA (5ng/µl) in jedem PCR Ansatz (50µl) konstant gehalten, aber die
Konzentration der Vorwärts- und Rückwärts-Primer variiert und kombiniert (50nM, 300nM
und 900nM, Tabelle 8). Alle Kombinationen wurden in 4-fach Ansätzen durchgeführt, um
gleichzeitig die Reproduzierbarkeit zu testen. Der PCR-Lauf wurde anschließend nach
Standardbedingungen durchgeführt (Material und Methode 3.2.3.2.). Nach Abschluß des
PCR-Laufes wurden die CT-Werte der verschiedenen Tests als Mittelwert +/Standardabweichung
Primerkonzentration
der
galt
4-fach
die,
Ansätze
die
den
ermittelt
kleinsten
(Tabelle
8).
CT-Mittelwert
Als
mit
optimale
geringster
Standardabweichung aufwies. Für die STAT1-spezifsche Q-RT-PCR wurde hier daher
eine
Vorwärts-
und
Rückwärts-Primerkonzentration
von
mit
900/900nM
(Endkonzentration/Ansatz) ausgewählt.
CT-Werte (n=4)
Primerkonzentration
(F/R, in nM)
Mittelwert
Standardabweichung
A
50/50
32,3000
0,21494
B
300/50
31,2250
0,55073
C
900/50
31,2630
0,16581
D
50/300
32,4850
0,43493
E
300/300
31,4775
0,3476
F
900/300
31,2167
0,30172
G
50/900
31,9925
0,47105
H
300/900
31,0875
0,2886
I
900/900
30,8550
0,29411
Tabelle 8: Primeroptimierung
Um die optimale Sondenkonzentration zu der ausgewählten Primerkonzentration zu
wählen, wurde als einziger Faktor die Sondenkonzentration von 50nM bis 250nM (in
- 29 -
Ergebnisse
50nM Schritten) variiert. Auch hier wurden 4-Fach Ansätze durchgeführt. Die Auswertung
erfolgte wie bereits für die Primeroptimierung beschrieben. Tabelle 9 zeigt, dass eine
Sondenkonzentration von 250 nM den kleinsten CT-Mittelwert aufwies.
Sonden-
CT-Werte (n=4)
konzentration
Mittelwert
Standardabweichung
(in nM)
J
50
33.82
0.90249
K
100
33.07
0.20089
L
150
32.06
0.10985
M
200
31.02
0.32664
N
250
30.65
0.44642
Tabelle 9: Sondenoptimierung.
4.1.1.2 Bestimmung der Sensitivität und Q-RT-PCR Effizienz
Die Amplifikation aller zu untersuchenden mRNA Sequenzen (Zielgen und Referenzgen)
muß vergleichbar ablaufen, um die relative Quantifizierung auch bei geringen RNA
Mengen zu gewährleisten. Daher wurde anhand einer Verdünnungsreihe von RNA die
Sensitivität und Effizienz der STAT1-spezifischen Q-RT-PCR überprüft. Hierzu wurden
eine RNA Probe in 5 Schritten verdünnt (Tabelle 10) und nach Standardprotokoll in cDNA
umgeschrieben (Material und Methoden 3.2.3). Danach wurde eine Q-RT-PCR angesetzt,
bei denen die zuvor bestimmten optimalen Primer- und Sondenkonzentrationen
verwendet wurden. Die Ergebnisse zeigten eine gute Amplifizierbarkeit der RNA bis hin
zu 2,2 ng (Tabelle 10), allerdings war die Reproduzierbarkeit mit einem RNA Einsatz von
11 ng deutlich besser. Die Ermittlung der Q-RT-PCR Effizienz (E) anhand der
aufgetragenen CT-Werte (Y-Achse) gegen den Logarithmus der RNA Konzentration
(x-Achse) und der Gleichung [e=10(-1/Steigung a)] zeigte eine Effizienz von 2,1 (Abb. 7 ). Dies
kommt dem optimalen Wert von „2“ sehr nahe und ist auch mit der bereits vorliegenden
Effizienz des TBP-Assays (E=2,1) vereinbar.
- 30 -
Ergebnisse
RNA Einsatz für eine RNA Menge für eine Log [RNA]
CT-Wert
20 µl cDNA Synthese Q-RT-PCR Reaktion
(Mittelwert
Reaktion [ng]
[ng]
Standardabweichung)
3300
550
2,74
30,2 +/- 0,15
1650
275
2,44
31,8 +/- 0,23
330
55
1,74
33,9 +/- 0,26
66
11
1,04
35,6 +/- 0,46
13,2
2,2
0,34
38,1 +/- 1,01
+/-
Tabelle 10: Einsatzmengen und Ergebnisse des Effizienz-Tests
45
y=-3,1096x+39,094
40
R 2 =0,9904
Ct-Werte
35
30
25
-1
0
1
Log RNA
2
3
Abbildung 7: Sensitivität und Effizienz der STAT1 Q-RT-PCR. Gezeigt sind die Ergebnisse der
Q-RT-PCR Analyse von STAT1 mRNA in einer Verdünnungsreihe der RNA Einsatzmenge (log RNA).
CT-Werte sind auf der y-Achse angegeben. Je weniger RNA Einsatz desto höher der CT-Wert, mit
Korrelation von r²=0.9904.
