scFv-basierte Immuntherapeutika als Werkzeuge in der

scFv-basierte Immuntherapeutika als Werkzeuge in
der Krebsbehandlung
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Katrin Martina Birkholz
aus Erlangen
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
4. Mai 2010
Vorsitzender der
Promotionskommission :
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Lars Nitschke
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Gerold Schuler
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung/Summary ............................................................................................. 1
2. Einleitung ............................................................................................................................. 4
2.1. Dendritische Zellen .................................................................................................................... 4
2.1.1. DC-Subpopulationen .......................................................................................................................... 5
2.1.1.1. Humane DC-Subpopulationen........................................................................................................ 5
2.1.1.2. Murine DC-Subpopulationen ......................................................................................................... 7
2.1.2. Aufnahme, Prozessierung und Präsentation von Antigenen ........................................................... 8
2.1.3. DC-Aktivierung................................................................................................................................. 10
2.1.4. Toleranzinduktion durch DC........................................................................................................... 11
2.2. T-Zellen ..................................................................................................................................... 12
2.2.1. T-Lymphozyten und ihr TZR .......................................................................................................... 12
2.2.2. T-Zell-Subpopulationen und ihre Rolle in der Immunantwort .................................................... 14
2.3. Immuntherapie maligner Erkrankungen .............................................................................. 16
2.3.1 Immuntherapie mit antikörperbasierten Therapeutika................................................................. 18
2.3.2. Immuntherapie mit Dendritischen Zellen....................................................................................... 20
2.3.2.1. DEC-204-Targeting...................................................................................................................... 22
2.3.3. Immuntherapie mit T-Zellen ........................................................................................................... 26
3. Zielsetzung ......................................................................................................................... 28
4. Ergebnisse .......................................................................................................................... 29
4.1. Optimierung der Beladung und Präsentation des Tumorantigens MAGE-A3 auf DC
durch Targeting des Endozytoserezeptors DEC-205 ............................................................ 29
4.1.1. Bestimmung der Effizienz verschiedener DC-Antigenbeladungsstrategien ................................ 29
4.1.2. :achweis der MAGE-A3-Peptid-Präsentation auf DC.................................................................. 30
4.1.3. Antigenbeladung von DC durch R:A-Elektroporation ................................................................ 31
4.1.4. DEC-205-Targeting von DC ............................................................................................................. 33
4.1.4.1. DEC-205-Expressionskinetik während der DC-Generierung....................................................... 33
4.1.4.2. Prinzip des DEC-205-Targetings mit scFv-Antigen-Konstrukten................................................ 34
4.1.4.3. Klonierung der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Konstrukte und der
anti-MCSPscFv-MAGE-A3-Kontrollkonstrukte.......................................................................... 34
4.1.4.4. Periplasmatische Expression der scFv-Antigen-Fusionsproteine in E.coli................................... 38
4.1.4.5. Spezifische Bindung der in E.coli hergestellten scFv-Antigen-Konstrukte.................................. 39
4.1.4.6. Negativer Einfluss von LPS auf iDC............................................................................................ 40
4.1.4.7. Expression der scFv-Antigen-Konstrukte in 293T-Zellen............................................................ 42
4.1.4.8. Spezifische Bindung der in 293T-Zellen hergestellten scFv-Antigen-Konstrukte ....................... 43
4.1.4.9. Keine Veränderung des DC-Phenotyps und –Zytokinsekretionsprofils sowie der
DC-Migrationskapazität nach DEC-205-Targeting ..................................................................... 48
Inhaltsverzeichnis
II
4.1.4.10. Effiziente MHC-Klasse-II-Beladung von DC durch DEC-205-Targeting ................................. 48
4.1.4.11. Dosisabhängige Effizienz der Antigenbeladung von DC durch DEC-205-Targeting ................ 51
4.1.4.12. Effiziente Antigenbeladung von Melanompatienten-mDC durch DEC-205-Targeting ............. 52
4.2. Etabierung eines schnellen und robusten Protokolls zur Klonierung und
funktionellen Charakterisierung von T-Zell-Rezeptoren .................................................... 57
4.2.1. Die PCR-Strategie zur Klonierung unbekannterTZR................................................................... 57
4.2.2. Identifizierung eines HIVgag/HLA-A2-spezifischen und zweier MelanA/HLA-A2spezifischer TZR mit Hilfe der TZR-PCR-Strategie ..................................................................... 59
4.2.3. Das Jurkat-T-Zell-Testsystem.......................................................................................................... 61
4.2.4. Funktionelle Charakterisierung der neu klonierten TZR mit Hilfe des
Jurkat-T-Zell-Testsystems ............................................................................................................... 62
4.2.5. Vergleich der Avidität der MelanA-spezifischen TZR-transfizierten T-Zellen........................... 66
4.2.6. Spezifische und aviditätsabhängige Erkennung von MelanA-positiven Tumorzellen durch
MelanA-spezifische T-Zellen............................................................................................................ 68
4.3. Herstellung und funktionelle Charakterisierung MHC-unabhängiger ErbB2- und
CEA-spezifischer T-Zellen ...................................................................................................... 70
4.3.1. Transiente Expression des ErbB2- und des CEA-spezifischen cTZR .......................................... 71
4.3.2. Antigenspezifische Zytokinsekretion der ErbB2- und CEA-spezifischen T-Zellen .................... 72
4.3.3. Spezifische Tumorzelllyse durch cTZR-R:A-elektroporierte CD8+ T-Zellen ............................ 74
4.3.4. Vergleich der Funktionalität retroviral transduzierter und R:A-elektroporierter
CEA-cTZR-exprimierender CD8+ T-Zellen ................................................................................... 76
5. Diskussion .......................................................................................................................... 80
5.1. DEC-205-Targeting als alternative Beladungsstrategie von DC .......................................... 81
5.1.1. Konstruktion geeigneter anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Fusionsproteine ...................... 82
5.1.2. Herstellung der Fusionsproteine in E. coli und in 293T-Zellen .................................................... 83
5.1.3. Auslesesystem zur Messung der Antigenpräsentation auf DC...................................................... 84
5.1.4. Das DEC-205-Targeting mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsprotein
bewirkte eine effiziente MHC-Klasse-II-Präsentation................................................................... 85
5.1.5. DEC-205-Targeting induzierte eine effizientere MHC-Klasse-II-Beladung als
R:A-Elektroporation und direkte Peptidbeladung....................................................................... 87
5.1.6. DEC-205-Targeting führte zur effizienten MHC-Klasse-II-Präsentation auf aus
Melanompatientenblut generierten DC .......................................................................................... 88
5.1.7. Ausblick ............................................................................................................................................. 89
5.2. Vereinfachte Klonierung von TZR und deren funktionelle Analyse mit dem
Jurkat-T-Zell-Testsystem........................................................................................................ 91
5.2.1. Die neu etablierte TZR-PCR-Strategie erlaubt ein schnelles und einfaches Klonieren
unbekannter TZR aus T-Zell-Klonen ............................................................................................. 93
5.2.2. Das robuste Jurkat-T-Zell-Testsystem ermöglicht eine schnelle und funktionelle
Charakterisierung neu klonierter TZR .......................................................................................... 93
5.3. Chimäre T-Zell-Rezeporen ..................................................................................................... 94
Inhaltsverzeichnis
III
5.3.1. cTZR-R:A-transfizierte T-Zellen erkannten und lysierten antigenspezifisch Tumorzellen ..... 95
5.3.2. R:A-transfizierte T-Zellen vs. Retroviral transduzierte T-Zellen............................................... 96
5.3.3. Ausblick ............................................................................................................................................. 98
5.4. Abschließender Kommentar ................................................................................................... 99
6. Material und Methoden .................................................................................................. 101
6.1. Material................................................................................................................................... 101
6.1.1. Arbeitsmaterialien .......................................................................................................................... 101
6.1.2. Laborgeräte ..................................................................................................................................... 101
6.1.3. Chemikalien..................................................................................................................................... 102
6.1.4. Zellkulturmedien und Zusätze....................................................................................................... 103
6.1.5. Zytokine und Chemokine ............................................................................................................... 104
6.1.6. Peptide.............................................................................................................................................. 104
6.1.7. Kommerziell erhältliche Kits ......................................................................................................... 104
6.1.8. Enzyme und deren Puffer............................................................................................................... 105
6.1.9. Antibiotika ....................................................................................................................................... 105
6.1.10. Vektoren......................................................................................................................................... 105
6.1.11. Software ......................................................................................................................................... 105
6.1.12. Puffer und Lösungen .................................................................................................................... 105
6.1.12.1. Puffer und allgemeine Medien für die Zellkultur ..................................................................... 105
6.1.12.2. Allgemeine Puffer und Medien für Molekularbiologische Arbeiten ........................................ 106
6.1.12.3. Puffer für Proteinexpression, -aufreinigung und -detektion ..................................................... 107
6.1.13. Bakterienstämme .......................................................................................................................... 108
6.1.14. Kultivierung von Zelllinien .......................................................................................................... 108
6.1.15. Kultivierung von primären Zellen............................................................................................... 109
6.1.16. Medien für primäre Zellen und Zelllinien .................................................................................. 109
6.1.17. Antikörper ..................................................................................................................................... 110
6.1.18. Oligonukleotide ............................................................................................................................. 110
6.2. Methoden ................................................................................................................................ 112
6.2.1. Zellbiologische Methoden............................................................................................................... 112
6.2.1.1. Allgemeine Anmerkungen.......................................................................................................... 112
6.2.1.2. Isolierung der primären Zellen ................................................................................................... 113
6.2.1.3. Kultivierung der primären Zellen ............................................................................................... 115
6.2.1.4. Kultivierung der Zelllinien ......................................................................................................... 115
6.2.1.5. Beladung von Zellen mit Tumorantigen..................................................................................... 116
6.2.1.6. Elektroporation von primären Zellen und Zelllinien .................................................................. 116
6.2.1.7. Bestimmung von Zytokinen im Überstand von Zellkulturen ..................................................... 117
6.2.1.8. Zytotoxizitätsexperimente .......................................................................................................... 117
6.2.1.9. Bestimmung der antigenspezifischen Proliferation von T-Zellen .............................................. 118
6.2.1.10. Migrations- und β-Glucoronidase-Experiment......................................................................... 118
6.2.1.11. Jurkat-T-Zell-Testsystem.......................................................................................................... 119
Inhaltsverzeichnis
IV
6.2.1.12. FACS-Färbungen...................................................................................................................... 120
6.2.2. Molekularbiologische Methoden.................................................................................................... 122
6.2.2.1. Klonierung der TZR nach der neu etablierten TZR-PCR-Strategie ........................................... 122
6.2.2.2. Einführung einer zusätzlichen Disulfidbrücke in den MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen
TZR ............................................................................................................................................ 126
6.2.2.3. Klonierung der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte und anti-MCSPMAGE-A3-Peptid-Kontrollkonstrukte ....................................................................................... 126
6.2.2.4. Klonierungsmethoden................................................................................................................. 129
6.2.2.5. RNA-Produktion ........................................................................................................................ 132
6.2.3. Methoden zur Proteinexpression ................................................................................................... 133
6.2.3.1. Expression in E.coli.................................................................................................................... 133
6.2.3.2. Expression in 293T-Zellen ......................................................................................................... 134
6.2.3.3. Aufreinigung von Proteinen ....................................................................................................... 134
6.2.3.4. Protein-Gelelektrophorese .......................................................................................................... 135
6.2.3.5. Abschätzen von Proteinkonzentrationen .................................................................................... 136
6.2.3.6. Western Transfer Experimente................................................................................................... 136
6.2.3.7. Überprüfung der Fusionsproteine auf LPS-Kontamination ........................................................ 137
6.2.3.8. Lagerung der Fusionsproteine .................................................................................................... 137
6.2.4. Statistische Analysen....................................................................................................................... 138
7. Literaturverzeichnis........................................................................................................ 139
8. Abkürzungsverzeichnis................................................................................................... 157
9. Lebenslauf ........................................................................................................................ 161
10. Eigene Publikationen und wissenschaftliche Vorträge.............................................. 162
11. Danksagung.................................................................................................................... 164
1. Zusammenfassung/Summary
1
1. Zusammenfassung/Summary
Zusammenfassung
Eine viel versprechende Strategie zur Behandlung von Tumoren stellt die Immuntherapie dar,
bei der ein Tumor durch Manipulation und/oder Aktivierung des Immunsystems oder durch in
vitro hergestellte, modifizierte Immunkomponenten eliminiert werden soll. Im Rahmen dieser
Dissertation wurden zwei scFv-basierte Ansätze zur Immuntherapie etabliert und analysiert.
Um die klinischen Erfolge in der Immuntherapie maligner Erkrankungen mit auf
Dendritischen Zellen (DC)-basierten Impfstoffen zu verbessern, wurde im Teilprojekt 1 dieser
Arbeit die Beladung von aus Monozyten generierten DC mit dem Tumorantigen (TA)
MAGE-A3 als Modellantigen optimiert. Dazu wurde eine neue DC-Antigenbeladungsstrategie, das Targeting des auf DC exprimierten Endozytoserezeptors DEC-205 mit scFv-AntigenKonstrukten, etabliert. Zur Überprüfung, ob durch DEC-205-Targeting eine effiziente MHCKlasse-II-Präsentation erzielt werden kann, wurde das anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKLKonstrukt, welches einen gegen DEC-205 gerichteten scFv und ein auf HLA-DP4-Molekülen
präsentiertes Peptid enthielt, hergestellt. Dieses Fusionsprotein band spezifisch an DEC-205,
ohne negative Effekte auf Phänotyp und Funktion der DC auszuüben. Dabei resultierte das
DEC-205-Targeting in einer effizienteren Präsentation des Antigens als die Elektroporation
mit RNA oder die direkte Beladung mit Peptid und konnte auch zur Beladung von DC, die
aus dem Blut von Patienten mit Malignen Melanom generiert wurden, angewendet werden.
Die Präsentation des MAGE-A3-Peptids wurde mit T-Zell-Rezeptor (TZR)-RNAelektroporierten T-Zellen nachgewiesen. Um die Klonierung weiterer TZR zu vereinfachen,
die zum Nachweis der Präsentation anderer Antigene eingesetzt werden könnten, wurde eine
PCR-basierte Strategie zur Identifizierung und Klonierung unbekannter TZR aus T-ZellKlonen, sowie ein preiswerter und schnell durchführbarer Test zur funktionellen Charakterisierung neu klonierter TZR etabliert.
Eine weitere Option zur Behandlung maligner Erkrankungen ist der adaptive Transfer von TZellen, welche zuvor mit einem chimären TZR (cTZR) ausgestattet wurden. Dabei vermittelt
ein im cTZR enthaltener scFv die spezifische Bindung an die Tumorzellen und intrazelluläre
Signaldomänen des cTZR aktivieren die T-Zelle und ermöglichen so die Beseitigung der
Krebszellen. Der Transfer dieser cTZR erfolgte bisher hauptsächlich durch retrovirale
Transduktion. Da jedoch die retrovirale Transduktion irreversible genetische Veränderungen
in der T-Zelle induzieren kann, und der Einsatz solcher T-Zellen Risiken wie eine langlebige
1. Zusammenfassung/Summary
2
Autoimmunität beinhaltet, wurden im Rahmen des Teilprojekts 2 der Arbeit transient
funktionelle ErbB2- und CEA-spezifische T-Zellen durch den Transfer cTZR-kodierender
RNA hergestellt. Die cTZR-transfizierten T-Zellen produzierten nach antigenspezifischer
Stimulation Zytokine und lysierten antigenpositive Tumorzellen, jedoch war die Aktivität der
cTZR-RNA-elektroporierten T-Zellen im Vergleich zu T-Zellen, welche durch retrovirale
Transduktion mit demselben cTZR ausgestattet wurden, etwa um die Hälfte reduziert.
Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation zwei neuartige Strategien, wie scFv-basierte
Immuntherapeutika als Werkzeuge in der Krebsbehandlung eingesetzt werden können.
1. Zusammenfassung/Summary
3
Summary
One promising approach to treat tumors is immunotherapy, which promotes the elimination of
the tumor by manipulation and/or activation of the immune system or by usage of in vitro-generated modified immune components. In this dissertation, two scFv-based strategies for cancer immunotherapy were established and analyzed.
In order to improve the clinical success of cancer immunotherapy using dendritic cell (DC)based vaccines, the loading of monocyte-derived DC with the tumor antigen MAGE-A3 as a
model antigen was optimized in sub-project 1 of this dissertation. To this end, the targeting of
the DEC-205 endocytosis receptor, which is expressed on DC, with scFv-antigen-constructs
was established as a new antigen-loading strategy of DC. In order to analyze whether efficient
MHC-class-II-presentation can be achieved by DEC-205-targeting, the anti-DEC-205scFvMAGE-A3-KKL-construct, which consisted of a DEC-205-directed scFv and an HLA-DP4restricted MAGE-A3 peptide, was constructed. This fusion protein specifically bound to
DEC-205 without causing any negative effects on DC phenotype and functionality. The DEC205-targeting of DC was superior to RNA electroporation or direct peptide loading in eliciting
antigen presentation, and, more importantly, could also be applied to load malignant
melanoma patient-derived DC. The presentation of the MAGE-A3 peptide was quantified
using T cell receptor (TCR)-RNA-electroporated T cells. In order to simplify the cloning of
additional TCR, which can be used to investigate the presentation of further tumorantigens, a
PCR-based strategy for the identification and cloning of unknown TCR from T cell clones, as
well as a fast and cost-effective assay to functionally characterize newly cloned TCR, were
developed.
Another strategy to treat cancer is the adoptive transfer of T cells equipped with a chimeric
TCR (cTCR). Such cTCR consist of a scFv that mediates the specific binding to the tumor
cells and intracellular signaling domains that activate the T cells, resulting in the elimination
of the cancer cells. To date, cTCR were most commonly transferred into T cells by retroviral
transduction. As retroviral transduction can induce irreversible genetic alterations in the T cell,
and the use of such T cells can bear risks such as induction of long-lasting autoimmunity,
transiently functional ErbB2- and CEA-specific T cells were generated by transfer of cTCRencoding RNA in sub-project 2 of this dissertation. These T cells secreted cytokines upon
antigen-specific stimulation and lysed antigen-positive tumor cells, although their activity was
only half as good as that of the T cells, which were retrovirally transduced with the same
cTCR. In conclusion, this dissertation describes two novel strategies how scFv-based immune
therapeutics can be used as tools to treat cancer.
2. Einleitung
4
2. Einleitung
Das Immunsystem von Säugetieren ist ein hoch komplexes, körpereigenes Abwehrsystem gegen Pathogene wie Bakterien, Pilze, Parasiten oder Viren, sowie in begrenzten Umfang auch
gegen entartete körpereigene Zellen. Hinsichtlich der verschiedenen Wirkungsweisen wird
dieses Abwehrsystem in angeborene und in adaptive Komponenten unterteilt. Sofort nach
dem Eindringen eines Krankheitserregers in den Körper werden die Mechanismen und Zellen
der angeborenen Immununität aktiv. Über pattern recognition receptors (PRR) erkennen
Immunzellen wie Makrophagen, Neutrophile Zellen, NK (natural killer)-Zellen sowie
Dendritische Zellen (DC) unveränderliche pathogene Strukturen (PAMPs, pathogenassociated molecular patterns) wie mikrobielle Bestandteile (z.B. Lipopolysaccharid, LPS),
bakterielle DNA, virale doppelsträngige RNA oder Mannose 1. Entweder werden so eingedrungene Pathogene direkt eliminiert, oder es wird die adaptive Immunantwort induziert. Im
Gegensatz zu Zellen des angeborenen Immunsystems, welche nur bestimmte molekulare
Strukturen erkennen können, verfügen die Effektorzellen der adaptiven Immunität, die B- und
T-Lymphozyten, über Zellrezeptoren, die durch somatische variable diversity joining (VDJ)Rekombination einzelner Rezeptor-Gensegmente in jeder Zelle individuell erzeugt werden.
Dadurch steht dem Organismus ein enorm großes Repertoire an Lymphozyten mit unterschiedlicher Antigenspezifität zur Verfügung, die fast alle auftretenden körperfremden Strukturen erkennen können. B-Zellen werden durch Bindung ihres spezifischen Antigens über
ihren B-Zell-Rezeptor (BZR) aktiviert und sezernieren entweder T-Zell-unabhängig oder nach
T-Zell-Hilfe antigenspezifische Antikörper und lösen so die humorale Immunantwort aus. TZellen hingegen erkennen ihr spezifisches Antigen nur, wenn es in MHC-Molekülen auf antigenpräsentierenden Zellen (APC) wie B-Zellen, Macrophagen oder DC präsentiert wird. Nach
Aktivierung der T-Zellen wird die zelluläre Immunantwort gegen das Antigen induziert (siehe
2.2). Das adaptive Immunsystem führt zur Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses,
so dass bei einer wiederholten Infektion durch ein Pathogen die Immunantwort schnell und
effizient ausgelöst werden kann.
2.1. Dendritische Zellen
DC stellen in ihrer Rolle als professionelle APC ein wichtiges Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort dar 2. Nach Aufnahme des Pathogens präsentieren
DC Peptide des aufgenommenen Antigens auf MHC-Molekülen, und induzieren damit die
2. Einleitung
5
Differenzierung von naiven T-Zellen zu Effektorzellen in den sekundären lymphatischen Organen (SLO) 3. Je nachdem welches immunologische Milieu vorliegt, können DC so entweder
eine Immunantwort gegen ein Pathogen oder in begrenzten Umfang gegen entartete Zellen
einleiten, oder Toleranz induzieren
4,5
. Nach ihrer Entdeckung im Jahre 1973 durch R.
Steinman und Z. Cohn 6, wurde es nach intensiver Forschung offensichtlich, dass es sich bei
diesen Zellen nicht um einen Zelltyp handelt, sondern um verschiedene DC-Subtypen, welche
die Immunantwort im Körper modulieren4.
2.1.1. DC-Subpopulationen
2.1.1.1. Humane DC-Subpopulationen
Pluripotente hematopoietische Stammzellen (HSC) im Knochenmark generieren konstant
Vorläuferzellen, aus denen sich die verschiedenen Immunzellen wie Lymphozyten, NK-Zellen, Makrophagen, Granulozyten und DC aber auch Erythrozyten und Trombozyten entwickeln
1,7
. Aus myeloiden Vorläuferzellen entwickeln sich dann die myeloiden DC (M-DC) und
aus lymphoiden Vorläuferzellen die plasmazytoiden DC (P-DC, siehe Abb. 2.1). Zwar unterscheiden sich diese Hauptgruppen in ihrer Morphologie, Funktionalität und Expression von
Oberflächenmolekülen, jedoch gibt es auch Oberflächenmarker, wie Adhäsionsmoleküle und
kostimulatorische Moleküle, Aktivierungsmarker und inhibierende Moleküle, die von beiden
DC-Gruppen exprimiert werden 4.
M-DC besitzen eine Monozyten-ähnliche Morphologie und zeichnen sich durch die Expression von myeloiden Markern wie CD13, CD33, β2-Integrin (CD11c) sowie durch eine hohe
Expression der IL-3Rα-Kette (CD123) aus
8-11
. Wegen ihrer Expression von MHC-ähnlichen
Molekülen wie CD1a, b, c und d können sie Lipidantigene speziellen T-Zellen präsentieren 12.
Außerdem können sie über den Mannoserezeptor (MR, CD206) große Mengen an glykosylierten Antigenen erkennen
13
. M-DC zeichnen sich durch eine hohe IL-12-Produktion nach
Stimulation mit LPS oder CD40L aus 14,15 und können daher Th1-Antworten induzieren (siehe 2.2.2) 4. Jedoch können auch Th2- Antworten ausgelöst werden, wenn die IL-12-Produktion durch IL-1016 oder auch Prostaglandin 2 (PGE2) 17-20 inhibiert wird. Nach Antigenaufnahme über Phagozytose oder Makropinozytose in der Peripherie wandern die M-DC zu den SLO,
wo sie naive T-Zellen stimulieren
4,21
. M-DC sind im peripheren Gewebe, aber auch in den
SLO und im Blut zu finden (Abb. 2.1). In der Haut kommen zwei verschiedene M-DC-Subtypen vor: die Langerhans-Zellen (LC) in der Epidermis, die sich durch die Expression von
CD1a, Langerin und E-Cadherin auszeichnen, sowie die interstitial DC (intDC) in der Dermis
22
, welche DC-SIGN (CD209, DC-specific intercellular adhesion molecule 3 (ICAM3)-
2. Einleitung
6
grapping non-integrin), CD11b, Faktor XIIIa und CD14 exprimieren (Abb. 2.1). Dabei sind
LC an der Induktion der zellulären Immunantwort beteiligt, wohingegen die intDC hauptsächlich eine humorale Immunantwort auslösen 21.
Myeloide Abstammung
Lymphoide Abstammung
M-DC
P-DC
Blut
Peripherie
CD13+, CD33+
CD11c+, CD123+
CD1a/b/c/d+
MMR+
SLO
CD2-
Dermis
intDC
CD13-, CD33-,
CD11c-, CD123++
CXCR3++
MHC-Klasse II++
BDCA-2
CD2+
Epidermis
LC
DC-SIGN+
Faktor XIIIa+
CD14+, CD11b+
CD1a+
Langerin+
E-Cadherin+
Abb. 2.1: Einteilung der humanen DC in Subpopulationen. Erklärung siehe Text. HSC: hematopoietische Stammzelle, M-DC: myeloide DC, P-DC: plasmazytoide DC, SLO: sekundäre lymphatische
Organe, intDC: interstitial DC, LC: Langerhans-Zelle.
P-DC, auch klassische DC oder konventionelle DC bezeichnet, entwickeln sich aus lymphoiden Vorläuferzellen
23,24
und zeichnen sich durch eine plasmazellähnliche Morphologie
aus. Diese exprimieren keine myeloiden Marker wie CD13 und CD33, aber verfügen über eine hohe Expression von CD123, CXC Chemokinrezeptor 3 (CXCR3) und MHC-Klasse-IIMolekülen
10,13,24-26
(Abb. 2.1). Im Gegensatz zu M-DC, exprimieren P-DC kein CD11c
26
und sezernieren nur geringe Mengen IL-12 nach CD40L-Stimulation 27. Trotz ihrer Fähigkeit
Th2-Antworten zu induzieren
11,13,26
, können sie nach Viruskontakt auch hohe Mengen des
Th1-polarizierenden Zytokins IFNα sekretieren 26,28,29. P-DC werden nach ihrer CD2-Expression in 2 Unterklassen eingeteilt: CD2- und CD2+ P-DC (Abb. 2.1). Im Gegensatz zu den
CD2- Zellen können CD2+ P-DC Zielzellen über einen TRAIL-abhängigen Mechanismus
(T$F-related apoptosis-inducing ligand) töten 21. P-DC sind im Blut 21, aber hauptsächlich in
2. Einleitung
7
den T-Zell-Gebieten lymphatischer Gewebe zu finden. Sie können nur schlecht Antigene via
Phagozytose oder Makropinozytose aufnehmen13, sondern sind darauf spezialisiert, Selbstantigene oder Viren zu erkennen und zu prozessieren 25.
Seit einigen Jahrzehnten ist es nun möglich, DC auch aus Monozyten oder aus CD34+ Vorläuferzellen in vitro zu generieren 30,31, um sie anschließend zur Therapie maligner Erkrankungen
einzusetzen (siehe Kapitel 2.3.2).
2.1.1.2 Murine DC-Subpopulationen
In der Maus werden die murinen klassischen DC (C-DC) in CD8α+ CD11b- DEC-205+ DC
(lymphoide DC, L-DC) und CD8α- CD11b+ 33D1+ DC (myeloide DC, M-DC) unterteilt. Die
CD8α+ DC kommen in T-Zell-Regionen der Milz vor und produzieren hohe Mengen an IL-12
und induzieren Th1-Antworten 32,33. Außerdem sind sie in der Lage, durch Kreuzpräsentation
von Antigenen CD8+ T-Zellen zu stimulieren
Lymphknoten sowie im Thymus
31
34-36
. Man findet diesen DC-Subtyp auch in
. Die CD8α- DC sind hauptsächlich in der Marginalzone
und in der roten Pulpa der Milz lokalisiert, wandern aber nach Antigenstimulation in die TZell-Gebiete ein
37,38
. Diese DC-Population scheint auf die Aufnahme toter Zellen speziali-
siert zu sein und spielt eine wichtige Rolle in der Abwehr von Viren
34,35,39
. Sie induziert
hauptsächlich Th2-Antworten und kann keine zytotoxischen T-Zellen aktivieren 40. Diese DCPopulation wird anhand ihrer CD4-Expression in CD4+ und CD4- Zellen unterteilt
41
. Im
Lymphknoten und im Thymus kommen CD8α- CD4- CD11b- DC vor, die über eine moderate
DEC-205-Expression verfügen
mierende DC gefunden
42
31
. In Haut-Lymphknoten wurden zusätzlich Langerin-expri-
. Vor ein paar Jahren wurde eine weitere DC-Subpopulation ent-
deckt, die murinen P-DC, welche durch eine hohe Expression von Ly6C und B220 und eine
niedrige Expression von CD11c charakterisiert sind 43-46. Wie die humanen P-DC haben diese
DC ein plasmazytoides Erscheinungsbild und können nach viralen oder mikrobiellen Stimuli
große Mengen an IFNα produzieren. Ob die DC eine Th1- oder eine Th2-Antwort induzieren,
hängt – wie schon bei den humanen DC – von dem jeweiligen immunologischen Milieu ab 4.
Die murinen P-DC und C-DC leiten sich von einer gemeinsamen DC-Vorläuferzelle (CDP,
common DC precursor) ab. Einige DC-Subpopulationen entwickeln sich hingegen aus Monozyten. So wurden inflammatorische TNFα- und iNOS-produzierende DC (TipDC) und Monozyten-abgeleitete DC nach einer Entzündung oder einer Infektion nachgewiesen 47-52.
Wie oben beschrieben, stellen die DC - sowohl in der Maus als auch im Menschen - ein
äußerst komplexes System verschiedener Zellen dar, die unterschiedlichen Aufgaben im Kör-
2. Einleitung
8
per übernehmen. In den nächsten Jahren werden sicherlich weitere hochspezialisierte DCSubpopulationen entdeckt werden.
2.1.2. Aufnahme, Prozessierung und Präsentation von Antigenen
DC nehmen in der Peripherie des Körpers oder in den lymphoiden Organen ständig Antigene
auf. Dies geschieht durch kontinuierliche Makropinozytose extrazellulärer Flüssigkeiten
und Phagozytose von Antigenen
54
53
, sowie durch rezeptorvermittelte Endozytose (Abb. 2.2).
