Punktate – Möglichkeit und Grenzen der - Ostschweiz
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Punktate – Möglichkeit und Grenzen der Immunphänotypisierung Dr. med et phil. nat Paula Fernandez Abteilungsleiterin FACS/Stammzell-Labor Kantonsspital Aarau AG Herbstweiterbildung labmed Sektion Ostschweiz St. Gallen 26.10.2013 Themen Einführung Besonderheiten der Proben Immunphänotypisierung: Vor- und Nachteile Fall-Beispiele Zusammenfassung Diagnostische Punktionen Fragestellung allgemein entzündlich infektiös neoplastisch auto-immuner Prozess Wichtig Pre-Analytik: Verlangte Analyse? -> Klinik? Fragestellung? Therapie? Probenbehandlung Entnahmetechnik: Wie? Reihenfolge? Entnahmeröhrchen: Antikoagulans? (EDTA/Heparin), kein Fixativ! Probentransport: Transportdauer, Temperatur (RT) Probenannahme: Art des Materials? Aussehen? Punktionsort? Entnahmezeit? Punktate sind “spezielle Proben” (Liquor, BAL, Ascites, Pleura, FNP, Biopsie, Augenflüssigkeit….) Warum? Haben andere Charakteristiken als die gewohnten Proben (Blut, KM) -> Zur Resultat-Optimierung braucht es Anpassungen bezüglich Lagerung, Probenvorbereitung und Probenverarbeitung Andersartigkeit bezüglich: Zellzahl / Zellkonzentration Zellviabilität Probenvolumen Probenzusammensetzung Wiederholbarkeit der Probengewinnung Charakteristiken Punktat Zellzahl Liquor tief klein sehr kurz klein FNP tief klein kurz klein BAL tief klein kurz gross Ascites variabel variabel kurz klein Pleura variabel variabel kurz klein Biopsie hoch hoch länger klein Konz Viabilität Vol Welche Methoden-Anpassungen sind sinnvoll? Zellzahl: Verringerung der Manipulationen, kürzere EC-Lyse Zellkonzentration: Konzentrieren/Verdünnen Zellviabilität: Sofort verarbeiten (Proben-Anmeldung / Annahmezeiten begrenzen/ Probenentnahme besprechen (Aufbewahrungslösung) / Probentransport organisieren), Viabilitätsindikator Probenvolumen: Konzentrieren/Verdünnen, Reserve zurückbehalten Zusammensetzung: zerstückeln (Biopsien), filtrieren (BAL) Probenbeurteilung Eingangskontrolle Beschaffenheit: blutig (kontaminiert?), ikterisch, lipidhaltig, geronnen, verklumpt Zellkonzentration: cave Zellzählung! Zellviabilität: erst anhand Daten möglich Erhaltenes Probenvolumen Dokumentieren; falls (zu) klein: hat andere Abteilung noch vom gleichen Material etwas übrig? Chemie braucht nur Überstand. Verarbeiten! kostbares Probenmaterial! Analyse durchführen! Probleme dokumentieren und im Befund angeben, ev. Interpretation anpassen Prinzip der multiparameter Analyse Gleichzeitige Messung verschiedener Charakteristiken einer EINZELNEN Zelle, die eine Lichtquelle passiert • Physische Eigenschaften (SSC/FSC) durch Messung der Licht-Streuung -> Grösse (FSC) -> Zellkomplexität (SSC) • Bindung von spez. Antikörpern, die Fluoreszenz- markiert sind Emittiertes Licht der an die Zellen gebundenen, fluoreszierenden mAK wird gemessen: Abdcerotec.com Immunphänotypisierung: Jeder Zelltyp hat ein charakteristisches Antigenprofil Bone marrow pluripotent hematopoietic stem cell Bone marrow common lymphoid progenitor B cell neutrophil eosinophil T cell Effector cells