quantitative analysis of diarrheal salmonella - ETH E

DISS. ETH Nr. 20990
QUANTITATIVE ANALYSIS
OF DIARRHEAL SALMONELLA INFECTION
A dissertation submitted to the
ETH Zürich
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
Patrick Kaiser
Master of Science ETH in Biology, ETH Zürich
born January 11th 1985
citizen of Gams (SG)
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Wolf-Dietrich Hardt
Prof. Dr. Martin Ackermann
Prof. Dr. Manfred Kopf
2013
Thesis summary
One of the most prominent and successful foodborne infectious agents is the gramnegative bacterium Salmonella enterica subspecies I serovar Typhimurium. Its broad
host range spans from chickens, ducks and other birds to swine, cattle and humans.
Most human infections emanate from the consumption of contaminated food derived
from cattle or poultry products (i.e. meat and eggs). After ingestion, the pathogen
grows to high numbers within the host's intestine and leads to first symptoms within
6 - 24h, ranging from nausea and abdominal pains to diarrhea. These symptoms are
caused by innate immune responses to the bacterial infection and by toxins produced
by the bacterium, which are injected into the intestinal epithelium, causing severe
reprogramming of the target cells. The toxins (encoded on the Salmonella
Pathogenicity Island - 1 (SPI-1)) induce the uptake of the bacterium into the epithelial
cells and cause the secretion of pro-inflammatory cytokines, inducing a strong
inflammatory response. Salmonella can profit from this inflammation, as it is more
resistant to induced killing mechanisms and grows faster in the inflamed gut than the
resident gut flora.
Although invasion into epithelial cells has been studied extensively, the mechanism for
crossing the epithelial cell and exiting on the basal side has remained elusive. Using a
novel intravital microscopy method, we have shed light on this epithelial traversal
mechanism. After host cell invasion, Salmonella Typhimurium crosses the epithelial cell
using the second most prominent pathogenicity island present, SPI-2. SPI-2 is only
expressed when the bacterium reaches an intracellular state and was long thought to
be solely important for intracellular replication and systemic bacterial spread. We
could provide evidence, that crossing of the epithelial cells from apical to basolateral
side is also dependent on SPI-2, thus suggesting an additional function for this
pathogenicity island. Furthermore, this process of epithelial traversal and exit into the
lamina propria involves the expulsion of the bacterium together with host cell material
on the basolateral side and subsequent uptake into resident phagocytic cells.
Investigating bacterial infections using endpoint analysis and total tissue loads, leads
to a very qualitative understanding of the infectious process. For full understanding,
additional, population dynamical information is needed. It has become increasingly
evident, that quantitative understanding of infections (i.e. exact site of entry, pathogen
fluxes between different organs, dynamics of organ colonization) can be of great use
for prevention and therapy. We developed a mathematical model for the first steps in
Salmonella Typhimurium infection, namely the colonization of the cecal lymph node.
The model was fit to experimental data gained from infection experiments using
phenotypically identical, isogenic tagged Salmonella strains that only differed in the
carriage of a unique 40 base pair tag (which can be detected by real time PCR). The
stochastic loss of these tags from the gut lumen to the lymph node and their relative
abundance gives insight into changes within the infectious bacterial population.
Parameters derived from these experiments revealed that only very low numbers (300
bacteria in the first 24h) ever reach the draining lymph node, where they double every
6h to reach a final density of ~ 2000 bacteria.
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Under normal conditions non-typhoidal Salmonella spp. (NTS) only cause a self-limiting
gastronenteritis in humans. In certain patients, such as infants, elderly or immunecompromised persons, complicated systemic infections can arise. This typhoid fever
like disease is a severe threat and has to be treated with antibiotics. In contrast to the
diarrheal disease, where antibiotics are incapable of reducing disease length, systemic
salmonellosis can be treated with appreciable success. Nevertheless, even treatment
with antibiotics is incapable of completely removing the pathogen from the host
organism. Relapsing disease is often observed after antibiotic therapy is discontinued,
leading to a new wave of Salmonella infection caused by bacteria not fully cleared from
the host. To study relapsing infections, we adapted the streptomycin pretreated mouse
model to mimic infection and antibiotic therapy in humans. Antibiotic tolerant
bacteria were found to be lodged in draining lymph nodes, specifically within dendritic
cells. These bacteria were found to be the source of relapsing infections and their
antibiotic tolerance to be strongly dependent on their dendritic cell niche.
To understand what makes these bacteria antibiotic tolerant, we made use of
stochastic fluctuations in the population dynamics of the infectious Salmonella and
combined this with mathematical modeling. From this model, growth, killing and
migration parameters of primary Salmonella infection and subsequent antibiotic
treatment could be derived. These parameters indicated that upon antibiotic
treatment, Salmonella in the lymph node form a very slow growing, but highly
antibiotic tolerant population that can persist for up to ten days under high antibiotic
concentrations. This demonstrates how quantitative measurement of a pathogens
population dynamics can be used to analyze the success or failure of infection and
therapy.