Für Letzteres stehen DC eine Vielzahl an Rezeptoren zur Verfügung, welche die Internalisierung von Antigenen bewirken. Dazu gehören C-Typ-Lektine wie DEC-205/CD205 55, BDCA2 (blood DC antigen 2)
56
, MR/CD206
53
, DC-SIGN
57
und Langerin/CD207
58
, die den
kohlenhydrathaltigen Anteil von Glykoproteinen binden. DC verfügen aber auch über Fc-Rezeptoren (FcR) für die Bindung von Fc-Domänen von Immunglobulinen (FcγR, FcεR,
59,60
),
sowie über spezifische Rezeptoren für Hitzeschockproteine (HSP), die deren Aufnahme in die
DC induzieren. Durch die Expression von CD36 und αvβ5-Integrinen können DC apoptotische Zellen binden und phagozytieren 61.
Nach der Bindung der Antigene an die verschiedenen Rezeptoren erfolgt die Internalisierung
durch rezeptorvermittelte Endozytose durch einen clathrinabhängigen oder -unabhängigen
Mechanismus
62
(Abb. 2.2). Die aufgenommenen Makromoleküle werden dann über frühe
und späte Endosomen zu den Lysosomen transportiert 63 (Abb. 2.2). In den Lysosomen erfolgt
die Degradation der Ligand-Rezeptor-Komplexe
64
in 12 bis 25 Aminosäuren lange Peptide,
+
die so auf MHC-Klasse-II-Molekülen CD4 T-Zellen präsentiert werden können 65 (Abb. 2.2).
Diese Moleküle bestehen aus einer α- und einer β-Kette, die zusammen mit der invarianten
Kette (Ii) den αβIi-Komplex bilden. Das CLIP-Peptidfragment der Ii verdeckt dabei die
MHC-Klasse-II-Peptid-Bindetasche, um eine Bindung anderer im Endoplasmatischen Retikulum (ER) befindlicher Proteine zu verhindern. Über den Trans-Golgi-Apparat gelangen die
MHC-Klasse-II-Moleküle in den MIIC (MHC class II-enriched compartment), in dem der
Austausch des CLIP-Fragmentes gegen ein Antigenpeptid erfolgt, der durch die MHC-KlasseII-Moleküle HLA-DM und HLA-DO katalysiert wird 66-68 (Abb. 2.2). Alternativ können auch
wieder internalisierte MHC-Klasse-II-Moleküle mit Peptiden beladen werden
10,23
.
Anschließend gelangen die MHC-Klasse-II-Peptid-Komplexe an die Oberfläche der DC (Abb.
2.2) und können nun CD4+ T-Zell-Antworten induzieren4. Es gibt drei verschiedene MHCKlasse-II-Molekül-Gruppen, HLA-DP, HLA-DR und HLA-DQ (HLA: human leucocyte
antigen; (IMGT/HLA Database), von denen jeweils etliche verschiedene Genvarianten existieren. Dieser Polymorphismus sowie die Polygenie führen zu einer hohen Diversität an ver-
2. Einleitung
9
schiedenen MHC-Molekülen, wobei jeder Mensch mindestens 3 verschiedene MHC-KlasseII-Moleküle auf seinen APCs exprimiert.
Direkte Peptidbeladung
Proteine
Tote Tumorzellen
Tumorlysate
Phagozytose/
Makropinozytose
RezeptorTargeting
Lysosom
MIIC
Endosom
Rezeptorvermittelte
Endozytose
HLA-II
Endosom
Lysosom
HLA-IIPräsentation
DC
HLA-II
HLA-II
HLA-II
ER
HLA- HLADM DO
KREUZPRÄSENTATION
Ribosom
HLA-II
CLIP
HLA-I
HLA-I
Proteasom
HLA-I
Virus
TAPTransporter
Nukleus
RNA
Protein
ubiquitinyliertes
Protein
DNA
DNA-Transfektion
Direkte Peptidbeladung
RNA-Transfektion
HLA-IPräsentation
Abb. 2.2: Antigenprozessierung durch DC. Dargestellt sind die Antigenprozessierungswege von DC,
die zur Präsentation von Peptiden auf MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Molekülen führen, sowie
Möglichkeiten zur Antigenbeladung von DC durch externe Beladungsstrategien für die Tumortherapie
(blaue Schrift). Erklärung siehe Text. MIIC: MHC class II-enriched compartment, ER: Endoplasmatisches Retikulum, HLA: human leukocyte antigen, TAP: transporter for antigen processing.
Zur Aktivierung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen muss die Präsentation von Antigenen auf
MHC-Klasse-I-Molekülen erfolgen, von denen es 3 Hauptgruppen, HLA-A, HLA-B und
HLA-C gibt (IMGT/HLA Database) 69. Wie bei den MHC-Klasse-II-Molekülen kommen sehr
viele unterschiedliche Genvarianten vor. Im Gegensatz zu MHC-Klasse-II-Molekülen, die nur
auf professionellen APC exprimiert werden, exprimieren nahezu alle murinen und humanen
Körperzellen MHC-Klasse-I-Moleküle
70,71
. Diese bestehen aus einer schweren Kette (HLA-
Molekül) und einer leichten Kette (β2-Mikroglobulin), die im ER mit Peptiden beladen werden (Abb. 2.2). Die Bindung der Peptide erfolgt dabei in einer von der schweren Kette ausgebildeten Grube. Die meisten dieser Peptide stammen aus dem Zytosol von körpereigenen Proteinen sowie Proteinen von intrazellulär replizierenden oder persistierenden Pathogenen wie
Viren. Nachdem diese endogenen Proteine ubiquitinyliert wurden, werden sie in einem ATPabhängigen Prozess durch das Proteasom degradiert 70,71 und anschließend mit Hilfe von TAP
2. Einleitung
10
(transporter for antigen processing, 72) ins ER transportiert, wo die Peptide auf MHC-KlasseI-Moleküle geladen werden
70,73
(Abb. 2.2). Werden MHC-Klasse-I-Peptid-Komplexe auf
Körperzellen präsentiert, welche keine professionellen APC sind, können die auf den MHCMolekülen präsentierten Antigene nicht aktiv eine Immunantwort gegen den Erreger auslösen,
sondern diese Antigene müssen auf APC übertragen werden. So können DC auch exogenes
Antigen auf MHC-Klasse-I-Molekülen präsentieren, indem sie exogene Antigene von sterbenden Zellen oder Immunkomplexe aufnehmen 59,74,75. Die aufgenommenen exogenen Antigene gelangen dann auf 3 unterschiedlichen Wegen in den MHC-Klasse-I-Präsentationsweg 4:
1) Das Antigen wird in den Endosomen hydrolysiert und auf recycelte MHC-Klasse-I-Moleküle geladen, 2) Das Antigen wird zunächst durch einen ATP- und Proteasom-abhängigen
Prozess aus den Lysosomen ins Zytosol transportiert und dann im ER auf MHC-Klasse-I-Moleküle geladen und 3) Das Antigen wird nach der Degradation durch das Proteasom in einem
ATP-abhängigen Prozess im Lysosom auf MHC-Klasse-I-Molekülen geladen. Diese so genannte Kreuzpräsentation ermöglicht die Induktion eine Immunantwort gegen Pathogene, die
76,77
keine professionellen APC infizieren, sondern andere Körperzellen
. Außerdem ermög-
licht dieser Mechanismus, Toleranz gegenüber Selbstantigenen zu induzieren
76,77
. Des Wei-
78
teren sind DC in der Lage, Antigene auf andere DC zu transferieren . Auch die rezeptorvermittelte Endozytose kann eine effiziente Kreuzpräsentation induzieren, wie z.B. für das CTyp-Lektin DEC-205 und für FcR gezeigt wurde 21,79.
2.1.2. DC-Aktivierung
Damit DC nach Antigenaufnahme eine effiziente Immunantwort gegenüber einem Erreger
oder entartete Zellen induzieren können, muss eine Reifung der DC erfolgen. Dabei verwandelt sich die unreife DC von einer Antigen aufnehmenden Zelle in eine APC 4,21. Während des
Reifungsprozesses verändert sich nicht nur die Morphologie der DC
80
, sondern es treten di-
verse Veränderungen in der Expression von Oberflächenmolekülen auf. So wird die Expression von Endozytose- und einigen Phagozytoserezeptoren herunterreguliert, wohingegen
kostimulatorische Moleküle (z.B. CD40, CD58, CD80, CD86, OX40-L, CD70, 4-1BB-L) verstärkt exprimiert werden 4,81. Um eine verstärkte Antigenpräsentation auf MHC-Molekülen zu
erreichen, kommt es zur Translokation der MIIC zur Zelloberfläche
23,82,83
. Es werden Che-
mokine sezerniert, die andere Immunzellen wie NK-Zellen, Neutrophilen Zellen, Monozyten
und T- und B-Lymphozyten anlocken 84-87 21, sowie Zytokine, welche die Differenzierung sowie die Polarisierung der angelockten Immunzellen modulieren
88
. Außerdem wird die Ex-
2. Einleitung
11
pression des Chemokinrezeptors CCR7 hochreguliert, der die Migration der DC in Lymphknoten ermöglicht 89-91.
DC werden auf vier verschiedenen Wege aktiviert: durch pathogene Organismen, absterbende
Zellen, sowie durch Zellen der angeborenen und adaptiven Immunantwort 21. Bestandteile von
Bakterien, Pilzen, Viren oder Parasiten werden durch PRR wie TLRs (toll-like receptors), CTyp-Lektine sowie intrazelluläre NLR (nucleotide oligomerization domain ($OD)-like
receptors) erkannt und induzieren so die Reifung der DC
4,21
. Ebenso lösen so genannte
DAMP (damage-associated molecular patterns 92) von sterbenden Zellen die Reifung von DC
aus. Dazu gehören Hitzeschockproteine (HSP
93
), das HMGB1-Protein (high-mobility group
box 1, 94), β-Defensin 95 und Harnsäure 77. Allerdings induzieren zumindest einige DAMP wie
z.B. β-Defensine oder HSP die Aktivierung von DC in einer TLR-4-abhängigen Art und Wiese, so dass mittlerweile diskutiert wird, ob die beobachtete Reifung der DC auch durch Verunreinigungen mit dem TLR-4-Liganden LPS induziert wurde 21. DC aktivieren nicht nur Zellen
des angeborenen Immunsystems, sondern sie werden auch von Immunzellen wie Neutrophilen, Basophilen, Makrophagen und Mastzellen aktiviert, indem diese Zytokine aber auch bioaktive Substanzen wie Gewebshormone (Prostaglandine) oder DAMP sezernieren 21. Auch eine Aktivierung der DC über kostimulatorische Moleküle ist möglich. So bewirkt die Interaktion zwischen CD40 auf der DC und CD40L auf der Th1-Zelle eine erhöhte Expression von
B7-Molekülen sowie des kostimulatorischen Moleküls CD70
21
. Außerdem kann auch die
Aufnahme von Antikörper-Antigen-Immunkomplexen zur Reifung der DC führen 4. Durch
diese verschiedenen Stimuli werden unterschiedliche Arten an reifen DC wie IFN-DC, TNFDC, IL-10-DC usw. generiert, die die induzierte T-Zell-Immunantwort modulieren (Model
beschrieben in 21).
Nachdem die DC die Antigene aufgenommen haben und durch zusätzliche Reifungsstimuli
aktiviert wurden, wandern sie in die SLO, um dort durch Interaktion mit den CD4+ und CD8+
T-Zellen die adaptive Immunantwort gegen einen Erreger oder Tumor zu induzieren (siehe
2.2).
2.1.4. Toleranzinduktion durch DC
DC spielen aber nicht nur eine wichtige Rolle in der Abwehr von Pathogenen, sondern tragen
auch entscheidend zur zentralen sowie peripheren Toleranz gegenüber Selbstantigenen bei
21,31
. Im Thymus wird die Apoptose potentiell autoreaktiver T-Zellen unter Mithilfe von Thy-
mus-DC induziert (zentrale Toleranz, 96). DC vermitteln aber auch periphere Toleranz. Liegt
keine Infektion oder Entzündung im Körper vor, befinden sich die DC in einem steady-state-
2. Einleitung
12
Zustand und nehmen Selbstantigene in Form von Exosomen 97,98 oder Detritus von Epithelzellen 42,99,100 auf. Werden apoptotische Zellen durch Rezeptoren wie CD36 oder αvβ3 / αvβ5-Integrinen aufgenommen, wird die Reifung und die Zytokinsekretion der DC unterdrückt
101,102
und die DC verbleiben dadurch im steady-state-Zustand. Migrieren diese Selbstantigen präsentierenden steady-state DC dann in den Lymphknoten,
103,104
aktivieren sie die antigenspe-
zifischen T-Zellen nicht, sondern lösen deren Anergie oder Deletion aus
CD4+ CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs)
83
und induzieren
21,103
. Dieser Prozess ist äußerst wichtig für die
Vermeidung von Autoreaktivität. So findet man bei der Autoimmunkrankheit SLE (systemic
lupus erythematosus) chronisch aktivierte DC im Körper der Patienten
105
. Tregs wiederum
können die Reifung von DC inhibieren, sowie deren Antigenpräsentationseffizienz und die
Zytokinsekretion pro-inflammatorischer Zytokine wie IL-12, TNF und IL-6 reduzieren
103
.
Außerdem zeigten einige Arbeiten, dass Tregs die DC sogar dazu induzieren können, IL-10 zu
sekretieren 106. Diese DC-Tregs-Interaktion kann von Tumoren ausgenützt werden. So wurde in
einem murinen B16-Melanoma-Modell gezeigt, dass tumorspezifische Tregs die DC-Funktion
supprimieren können und der Tumor Tregs zum Schutz vor Effektorzellen rekrutiert 107,108.
2.2. T-Zellen
Die adaptive Immunantwort wird sowohl durch B-Zellen als auch durch T-Zellen vermittelt.
Im Gegensatz zu B-Zellen, welche eine humorale Immunantwort auslösen, induzieren T-Zellen hauptsächlich die zelluläre Immunantwort gegen einen Erreger.
