The Role of the Intestinal Microbiota in Enteric - ETH E

DISS. ETH Nr. 21643
The Role of the Intestinal Microbiota in Enteric
Salmonella Typhimurium Infection
A dissertation submitted to the
ETH Zurich
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
Lisa Beate Maier
Dipl.-Biochem., Eberhard Karls University, Tübingen, Germany
Born June 2nd 1984
Citizen of Germany
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Wolf-Dietrich Hardt
Prof. Dr. Julia Vorholt
Prof. Dr. Andrew Macpherson
2013
Summary
In a healthy individual, enteric infections are prevented by a series of immunological and physical
barriers, as well as by activities of the gut microbes. Both the host and its microbiota live in a
mutualistic relationship; the microbes benefit from stable growth conditions and nutrient supply
while the microbiota helps the host in shaping the mucosal immune system, degrading nutrients and
inhibiting pathogen invasion. However, enteropathogenic bacteria including Salmonella enterica spp.
I serovar Typhimurium (S. Tm), have evolved strategies to intrude into this complex ecosystem and
to propagate in this highly competitive niche. As soon as the pathogen’s population density is
sufficiently high, S. Tm elicits mucosal inflammation to further inhibit competitors and to gain access
to additional nutrients.
The molecular basis of how S. Tm competes with the microbiota during the early phase of gut
ecosystem invasion has remained elusive. In particular, as nutrients are scarce in the densely
colonized gut, the substrates for consumption by S. Tm remain to be identified. To address these
questions, we developed an in vivo screening approach to search for S. Tm genes conferring fitness
benefits during the early phase of S. Tm infection in mice.
First, a reliable screening technique for S. Tm mutants with a growth deficit in vivo had to be
established. As our strategy was based on negative selection, random loss of mutants (which would
result in a high false-positive rate) had to be avoided. Random disappearance of mutants can occur
in case of a drastic decrease of the population size (i.e. a bottleneck effect). Indeed, we detected a
transient, inflammation-dependent population bottleneck phenomenon within the course of the S.
Tm infection in our standard mouse model for Salmonella diarrhea. This provided important new
information on the pathogen-host interaction in the gut infection. Based on these findings we were
able to modify our infection model to circumvent bottleneck effects and to establish conditions
which would allow genome-wide genetic screens.
In a pilot in vivo screen we found that the hyb hydrogenase supports S. Tm growth during
this early gut ecosystem invasion phase of infection. This hydrogenase enables S. Tm to oxidize
hydrogen (H2) for anaerobic respiration and consequently fuels microbial growth. As H2 is a central
metabolite of the microbiota metabolism, it is highly abundant in the unperturbed gut. Thus, S. Tm
can exploit microbiota-derived H2 to gain a competitive edge in the gut.
The level of competitiveness of S. Tm against the resident gut microbes in the absence of
inflammation can lead to the emergence of “asympomatic pathogen excretors”, a condition in which
the microbiota cannot clear the pathogen from the gut lumen after infection. We questioned
whether antibiotic treatment could reduce the emergence of asymptomatic pathogen excretion. In
our mouse model for Salmonella diarrhea, antibiotic therapy with ceftriaxone and ciprofloxacin
reduced fecal shedding and disease symptoms, but it did not change the frequency of nonsymptomatic excretors compared to untreated controls. Interestingly, only ceftriaxone-treated mice
developed protective adaptive immune responses against invasive Salmonella infection.
In conclusion, this work provides both experimental tools and a first glimpse into the
interaction between the resident microbiota and an intruding enteric pathogen in the gut
ecosystem. This paves the way for future studies on such interactions, which will provide new
insights for the prevention and treatment of enteric diseases.
Zusammenfassung
Im gesunden Menschen dienen eine Reihe von immunologischen und physischen Barrieren,
zusammen mit den Aktivitäten der Darmmikroben, zum Schutz vor Darminfektionen. Der Wirt und
seine Mikrobiota leben in einer wechselseitigen Beziehung: die Mikroben profitieren von stabilen
Wachstumsbedingungen und einer stetigen Nährstoffversorgung, während die Mikrobiota dem Wirt
bei der Ausbildung des mukosalen Immunsystems, beim Abbau von Nährstoffen und zum Schutz vor
Krankheitserregern dient. Jedoch haben Darmerreger wie Salmonella enterica spp. I serovar
Typhimurium (S. Tm) Strategien entwickelt, um in dieses komplexe und kompetitive Ökosystem
einzudringen und sich zu vermehren. Sobald die Populationsdichte des Erregers ausreichend hoch
ist, löst S. Tm eine Darmentzündung aus, um Konkurrenten am Wachstum zu hindern und sich
Zugang zu zusätzlichen Nährstoffen zu verschaffen.