plasma cell megakaryocyte/ erythrocyte progenitor Blood Granulocytes (or polymorphonuclear leukocytes) common myeloid progenitor activated T cell granulocyte/macrophage progenitor basophil unknown precursor immature dentritic cell megakaryocyte erythroblast platelets erythrocyte monocyte Tissues mast cell Lymph nodes macrophage immature dendritic cell mature dendritic cell Datenrepräsentation Zellkomplexität Eosinophile „Granularität“ Granulozyten Monozyten Lymphocyten Rote Vorstufen Zellgrösse Datenrepräsentation „Granularität“ Zellgrösse Jeder Punkt ist eine Zelle CD45 Expressionsstärke Pan-Leukocyten Antigen Knochenmark: „normal“ „Granularität“ normal Eosinophile Neutrophile „Vorläuferzellen“ Monozyten Erythroide Lymphozyten CD45 Expressionsstärke Die Kenntnis des „normalen“ ist die Voraussetzung zur Erkennung von „abnorm“ • Zusammensetzung des Probenmaterials (Liquor, PB, KM) • Alter • Therapie des Patienten (zB Steroide, mAk) • Zellreifung • Zelldifferenzierung • Zellaktivierung Normale Probenzusammensetzung peripheres Blut debris enthält: reife Granulocyten reife Monocyten dendritische Zellen Lymphocyten No debris keine: unreifen Zellen CD45+(dim) (hier: B-ALL) Probenstabilität: 48h, Aufbewahrung bei RT -> korrekte Probe für hämatologische Neoplasien, Immunstaten, PNH, CVID, funktionelle Tests Normale Probenzusammensetzung Liquor cerebrospinalis Enthält: reife Monocyten Lymphocyten: T-Zellen keine: (fast) keine B-Zellen! keine Granulocyten keine EC Probenstabilität: Minuten!, Aufbewahrung bei RT -> kein Antikoagulans nötig Probenstabilität Liquor Zeit nach Entnahme 30 min 60 min 90 min Zellviabilität 50% 20% 10% Dux et al, J Neurol Sci, 1994; 121; 74-78 • beeinflusst durch Suspensions-Medium • Zelltyp (hohe Proliferationsrate (Burkitt), pro-apoptotic state • Behandlung (z.B. Steroide) -> „Heilen“ Sie Ihren Patienten nicht durch Analyse von altem Liquor! (Garbage in – Garbage out) Pathologischer Liquor enthält: Neutrophile Monocyten Lymphocyten Blasten -> Kontamination mit Blut (B-ALL) (Peripherblut vom gl. Tag) enthält: Lymphocyten Blasten ->Burkitt Lymphom Normale Probenzusammensetzung Lymphknoten enthält: Lymphocyten (T- und B-Zellen) dendritische Zellen (Antigenpräsentation) keine: keine Granulocyten keine Monocyten Cave: Lymphknoten= Ort der B-Zell Reifung. Enthält follikuläre B-Zellen und Mantel-B-Zellen -> keine Verwechslung zwischen Lymphom und reaktiven follikulären B-Zell-Hyperplasien Häufige Fragestellung: reaktiv versus Infiltration durch Lymphom Charakteristiken: Liquor • Zellzahl: tief • Zellkonzentration: tief • Zellviabilität: sehr kurz! • Probenvolumen: klein • Probenkontamination: peripheres Blut (iatrogen, Blutung?) -> kostbares Probenmaterial, Analyse durchführen, Probleme dokumentieren und angeben, ev. Befund anpassen Charakteristiken: FNP (Feinnadelpunktion) • Zellzahl: tief • Zellkonzentration: tief • Zellviabilität: kurz (ca. 4-6 Stunden) • Probenvolumen: variabel, eher gross • Probenkontamination: mit peripherem Blut -> sofort verarbeiten; cave: Entnahmetechnik entscheidend: bei wiederholt schlechten Proben Rücksprache