2.2.1. T-Lymphozyten und ihr TZR
CD8+ und CD4+ T-Zellen erkennen mit ihrem TZR Peptide, welche in MHC-Klasse-I- bzw. in
MHC-Klasse-II-Molekülen auf der Oberfläche von APC präsentiert werden. Zusätzlich können auch Lipidantigene, welche auf MHC-ähnlichen Molekülen (CD1) gezeigt werden, erkannt werden
109,110
. Zwischen 90 und 99 % der vorkommenden T-Zellen besitzen einen
membranständigen TZR, welcher aus einer α- und β-Kette besteht, die durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Dabei bindet der TZR mit seinem variablen Anteil an
Peptide, welche in bestimmten MHC-Molekülen präsentiert werden. Zwischen 1 und 10 %
der T-Zellen sind γδ-T-Zellen, deren TZR über eine γ- und δ-Kette verfügt. Um die hohe Anzahl verschiedener Antigene erkennen zu können, ist ein großes Repertoire an verschiedenen
TZR nötig. Dem menschlichen Immunsystem stehen nach positiver und negativer Selektion
im Thymus schätzungsweise 107 verschiedene TZR zur Verfügung
109
, welche durch die
2. Einleitung
13
V(D)J-Rekombination der variablen Gensegmente des TZR-Lokus entstehen. Der humane
Lokus der TZR α-Kette ist auf Chromosom 14 lokalisiert und enthält 44-46 variable Domänen (Vα), 50 joining-Regionen (Jα), sowie eine konstante Region (Cα; siehe Abb. 2.3A). Der
TZR-β-Lokus befindet sich auf Chromosom 7 und besteht zusätzlich zu den 64-74 Vβ- und
12 Jβ-Regionen noch aus 2 diversity-Regionen (Dβ, siehe Abb. 2.3B). Im Gegensatz zur αKette existieren für die β-Kette zwei verschiedene konstante Regionen (Cβ1 und Cβ2). Die
V(D)J-Rekombination findet im Thymus statt und ist eng mit den verschiedenen Entwicklungsstadien der T-Zellen verknüpft 110,111. Die CD4- und CD8-negativen T-Lymhozyten rearrangieren zunächst die Gensegmente der β-Kette des TZR, wobei als erstes durch somatische
Rekombination ein Dβ-Gensegment mit einem Jβ-Gensegment verknüpft wird, gefolgt von
der Verknüpfung des entstandenen DJβ-Gensegments mit einem Vβ-Gensegment. Die somatische Rekombination erfolgt dabei durch den VDJ-Rekombinase-Komplex. Nach Transkription dieses rearrangierten Gens werden die Introns zwischen dem VDJβ-Segment und einer
der konstanten Cβ-Ketten-Domänen durch den Mechanismus des Spleißens entfernt (mRNA,
siehe Abb. 2.3). Kann die TZR-β-Kette translatiert werden, entwickeln sich die T-Lymphozyten in CD4 und CD8 doppelt positive Zellen, die dann mit dem Rearrangement der α-Kette
beginnen. Analog zur Rekombination des β-Ketten-Lokus erfolgt die VJ-Rekombination im
α-Ketten-Lokus. Sowohl bei dem Rearrangement des α-Ketten- als auch des β-Ketten-Lokus
wird das TZR-Repertoire zusätzlich erweitert, indem in der CDR3
(complementarity
determining region 3) zwischen dem V- und J-Segment des α-Ketten-Lokus und dem V- und
D-Segment des β-Ketten-Lokus während des Rekombinationsvorganges entweder Nukleotide
eingefügt oder deletiert werden.
L
A
Vα (44-46)
Cα
Jα (50)
Lokus
CAP 5’NTR
Vα
Jα
Cα
3’NTR
mRNA
L
B
PolyA
AAAAAAAAAA
Vβ (64-67)
Dβ1
Cβ1
Jβ1 (6)
Dβ2
Jβ2 (6)
Cβ2
Lokus
CAP 5’NTR
mRNA
Vβ
Dβ1/2
Jβ
Cβ1/2
3’NTR
PolyA
AAAAAAAAAA
Abb. 2.3: TZR α- und β-Ketten-Lokus und -mRNA. Darstellung des TZR-α-Ketten-Lokus (A) und
des TZR-β-Ketten-Lokus (B) sowie der TZR-α-Ketten-RNA (A) und TZR-β-Ketten-RNA (B). L: Leitsequenz, V: variable Region, J: joining-Region, D: diversity-Region, C: konstante Region, NTR: nichttranslatierter Bereich, PolyA: PolyA-Schwanz der mRNA.
2. Einleitung
14
Entsteht eine funktionelle α-Kette, wird der TZR zusammen mit dem CD3-Komplex auf der
Oberfläche der T-Zellen exprimiert. Der CD3-Komplex besteht aus einem CD3γε-, einem
CD3δε- und einem CD3ζζ- oder CD3ζη-Dimer
110
. Die CD3-Proteine enthalten alle 1 bis 3
ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motif), die nach Antigenerkennung durch
die p56Lck phosphoryliert werden. Dabei spielen die Korezeptoren CD4 und CD8 der T-Zellen eine entscheidende Rolle. Die Korezeptoren binden antigenunabhängig an MHC-KlasseII- (CD4) oder MHC-Klasse-I-Moleküle (CD8) und befinden sich dadurch in räumlicher Nähe
zu dem TZR-CD3-Komplex. Beide Korezeptoren besitzen in der zytoplasmatischen Domäne
ein CXCP-Motiv, an das die Kinase p56Lck, welche vorher durch die TransmembranproteinTyrosinphosphatase CD45 dephosphoryliert und damit aktiviert wurde, bindet, wodurch die
p56Lck in die räumliche Nähe des TZR-CD3-Komplexes gelangt. Dadurch kann nach Antigenerkennung eine Signalkaskade ausgelöst werden, welche zur Aktivierung der T-Zelle führt
110
.
2.2.2. T-Zell-Subpopulationen und ihre Rolle in der Immunantwort
T-Zellen werden anhand der Expression ihres Korezeptors in CD8+ zytotoxische T-Zellen
(CTL, cytotoxic T lymphocytes) und CD4+ T-Helfer-Zellen (Th-Zellen) unterschieden. CTL
erkennen Antigene, welche auf MHC-Klasse-I-Molekülen von APC präsentiert werden. Sie
sind hauptsächlich darauf spezialisiert, virusinfizierte Körperzellen abzutöten, können aber
auch zu einem gewissen Anteil maligne transformierte Körperzellen erkennen 69. Die Aktivierung von CTL wird in 2 Phasen unterteilt: In der ersten Phase werden die naiven T-Zellen
durch antigenexprimierende APC aktiviert und differenzieren in Effektorzellen. Diese zerstören dann in der 2. Phase Zellen, welche dasselbe Antigen auf MHC-Molekülen präsentieren. Zur Differenzierung der naiven CD8+ T-Zelle zur Effektorzelle müssen die Zellen zunächst den Antigen-MHC-Klasse-I-Komplex auf APC binden (Signal 1). Zusätzlich ist ein
kostimulatorisches Signal (Signal 2) nötig, welches durch die Interaktion zwischen B7.1
(CD80) oder B7.2 (CD86) auf der APC und dem CD28-Molekül, welches von der T-Zelle exprimiert wird, ausgelöst wird. Durch diese Interaktion wird die Expression des IL-2-Rezeptors
und IL-2 induziert (Signal 3), was zur vollständigen Aktivierung der CD8+ T-Zellen nötig ist
69
. An der T-Zell-Aktivierung sind jedoch noch weitere kostimulatorische Moleküle wie
CD40, OX40 und CD70 und Zytokine wie IL-12 beteiligt. Die Interaktion zwischen diesen
kostimulatorischen Molekülen sowie ihren Liganden auf APC und deren Bedeutung für die TZell-Aktivierung wird zurzeit intensiv erforscht. Außerdem spielen auch T-Helfer-Zellen eine
wichtige Rolle in der Entwicklung naiver CD8+ T-Zellen in Gedächtniszellen (siehe unten).
2. Einleitung
15
CD8+ T-Zellen verfügen auch über einen weiteren B7-Liganden, das CTL-assoziierte Antigen
4 (CTLA-4). Durch diese Interaktion wird die T-Zell-Antwort inhibiert und die periphere TZell-Toleranz induziert 69. Nach erneuter Aktivierung der CTL durch Zielzellen, welche dasselbe Antigen auf MHC-Klasse-I-Molekülen präsentieren, können CTL diese Zielzellen entweder durch den Granzym B/Perforin-abhängigen Mechanismus
aktion
114
112,113
, nach Fas/FasL-Inter-
oder durch Zytokinproduktion (IFNγ, TNF 69) töten, indem sie entweder Apoptose
induzieren
114
oder die Zielzellen direkt lysieren. Im Gegensatz zur initialen Aktivierung der
CD8+ T-Zellen sind hierfür keine kostimulatorischen Signale nötig, da CTL die Fähigkeit besitzen müssen, jede infizierte Körperzelle zu töten, auch wenn diese keine kostimulatorischen
Moleküle exprimiert 69,115,116. Zusätzlich zu den Effektorzellen entstehen auch CD8+ Gedächtniszellen, welche sich nach erneutem Antigenkontakt schnell in funktionelle CTL differenzieren können.
CD4+ T-Helferzellen werden durch die Bindung von MHC-Klasse-II-Peptid-Komplexen
durch ihren TZR (Signal 1) und ein kostimulatorisches Signal (Signal 2) aktiviert. Je nachdem
in welchem inflammatorischen Milieu diese Aktivierung erfolgt, differenzieren die T-Helferzellen in unterschiedliche CD4+ T-Zellpopulationen wie Th1-, Th2-, Th17-, Th22- oder Tregs
(Signal 3, 117-119). Das Zytokin IL-12, welches von NK-Zellen oder DC-Subpopulationen nach
Antigenkontakt exprimiert wird (siehe Kapitel 2.1.1, 120), induziert die Entwicklung von Th1Zellen über einen STAT-4- und T-bet- (T-box expressed in T-cells) abhängigen Signalweg
118,121
. Dieser T-Zellsubtyp zeichnet sich durch die Sekretion von IL-2, IFNγ und Lymphoto-
xin (ehemals TNFβ) aus und induziert Immunantworten, die zur Eliminierung von intrazellulären Pathogenen führt
120
. Th1-Zellen induzieren eine gesteigerte Aktivität von CTL sowie
die Entwicklung langlebiger CD8+ Gedächtniszellen 122. Dazu ist es allerdings nötig, dass die
Th1-Zellen, sowie die CTL das Antigen auf derselben DC erkennen. Die Interaktion dieser 3
Zelltypen erfolgt dabei entweder nach dem „Drei-Zell-Interaktions-Modell“ (passives Modell)
oder nach dem „sequenziellen Zwei-Zell-Interaktionsmodell“ (dynamisches Modell) 123).
Die Entwicklung von Th2-Zellen wird hingegen durch die Anwesenheit des Zytokins IL-4 gesteuert, welches von Mastzellen, NKT-Zellen, γδ-T-Zellen, sowie basophilen und eosinophilen Zellen produziert wird 118,124. Dabei führt ein STAT-6-abhängiger Signalweg zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors GATA3 und des Protoonkogens cMAF (musculoaponeurotic
fibrosarcoma oncogene homolog,
118
). Th2-Zellen sekretieren die Zytokine IL-4, IL-5, IL-10
sowie IL-13 und beeinflussen damit die humorale Immunantwort gegen extrazelluläre Parasiten und gegen persistierende Antigene.
2. Einleitung
16
Tregs hingegen entstehen in einer TGFβ-dominierten Umgebung
Transkriptionsfaktors Foxp3 (forkhead box protein 3) führt
126,127
ten“ Foxp3-positiven T-Zellen entstehen Tregs auch im Thymus
Entwicklung und Aufrechterhaltung von Toleranz
128
125
125
, die zur Expression des
. Außer diesen „induzier-
. Tregs sind wichtig für die
sowie zur Herunterregulierung initiierter
Immunantworten 129, können jedoch auch verhindern, dass entartete Zellen von Effektorzellen
erkannt werden (siehe auch Kapitel 2.1.4). Zusätzlich zu diesen 3 Subpopulationen kommen
noch Th17-Zellen
hen
130
117
, welche unter dem Einfluss der Zytokine TNFβ, IL-21 und IL-6 entste-
, vor, sowie IL-22-sezernierende Th22-Zellen 119 und invariante NK-ähnliche T-Zellen,
welche glykosylierte Lipide auf CD1-Molekülen erkennen (iNKT-Zellen, 131).
2.3. Immuntherapie maligner Erkrankungen
Obwohl dem menschlichen Körper ein äußerst komplexes und effizientes System zur Abwehr
von Pathogenen und entarteten Zellen zur Verfügung steht, treten trotzdem Tumorerkrankungen auf (Abb. 2.4). Die häufigste Krebserkrankung bei Männern ist mit 25 % aller Neuerkrankungen der Prostatakrebs, bei Frauen stellt eine Brustkrebserkrankung sogar 28 % aller malignen Neuerkrankungen dar (Robert-Koch-Institut 2008). Häufig treten auch Tumore im Darm
und in der Lunge auf, aber es ist auch eine deutliche Zunahme des schwarzen Hautkrebses
(Malignes Melanom) zu beobachten.
Abb. 2.4: Prozentualer Anteil ausgewählter Tumorlokalisationen an allen Krebsneuerkrankungen in Deutschland. Übernommen aus Krebs in Deutschland, 2003 - 2004, Häufigkeiten und Trends.
Tumore haben diverse Mechanismen entwickelt, um dem Angriff durch Immunzellen zu umgehen. So inhibieren z.B. Tregs tumorspezifische CTL-Antworten durch die Sekretion immunosuppressiver Zytokine wie IL-10 und TNFβ
132
. Zusätzlich können im Tumor befindli-
2. Einleitung
17
che Makrophagen sowie myeloide Suppressorzellen die Funktion von DC inhibieren und die
Angiogenese und das Tumorwachstum fördern
133,134
. Des weiteren können Tumorzellen
Immunantworten ausweichen, indem sie nur wenig Peptid/MHC-Komplexe auf der Zelloberfläche präsentieren. So wurde in einigen humanen Tumorzellen eine reduzierte Synthese und
Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen nachgewiesen
135,136
. Zusätzlich wird in Tumoren
oftmals die Expression kostimulatorischer Moleküle sowie von Tumorantigenen herunterreguliert
137
. Außerdem ist in Tumoren oft die Prozessierung von Antigenen eingeschränkt. So
ist z.B. das TAP-Protein, welches den Transport der degradierten Proteine ins ER ermöglicht
(siehe 2.1.2), nur unzureichend in einigen humanen Tumorzellen exprimiert 138. Diese Tumorzellen können dann durch T-Zellen nicht mehr erkannt werden
139-142
. Tumorzellen können
auch lösliche Faktoren wie den löslichen Fas-Ligand sekretieren, der dazu führt, dass CTL
Tumorzellen nicht durch eine Fas/FasL-vermittelte Apoptose eliminieren können
137
. Außer-
dem exprimieren Tumorstromazellen wie Endothelzellen oder Makrophagen/DC-ähnliche
Zellen sowie Tumorzellen das lösliche Suppressormolekül indoleamine-2,3-dioxygenase
(IDO), welche T-Zell-Antworten gegen den Tumor inhibieren kann 143.