4.1.1.3 Bestimmung der Q-RT-PCR Spezifität - Sequenzierung
Nachdem die optimalen Reaktionsbedingungen, die Sensitivität und Effizienz der
STAT1-spezifischen Q-RT-PCR geklärt waren, wurde abschließend die Spezifität mittels
Sequenzierung (Material und Methode 3.2.2.3) des Q-RT-PCR Produktes überprüft. Wie
in Abb. 8 gezeigt, stimmten die Sequenzen mit der Datenbank überein.
- 31 -
Ergebnisse
pGEM
S T A T 1 V o rw ä r ts
S T A T 1 R ü c kw ärs
Abbildung
8:
Sequenzierung
der
STAT1
Q-RT-PCR
Produkte.
Die
Graphik
zeigt
die
Sequenzergebnisse der STAT1-spezifischen Q-RT-PCR Produkte für den Vorwärts- und Rückwärtsprimer,
mit pGEM = Positivkontrolle.
4.1.2 STAT1 mRNA Expression in Ovarialkarzinomen
Mit dem etablierten STAT1-spezifischen und dem vorhanden TBP-spezifischen Assays
wurden die RNA Proben von Ovarialkarzinomen (n=106) und von normalem Ovar (n=29)
untersucht. Wie in Abb. 9 gezeigt, war die STAT1 mRNA Expression zwischen normalen
Ovarien und mikrodissektierten Tumorzellen von Ovarialkarzinomen ähnlich.
Abbildung 9: Vergleich STAT1 mRNA Expression
in normalen Ovarien und in Ovarialkarzinomen.
Y-Achse zeigt die relative STAT1 mRNA Expression.
No
Tu
- 32 -
4.2
STAT1,
P-STAT1,
MCM3
Ergebnisse
und
MCM5
Proteinexpression
in
Ovarialkarzinomen
Nach Bestimmung der STAT1 mRNA Expression wurde mit Hilfe der Immunhistochemie
die Proteinexpression von STAT1 (unphosphoryliert/inaktiv), Phospho-STAT1 (P-STAT1,
Tyrosin-phophoryliert/aktiv) und den STAT1-assoziierten Proteinen MCM3 und MCM5 in
situ an Gewebemikroarrays der Ovarialkarzinome und normalen Ovarien analysiert
(Material und Methoden 3.2.4). Für die Immunhistochemie mussten zunächst das
Färbeprotokoll für die verwendeten Antikörper etabliert werden.
4.2.1 Etablierung der Färbungen
Hierzu wurde ein Test-Gewebearray mit Kontrollgewebe (Lymphknoten, Ovarialkarzinom,
Kolonkarzinom
und
Zervixkarzinom)
(Gewebevorbehandlung,
benutzt,
Antigen-Demaskierung,
um
die
Reaktionsbedingungen
Antikörper
Verdünnung
und
Reaktionszeit) zu optimieren.
Wie in Abb. 10 A und B gezeigt, waren die optimalen Bedingungen für die STAT1
Immunhistochemie eine Antigen-Demaskierung in Zitratpuffer bei ph6 und eine 1:100
Verdünnung des STAT1 Antikörpers sowie für die P-STAT1 Immunhistochemie eine
Antigen-Demaskierung in Tris-Puffer bei ph10 und eine 1:50 Verdünnung des P-STAT1
Antikörpers.
Für die MCM3 und MCM5 Färbungen zeigten beide Antikörper eine Vorbehandlung in
Zitrat-Puffer ph6,0, eine 1:400 Verdünnung von MCM3 und eine 1:100 Verdünnung von
MCM5(Abb.11) die besten Ergebnisse.
- 33 -
A
Ergebnisse
B
1:50
A
Zitrat (pH 6)
1:100
Zitrat (pH 6) + Pronase
1:200
Tris (pH 10)
1:400
Abbildung 10: Ergebnisse der Färbeoptimierung von STAT1 (A) und PSTAT1 (B). A: Die 1:100
Verdünnung des STAT1 Antikörpers zeigt eine bessere zytoplasmatische Färbung. B: Die Vorbehandlung
mit Trispuffer ermöglichte eine Färbung von P-STAT1.
- 34 -
A
Ergebnisse
B
1:100
1:50
1:200
1:100
1:400
Abbildung 11: Ergebnisse der Färbeoptimierung von MCM3 (A) und MCM5 (B). A zeigt die
Austestung der Konzentrationsreihe von MCM3 auf Kolonkarzinom Schnitten, wobei eine 1:400
Verdünnung eine starke Nukleärfärbung mit geringstem Hintergrund aufwies. B zeigt die Austestung der
Konzentrationsreihe von MCM5 auf Schnitten von Zervixkarzinom. Die 1:100 Verdünnung wies eine
vergleichbare Zellkernfärbung wie die 1:50 Verdünnung auf, allerdings mit geringerer Hintergrundfärbung.
- 35 -
Ergebnisse
4.2.2 STAT1 und P-STAT1 Proteinexpression in Ovarialkarzinomen
Die Gewebearrays der Kollektivfälle wurden nach den in 4.2.1. etablierten Protokollen für
STAT1 und P-STAT1 gefärbt und semiquantitativ ausgewertet (Material und Methoden
3.2.4.3). Die statistische Analyse der unten beschrieben Daten zeigte, dass im Vergleich
zu normalen Ovarien sowohl die STAT1 (p < 0,0001) und P-STAT1 (p < 0,0001)
Proteinexpression in den Ovarialkarzinomen signifikant erhöht waren.