und ev. Schulung der Punkteure Charakteristiken: Biopsie • Zellzahl: variabel, meist genügend • Zellkonzentration: variabel • Zellviabilität: länger (intakt bis 12 Stunden ok) • Probenvolumen: variabel, Gewebestück • Probenkontamination: ev. mit peripherem Blut -> Probenvorbereitung: Zellen aus Material herauslösen -> Spritze aufgezogen mit NaCl (oder PBS oder Medium), NICHT enzymatisch (Trypsin etc)! Charakteristiken: BAL (Broncho-alveoläre Lavage) • Zellzahl: tief • Zellkonzentration: tief • Zellviabilität: kurz (übernacht ok) • Probenvolumen: gross • Probenkontamination: mit Schleim und amorphem Material -> zuerst Material filtrieren (Gaze/Glastrichter), dann konzentrieren Charakteristiken: Ascites/ Pleura • Zellzahl: variabel • Zellkonzentration: variabel • Zellviabilität: kurz (zu wenig Erfahrung) • Probenvolumen: variabel, genügend • Probenkontamination: mit peripherem Blut Vorgehen minimale Probe (Bsp: Liquor) Screening Röhrchen 1/3 der Probe Färben, Acquirieren, Analysieren Positiv (abnorm) Negativ (normal) Wiederholung mit identischem Panel Charakterisierung der patholog. Zellen mit adaptierten Panel Verarbeitung der restlichen 2/3 der Probe Immunphänotypische Analyse von Populationen CD19+ B-Zellen CD3CD19NK-Zellen CD3+T-Zellen Normale NK-Zellen normale NK-Zellen sind CD56+, CD38+, CD5- Normale T-Zellen T-Zellen sind CD5 CD8+ CD4+ CD38+ aktivierte T-Zellen CD56+ Effektor T-Zellen Normale B-Zellen polyklonal Naive T-Zellen sind CD5+ CD5+ Lymphome, klonal CD19+CD20+ Normalerweise CD38+ Expression: ->Differenzierung in Plasmazellen -> unreife B-Zellen: CD45+(dim) -> B-Zell Lymphome (u.a. Burkitt) Probenvorbereitung (Bsp: Liquor) Zellkonzentration durch Zentrifugation (540g; 10min) Überstand in sep.Röhrchen, Zellpellet waschen (2ml; PBS/BSA) Zentrifugieren, Zellpellet resuspendieren (300µl; PBS/BSA 0.5%)) 1/3 färben (15min, dunkel, RT) Lyse (2ml, FACSlyse) (nur 5min!, dunkel, RT) Zentrifugieren, Zellpellet waschen (2ml) resuspendieren in PBS (200µl) Datenakquisition (leerlaufen lassen) Themen Einführung Prä-Analytik Besonderheiten der Proben Immunphänotypisierung: Vor- und Nachteile Fall-Beispiele Zusammenfassung Immunphänotypisierung (FACS-Analyse) Methode zur Abklärung hämatopoetischer Erkrankungen (Exklusiv: M. Hodgkin) Quantifizieren von Zellpopulationen / Quantifizieren der Expression eines bestimmten Oberflächenmoleküls „Qualitative“ Beurteilung von Zellpopulationen anhand der Expression mehrer (aussagekräftiger) Oberflächenmoleküle -> Fragestellung: abnorm? normal? Indikationen für FACS Blasten in PB oder KM: -> immer Atypische Zellen in Körperflüssigkeiten: -> haematopoietische Zellen? Reaktiv vs neoplastisch -> grössere Sensitivität und Spezifität als ausschliesslich Morphologie / MoZytologie alleine Monoklonale Gammopathien, Plasmocytosen Plasmazell-Dyskrasien (MM/MGUS), B-NHL, DD reaktive Plasmozytose Organomegalien/ Gewebeinfiltrationen Lymphadenopathien, Splenomegalie, Hepatomegalie, Hautinfiltrationen, lytische Knochenläsionen -> Ausnahme: M. Hodgkin Stärken Schnell (2-3h) Spezifisch und sensitiv (abhängig von # analysierten