Standardtherapien zur Behandlung maligner Erkrankungen beinhalten – neben der chirurgischen Entfernung des Tumors – die Chemotherapie als Mono- oder Polychemotherapie, sowie
die radioaktive Bestrahlung 131,144. Jedoch können Tumore Resistenzen gegen das verwendete
Medikament entwickeln und es werden auch gesunde Körperzellen durch diese Therapieformen zerstört. Eine alternative Behandlungsmethode ist die Immuntherapie maligner Erkrankungen, bei der ein Tumor durch Manipulation und/oder Aktivierung des Immunsystems
oder durch den Einsatz verschiedenster Immunkomponenten, welche entweder in vitro hergestellt oder modifiziert wurden, eliminiert werden soll. Diese Therapieform nützt die Spezifität
des Immunsystems aus, um gezielt Tumorzellen zu eliminieren, ohne gesunde Zellen abzutöten 145. Seit der Entdeckung von Tumorantigenen (TA) ist es möglich, zwischen Tumorzellen
und Körperzellen zu unterscheiden, und so eine tumorspezifische Immunantwort mit Hilfe der
Immuntherapie zu induzieren. Die Wahl des TA ist für den Erfolg der Immuntherapie sowie
für die Begrenzung ungewollter Nebenwirkungen sehr wichtig. So sollte das verwendete TA
im günstigsten Falle nur von Tumorzellen exprimiert werden wie z.B. neu entstandene Fusionsproteine (z.B. BCR-ABL 146) oder in Krebszellen vorkommende mutierte Proteinvarianten (z.B. ras, p53) oder die Proteine sollten über eine tumorspezifische Glykosylierung verfügen wie z.B. MUC1 145. Eine weitere Möglichkeit stellt die Verwendung von TA dar, welche
in malignem Gewebe überexprimiert werden wie z.B. das carcinoembryonic antigen (CEA,
147
), welches in Brust-, Lungentumoren sowie in Tumoren des Gastrointestinaltraktes vor-
2. Einleitung
18
kommt 148, oder das TA Her2/neu (human epidermal growth factor receptor 2), auch bekannt
unter dem Namen ErbB2 (erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2), welches u.a. in
Brust- und Eierstocktumoren überexprimiert wird
16,149
. Das TA MelanA (melanocyte
antigen), auch MART-1 (melanoma antigen recognized by T cell 1) genannt, ist ein Differenzierungsmarker für Melanozyten und wird in Melanozyten-abgeleiteten Tumoren wie dem
Malignen Melanom exprimiert 150. Eine weitere Gruppe von TA stellen die cancer-testis Antigene dar, welche außer in Geweben des Hodens nur in Tumoren exprimiert wird. Zu dieser
Gruppe gehört auch das TA MAGE-A3, dessen Expression in malignen Erkrankungen wie
dem Malignen Melanom, Multiplem Myelom, Hals- und Kopf-Plattenepithelkarzinom sowie
beim Lungen- und Brustkrebs zu finden ist 151,152.
Zur Immuntherapie maligner Erkrankungen können antikörperbasierte Therapeutika (siehe
2.3.1) eingesetzt werden. Eine andere Option, welche individuell auf den Patienten abgestimmt ist, stellt die zelluläre Immuntherapie mit DC (siehe 2.3.2) oder mit T-Zellen (siehe
2.3.3) dar.
2.3.1. Immuntherapie mit antikörperbasierten Therapeutika
Ein wirkungsvoller Ansatz zur Therapie maligner Erkrankungen ist der Einsatz therapeutischer Antikörper
131
, von denen bereits etliche Antikörper von der FDA (food and drug
administration) zugelassen wurden 153. Antikörper entfalten ihre Wirksamkeit entweder in einer effektorvermittelten oder effektorunabhängigen Art und Weise 153. Bei der effektorvermittelten Wirkungsweise vermitteln Antikörper den Kontakt zwischen Effektorzellen wie Neutrophilen Zellen, Granulozyten, Makrophagen, NK-Zellen sowie DC und einer Tumorzelle
(siehe Abb. 2.5A). Dabei binden Effektorzellen über ihre FcR an den Fc-Teil des therapeutischen Antikörpers, welcher über seine variablen Regionen an ein spezifisches Oberflächenmolekül der Tumorzelle bindet. Dieser Kontakt kann auch durch die Verwendung diabodies
154
oder bispezifische scFv-Antikörperformate 155 vermittelt werden. Diese Antikörperderivate
besitzen keinen Fc-Teil, sondern in diesen werden die Antigen bindenden Regionen zweier
unterschiedlicher Antikörper vereint, wodurch zwei unterschiedliche Antigene gleichzeitig
gebunden werden können. Dies ermöglicht eine Rekrutierung von Effektorzellen zu den Tumorzellen, wodurch Limitierungen der durch den Fc-Teil vermittelten oder MHC-abhängigen
Aktivierung von Effektorzellen umgangen werden
156
. Eine Weiterentwicklung stellen scFv
triabodies dar, welche über eine zusätzliche Bindedomäne für ein TA verfügen 157. Der Kontakt zwischen Effektor- und Tumorzellen ermöglicht zum einen die Phagozytose durch DC
und Makrophagen, zum anderen werden Tumorzellen durch einen Perforin-vermittelten
2. Einleitung
19
Mechanismus, der als antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) bezeichnet wird,
durch NK-Zellen lysiert 131. Viele therapeutische Antikörper entfalten ihre Wirkung durch die
Vermittlung von ADCC, wie z.B. Rituximab und Trastuzumab 153.
A) Rekrutierung von
Effektorzellen
Effektorzelle
C) Signalisieren
Antikörper
Immunzytokin
Radioimmunkonjugat
Tumorzelle
Immuntoxin
Zytostatika-Konjugat
Immunliposom
C1q
Fc Rezeptor
Antigen
Liganden
Reaktive Zelle
Signalweiterleitung
D) Immunkonjungate
B) Blockieren
Signalblockade
Antiproliferatives /
apoptotisches Signal
Abb. 2.5: Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper (abgewandelt nach Glennie et al., 2000).
Erklärung siehe Text.
Mit Antikörpern opsonisierte Tumorzellen können aber auch durch den Mechanismus der
complement dependent cytotoxicity (CDC) lysiert werden, indem die primäre Komplementkomponente C1q an den Fc-Teil des Antikörpers bindet und damit die Komplementreaktion
ausgelöst wird 153. Rituximab wirkt neben der Induktion von apoptotischen Signalen unter anderem auch durch die Induktion von CDC gegen die Tumorzellen 131.
Bei den effektorunabhängigen Wirkprinzipien unterscheidet man zwischen Blockieren (Abb.
2.5B), Signalisieren (Abb. 2.5C) und der Verwendung von Immunkonjungaten (Abb. 2.5D).
Durch die Bindung eines Antikörpers an Zielstrukturen auf Tumorzellen wird zum einem die
Signalisierung durch Wachstumsfaktoren, Zytokinen oder anderen löslichen Mediatoren gehemmt. Zum anderen können die Antikörper auch direkt an diese löslichen Liganden oder an
2. Einleitung
20
deren Rezeptoren binden (Abb. 2.5B). So blockiert z.B. Trastuzumab (Herceptin®), ein monoklonaler Antikörper (mAb) der zur Behandlung von Brustkrebs eingesetzt wird, durch Bindung des Rezeptors Her2/neu die Interaktion mit dem epithelialen Wachstumsfaktor
(epithelial growth factor, EGF) und hemmt damit proliferations- und wachstumsfördernde
Signale 158. Beim Signalisieren (Abb. 2.5C) wird mit Hilfe von agonistischen Antikörpern das
Kreutzvernetzen von Oberflächenmolekülen bewirkt, was zur Auslösung von pro-apoptotischen oder anti-proliferativen Signalen in der Zielzelle führen kann
153,159
. Ein in der Klinik
eingesetzter Antikörper, der über die Kreuzvernetzung des Zielantigens CD20 Apoptose auslöst, ist der mAb Rituximab (Rituxan, MabThera®,
131
). Die Behandlung von Patienten mit
Non-Hodgkin-Lymphom mit diesem mAb führte zu einer Ansprechrate von 48 % 160. Bei der
Verwendung von Immunkonjugaten (Abb. 2.5D) nutzt man die rezeptorvermittelte Endozytose aus, um in die Tumorzelle ein Toxin, oder ein Zytostatikum (z.B. Methotrexat, Antrazyklin,
Doxorubicin) einzuschleusen, oder um Radionukleotide (z.B.
131
IL-2) in die räumliche Nähe von Tumorzellen zu transportieren
I,
90
Y) oder Zytokine (z.B.
131,153
. Die toxische Kompo-
nente ist dabei an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gekoppelt, um eine spezifische Bindung des Immunkonjugats an die Tumorzelle zu ermöglichen. Bei der Verwendung
eines Immunliposoms, an das spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente gekoppelt
sind, kann sogar eine größere Anzahl von Zytostatika-Molekülen zur Zielzelle transportiert
werden
161
. Beispiele für Immunkonjugate, sind die mAb Epratuzumab und Inotuzumab
ozogomicin sowie ein gegen CD22-gerichtetes Immuntoxin 131. Der Behandlungserfolg vieler
mAb wird in Kombination mit herkömmlichen Therapien wie die Chemotherapie oder radioaktive Bestrahlung verbessert 131,162.
2.3.2. Immuntherapie mit Dendritischen Zellen
Tumoren unterdrücken ihre Erkennung und damit ihre Beseitigung durch das Immunsystem
auf unterschiedliche Art und Weise (siehe Kapitel 2.3). Eine viel versprechende Strategie, um
eine erfolgreiche Immunantwort gegenüber einen Tumor einzuleiten, stellt die Impfung von
Krebspatienten mit DC dar
163
. Nach der in-vitro-Beladung der DC mit TA werden jene in
Krebspatienten injiziert, um eine Immunantwort gegen den Tumor zu induzieren. Dazu müssen die DC in die Lymphknoten wandern, um dort antigenspezifische T-Zellen zu aktivieren,
die im Falle der CTL den Tumor direkt angreifen, oder wichtige T-Zellhilfe geben können
(siehe Kapitel 2.2.2).
DC, welche in der Tumorimmuntherapie eingesetzt werden, werden entweder direkt als unreife DC-Vorläufer aus dem peripheren Blut der Patienten gewonnen, oder es werden DC aus
2. Einleitung
21
CD34+ hämatopoietischen Vorläuferzellen oder aus Monozyten ex vivo hergestellt
145,163
. Be-
vor die DC den Patienten verabreicht werden, werden sie durch Zugabe von LPS, CD40-Ligand, TNF, monocyte-conditioned medium (MCM) oder auch einem Zytokincocktail bestehend aus IL-6, TNF, IL-1β und PGE2 oder dem „multi-cytokine cocktail“ (TNF, IL-1β,
PolyI:C, IFNα und IFNγ) gereift, um ihre Immunogenität zu steigern und die Induktion von
Toleranz zu vermeiden (siehe Kapitel 2.1.4) 145,163,164. Die Injektion der in vitro beladenen DC
kann entweder intravenös, intradermal, subkutan, oder intranodal erfolgen oder durch Injektion der Zellen in lymphatische Gefäße, jedoch ist noch nicht bekannt, welche der Injektionsroute am Besten ist 164-166.
DC können in vitro auf unterschiedliche Weise mit TA beladen werden (siehe Abb. 2.2), wie
durch die Zugabe von Tumorpeptiden, von autologen oder allogenen Tumorzelllysaten
und -proteinextrakten, aber auch durch Transfer TA-kodierender retroviraler Vektoren, rekombinanter Adenoviren oder Lentiviren oder durch Elektroporation der DC mit TA-kodierender RNA oder der kompletten RNA isoliert aus Tumoren oder Tumorzelllinien (Zusammengefasst in 145,163,165,167). Um eine effiziente MHC-Klasse-II-Präsentation nach Elektroporation von DC mit TA-kodierender RNA zu erhalten, muss diese so modifiziert werden, dass
das translatierte Protein zu den Endosomen transportiert wird. Bonehill et al. verwendeten dazu eine MAGE-A3-DCLAMP-RNA (DCLAMP: DC-specific lysosome-associated membrane
glycoprotein), welche zusätzlich zum N-terminalen Signalpeptid, welches die Translation des
Proteins ins ER induziert, C-terminal die endosomale Targeting-Sequenz von DCLAMP enthielt, die den Transport von Proteinen zu den Endosomen ermöglicht. Die Elektroporation
von DC mit MAGE-A3-DCLAMP-RNA führte daher sowohl zu einer MHC-Klasse-I- als
auch MHC-Klasse-II-Präsentation des MAGE-A3-TA
168
. Aber auch die Eigenschaften von
DC können durch RNA-Elektroporation modifiziert werden: So könnte die Elektroporation
von E/L-Selektin-kodierender RNA die Migration der DC zu den Lymphknoten verbessern 169.
Außerdem ist es möglich durch Elektroporation mit mRNA kodierend für CD40L, CD70 und
dem konstitutiv aktivierten TLR4 DC zu aktivieren (Trimix-DC) und gleichzeitig TA-kodierende RNA in die DC einzubringen 170,171.
Die Effizienz der DC-Impfung zur Therapie maligner Erkrankungen wurde in den letzen Jahrzehnten in vielen klinischen Studien analysiert. Obwohl sich DC in klinischen Studien als
immunogen herausgestellt haben und erste viel versprechende klinische Ergebnisse erzielt
wurden, bleibt insgesamt die klinische Effizienz der DC-Impfungen immer noch unbefriedigend
164,165
. Um die Effizienz dieser Therapie zu verbessern, wird zurzeit versucht, die durch
die DC-Impfung induzierte Immunantwort zu optimieren, indem intensiv an der TA-Beladung,
2. Einleitung
22
verschiedenen Reifungsstimuli, dem verwendeten DC-Subtyp sowie an der Injektionsroute
der DC geforscht wird
166
. Eine weitere Möglichkeit, um die klinische Effizienz zu erhöhen,
wäre eine Kombination der DC-Impfung mit anderen Therapieformen wie die Chemo- oder
Radiotherapie oder die Therapie mit anti-CTLA-4-Antikörpern, was zurzeit in klinischen Studien analysiert wird 165.
Zur Immuntherapie maligner Erkrankungen können aber auch entweder modifizierte Tumorzellen injiziert werden, welche immunstimulierende Zytokine exprimieren, oder TA-kodierende Plasmide oder Viren sowie Peptide zusammen mit Adjuvans verabreicht werden. Diese TA
können dann von in der Haut befindlichen DC aufgenommen und prozessiert werden 145. Eine
weitaus elegantere Methode stellt das direkte in-vivo-Targeting von DC mit Antikörper-Antigen-Konstrukten dar. DC exprimieren auf ihrer Zelloberfläche diverse Endozytoserezeptoren,
welche zum Targeting mit Antikörper-Antigen-Konstrukten verwendet werden können. Zum
einen eignen sich dazu Mitglieder der Familie der C-Typ-Lektin-Rezeptoren (CLR), zu denen
u.a. der Mannoserezeptor, DEC-205 (siehe Kapitel 2.3.3) sowie DC-SIGN gehören, zum anderen FcR und Integrine (Übersicht siehe 172). Dabei führte das in-vivo-Targeting von DC mit
Antikörper-Antigen-Konstrukten zur Präsentation des verwendeten TA, sowie zur Induktion
einer TA-spezifischen Immunantwort in Mäusen 172-175.
Das in-vivo-Targeting von DC hat einige Vorteile gegenüber der Verwendung von ex vivo beladenen DC. Im Gegensatz zu ex vivo generierten DC, die für jeden Patienten individuell hergestellt werden müssen, wird zum in-vivo-Targeting von DC nur ein Produkt benötigt, welches universell eingesetzt werden kann. Somit werden die Kosten deutlich gesenkt und es
steht für die Immuntherapie ein Produkt zur Verfügung, was in gleich bleibender Qualität hergestellt werden kann. Außerdem werden die DC in ihrer „natürlichen Umgebung“ mit TA beladen und es können verschiedene DC-Subpopulationen erreicht werden, wohingegen für die
ex-vivo-Beladung von DC nur bestimmte DC-Subpopulationen eingesetzt werden. Jedoch
bringt das in-vivo-Targeting auch Nachteile mit sich: Der Reifungs- und Aktivierungszustand
von in-vivo-beladenen DC kann im Gegensatz von in-vitro-beladenen DC nicht analysiert
werden. Außerdem werden viele Targeting-Rezeptoren nicht nur auf DC exprimiert, so dass
die Antikörper-Antigen-Konstrukte auch von anderen Zellen aufgenommen werden können
172
.