Auf molekularer Ebene ist der Wettstreit zwischen S. Tm und der Mikrobiota in der frühen Phase der
Invasion in das Darmökosystem noch ungeklärt. Da im dicht besiedelten Darm die Nährstoffe knapp
sind, müssen die Substrate, die S. Tm zum Wachstum zur Verfügung stehen, ermittelt werden.
Hierfür wurde im Rahmen dieser Arbeit eine in vivo Screening-Methode entwickelt, die es erlaubt,
nach Genen zu suchen, die S. Tm während der frühen Phase der Infektion in der Maus Fitnessvorteile
verschaffen.
Zunächst musste eine verlässliche Screening-Methode für S. Tm Mutanten mit Wachstumsdefizit in
vivo etabliert werden. Da unsere Screening-Strategie auf einer negativen Selektion basiert, kann der
zufällige Verlust von Mutanten zu einem hohen Anteil an falsch-positiven Entdeckungen führen und
muss daher verhindert werden. Das zufällige Verschwinden von Mutanten kann im Falle einer
drastischen
Abnahme
der
Populationsgrösse
vorübergehendes, entzündungsabhängiges
eintreten
(Bottleneck-Effekt).
Ein
solches
Populations-Bottleneck konnte im verwendeten
Standard-Mausmodell für Salmonella-induzierte Diarrhö nachgewiesen werden. Diese Entdeckung
liefert wichtige neue Informationen über die Pathogen-Wirts-Interaktionen während der
Darminfektion. Durch diese Erkenntis konnte das Infektionsmodell entsprechend anpasst werden,
um Bottleneck-Phänomene zu vermeiden und Bedingungen zu schaffen, die genomweite Screens
erlauben.
Ein in vivo Pilotscreen zeigte, dass die hyb Hydrogenase das Wachstum von S. Tm in dieser frühen
Infektionsphase, der Invasion ins Darmökosystem, unterstützt. Diese Hydrogenase ermöglicht es S.
Tm Wasserstoff (H2) zur anaeroben Atmung zu oxidieren und verstärkt daher mikrobielles
Wachstum. Wasserstoff, als ein zentraler Metabolit des Mikrobiota-Stoffwechsels, ist im gesunden
Darm reichlich vorhanden. Salmonella kann daher den von der Mikrobiota produzierten Wasserstoff
ausnutzen, um selbst einen Wettbewerbsvorteil im Darm zu erlangen.
Im gesunden Darm kann eine hohe Wettbewerbsfähigkeit von S. Tm im Vergleich zur den
Darmmikroben zu „asymptomatischen Keimausscheidern“ führen, ein Zustand in dem die
Mikrobiota die pathogenen Darmkeime nach der Infektion nicht aus dem Darmlumen verdrängen
kann. Es wurde die Frage adressiert, ob Antibiotiabehandlung das Auftreten solcher
asymptomatischen Keimausscheider reduzieren kann. In unserem Mausmodell für SalmonellaDiarrhö reduzierte die Behandlung mit den Antibiotika Ceftriaxon und Ciprofloxacin die
Keimausscheidung und Krankheitssymptome, änderte aber die Häufigkeit asymptomatischer
Ausscheider nicht im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Interessanterweise entwickelten nur
Ceftriaxon-behandelte Mäuse protektive adaptive Immunantworten gegen Salmonella-Infektionen.
Diese Arbeit liefert sowohl experimentelle Hilfsmittel als auch erste Einblicke in die Interaktion
zwischen der Darmmikrobiota und eindringenden Krankheitserregern im Darmökosystem. Das ebnet
den Weg für zukünftige Studien solcher Interaktionen, die wiederum für die Prävention und
Behandlung von Darmerkrankungen hilfreich sein werden.