Parameter und Anzahl acquirierter Zellen (10-5)) Breite Anwendungsmöglichkeit in Bezug auf Probenmaterial (Blut, Punktate, Aspirate, Biopsien) und hämatopietische Erkrankung Diagnose / Klassifikation (Prognose) / Minimale Restinfiltration (MRD) Bei zellarmen Materialien (zB Liquor) können alle in der Probe vorkommenden Zellen untersucht werden Limitationen Analytik Analytische Sensitivität ist abhängig von: Ausmass des aberranten Immunphänotyps Immunphänotyp der Hintergrundpopulation Anzahl acquirierter Events/ Infiltrationsgrad Auswahl des Panels (informative mAk-Kombination?) Qualität des Probematerials Verfügbare Reagenzien (wenige für Basos, Eos) Falsch negative Resultate: Inadäquates Material Keine Anfärbung Kappa/Lambda Sampling error Periphere T-Zell Lymphome M. Hodgkin Falsch positive Resultate Kontamination (zB mit peripherem Blut) Cave abnorme Kappa/Lambda Ratio ohne abnormen Immunphänotyp! Schwächen Ungenügend standardisiert (Probenverarbeitung / Instrumenten Einstellung / Panels / Datenanalyse und Interpretation / Befund) Dateninterpretation stark abhängig von Kenntnis des normalen (Ausreifung der verschiedenen Zell-Linien, Aktivierungsstadium der Zellen, abnorme (neoplastische) Immunphänotype Aktuelles Konzept zur Wahl des Panels (AK-Kombinationen) Standardisiertes Vorgehen (Probenverarbeitung / Instrumenten Einstellung / Panels / Datenanalyse und Interpretation / Befund) Konsortium (10 internationale Labors, EU-Grant (Millionen), 6 Jahre Testung) Screening basiert auf Klinik Clinic Screen Classification Themen Einführung Prä-Analytik Besonderheiten der Proben Immunphänotypisierung: Vor- und Nachteile Fall-Beispiele Zusammenfassung Immunphänotypische Analyse: Die Strategie • Identifizierung • Quantifizierung • Charakterisierung Jeder Population der Probe Immunphänotypische Charakterisierung neoplastischer Zellen • Zuordnung zu einer Zell-Linie • Bestimmung des Reifegrades • aberranter Immunphänotyp - erhöhte/erniedrigte Antigen Expression - asynchrone Expression - aberrante Expression eines Antigens Ausschluss Infiltration durch B-NHL: Normaler Liquor Normaler Liquor Debris Ohne Debris (live gate) und Doublets Enthält: reife Monocyten Lymphocyten: T-Zellen Normaler Liquor Enthält: reife Monocyten Lymphocyten: T-Zellen NK-Zellen CD3+T-Zellen HIV-Patient: Ausschluss Lymphom Liquor Reaktiv, Virus-Infekt Liquor Enthält: reife Monocyten Lymphocyten: T-Zellen NK-Zellen CD3+T-Zellen Liquor CD3+T-Zellen NK-Zellen ! HIV unauffällig Liquor, viraler Infekt CD38+ Expression stark aktivierte CD8+ cytotoxische T-Zellen ZNS Symptome (Kopfweh, Schwindel; seit Wochen) Ausschluss Lymphom Liquor Liquor, entzündlich Enthält: reife Monocyten Lymphocyten: T-Zellen keine: (fast) keine B-Zellen! keine Granulocyten keine EC Liquor, entzündlich heterogene CD38+ Expression beider T-Zell Subsets Liquor, entzündlich NK-Zellen unauffällig Liquor, entzündlich B-Zellen! jedoch polyklonal unauffällige Plasmazellen! Patient mit Diffus grosszelligem B-Zell Lymphom Darmbiopsie Liquor alt vs frisch Darmbiopsie sehr frisches Material trotzdem viel Debris Granulocyten, Material