2.3.2.1. DEC-205-Targeting
DEC-205, auch bekannt unter den Namen CD205, gp200-MR6 oder LY75 (lymphocyte
antigen 75), ist ein Endozytoserezeptor, welcher zur Familie der CLR gehört
176
. In Mäusen
2. Einleitung
23
wird DEC-205 auf CD11c+, CD8+ DC exprimiert, welche im Thymus, in Lymphknoten, aber
auch in der Milz vorkommen, sowie auf dermalen DC und LC 177. Im Menschen kommt DEC205 auf myeloiden und plasmazytoiden DC vor, jedoch – im Gegensatz zu Mäusen – auch auf
Monozyten, B-Zellen, NK-Zellen, T-Zellen sowie auf Epithel-, Knochenmarkstroma- und Endothelzellen 176,178. Die Struktur von DEC-205 ist in Abbildung 2.6 schematisch dargestellt.
N
S
S
S
cysteinreiche
Domäne
S
FNII
CTLD1
CTLD2
CTLD3
CTLD4
CTLD5
CTLD6
CTLD7
CTLD8
CTLD9
CTLD10
Endozytosemotiv
EDE-Motiv
C
176
179
Abb. 2.6: Der DEC-205-Endozytoserezeptor (abgewandelt nach East et al.
und Figdor et al. ).
Die zytoplasmatische Domäne von DEC-205 enthält eine cysteinreiche Region, eine FNII-Domäne
(fibronectin type II) sowie 10 C-Typ-Lektin-ähnliche Domänen (CTLD). Im intrazellulären Bereich des
Rezeptors befinden sich ein Endozytose- sowie das EDE-Motiv.
Der extrazelluläre Anteil des DEC-205-Moleküls enthält 10 C-Typ-Lektin-ähnliche Domänen
(C-type-lectin-like domain, CTLD), eine FNII-Domäne (fibronectin type II), sowie eine N-terminale cysteinreiche Region. Die zytoplasmatische Domäne beinhaltet ein tyrosinbasiertes
Endozytosemotiv (FSSVRY), welches die Internalisierung über einen clathrinabhängigen Mechanismus in die frühen Endosomen steuert 176,179. Durch das in der zytoplasmatischen Domäne enthaltene saure Aminosäuremotiv (EDE) gelangt der Rezeptor anschließend in die späten
Endosomen, welche MHC-Klasse-II-Moleküle beinhalteten
57,180
. Obwohl der DEC-205-En-
dozytoserezeptor mehrere CTLD sowie eine cysteinreiche Region enthält, kann dieser Rezeptor keine C-Typ-Lektine und sulfathaltige Zucker binden
176
. Zwar ist der genaue Ligand für
DEC-205 noch nicht identifiziert, jedoch scheint dieser Endozytoserezeptor Selbstantigene
von apopototischen und nekrotischen Körperzellen aufzunehmen und damit eventuell an der
2. Einleitung
24
Aufrechterhaltung der Toleranz gegenüber Selbstantigenen beteiligt zu sein 177,181. Außerdem
scheint der murine DEC-205-Endozytoserezeptor Einfluss an der Verbreitung des Bakteriums
Yersinia pestis zu haben
182
. Andere Gruppen berichten, dass DEC-205 mit dem IL-4-Rezep-
tor interagiert und dabei dessen Signalweg modulieren könnte 176. So wurde gezeigt, dass ein
anti-DEC-205-Antikörper die IL-4-induzierte Proliferation von DEC-205-exprimierenden TZellen blockieren kann 183. Außerdem ist die DEC-205-Expression assoziiert mit Zelldifferenzierung und Inhibition von Zellwachstum, wohingegen invasive Brust- oder Mastdarmtumore
DEC-205-negativ sind 176. Daher könnte es sein, dass DEC-205 eine tumorsuppressive Funktion ausübt, indem die Teilung von Epithelzellen inhibiert und die Differenzierung verstärkt
wird, welche möglicherweise durch eine Interaktion von DEC-205 mit dem IL-4-Rezeptor gesteuert wird 176.
Eine Möglichkeit, um DC in vivo mit TA zu beladen, stellt das Targeting des DEC-205-Endozytoserezeptors mit Antikörper-Antigen-Konstrukten dar (siehe 2.3.2). In den letzten Jahren
wurden die verschiedensten anti-DEC-205-Antigen-Konstrukte zum DEC-205-Targeting verwendet (siehe Tabelle 2.1).
Tabelle 2.1: Übersicht über existierende DEC-205-Antigen-Konstrukte
Konstrukt
1
mAb mit chemisch2
gekoppelten Ag
1
mAb mit
2
fusionierten Ag
verwendetes Ag
Maus
Maus
OVA
189
TRP-2 und gp100
190
HEL
79,188,191,192
OVA
193,194,195,196
HIVgag (p24, p41, nef)
192
Plasmodium yoelii
197
Survivin (human/murin)
198
Yersinia pestis (LcrV-Protein)
186
Humanes Mesothelin
195
HIVgag (p24)
199
EBNA1
184
Ag85B (M. tuberculosis)
185
gp100
184
OVA
Maus
Proteine, DNA, Peptide
Maus
CD40 siRNA
Maus
OVA, HIVgag (p24)
Maus
Human
3
scFv mit
fusionierten Antigen
3
scFv -Liposom mit
Antigen
3
scFv mit
StreptavidinDomäne mit
2
biotinyliertem Ag
1
mAb -Liposom mit
Antigen
DNA-Vektor (DEC3
205scFv + Antigen)
1
2
Maus/
Human
Maus
2
187,188
186
200
3
201,202
4
5
monoklonaler Antikörper; Antigen; single-chain Fragment variable; ovalbumin;
tyrosinase6
7
8
9
related protein 2; glycoprotein 100; hen egg lysosome; human immunodeficiency virus; Epstein10
Barr nuclear antigen 1; small inhibitory RNA.
2. Einleitung
25
Entweder es wurden Antikörper-Antigen-Konstrukte verwendet, in dem das Antigen
chemisch an den mAb gekoppelt wurde, oder Konstrukte, bei dem das Antigen genetisch in
den C-Terminus des mAb fusioniert wurde (siehe Tabelle 2.1). Anstatt einen kompletten mAb
zu verwenden, wurden auch Konstrukte hergestellt, welche einen DEC-205-gerichteten scFv
enthielten. An diesen scFv wurden entweder verschiedenste TA-Peptide genetisch fusioniert
184,185
oder der scFv wurde mit einer Streptavidin-Domäne ausgestattet, um die Bindung ver-
schiedenster biotinylierter Peptide, Proteine oder DNA zu ermöglichen
186
. Andere Forscher
verwendeten Vektoren, welche für ein DEC-205scFv-Antigen-Konstrukt kodieren. Dabei
führte die Injektion dieses DNA-Impfstoffes zusammen mit Adjuvans zu einer besseren
Immunantwort gegen das im Vektor kodierte Antigen, als wenn der Vektor verwendet wurde,
der nur die Sequenz kodierend für das TA enthielt
201,202
. Außerdem wurden Liposomen her-
gestellt, die entweder mit dem anti-DEC-205mAb oder dem anti-DEC-205scFv ausgestattet
wurden (siehe auch 2.3.1) und entweder ein TA enthielten 184 oder CD40-siRNA um gezielt in
vivo die CD40-Expression in DC zu unterdrücken, um so eine antigenspezifische
Immunsuppression zu induzieren, welche zur Therapie von Autoimmunkrankheiten eingesetzt
werden könnte
200
.
Das Targeting des murinen DEC-205-Endozytoserezeptors mit mAb-Antigen-Konstrukten
(verwendeter Klon: NLDC-145), welche Ovalbumin (OVA
191
), oder Survivin
197
enthielten,
führte zur Induktion einer antigenspezifischen Immunantwort in Mäusen, wenn ein zusätzlicher Reifungsstimulus wie polyI:C oder anti-CD40-Antikörper erfolgte. Fehlte dieser Reifungsstimulus, wurde Toleranz induziert 187,196 (siehe auch 2.1.4). Mahnke et al. zeigten, dass
nach DEC-205-Targeting mit einem mAb-Antigen-Konstrukt, welches Peptide des
glycoprotein 100 (gp100) und des tyrosinase-related protein 2 (TRP-2) enthielt, 70 % der an
einem Tumor leidenden Mäuse geheilt wurden 189. Obwohl bekannt ist, dass DEC-205 in seinem zytoplasmatischen Anteil das EDE-Motiv enthält, welches den Transport in die späten
Endosomen ermöglicht (189, siehe oben) und damit eine effiziente Präsentation von Antigenen
auf MHC-Klasse-II-Molekülen vermitteln sollte, scheinen DEC-205+ DC der Maus auf die
Kreuzpräsentation von Antigenen spezialisiert zu sein
79
. Andere Gruppen berichten jedoch
+
auch über starke CD4 T-Zellantworten nach DEC-205-Targeting 188,194,197. Die Effizienz des
DEC-205-Targetings humaner DC wurde bisher in 2 Arbeiten analysiert (verwendeter Klon:
MG38). Die Beladung humaner DC in vitro durch ein mAb-HIVgag(p24)-Fusionsprotein resultierte in der Präsentation verschiedenster Peptide des Antigens auf MHC-Klasse-I-Molekülen
195
. Außerdem induzierte das DEC-205-Targeting humaner DC mit einem mAb-EBNA1-
Fusionprotein (Epstein-Barr nuclear antigen 1) eine schützende T-Zell-Immunantwort gegen
2. Einleitung
26
EBV in einem Mausmodel, welches über ein rekonstituiertes humanes Immunsystem verfügte
199
. Diese Arbeiten zeigen, dass das in-vivo-Targeting von DC durch DEC-205-Antikörper-
Antigen-Konstrukte eine viel versprechende Methode darstellt, um DC mit TA zu beladen.
2.3.3. Immuntherapie mit T-Zellen
Eine weitere Möglichkeit zur Behandlung maligner Erkrankungen stellt die adaptive T-ZellImmuntherapie dar, bei der in vitro manipulierte und expandierte, meist autologe T-Zellen Patienten verabreicht werden
203,204
. Zunächst wurden hierzu tumor-infiltrating lymphocytes
(TIL) aus Tumoren der Patienten gewonnen, in vitro expandiert und anschließend zusammen
mit IL-2 in hoher Dosis den Patienten verabreicht. Dabei sprachen 34 % der 86 behandelten
Melanompatienten auf die Therapie an
205,206
, jedoch war das Überleben der transferierten
Zellen und die Ansprechrate der Patienten nur von kurzer Dauer. Nachdem jedoch vor der
Administration der TIL eine Lymphozytendepletion des Patienten durch Bestrahlung durchgeführt wurde, erhöhte sich die Ansprechrate auf 72 %, wohingegen die der Kontrollgruppe, bei
denen keine Bestrahlung durchgeführt wurde, bei 49 % lag. Außerdem konnten die transferierten T-Zellen deutlich länger in den Patienten detektiert werden
204
. Trotz dieser viel ver-
sprechenden Ergebnisse bei der Behandlung des Malignen Melanoms ist der Bedarf an alternativen Therapien vorhanden, da nur bei wenigen Patienten mit Malignen Melanom TIL isoliert und expandiert werden konnten. Zusätzlich war der Therapieerfolg auch bei anderen Tumoren wie Brust-, Prostata- oder Eierstockkrebs nur gering 203,204.
Eine Alternative stellt die Verwendung genetisch modifizierter T-Lymphozyten dar. T-Zellen
können durch retrovirale Transduktion mit einem TZR, welcher zuvor aus tumorspezifischen
T-Zell-Klonen isoliert wurde, ausgestattet werden. Sie erhalten so eine neue Antigenspezifität
und können dann zur Immuntherapie eingesetzt werden. So zeigten Morgan et al., dass der
Transfer von autologen MART-1-spezifischen PBL (peripheral blood lymphocytes), welche
durch retrovirale Transduktion TZRα- und -β-Ketten-kodierender Gene hergestellt wurden, in
2 von 17 Melanompatienten zum Rückgang von Leber- und Lungenmetastasen führte 207, wobei diese Patienten 2 Jahre nach der Therapie noch tumorfrei waren 204. Der Transfer eines gewünschten TZR in T-Zellen kann aber auch durch Elektroporation TZRα- und -β-Ketten-kodierender RNA erfolgen 208-211. Dabei würde diese Technik die Risiken der retroviralen Transduktion wie eine genetische Insertion des retroviralen Provirus in Tumorsuppressorgenen oder
in die Nähe von Protoonkogenen sowie eine langlebige Autoimmunität (siehe Diskussion
5.3.2) verhindern. Die erfolgreiche Immuntherapie mit TZR-transfizierten T-Zellen erfordert
jedoch die Präsentation von TA-Peptiden in MHC-Molekülen. Da jedoch maligne transfor-
2. Einleitung
27
mierte Zellen oftmals Defekte in der Antigenprozessierung sowie in der Expression von
MHC-Molekülen aufweisen, können diese Tumorzellen nicht mehr durch die eingebrachten
CTL erkannt werden 139-142. Außerdem ist durch den hohen HLA-Polymorphismus in der Bevölkerung die Anwendbarkeit der Therapie mit TZR-transfizierten T-Zellen stark eingeschränkt. Eine Alternative zur Verwendung von TZR stellt daher der Einsatz chimärer TZR
(cTZR) dar, die aus einer antikörperabgeleiteten Bindedomäne, welcher an unprozessiertes
TA binden kann, und einer Signaldomäne wie die der TZR-ζ-Kette oder der FcεRI-γ-Kette
besteht
203
. Bereits cTZR der ersten Generation zeigten erste viel versprechende Erfolge in
vitro und in Mausmodellen 212, jedoch führte die Einführung von Signaltransduktionsdomänen
aus kostimulatorischen Molekülen in den cTZR zu einer verbesserten Effizienz der cTZRtransfizierten T-Zellen (cTZR, der zweiten Generation;
203
). So bewirkte das Einbringen der
Transmembran- und zytoplasmatischen Domäne des CD28-Moleküls in einen CEA-spezifischen cTZR 213 und in einen ErbB2-spezifischen cTZR 113 eine verbesserte Erkennung der Tumorzellen in vitro
Tumoren
113
213
oder sogar zu einer verbesserte Immunantwort gegenüber etablierten
. Aber auch das Einbringen anderer kostimulatorischer Domänen wie 4-1BB,
ICOS (inducible T cell costimulator) oder OX40 in einen cTZR kann die Funktion cTZRtransfizierter T-Zellen verbessern
186,203,214,215
. Mittlerweile wurden klinische Studien mit
cTZR-modifizierten T-Zellen durchgeführt. Die adaptive T-Zell-Therapie mit CD20-spezifischen cTZR-transfizierten T-Zellen zur Behandlung von Patienten mit Non-Hodgkin- oder
Mantelzelllymphom führte bei 2 der 7 behandelten Patienten zu einer vollständigen Remission, bei 1 Patienten zu einer partiellen Remission und bei 4 Patienten zu einer Stabilisierung
des Tumors 216. In einer Studie zur Behandlung von Patienten mit Eierstockkrebs mit T-Zellen,
welche mit dem Folat-scFv-FcRγ-cTZR transfiziert wurden, wurde jedoch kein Tumorrückgang beobachtet
217
. Die Therapie von Patienten mit Nierenzellkarzinom mit carboxy-
anhydrase-IX-spezifischen cTZR-transfizierten T-Zellen führte zum Auftreten progressiver
Lebertoxizität, da das verwendete Antigen auch auf gesunden Lebergewebe exprimiert wird
218
. Demnächst wird jedoch die Funktionalität von cTZR der zweiten Generation wie dem
Lewis-Y-CD28-CD3ζ-cTZR in klinischen Studien getestet 203.