STAT1: Während die normalen Ovarien keine STAT1 Proteinexpression zeigten, waren in
den Ovarialkarzinomen verschiedene Muster der STAT1 Proteinexpression zu
beobachten (Abb 12): Eine komplett negative Färbung war in 29/107 (27,1%) Fällen zu
sehen, der Rest der Fälle zeigte Unterschiede in der Anfärbung von Tumor-assoziierten
Stromazellen (Fibroblasten) bzw. Lymphozyten, und von Tumorzellen (Tabelle 11). Bei
28/107 (26,2%) Fällen waren Stromazellen und Lymphozyten, nicht aber die Tumorzellen
STAT1 positiv, bei 23/107 (21,5%) der Fälle war das Stroma negativ aber die Tumorzellen
positiv und bei 27/107 (25,2%) der Fälle waren sowohl Stroma als auch Tumorzellen
STAT1 positiv. Die Lokalisation der STAT1 Färbung war größtenteils zytoplasmatisch, mit
der Ausnahme von 4 Fällen in denen eine nukleäre STAT1 Färbung in den Tumorzellen
beobachtet wurde.
STAT1
negativ
Stromazellen
Positivität
Anzahl
der 29/107
Stroma- und
Tumorzellen
Tumorzellen
Zytoplasma
Nukleus
28/107
27/107
19/107
4/107
26,2
25,2
17,8
3,7
Fälle (n/N)
Prozent (%)
27,1
Tabelle 11: Übersicht der STAT1 Positivität bei 107 Ovarialkarzinomen
- 36 -
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
Abbildung 12: Repräsentative Beispiele der STAT1 Färbung in Ovarialkarzinomen A und B: STAT1
färbt nur Stromazellen zytoplasmatisch, die die negativ gefärbte Tumorzellen begrenzten. C und D: STAT1
färbt Stromazellen und Tumorzellen zytoplasmatisch an. E und F: STAT1 färbt nur Tumorzellen aber
zytoplasmatisch und nukleär an.
- 37 -
Ergebnisse
P-STAT1: In normalen Ovarien konnte keine P-STAT1 Proteinexpression beobachtet
werden. Im Gegensatz dazu wurde in den untersuchten Ovarialkarzinomen häufig eine
P-STAT1 Positivität gefunden (Abb. 13). Diese P-STAT1 Proteinexpression war allerdings
zwischen
den
Ovarialkarzinomen
sehr
unterschiedlich,
insbesondere
die
zytoplasmatische und nukleäre Lokalisation sowie die Heterogenität innerhalb eines
Tumors, wobei die P-STAT1 Positivität auf die Tumorzellen (keine Stromazellen)
beschränkt war.
Eine negative P-STAT1 Färbung war in 19/105 (18,1%) der Ovarialkarzinome zu sehen.
Eine positive Anfärbung der Tumorzellen war in 47/105 (44,8%) der Ovarialkarzinome als
ausschließlich
zytoplasmatische,
ausschließlich
nukleäre
und
in
in
21/105
18/105
(20%)
der
Ovarialkarzinome
als
(17,1%)
der
Ovarialkarzinome
als
zytoplasmatische und nukleäre Färbung zu finden (Tab.12).
Interessant war dabei die Anordnung der P-STAT1 nukleär-positiven Tumorzellen
(Abb.13e,f,g): Es bildeten sich in unterschiedlichen Arealen des Tumors „Zell-Nester“,
bzw. „Zell-Foci“ von nukleär P-STAT1 positiven Tumorzellen, die sich in ihrer Anzahl
zwischen den Ovarialkarzinomen mit diesem Merkmal auch unterschieden. In 21/105
Fällen konnten mehr als 2 Foci von P-STAT1 positiven Tumorzellen (pro Areal der
Gewebestanze) gezählt werden. In der Nähe dieser Zell-Nester waren vereinzelt auch
Lymphozyten nukleär mit P-STAT1 angefärbt, eine Tatsache, die auf einen sehr
spezifischen und aktiven Prozess hinweist.
P-STAT1
Positivität
Tumorzellen
negativ
Zytoplasma
Zytoplasma
Nukleus
und Nukleus
Anzahl der
19
47/105
18/105
21/105
18,1
44,8
17,1
20
Fälle(n/N)
Prozent (%)
Tabelle 12.: Übersicht der P-STAT1 Proteinexpression in Tumorzellen der Ovarialkarzinome
- 38 -
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
G
Abbildung 13: Repräsentative Beispiele der P-STAT1 Färbung in Ovarialkarzinomen A und B:
zytoplasmatische Färbung in Tumorzellen C und D: zytoplasmatische und nukleäre Färbung in
Tumorzellen E: nukleäre Färbung in Tumorzellen F und G: „Zell-Nester“ von nukleär gefärbten
Tumorzellen
- 39 -
Ergebnisse
4.2.3 MCM3 und MCM5 Proteinexpression in Ovarialkarzinomen
MCM3: In normalen Ovarien sowie dem Tumor-assoziierte Stroma, bzw. in den
Lymphozyten der Ovarialkarzinome war keine MCM3 Proteinexpression zu beobachten.
Im Gegensatz dazu, zeigten die Tumorzellen der Ovarialkarzinome eine starke nukleäre
MCM3 Färbung, wobei unterschiedliche Anteile der Tumorzellen betroffen waren. In
27/105 (25,7%) Fällen waren 1-25% positive Tumorzellen, in 26/105 (24,8%) Fällen
26-50% positive Tumorzellen, in 27/105 (25,7%) Fällen 51-75% Tumorzellen und in
25/105 (23,8%) Fällen 75-100% MCM3-positive Tumorzellen zu sehen (Tabelle 13, Abb.