leicht blutig tingiert Lymphocyten ? Darmbiopsie sehr viel Debris Liquor nachts punktiert! B-Zellen mit weniger CD45 Expression! Darmbiopsie mit DLBCL B-Zellen klonal Lambda+ B-Zellen sind CD19+, CD20+, CD38+ Lambda+ und grosszellig Liquor für Staging sehr viel Debris Liquor nachts punktiert! Keine B-Zellen -> kein Lymphom…? Cave: Probe zu alt für Auschluss ZNF-Befall! Frischer Liquor für Staging wenig Debris: frisch… ! Frischer Liquor: ZNS-Befall B-Zellen klonal Lambda+ Feinnadelpunktion cervikaler Lymphknoten Lymphom? FNP cervikaler Lymphknoten wenig Debris viel Zellen -> gute Qualität! nur Lymphocyten FNP cervikaler Lymphknoten T-Zellen unauffällig Eine B-Zellpopulation ohne Leichtkettenexpression! FNP cervikaler Lymphknoten Eine B-Zellpopulation ohne Leichtkettenexpression! CD19+, CD20+, CD38(also keine Plasmazellen) FNP cervikaler Lymphknoten: reaktiv plus FCL CD19+, CD20+, CD38-> Expression von CD10! -> follikuläres Lymphom Polyklonale B-Zellen jedoch Auch teilweise CD10+! -> reaktive follikuläre Zellen! Unterschiedliche cyBCL-2 Expression: FCL (mit t14;18): cyBCL2++ Reaktive follikuläre: cyBCL2- Beispiel Lymphknoten: follikuläre Zellen und follikäres Lymphom CD20+, CD10+, CD19+ „Gate“: B Zellen Normale follikuläre B-Zellen: CD20++, CD10+, CD19+, BCL-21 Lymphom-Zellen: CD20++, CD10+, CD19+(dim), Kappa+, cyBCL-2++ cyBCL-2++: Assoziiert mit t(14;18) Feinnadelpunktion mediastinaler Lymphknoten Lymphom? FNP mediastinaler Lymphknoten viel Debris viel Zellen Sehr grosse Zellen! CD45 - (pan-leukocyten Antigen) hämatopoetisch? Ausschluss (abnorme) Plasmazellen? -> CD38? FNP mediastinaler Lymphknoten mit Tumorzellen viel Debris viel Zellen Sehr grosse Zellen! CD45-: hämatopoetisch? Plasmazellen? -> CD38++? CD45-, CD38-, CD56++ Neuroepithelialer Tumor -> Bronchus-Ca Feinnadelpunktion supraclavikulärer Lymphknoten Lymphom? FNP supraclavikulärer Lymphknoten Zelltodzeichen! Debris CD45+(dim), CD38+(dim), CD56 teilweise + alle anderen Antige negativ, „Proliferationsindex“ hoch -> unreife Zellen? FNP supraclavikulärer Lymphknoten „Chlorom“ CD45+(dim), CD38+(dim), CD56 teilweise + alle anderen Antige negativ, „Proliferationsindex“ hoch -> unreife Zellen? -> CD117+, CD34-, HLA-DR+(dim) -> AML Pleura Lymphom-Rezidiv? Pleuraerguss B-Zellen polyklonal Pleuraerguss NK-Zellen ? NK-Zellen ? Ja, teilweise: CD5- und CD38+ T-Zellen unauffällig Pleuraerguss mit AILT-Rezidiv Angio-immunoblastisches T-Zell Lymphom CD45++, CD3-/+(dim), CD4+, CD8-, CD5+/+(dim), CD38-/+ Themen Einführung Prä-Analytik Besonderheiten der Proben Immunphänotypisierung: Vor- und Nachteile Fall-Beispiele Zusammenfassung Zusammenfassung • Spezielle Proben bedürfen adäquater Behandlung • Spezielle Proben sollen immer verarbeitet werden • Dokumentation der Probe (Eingangskontrolle) wichtig! • Färbung abhängig von Fragestellung, Vorbefund, cave: Therapie • Befundung braucht Erfahrung, Kenntnis des Normalen • Befund-Interpretation abhängig von Materialqualität, möglicher Kontamination • Integrative Diagnosestellung anhand aller erhobener Daten (Klinik, Morphologie, Zytopathologie, Bildgebung etc.)