3. Zielsetzung
28
3. Zielsetzung
In dieser Dissertation sollten zwei verschiedene single chain Fragment variable (scFv)-basierte Strategien zur zellulären Immuntherapie etabliert und auf Anwendbarkeit überprüft
werden. Im Teilprojekt 1 sollte die Beladung von Dendritischen Zellen (DC) mit Tumorantigen (TA) optimiert werden, um so die klinische Effizienz von DC-Impfstoffen zur Krebsbehandlung zu verbessern. Dazu sollten scFv-Antigen-Konstrukte hergestellt werden, welche
aus einem gegen den DEC-205-Endozytoserezeptor gerichteten scFv und verschiedenen TZell-Epitopen des TA MAGE-A3 bestanden. Die Inkubation von DC mit diesen Fusionsproteinen sollte nach rezeptorvermittelter Endozytose zur Präsentation des MAGE-A3-Peptides
auf der DC führen. Es sollte überprüft werden, ob die Fusionsproteine Einfluss auf den Phänotyp, das Zytokinsekretionsprofil sowie die Migrationseigenschaften der DC haben. Anschließend sollte mit Hilfe von T-Zellen, welche zuvor mit einem antigenspezifischen TZR
durch Elektroporation mit TZRα- und -β-Ketten-kodierender RNA ausgestattet wurden, die
Effizienz dieser Beladungsmethode analysiert und mit zwei bereits in der Klinik angewandten
Methoden, der RNA-Elektroporation und der direkten Peptidbeladung, verglichen werden. Im
Anschluss sollte überprüft werden, ob das DEC-205-Targeting auch zur Beladung von Patienten-DC mit TA geeignet ist. Um auch die Präsentation anderer Epitope messen zu können
sollte eine PCR-basierte Strategie zur Identifizierung und Klonierung unbekannter TZR aus
T-Zell-Klonen sowie ein schneller, preiswerter Test zur funktionellen Charakterisierung dieser neu klonierten TZR etabliert werden, um einen schnellen Zugriff auf verschiedenste TZR
zu ermöglichen.
scFv können auch als Bindedomäne chimärer TZR (cTZR) dienen, welche – nach Transfer in
T-Zellen – zur Immuntherapie maligner Erkrankungen eingesetzt werden können. Im Teilprojekt 2 sollten ErbB2- sowie CEA-spezifische T-Zellen durch cTZR-Transfer generiert und
funktionell charakterisiert werden. Die cTZR verfügten über einen ErbB2- oder CEA-spezifischen scFv und eine Signaldomäne bestehend aus der Transmembran -und intrazellulären Domäne des CD28-Moleküls und der intrazellulären Domäne des CD3ζ-Kette. Um die Risiken
retroviraler Transduktion zu umgehen, sollte überprüft werden, ob durch Elektroporation von
cTZR-kodierender RNA funktionelle T-Zellen generiert werden können, und ihre funktionelle
Aktivität sollte dann mit der retroviral transduzierter T-Zellen verglichen werden.
4. Ergebnisse
29
4. Ergebnisse
4.1. Optimierung der Beladung und Präsentation des Tumorantigens
MAGE-A3 auf DC durch Targeting des Endozytoserezeptors DEC-205
Es steht eine Vielzahl an Möglichkeiten zur Verfügung, Dendritische Zellen (DC) mit Tumorantigen zu beladen (siehe Kapitel 2.3.2). Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Antigenbeladung
und -präsentation der DC am Beispiel des Tumorantigens MAGE-A3 zu optimieren. Dazu
sollten anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte entwickelt werden, welche an den
Endozytoserezeptor DEC-205 auf DC binden können und so eine Beladung der DC mit
MAGE-A3-Peptiden ermöglichen. Dieses DEC-205-Targeting sollte anschließend mit anderen etablierten Beladungstechniken wie der RNA-Elektroporation und der direkten Peptidbeladung verglichen werden.
4.1.1. Bestimmung der Effizienz verschiedener DC-Antigenbeladungsstrategien
Um die Effizienz verschiedener Antigenbeladungsstrategien miteinander vergleichen zu können, wurde folgendes Auslesesystem angewendet (Abb. 4.1). Anstatt T-Zell-Klone oder
IL-2
IFNγγ
TNF
IL-10
IFNγγ
IL-10
TNF
Elektroporation
TZRα
α- und β -Kettenkodierender RNA
Peptid
TZR
T-Zelle
DC
Antigenbeladung durch
- direkte Peptidbeladung
- RNA-Elektroporation definierter
Tumorantigen-RNA
- DEC-205-Targeting
HLA
Abb. 4.1: Auslesesystem zur Bestimmung der Effizienz unterschiedlicher DC-Beladungsstrategien. Erklärung siehe Text. Pro-inflammatorische Zytokine sind schwarz dargestellt, IL-10 als anti-inflammatorisches Zytokin rot.
T-Zelllinien zu verwenden, wurden antigenspezifische T-Zellen zum „Scannen“ der Antigenbeladung eingesetzt, welche durch Elektroporation mit T-Zell-Rezeptor (TZR) α- und β-Ketten-kodierender RNA hergestellt wurden. Diese haben gegenüber T-Zell-Klonen den Vorteil,
dass sie in einer konstanten Qualität hergestellt werden können und daher ein verlässliches
Auslesesystem darstellen. Die antigenspezifischen T-Zellen werden dann mit DC kokultiviert,
welche auf unterschiedliche Weise mit Tumorantigen beladen wurden. Nach antigenspezifischer Stimulation der T-Zellen produzieren diese u.a. das Zytokin IL-2. Die Menge an abge-
4. Ergebnisse
30
gebenem IL-2 gibt Aufschluss über die Effizienz der angewandten DC-Antigenbeladungsstrategie, da eine effizientere Antigenbeladung zu einer stärkeren Stimulation der spezifischen TZellen und somit zu einer erhöhten IL-2-Produktion führt. Die antigenspezifische Stimulation
induziert auch die Produktion von TNF, IFNγ und IL-10 sowohl durch DC als auch durch TZellen.
4.1.2. :achweis der MAGE-A3-Peptidpräsentation auf DC
Im Rahmen der Arbeit sollte die Antigenpräsentation von DC am Beispiel des Tumorantigens
MAGE-A3 optimiert werden. Um die Effizienz verschiedener DC-Antigenbeladungsstrategien anhand der oben beschriebenen Methode ermitteln zu können, wurde die α- und β-Ketten-kodierende-RNA MAGE-A3-spezifischer TZR benötigt. Dafür standen zwei bereits klonierte TZR zur Verfügung: Zum einen die α- und β-Kette eines TZR, welcher das MAGEA3243-258-Peptid KKLLTQHFVQENYLEY (KKL) auf HLA-DP4-Molekülen erkennt, und
zum anderen die α- und β-Kette eines TZR, der spezifisch für das MAGE-A3168-176-Peptid
EVDPIGHLY (EVD) im HLA-A1-Kontext ist. Der MAGE-A3/HLA-DP4-spezifische TZR
wurde nach dem Protokoll von Cohen et al. 219 weiter modifiziert. Dazu wurde sowohl in die
α- als auch in die β-Kette des TZR ein zusätzliches Cystein eingebracht, um die Paarung der
beiden Ketten zu optimieren.
Zunächst wurde überprüft, ob mit Hilfe von MAGE-A3-Peptid-spezifischen T-Zellen die
MAGE-A3-Antigenpräsentation auf DC nachgewiesen werden kann. Dazu wurden MAGEA3-Peptid-spezifische T-Zellen hergestellt, indem CD4+ und CD8+ T-Zellen mit jeweils 15
µg der TZR α- und β-Ketten-kodierender RNA elektroporiert wurden. Vier Stunden nach
Elektroporation wurden die T-Zellen zum Nachweis der Antigenpräsentation eingesetzt. Dazu
wurden die MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen CD4+ T-Zellen mit MAGE-A3/HLA-DP4
peptidbeladenen reifen DC (mDC) und die MAGE-A3/HLA-A1-spezifischen CD8+ T-Zellen
mit MAGE-A3/HLA-A1 peptidbeladenen mDC im Verhältnis 1:1 kultiviert. Nach 16- bis 18stündiger Koinkubation wurden die Zytokine im Überstand bestimmt. Wie in Abb. 4.2 dargestellt, erkannten sowohl MAGE-A3/HLA-DP4-spezifische CD4+ T-Zellen als auch MAGEA3/HLA-A1-spezifische CD8+ T-Zellen das entsprechende Peptid auf der Oberfläche der DC.
Zusätzlich zur IL-2-Produktion durch die spezifischen T-Zellen wurde auch die Produktion
von TNF und IFNγ im Überstand nachgewiesen. Dabei war die produzierte Zytokinmenge der
CD4+ T-Zellen geringer als die der CD8+ T-Zellen, allerdings wurde bei der Stimulation von
4. Ergebnisse
31
A
B
5
Konz. [ng/ml]
Konz. [ng/ml]
1,5
1,0
0,5
0
IL-2
TNF
IFNγγ
DC + MAGE-A3/HLA-DP4 Peptid
DC + NY-ESO-1/HLA-DP4 Peptid
4
3
2
1
0
IL-2
TNF
IFNγγ
DC + MAGE-A3/HLA-A1 Peptid
DC + MAGE-A3/HLA-DP4 Peptid
+
Abb. 4.2: Zytokinsekretion der MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen CD4 T-Zellen und der MAGE+
A3/HLA-A1-spezifischen CD8 T-Zellen nach Stimulation mit peptidbeladenen DC. mDC wurden
für 3 Stunden mit dem MAGE-A3/HLA-DP4-Peptid KKL (A) oder dem MAGE-A3/HLA-A1-Peptid EVD
(B) beladen. Als Kontrollpeptid diente entweder das NY-ESO-1-Peptid (A), welches auf HLA-DP4-Molekülen präsentiert wird, oder das MAGE-A3/HLA-DP4-Peptid (B). Anschließend wurden diese peptid+
beladenen DC verwendet um MAGE-A3/HLA-DP4-spezifische CD4 T-Zellen (A) oder MAGE-A3/HLA+
A1-spezifische CD8 T-Zellen (B) zu stimulieren, welche durch RNA-Elektroporation hergestellt wurden. Die Zytokinsekretion der spezifischen T-Zellen wurde nach 16- bis 18-stündiger Koinkubation
analysiert.
CD8+ T-Zellen im Verhältnis zur IL-2- und IFNγ-Produktion nur wenig TNF produziert (Abb.
4.2B). Die Stimulation der spezifischen T-Zellen mit DC, welche mit einem irrelevanten
Peptid beladen wurden, führte zu keiner Zytokinproduktion (Abb. 4.2). Diese Ergebnisse
zeigten, dass mit Hilfe von antigenspezifischen T-Zellen, welche durch die Elektroporation
von TZR-kodierender RNA hergestellt wurden, die Antigenpräsentation von DC nachgewiesen werden kann. Somit kann das Auslesesystem zum „Scannen“ der Antigenpräsentation
verwendet werden.
4.1.3. Antigenbeladung von DC durch R:A-Elektroporation
Die Beladung von DC mit MAGE-A3 sollte auch durch Elektroporation mit MAGE-A3-kodierender RNA erfolgen, um diese später mit der neu etablierten Beladungsstrategie, dem
DEC-205-Targeting (siehe Kapitel 4.1.4) vergleichen zu können. Dazu stand sowohl MAGEA3-RNA (Argos Therapeutics) als auch MAGE-A3-DCLAMP-RNA, welche durch die C-terminale, endosomale Targeting-Sequenz des DCLAMP eine Präsentation auf MHC-II-Molekülen ermöglicht (siehe 2.3.2,
168
), zur Verfügung. Um DC durch RNA-Elektroporation mit
MAGE-A3 zu beladen, wurden reife DC (mDC), die 24 Stunden vorher mit einem Zytokincocktail (IL-1β, IL-6, TNF, PGE2) gereift worden waren, mit 15 und 30 µg MAGE-A3-RNA
oder MAGE-A3-DCLAMP-RNA elektroporiert. Nach einer 24-stündigen Inkubationszeit,
welche die Translation und die Prozessierung des MAGE-A3-Proteins gewährleisten sollte,
wurde zunächst das MAGE-A3-Protein durch intrazelluläre FACS-Färbung nachgewiesen.
4. Ergebnisse
32
Als Negativkontrolle dienten hierbei DC, welche nicht elektroporiert wurden. Wie in Abb.
4.3A gezeigt, konnte MAGE-A3 nach Elektroporation von sowohl MAGE-A3-RNA als auch
MAGE-A3-DCLAMP-RNA intrazellulär angefärbt werden. Auffallend war, dass das MAGEA3-DCLAMP-Protein erst nach Verwendung von 30 µg RNA gut nachweisbar war, wohingegen die Verwendung von 30 µg MAGE-A3-RNA nur zu einer geringfügigen Steigerung der
Expression von MAGE-A3 führte (Abb. 4.3A).
Als nächstes wurde untersucht, ob auch endogen prozessiertes Antigen durch die MAGE-A3spezifischen T-Zellen, welche durch TCR-RNA-Transfer hergestellt wurden, nachgewiesen
werden kann. Dazu wurden mDC 24 Stunden nach Elektroporation mit MAGE-A3- und
MAGE-A3-DCLAMP-RNA sowohl mit MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen CD4+ T-Zellen
A
MAGE-A3-RNA
MAGE-A3-DCLAMP RNA
Keine Elektroporation
Elektroporation mit 15 µg RNA
Zellzahl
Elektroporation mit 30 µg RNA
Fluoreszenzintensität
MAGE-A3/HLA-DP4spezifische CD4+ T-Zellen
3
IL-2 [ng/ml]
B
MAGE-A3/HLA-A1spezifische CD8+ T-Zellen
2
1
0
A
RN )
3- µg
M 5
(1
A
RN )
3- µg
M 0
(3
PPM g)
M )
A
A
g
µ
L
L µ
DC (30
DC (15
3
3
M NA
M NA
R
R
mDC elektroporiert mit
Abb. 4.3: Die Elektroporation von DC mit MAGE-A3- und MAGE-A3-DCLAMP-RNA führte zur
Translation, Prozessierung und Präsentation von MAGE-A3. A) Intrazellulärer Nachweis von
MAGE-A3 nach RNA-Elektroporation. mDC wurden mit 15 (graue Histogramme) oder 30 µg (schwarze Histogramme) MAGE-A3- oder MAGE-A3-DCLAMP-RNA elektroporiert. Nach 24-stündiger Inkubation wurde sowohl mit den elektroporierten als auch mit nicht-elektroporierten (weiße Histogramme)
DC eine intrazelluläre Färbung des MAGE-A3-Proteins durchgeführt. B) IL-2-Sekretion der MAGE+
+
A3/HLA-DP4-spezifischen CD4 und MAGE-A3/HLA-A1-spezifischen CD8 T-Zellen nach Stimulation
mit MAGE-A3- oder MAGE-A3-DCLAMP-RNA elektroporierten DC. mDC wurden mit 15 und 30 µg
MAGE-A3- oder MAGE-A3-DCLAMP-RNA elektroporiert. Nach 24-stündiger Inkubationszeit wurden
+
diese DC verwendet, um entweder MAGE-A3/HLA-DP4-spezifische CD4 T-Zellen (schwarze Balken)
+
oder MAGE-A3/HLA-A1-spezifische CD8 T-Zellen (weiße Balken) zu stimulieren. Nach 16- bis 18stündiger Kokultivierung wurde die IL-2-Sekretion der T-Zellen bestimmt. M3: MAGE-A3. Dargestellt
ist ein repräsentatives Experiment aus 2 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
4. Ergebnisse
33
als auch mit MAGE-A3/HLA-A1-spezifischen CD8+ T-Zellen kultiviert. Nach 16- bis 18stündiger Kokultivierung wurde die Konzentration des durch die spezifischen T-Zellen produzierten IL-2 im Überstand der Zellen ermittelt. Wie erwartet, führte die Elektoporation von
MAGE-A3-RNA nur zu einer Präsentation von MAGE-A3-Peptid in HLA-A1-Molekülen
(Abb. 4.3B). Wurde hingegen die MAGE-A3-DCLAMP-RNA verwendet, konnte sowohl eine
Präsentation der MAGE-A3-Peptide auf HLA-A1- als auch auf HLA-DP4-Molekülen nachgewiesen werden (Abb. 4.3B). Die Präsentation des MAGE-A3-Peptides in HLA-DP4-Molekülen wurde durch die Elektroporation von 30 µg RNA gegenüber von der mit 15 µg deutlich
erhöht, wohingegen die erhöhte RNA-Menge die Präsentation des MAGE-A3/HLA-A1-Peptides nicht verbesserte (Abb. 4.3B). Dies korreliert jedoch mit den Ergebnissen der intrazellulären FACS-Färbung, bei der kein großer Unterschied in der Expressionsstärke des MAGE-A3Proteins nach Elektroporation mit 15 oder 30 µg MAGE-A3-RNA nachgewiesen wurde (Abb.