14).
MCM3
Tumorzellen
Positivität
1-25%
26-50%
51-75%
76-100%
Anzahl der Fälle (n/N)
27/105
26/105
27/105
25/105
Prozent (%)
25,7
24,8
25,7
23,8
Tabelle 13 Übersicht der MCM3 Positivität bei 105 Ovarialkarzinomen
MCM5: In einigen (4/29) normalen Ovarien wurde eine schwache zytoplasmatische
MCM5 Färbung beobachtet. Das Tumor-assoziierte Stroma sowie infiltrierende
Lymphozyten in den Ovarialkarzinomen waren dagegen MCM5 negativ. Von den
Ovarialkarzinomen, deren Tumorzellen MCM5 positiv waren, wiesen je 49/107 (45,8%)
der Fälle entweder eine ausschließlich zytoplasmatische, oder eine zytoplasmatische
und nukleäre MCM5 Proteinexpression auf. In 7/107 (6,5%) Fälle war ausschließlich eine
starke nukleäre MCM5 Proteinexpression zu sehen (Tab 14, Abb.15).
MCM5
Positivität
Tumorzellen
negativ
Zytoplasma
Zytoplasma
Nukleus
und Nukleus
Anzahl der Fälle (n/N)
2/107
49/107
49/107
7/107
Prozent (%)
1,9
45,8
45,8
6,5
Tabelle 14: Übersicht der MCM5 Positivität bei 107 Ovarialkarzinomen
- 40 -
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
G
H
Abb 14: Beispiele der MCM3 Proteinexpression in Ovarialkarzinomen nach dem Anzahl der nukleär
gefärbten Tumorzellen A und B: 1-25% C und D: 26-50% E und F: 51-75% G und H: 76-100%
- 41 -
Ergebnisse
Abb 15: Beispiele der MCM5 Färbung in Ovarialkarzinomen A und B: zytoplasmatische Färbung in
Tumorzellen C und D: zytoplasmatische und nukleäre Färbung in Tumorzellen E und F: starke nukleäre
aber schwache zytoplasmatische Färbung in Tumorzellen G: nur nukleäre Färbung in Tumorzellen
- 42 -
4.3
Korrelation
der
STAT1,
Ergebnisse
PSTAT1,
MCM3
und
MCM5
Proteinexpression zur Histologie und den klinischen Verlaufsdaten
Die STAT1 mRNA, die STAT1 und P-STAT1 sowie die MCM3 und MCM5
Proteinexpression wurden mit den Patientendaten (Alter), der Histologie (histologischer
Sub-Typ,
Grading)
sowie
den
klinischen
Verlaufsdaten
(Rezidiv-freies
und
Gesamtüberleben) korreliert (Material und Methoden 3.2.5). Es wurde keine signifikanten
Korrelationen zu den histopathologischen Daten gefunden. Eine Tatsache, die mit dem
einheitlichen Patientenkollektiv zu erklären ist und daher nicht näher beschrieben wird.
4.3.1 Korrelation der STAT1-, PSTAT1-, MCM3- und MCM5- Expression zu
klinischen Verlaufsdaten
Für die Überlebensanalysen nach Kaplan-Meier (Material und Methoden 3.2.5), wurden
die Patientinnen zunächst in zwei Gruppen - optimales (n=85) und nicht-optimales
Debulking (n= 27) - unterteilt, da dies per se einen klassischen prognostischen Marker
darstellt (vgl. Einleitung 2.1.4). Innerhalb dieser beiden Gruppen zeigte keiner der
bestimmten Marker einen signifikanten progostischen Wert, weder für das Rezidiv-freie
noch für das Gesamtüberleben.
Um bei der prognostischen Aussage auch den Einfluss der unterschiedlichen
Chemotherapien zu berücksichtigen, wurde in einem zweiten statistischen Ansatz der
prognostische Wert der STAT1, PSTAT1, MCM3 und MCM5 Expression bei Patientinnen
mit adjuvanter Taxol/Carboplatin Chemotherapie (n=68) untersucht. Für die anderen
Chemotherapie-Gruppen waren die Fallzahlen für eine statistische Analyse zu gering (vgl.
Tabelle 3), so dass ein Vergleich des prognostischen Wertes von STAT1 zwischen
verschiedene Chemotherapie-Gruppen nicht möglich war.
Die Ergebnisse für die Taxol/Carboplatin-Gruppe zeigten, dass eine hohe STAT1
Proteinexpression mit einem längeren Rezidiv-freien Überleben (p=0,0221) korrelierte
(Abb.16 A). Des Weiteren waren eine hohe STAT1 (p=0,0019) und PSTAT1 (p=0,0325)
Proteinexpression mit einem längeren Gesamtüberleben verbunden (Abb. 16 B,C).
- 43 -
Ergebnisse
A
B
C
Abbildung 16: Kolleration von STAT1 zum Rezidiv-freien (A) und Gesamtüberleben (B,C) bei
Patientinnen mit Taxol/Carboplatin (n=68). Die Abb. zeigt Kaplan-Meier Analyse wobei: rote Kurve =
niedrige STAT1 Expression, blaue Kurve = Mittelmäßige STAT1 Expression und magenta Kurve = hohe
STAT1 Expression.