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Zusammenfassung
Eine der weltweit häufigsten Lebensmittel-assoziierten Bakterien ist Salmonella
enterica Subspezies I serovar Typhimurium. Nach dem Verzehr von kontaminierten
Nahrungsmitteln, siedelt sich das Pathogen im Darmtrakt des Wirtes an. Dort löst es
meistens eine starke lokale Entzündung aus, welche sich durch Symptome wie
Durchfall, Schwindel, Erbrechen und Bauchkrämpfe zu erkennen gibt. Diese
Entzündungsreaktion wird durch die Injektion von bakteriellen Toxinen und das darauf
folgende Eindringen des Bakteriums in die Darmepithelzellen ausgelöst. Ein Teil der
Entzündung wird aktiv durch das Pathogen induziert, während die restliche
Entzündungsreaktion durch das Immunsystem induziert wird, welches Bestandteile
des eindringenden Bakteriums erkennt. Das Eindringen in Epithelzellen und die
zugrunde liegenden molekularen Mechanismen wurden in der Vergangenheit
eingehend untersucht. Verschiedene bakterielle Toxine, sogenannte Effektorproteine,
und deren biochemischen Eigenschaften wurden beschrieben und sowohl in Zellkultur
wie auch in Tiermodellen erforscht.
Nach dem Eindringen in die Darmepithelschicht, besiedelt Salmonella Typhimurium
die darunter liegende Submukosa. Obwohl die Invasion ins Epithelgewebe und die
Besiedlung der darunter liegenden Zellschicht, der lamina propria, lange bekannt ist,
blieb es lange rätselhaft ob und wie die Bakterien die Epithelzellen wieder verlassen. Im
ersten Teil der vorliegenden Arbeit, haben wir dank einer neuen von uns entwickelten
Technik, der Intravitalmikroskopie, genau diesen Schritt in der Infektion untersucht.
Wir konnten zeigen, dass Salmonella Typhimurium nach dem Eindringen in die
Epithelzelle, von der apikalen zur basolateralen Seite migriert und dort aus der
Epithelzelle zusammen mit Epithelmaterial austritt. Dieser ganze Prozess ist abhängig
von Virulenzfaktoren, welche auf der Salmonella Pathogenitätsinsel 2 (SPI-2) kodiert
sind. Bisher wurde dieser Virulenzfaktor nur mit intrazellulärem Wachstum und der
Fähigkeit des Pathogens systemische Infektionen auszulösen assoziiert. Mit dieser
Arbeit ergänzen wir das Funktionspektrum von SPI-2 um eine weitere Facette.
Derzeitige Forschung an Infektionskrankheiten fokussiert sich vor Allem auf
molekulare Mechanismen und qualitative Aussagen über den Infektionsverlauf. Dies
rührt meist daher, dass Tierexperimente nur mittels Endpunktanalyse ausgewertet
werden können und somit das mehrfache Beproben derselben Organe nicht möglich
ist. Um Aussagen über die Zeit zwischen zwei Messpunkten treffen zu können, muss
Interpoliert werden. Diese Interpolation lässt jedoch nur grobe Aussagen zu und
vernachlässigt dynamische Änderungen, welche schlichtweg nicht sichtbar werden.
Um genauere Aussagen über dynamische Prozesse in Infektionen treffen zu können,
braucht es neue Populationsbiologische Ansätze. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie man
mit Hilfe von neutralen genetischen Etiketten und einem mathematischen Modell
Infektionsparameter bestimmen kann, welche eine genaue Aussage über die
dynamischen Prozesse der Infektion erlauben. Wir haben ein Modell entwickelt in dem
wir den ersten Schritt der Salmonella Typhimurium Infektion, die Besiedlung des
caecalen Lymphknotens beschreiben können. Mit dessen Hilfe lassen sich zB.
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Vorhersagen über die Effektivität von Impfungen machen. In einem zweiten Schritt
haben wir diese Methodik zur Optimierung/Untersuchung von Therapien angewendet.
Weltweit erkranken bis zu einer Milliarde Menschen jährlich an Salmonella spp., wobei
ca. drei Millionen Erkrankungen tödlich ausgehen. In industrialisierten Ländern ist die
Gefahr an Salmonella spp. zu sterben relativ gering, ausser man gehört zur
Risikogruppe der Alten, Kleinkinder und Immunsupprimierten. In dieser Risikogruppe
kann die lokale Darmentzündung schnell zu einer sehr gefährlichen körperweiten,
systemischen Infektion ausarten, welche akute medizinische Hilfe erfordert. In solchen
Fällen werden die Patienten mit Antibiotika, meist Ciprofloxacin, behandelt. Die
Behandlung ist meistens erfolgreich, doch es geschieht oft, dass nach Absetzten der
Antibiotika ein Rückfall eintritt. Dies führt zu einer erneuten Hospitalisierung des
Patienten und zu weiterer Antibiotikatherapie. Um herauszufinden wieso Salmonella
spp. nicht immer durch Antibiotikabehandlung eliminiert werden können, haben wir
unser Mausmodell so angepasst, dass Rückfälle untersucht werden können. Wir haben
herausgefunden, dass die Bakterien, welche für den Rückfall verantwortlich sind, sich
im Lymphknoten befinden und dort in speziellen in dendritischen Zellen zu finden sind.
Durch eine Erweiterung unseres mathematischen Modelles konnten wir zeigen, dass
die persistenten Bakterien sich unter Antibiotikabehandlung sehr langsam teilen und
in eine Art Dauerzustand übergehen. Diese Erkenntnis konnte nur dank der
quantitativen populationsdynamischen Analyse gewonnen werden und zeigt wie
wichtig solche Analysen in der Zukunft sein werden.
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