- 44 -
Ergebnisse
4.3.2 Korrelation der STAT1, PSTAT1, MCM3 und MCM5 Expression
miteinander
Um zu klären inwieweit die Expression von STAT1, PSTAT1, MCM3 und MCM5 in den
Ovarialkarzinomen miteinander korrelieren, wurden die Marker untereinander verglichen.
Dies ergab eine Korrelation zwischen der STAT1 mRNA Expression und der STAT1
(p<0,0001) und PSTAT1 (p= 0,0004) Proteinexpression. Die STAT1 und PSTAT1
Proteinexpression korrelierten untereinander mit p=< 0,0001.
Die STAT1 mRNA Expression korrelierte ebenfalls mit der MCM3 (p = 0,0005) und MCM5
(p = 0,0118) Proteinexpression. Auch die STAT1 Proteinexpression korrelierte mit MCM3
(p= 0,0317) und MCM5 (p = 0,0346) Proteinexpression. Im Gegensatz dazu war die
PSTAT1 Proteinexpression nicht mit der MCM3 (p =0,8732) oder MCM5 (p = 0,261)
Proteinexpression korreliert.
- 45 -
Diskussion
5 Diskussion
Das Ovarialkarzinom ist die siebt-häufigste Krebserkrankung bei Frauen und ist, nach
dem Mammakarzinom, die häufigste Todesursache gynäkologischer Krebserkrankungen.
Die 5-Jahres-Überlebensrate ist trotz Fortschritte in der Diagnostik und Behandlung mit
ca. 20-25% gering. Die Identifizierung molekularer Prognosemarker könnte verbesserte
und individualisierte Therapieprotokolle ermöglichen.
Die Proteine der „Signal Transducer and Activator of Transcription“ (STAT) Familie
übertragen unter streng regulierten physiologischen Bedingungen Signale von Zytokinund Wachstumsfaktor-Rezeptoren sowie von intrazellulären Tyrosinkinasen in den
Zellkern und schalten damit die Transkription von spezifischen Genen an. Damit werden
definierte zelluläre Funktionen, wie z.B. Zellproliferation, gesteuert. Eine aberrante
Expression von STAT Proteinen, bzw. deren dauerhafte Aktivierung, wurde in
verschiedenen humanen Tumoren beschrieben (Yu und Jove, 2004). Dabei ist STAT3
bisher am besten untersucht und wird bereits als Onkogen bezeichnet (Calo et al, 2003).
Im Gegensatz dazu gibt es zwar einige Daten zu den physiologischen, aber kaum Daten
zu den pathologischen Funktionen von STAT1, insbesondere betroffenen maligne
Tumoren. So ist bekannt, dass STAT1 sich negativ auf die Proliferation und
Metastasierung von Tumorzelllinien auswirkt und zu einer verminderten Angiogenese
führen kann (Huang et al, 2002). Des Weiteren war zu beobachten, dass eine erhöhte
STAT1 Expression bei gleichzeitigem Vorliegen einer P53 oder BRCA1 Mutation zu einer
vermehrten Tumorzellapoptose führte (Welcsh et al, 2001,Townsend et al, 2004). Es
konnte für Mammakarzinome gezeigt werden, dass eine hohe STAT1 Aktivität mit einer
besseren Prognose einher ging (Widschwendter et al, 2002). Somit könnte STAT1 eher
ein Tumorsuppressorgen als ein Onkogen darstellen (Bromberg et al, 1996, Kaplan et al,
1998). Die STAT1 Expression in Ovarialkarzinomen sowie deren mögliche prognostische
Bedeutung sind bisher noch nicht bekannt.
Ziel dieser Studie war es daher die mRNA und Proteinexpression von STAT1 und den
STAT1-assoziierten „MiniChromosome-Maintenance“ Proteinen MCM3 und MCM5 in
- 46 -
Diskussion
epithelialen Ovarialkarzinomen des Stadiums IIIc zu untersuchen und auf ihren
prognostischen Wert hin zu überprüfen. Da dies die Auswahl und Untersuchung eines
homogenen Patientenkollektives voraussetzte, konzentrierte sich die Diskussion daher
auf die mögliche biologische und klinische Bedeutung des STAT1 Signalweges in
epithelialen Stadium IIIc Ovarialkarzinomen.
Die im Ergebnisteil vorgestellten Daten zeigen, dass die Analyse der ausgewählten
Marker sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene in allen der Formalin-fixierten und
Paraffin-eingebetteten Gewebe möglich war. Die Sensitivität, Spezifität und Effizienz der
neuen STAT1 Q-RT-PCR wurden bestimmt und zeigten optimale Werte. Für die
Proteinanalyse konnten die Färbungen für die ausgewählten Primärantikörper
(STAT1,PSTAT1,MCM3,MCM5) an Serienschnitten der Formalin-fixierten und Paraffineingebetten Gewebeproben etabliert werden.
5.1 Die Bedeutung des STAT1 im Signalweges in Ovarialkarzinomen
Die Aktivierung des STAT1 Signalweges kann über drei Mechanismen erfolgen
(Einleitung, Abb. 2), wobei die Kaskade IFNγ-JAK-STAT1 einen Schwerpunkt einnimmt
und hauptsächlich immunologische Kontrollfunktionen, wie z.B. anti-virale Aktivität, sowie
anti-proliferative Funktionen stimuliert.
Die untersuchten Ovarialkarzinome zeigten in 51,4% der Fälle eine STAT1 positive
Proteinexpression in den Tumor-assoziierten Stromazellen mit oder ohne gleichzeitige
Expression in den Tumorzellen. Dies betraf vor allem Fibroblasten und Lymphozyten, die
die Tumorzellen eingrenzten (vgl. Abb.12 A, B). Es ist anzunehmen, dass der
entstehende Tumor eine Stromareaktion mit vermehrter Produktion von IFNγ anregt und
so zu einer erhöhten und aktivierten Tumor-assoziierten Lymphozyten bzw. Fibroblasten
Population
führt.
Die
genaue
Rolle
erhöhter
STAT1
Proteinexpression
in
Tumor-assoziierten Lymphozyten oder Fibroblasten ist bis jetzt noch nicht geklärt.
Allerdings könnte ein Tumor-Stroma-Milieu vorliegen, das über IFNγ und STAT1 die
Lymphozyten-Infiltration
weiter
unterstützt
und
so
eventuell
auch
eine
Lymphozyten-vermittelte Immunreaktion, die sich gegen den Tumor richtet, ermöglicht.
- 47 -
Diskussion
Tatsächlich hatten in der vorgelegten Studie Ovarialkarzinom-Patientinnen mit adjuvanter
Taxol/Carboplatin Therapie und mit STAT1-positiven (Lymphozyten und Tumorzellen)
Tumoren ein signifikant längeres Rezidiv-freies und Gesamt-Überleben als Patientinnen
mit STAT1-negativen Tumoren. Eine mögliche
immunologische
Kontrolle
von
Ovarialkarzinomen mit einhergehender STAT1 Aktivierung und die damit assoziierte
stärkere Induktion von Tumorzell-Apoptose ist daher denkbar.
Im Gegensatz dazu ist interessant, dass bei einigen Patientinnen (25,2%) ausschließlich
Tumorzellen eine zytoplasmatische (21,5%) oder nur nukleäre (3,7%) STAT1 Expression
aufwiesen. Dies könnte entweder durch eine Zytokin-vermittelte Reaktion und STAT1
Aktivierung entstanden sein, wie sie z.B. auch durch IFNγ in vitro bei Tumorzelllinien
induziert werden kann (Lillemeier et al, 2001), oder auch dadurch, dass die Tumorzellen
konstitutiv aktiviertes STAT1 besitzen, wie es z.B. auch für STAT3 bekannt ist
(catlette-falcone et al, 1999, Yu und Jove, 2004 ).
Ähnlich wie bei der positiven STAT1 Expression, war auch die Phospho-STAT1
Proteinexpression in Ovarialkarzinomen, zumindest bei Patientinnen mit adjuvanter
Taxol/Carboplatin Therapie, mit einem längeren Gesamtüberleben korreliert. Interessant
waren zwei Beobachtungen:
1. Die P-STAT1 Proteinexpression wurde nur in 37,1% der Fälle im Zellkern der
Tumorzellen detektiert. Es ist bekannt, dass nur ca. 1/3 der STAT1 Proteine bei
Aktivierung des Signalweges aktiviert werden und somit als P-STAT1 in den Zellkern
wandern (Haspel et al, 1996, Vinkemeier, 2004). Auch wurde gezeigt, dass
STAT-Proteine zwischen Zytoplasma und Nukleus unabhängig von externer
Stimulation pendeln können (Meyer et al, 2002) und dies auch für unphosphoryliertes
STAT1 gilt (Chatterjee-kishore et al, 2000). Beide Mechanismen könnten die geringe
nukleäre P-STAT1 Positivität erklären. Des Weiteren könnte der nukleäre Import des
P-STAT1 in den Tumorzellen blockiert sein. In der STAT1-spezifischen DNA
bindungsdomäne befindet sich ein sognannten „nuclear localisation signal“ (NLS)
(Melen et al, 2001), das als „dimer-specific“ NLS (dsNLS) für das Einschleusen von
(P-)STAT1 in den Zellkern verantwortlich ist (Meyer et al, 2002). Ein Fehlen oder
- 48 -
Diskussion
Blockieren der NLS wäre für eine Akkumulation von P-STAT1 im Zytoplasma
verantwortlich und würde die zytoplasmatische P-STAT1 Proteinexpression in 44.8 %
der untersuchten Ovarialkarzinome (vgl. Tabelle 12, Abb. 13) erklären.
2. Bei den 20% der Fällen mit nukleärer P-STAT1 Expression war das Färbemuster im
Tumorareal nicht homogen, sondern fokal als Tumorzellnester zu sehen (vgl. Abb. 13
E,F,G). Diese fokal auf Tumorzellnester begrenzte P-STAT1 Expression könnte eine
spezifische, evtl. auch prognostisch relevante Tumorzell-Subpopulation darstellen,
die z.B. durch genetische Veränderungen STAT1 konstitutiv aktiviert. Die
Tumorzellnester korrelierten weder mit einer parallelen Expression von MCM3 und
MCM5 (vgl. Abb. 14, Abb. 15) noch mit der Infiltration von CD3 oder CD20-positiven
T- oder B-Lymphozyten (Daten nicht gezeigt), so dass eine durch das
Tumor-Stroma-Milieu
verursachte
und
lokal
begrenzte
(IFNγ)
Stimulation
auszuschließen ist und eher an eine konstitutive Tumorzell-spezifische STAT1
Aktivierung zu denken ist.
Um zu überprüfen inwieweit die Regulation der STAT1 und P-STAT1 Proteinexpression
von der STAT1 mRNA Expression abhängig ist, wurden die STAT1 mRNA Werte mit den
STAT1 Proteindaten in den Ovarialkarzinomen korreliert. Die Daten zeigten, dass STAT1
mRNA, Proteinexpression (STAT1) und Aktivität (P-STAT1) miteinander signifikant
korrelierten. Allerdings war auf mRNA Ebene weder ein Unterschied zwischen normalen
Ovarien und Ovarialkarzinomen noch eine signifikante Korrelation zum Überleben zu
sehen. Dies könnte dadurch erklärt werden, dass die STAT1 mRNA Expression nicht so
stabil ist (Abril et al,1998) wie die STAT1 Proteinexpression (Haspel et al,1996) und der
mögliche schnelle Abbau der STAT1 mRNA in den operierten Ovarialkarzinomen nicht zu
erfassen war. Trotzdem unterstützt die enge Korrelation der STAT1 mRNA und
Proteinexpression sowie der Aktivität (P-STAT1) in Ovarialkarzinomen die Bedeutung
des STAT1-Signalweges für die Entstehung und Progression von Ovarialkarzinomen.
Wichtig ist, dass ein deutlicher Unterschied zwischen normalen Ovarien und
Ovarialkarzinomen, bzw. insbesondere zwischen Patientinnen mit guter oder schlechter
Prognose, nur auf Basis des aktivierten STAT1 Proteins (P-STAT1) und nicht auf STAT1
- 49 -
Diskussion
mRNA zu sehen ist. Dies würde die mögliche zukünftige Anwendung von STAT1 als
zusätzlichen prognostischen Marker erleichtern, da immunhistologische Färbungen
einfach in die Routinediagnostik einzubauen wären. Auch wäre zu überlegen, ob man
den STAT1 Signalweg therapeutisch nutzen könnte, z.B. durch Steigerung der STAT1
Aktivität mittels IFNγ-Stimulation. Tatsächlich war allein die STAT1 Proteinexpression,
bzw. Aktivität prognostisch relevant, nicht jedoch die mRNA Expression. Sowohl die
STAT1 als auch P-STAT1 Proteinexpression korrelierten signifikant mit dem
Gesamtüberleben. Dabei war eine starke STAT1 und/oder P-STAT1-Proteinexpression in
Stroma- und/oder Tumorzellen mit einer besseren Prognose assoziiert. Während die
STAT1 Expression in den Stromazellen, wie bereits oben diskutiert, eine mögliche
immunregulatorische, anti-Tumor Rolle spielt, wäre die günstige Auswirkung der
Tumorzell-spezifischen STAT1 Expression eher mit einer Rolle von STAT1 als
Tumorsuppressorgen zu vereinbaren. Somit sollte eher der Verlust, nicht aber die
Aktivierung von STAT1 in Tumorzellen zur Progression von Ovarialkarzinomen beitragen.
Eine mögliche Rolle von STAT1 als Tumorsuppressor ist nicht auszuschließen, da die
STAT1 Aktivität anti-proliferativ wirkt (Ramana et al, 2000). Auch in anderen
gynäkologischen Tumoren, wie z.B. dem Mammakarzinom (Widschwender et al, 2002)
konnte eine solche prognostische Relevanz der STAT1 Proteinexpression gezeigt
werden.
5.2 Die Bedeutung der MCM3 und MCM5 Proteinexpression in
Ovarialkarzinomen
Neben
der
STAT1
Expression
wurde
in
der
vorgelegten
Studie
auch
die
Proteinexpression der STAT1-assoziierten Marker MCM3 und MCM5 untersucht, um hier
eine weitere Komponente des STAT1 Signalweges in Ovarialkarzinomen zu bestimmen.
Die Funktion der MCM Proteine ist im Wesentlichen die DNA Replikation. MCM Proteine
sind Komponenten des DNA Replikations „licensing-systems“, das die einmalige DNA
- 50 -
Diskussion
Replikation jedes Zellzykluses garantiert (Tye, 1999). Somit stellen die MCM Proteine
auch einen Marker für den Zellzyklus dar (Ha et al, 2004, Freeman et al, 2003).
Insbesondere
scheinen
die
MCM
Proteine,
vergleichbar
mit
anderen
Chromatin-assoziierten Markern wie cdc6, Zielproteine für die Phosphorylierung durch
Zytokin-unabhängige Kinasen zu sein, deren abnorme Regulation zur unkontrollierten
DNA Replikation führen kann (Ishimi et al, 2003). In „ruhenden“ Zellen und
ausdifferenzierten Zellen nimmt die MCM Proteinexpression stark zu. In normalen
Geweben findet sich die MCM Expression fokal auf Proliferationsareale begrenzt. In
dysplastischen oder invasiv malignen Zellen ist die Expression von MCM Proteinen sehr
prominent (Ishimi et al, 2003, Freeman et al, 2003), wobei z.B. die MCM3 Expression
verglichen mit den Proliferationsmarkern Ki-67 in Zervixkarzinomen deutlicher
ausgeprägt ist (Ha et al, 2004). Eine Assoziation von MCM Proteinen mit Zellmalignität ist
daher anzunehmen.
In dieser Studie wurde die MCM3 und MCM5 Proteinexpression in malignen
Ovarialkarzinomen bestimmt. Die Daten zeigten eine starke nukleäre MCM3
Proteinexpression in allen Ovarialkarzinomen und auch das MCM5 Protein war in den
meisten Ovarialkarzinomen (98,1%) als positive Tumorzellfärbung zu finden. Im
Gegensatz dazu, war in allen untersuchten normalen Ovarien sowie in dem
Tumor-assozierte
Stroma
der
Ovarialkarzinome
keine
signifikante
MCM3
Proteinexpression zu beobachten. Das MCM5 Protein lag sehr schwach im Zytoplasma
der normalen Ovarzellen vor und war im Tumor-assozierte Stroma negativ. Diese Daten
deuten daher auf eine Assoziation der MCM3 und MCM5 Proteinexpression mit der
Proliferation maligner Ovarialkarzinomzellen hin.
Eine weitere wichtige funktionelle Rolle der MCM Proteine ist die Regulation der
transkriptionellen Aktivität von STAT1 (Forsburg, 2004). So konnte durch Ausschalten der
MCM5 mRNA mittels sgn. „small inhibitory RNA“ (siRNA) eine verminderte Expression
der STAT1-induzierbaren Gene, nicht aber von STAT1 Expression oder Aktivierung
nachgewiesen werden (Synder et al, 2005). Hier konnte gezeigt werden, dass die MCM3
und MCM5 Proteinexpression in den Tumorzellen der Ovarialkarzinome sehr stark
- 51 -
Diskussion
nukleär ausgeprägt war. Während die STAT1 Expression mit der MCM3 und MCM5
Proteinexpression korrelierte, war dies für PSTAT1 nicht der Fall. Dies könnte daran
liegen, dass die Interaktion von STAT1 und MCM Molekülen auch durch die STAT1-Serin
Phosphorylierung bestimmt wird, die in dieser Studie nicht untersucht worden ist.
Es ist allerdings anzunehmen, dass auch die STAT1 oder STAT1 induzierte
Transkkriptionsaktivität die DNA Replikation beeinflusst und die IFNγ−Stimulation des
STAT1 Signalweges die Zellproliferation durch Blockierung der G1 zu S Phase
verhindern kann. Liegen Mutationen der STAT1 Bindungsstelle (Serin727) für MCM(5)
Proteine vor, kann diese Blockierung der Zellproliferation durch den STAT1 Signalweg
aufgehoben werden (Zhang et al, 1998, Bromberg et al, 1996). Die Interaktion zwischen
STAT1 und MCM Proteinen steuert also zwei verschiede wichtige zelluläre Prozesse, die
DNA Replikation und die Zytokin induzierte Transkription (Danvonseca,et al 2001). Die
Balance zwischen den Interaktionen ist somit verantwortlich für die Auswirkungen auf
die DNA Replikation und Zellproliferation.
5.3 Fazit
Diese Studie hat den STAT1-Signalweg als neuen prognostisch-relevanten Marker für
Patientinnen mit fortgeschrittenen Ovarialkarzinomen identifiziert. Dabei scheint sich eine
hohe STAT1 Aktivität günstig auf das Rezidiv-freie und Gesamtüberleben bei adjuvanter
Taxol/Carboplatin Chemotherapie auszuwirken.
Des
Weiteren
besteht
eine
Assoziation
des
STAT1
Signalweges
mit
der
Proteinexpression der MCM3 und MCM5 Proteine in Tumorzellen von Patientinnen mit
Ovarialkarzinomen.
- 52 -
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Danksagung
Danksagung
Ich möchte zuerst Herrn Prof. Martin Werner für das interessante Thema und für die
freundliche Übernahme meiner Doktorarbeit bei ihm im Pathologischen Institut und noch
für die große Unterstützung beim Antrag an Dr. Heinrich Kircher-Stiftung danken.
Weiterhin möchte ich mich bei Frau PD. Dr. Hasenburg dafür bedanken, dass sie mir den
ersten Blick auf Operation auf Patientin mit Ovarialkarzinom in Deutschland gezeigt hat
und sich als Zweitgutachter meiner Promotion zur Verfügung stellte.
Mein ganz besonders Dank gilt Frau Dr. Silke Lassman für die Betreuung meines
Aufenthalts in Freiburg und für die große Hilfebereitschaft während der gesamten
Doktorarbeit insbesondere bei der Korrektur der Doktorarbeit. Sie ist mir immer ein gutes
Vorbild gewesen. Die gemeinsame Arbeit im Labor hat mir viel Freude gemacht und auch
viel Kenntnisse gelehrt.
Bei Herrn Prof. Axel ZurHausen und Frau Dr. Ulrike Gerlach möchte ich mich für die
Begutachtung
dessen
Archiv
und
der
immuhistochemischen
Analyse
von
Ovarkarzinomen bedanken.
Bei Anja Schopflin, Jasmine Roth und Evylen Wätzig möchte ich für die ausgezeichnet
Zusammenarbeiten und gute Betreuung während meinem Aufenthalt in Freiburg. Frau
Lieselotte Bokle gilt mein Dank für ihre Hilfe bei der Durchführung der histochemischen
Färbung.
Alle anderen hier namelich nicht genannten Mitarbeiten im pathologischen Institut danke
ich für die gute Zusammenarbeit.
Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei Herrn Rektor Prof. Guobing Wang und
Herrn Prof. Zhongbi Wu in China für die große Unterstützung meinen Arbeiten in Freiburg.
Sie haben mir die Möglichkeit diesen wissenschaftlichen Austausch gegeben und großen
Vertrauen in meinen Arbeiten aufgezeigt.
Den größten Dank möchte ich meiner Familie aussprechen. Sie haben mir ihre möglichst
Riesenhilfe gegeben und waren immer für mich da gewesen, die Schwierigkeiten zu
überwinden.