4.3A). Mit diesen Ergebnissen konnte bestätigt werden, dass die Elektroporation von MAGEA3-RNA zur Präsentation von MAGE-A3-Peptiden in HLA-A1-Molekülen und die Elektroporation von MAGE-A3-DCLAMP-RNA zur Präsentation von MAGE-A3-Peptiden in HLAA1- und HLA-DP4-Molekülen führt. Somit wurde gezeigt, dass auch endogen prozessiertes
MAGE-A3-Protein durch MAGE-A3-spezifische T-Zellen nachgewiesen werden kann, welche durch RNA-Transfer eines spezifischen TZR hergestellt wurden.
4.1.4. DEC-205-Targeting von DC
4.1.4.1. DEC-205-Expressionskinetik während der DC-Generierung
DEC-205 wird auf verschiedenen murinen sowie humanen DC-Populationen exprimiert (siehe
Kapitel 2.1.1). Da für die DC-Impfung zur Behandlung von Tumoren bisher hauptsächlich aus
Monozyten generierte DC (moDC) verwendet wurden, wurde zunächst überprüft, ob humane
moDC DEC-205 exprimieren. Dazu wurde die DEC-205-Expressionskinetik während der
Entwicklung von Monozyten zu mDC durchflusszytometrisch analysiert (Abb. 4.4). Die Färbung des Reifungsmarkers CD83 zeigte, dass die DC durch die Zugabe des Zytokincocktails
(IL-1β, IL-6, TNF, PEG2) am Tag 6 nach 24 Stunden erfolgreich gereift wurden (Abb. 4.4A).
Der Monozytenmarker CD14 war ab Tag 4 nicht mehr nachweisbar, da die Zellen bereits zu
diesem Zeitpunkt begannen, sich in DC zu differenzieren. Während der Entwicklung zu DC
stieg die DEC-205-Expression stetig an (Abb. 4.4B). Nahezu alle unreifen DC (iDC, Tag 6)
und reifen DC (mDC, Tag 7) waren DEC-205-positiv, allerdings war die Expressionsstärke
auf den mDC höher. Da sowohl unreife als auch reife moDC sich durch eine hohe DEC-205-
4. Ergebnisse
34
Expression auszeichneten, wurde im Rahmen dieser Arbeit überprüft, ob beide DC-Populationen durch DEC-205-Targeting mit Tumorantigen beladen werden können.
A
B
Reifung
80
60
40
20
0
DEC-205
80
spezifische MFI
positive Zellen [%]
100
Reifung
CD14
60
CD83
40
20
0
1
4
5
6
7
8
Tag der DC-Generierung
1
4
5
6
7
8
Tag der DC-Generierung
Abb. 4.4: DEC-205-Expressionskinetik während der Entwicklung von Monozyten zu mDC. Zur
Generierung von DC wurde die an Plastik adhärierende Fraktion der PBMC von freiwilligen Spendern
in GM-CSF- und IL-4-haltigem Medium kulitiviert. Ab Tag 6 der Kultivierung wurden die Zellen für 48
Stunden mit dem Zytokincocktail gereift. Die Zellen wurden am Tag 1, 4, 5, 6, 7 und 8 geerntet und auf
ihre DEC-205-, CD14-, und CD83-Expression überprüft (A). Zusätzlich wurde die spezifische MFI
(Mittlere Fluoreszenzintensität) der DEC-205-Expression ermittelt (B). Dargestellt ist der Mittelwert +/Standardabweichung von 3 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
4.1.4.2. Prinzip des DEC-205-Targetings mit scFv-Antigen-Konstrukten
Um die Beladung von DC mit Tumorantigen zu optimieren, wurde im Rahmen der Arbeit die
DEC-205-Targeting-Strategie angewendet. Dazu wurden zunächst scFv-MAGE-A3-Fusionsproteine generiert, welche gegen den humanen DEC-205 Endozytoserezeptor gerichtet waren.
Wie in Abb. 4.5A dargestellt, wurde hinter die Sequenz des gegen den humanen DEC-205Rezeptor gerichteten scFv eine DNA-Sequenz kloniert, welcher für ein MAGE-A3-T-ZellEpitop kodiert. Das scFv-Antigen-Fusionsprotein sollte an DEC-205 binden und nach erfolgreicher Internalisierung des Rezeptors und Prozessierung des Antigens sollte das Peptid auf
den entsprechenden MHC-Molekülen auf der DC präsentiert werden (Abb. 4.5B).
4.1.4.3. Klonierung der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Konstukte und der anti-MCSPscFvMAGE-A3-Kontrollkonstrukte
Um DC durch DEC-205-Targeting mit MAGE-A3-Peptiden beladen zu können, wurden drei
verschiedene anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte kloniert (siehe Tabelle 4.1,
Abb. 4.6). Dabei wurde sowohl ein scFv-MAGE-A3-Fusionsprotein generiert, welches ein
MAGE-3-Peptid enthielt, das auf HLA-A1-Molekülen präsentiert wird (MAGE-A3-EVD, AS
168-176), als auch ein scFv-MAGE-A3-Fusionsprotein, dessen MAGE-A3-Peptid auf HLA-
4. Ergebnisse
35
DP4-Molekülen (MAGE-A3-KKL, AS 243-258) gezeigt wird. Beide Peptide werden auf
HLA-Molekülen präsentiert, welche eine große Verbreitung in der Kaukasischen Bevölkerung haben (HLA-DP4: 63 %, HLA-A1: 26%). Dies würde ein breites Einsatzgebiet bei einer
späteren Anwendung in der Tumorimmuntherapie ermöglichen. Außerdem standen zur Detektion dieser Peptide funktionelle TZR zur Verfügung (siehe 4.1.2 und 4.2.3). Zusätzlich zu
MAGE-A
3-Pepti
d
DEC
-205
DE C
-205
Region
VH
VL
A Variable
Leichte
Kette
Konstante
Region
Schwere
Kette
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-Peptid-Konstrukt
anti-DEC-205 Antikörper
B
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-Konstrukt
Internalisierung
Prozessierung
Präsentation
DEC-205
DEC-205
MHC
MHC
MAGE-A3Peptid
DC
DC
Abb. 4.5: DEC-205-Targeting-Strategie mit anti-DEC-205svFv-MAGE-A3-Peptid-Fusionsproteinen. A) Die anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Fusionsproteine bestanden aus einem gegen
DEC-205-gerichteten scFv und einer Sequenz für ein MAGE-A3-T-Zell-Epitop. B) Nach Bindung des
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Fusionsproteins sollte es nach der Internalisierung des Rezeptors und der Prozessierung des Antigens im Inneren der DC zur Präsentation des MAGE-A3-Peptides
in MHC-Molekülen auf der Oberfläche der DC kommen.
~ 29 kDa
A
S DEC-205 VL
~ 29 kDa
DEC-205 VH
(G4S)4
M3-Peptid H
G4SA3
B
S
MCSP VH
MCSP VL
(G4S)3
M3-Peptid H
G4SA3
Abb. 4.6: Schematische Darstellung der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte und
anti-MCSPscFv-MAGE-A3-Peptid-Kontrollkonstrukte. A) Aufbau der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3Peptid-Konstrukte (A) und der anti-MCSPscFv-MAGE-A3-Peptid-Kontrollkonstrukte (B); S: N-terminaler Strep-Tag, H: C-terminaler His-Tag, (G4S)4 bzw. (G4S)3: Linker bestehend aus 4 bzw. 3 Wiederholungen einer Glycin4 Serin-Einheit. G4SA3: Linker bestehend aus einer Glycin4 Serin Alanin3-Einheit.
4. Ergebnisse
36
Tabelle 4.1: Klonierte anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte und anti-MCSPscFvMAGE-A3-Peptid-Kontrollkonstrukte
Konstrukt
MAGE-A3Peptid
Peptid
präsentiert auf
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-KKL
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-EVD
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-LP
anti-MCSPscFvMAGE-A3-KKL
anti-MCSPscFvMAGE-A3-EVD
anti-MCSPscFvMAGE-A3-LP
KKLLTQHFVQ
ENYLEY
EVDPIGHLY
HLA-DP4, -DQ6
MAGE-A3Peptida
Gewicht
Gesamta
gewicht
Expression
b
in
2,0
33,7
HLA-A1
1,2
33,0
Langes Peptid
(AS110-279)
KKLLTQHFVQ
ENYLEY
EVDPIGHLY
HLA-A1, -A2, -B35,
-B40, -DP4, -DQ6
HLA-DP4, -DQ6
18,9
50,6
2,0
33,9
E. coli
293T
E. coli
293T
E. coli
293T
293T
HLA-A1
1,2
33,1
293T
Langes Peptid
(AS110-279)
HLA-A1, -A2, -B35,
-B40, -DP4, -DQ6
18,9
50,1
293T
a
Gewicht in kDa
Expressionsvektor für Produktion in E. coli: pet27b, Expressionsvektor für Produktion in 293T-Zellen:
pSeqTag2HygroC
b
den beiden Konstrukten, welche nur ein MAGE-A3-T-Zell-Epitop beinhalteten, wurde auch
ein Konstrukt entwickelt, welches T-Zell-Epitope für HLA-A1 (MAGE-A3-EVD), HLA-A2
(AS 271-279), HLA-B40 (AS 114-122), HLA-DP (MAGE-A3-KKL) und HLA-DR1 (AS
267-282) enthielt (anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-LP, siehe Tabelle 4.1). Um eine spätere
Aufreinigung und Detektion der Fusionsproteine zu ermöglichen, wurden die anti-DEC205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte von einem N-terminalen Strep-Tag und einen C-terminalen His-Tag flankiert (siehe Abb. 4.6A).
Zunächst lag der DEC-205scFv im Vektor pet27b-Strep-anti-DEC-205 VL-VH-MCS-PeptidHis vor (bereitgestellt durch Prof. Fey (Vektor), DEC-205-Sequenz durch Prof. Steinman).
Zunächst wurde die Sequenz kodierend für Strep-DEC-205scFv-His in den Säugerzell-Expressionsvektor pSeqTag2-HygroC-Strep-4G7mutxCD16mut kloniert, aus dem vorher die Sequenz für den bispezifischen scFv 4G7mutxCD16mut entfernt wurde. Zur Herstellung des
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-LP-Konstrukts wurde dann die MAGE-A3110-279-Peptid-kodierende Sequenz (MAGE-A3-LP) aus dem Vektor pGEM4Z64A-MAGE-A3 amplifiziert. Im
Gegensatz dazu wurde für die Herstellung der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte die kodierende DNA-Sequenz für das MAGE-A3-KKL- und für das MAGE-A3-EVDPeptid durch Hybridisierung MAGE-A3-kodiender Oligonukleotide generiert. Dabei wurden
die Oligonukleotide so gewählt, dass vor der T-Zell-Epitop-kodierenden Sequenz noch die
Nukleotidsequenz der zwei N-terminal gelegene Aminosäuren (MAGE-A3-KKL: DP,
MAGE-A3-EVD: LM) enthalten waren, um eine korrekte Antigenprozessierung des MAGE-
4. Ergebnisse
37
A3-Peptides in der DC zu ermöglichen. Anschließend wurden die jeweiligen MAGE-A3Peptid-kodierenden Sequenzen hinter die DEC-205scFv-Sequenz und einen flexiblen Linker
in den 293T-Expressionsvektor pSecTag2-HygroC eingefügt (siehe Abb. 4.6A). Um die periplasmatische Expression der Fusionsproteine in E. coli zu ermöglichen, wurden die Konstrukte auch in den Expressionsvektor pet27b kloniert.
Als Negativkontrolle für die späteren Versuche sollten zusätzlich Kontrollkonstrukte kloniert
werden, welche nicht an DC binden können. Da ein MCSP-spezifischer scFv (MCSP:
melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan) von der Arbeitsgruppe Fey zur Verfügung gestellt werden konnte, wurde in Vorversuchen ermittelt, ob MCSP auf DC exprimiert
wird. Dazu wurden iDC und mDC mit dem MCSP-spezifischen monoklonalen Antikörper
9.2.27 gefärbt, der mit einen PE-konjungierten Sekundärantikörper nachgewiesen wurde. Als
Positivkontrolle für diese Färbung diente die MCSP+ Zelllinie A2058.
iDC
mDC
A2058
Zellzahl
Negativkontrolle
MCSP-spezifischer
Antikörper 9.2.27
Fluoreszenzintensität
+
Abb. 4.7: MCSP-Expression auf iDC, mDC und A2058-Zellen. iDC, mDC und Zellen der MCSP
Zelllinie A2058 wurde mit dem MCSP-gerichteten monoklonalen Antikörper 9.2.27 inkubiert, der mit einem PE-konjungierten Sekundärantikörper nachgewiesen wurde. Als Negativkontrolle wurden die Zellen nur mit dem Sekundärantikörper gefärbt.
Wie in Abb. 4.7 dargestellt, konnte MCSP nur auf den A2058-Zellen, nicht aber auf iDC oder
mDC nachgewiesen werden. Daher sind MCSP-spezifische Konstrukte als Kontrollkonstrukte
für die nachfolgenden Experimente geeignet.
Zur Klonierung dieser drei Kontrollkonstrukte (siehe Tabelle 4.1) wurde die Sequenz kodierend für den DEC-205scFv gegen die Sequenz kodierend für den aus dem monoklonalen Antikörper 9.2.27 hergestellten MCSPHLscFv (kurz, MCSPscFv; zur Verfügung gestellt durch
Prof. Fey und Michael Schwenkert) im Vektor pSecTag2HygroC ausgetauscht. Im Gegensatz
zum anti-DEC-205scFv war im MCSP-spezifischen scFv die VH Domäne N-terminal und die
VL Domäne C-terminal positioniert. Außerdem bestand der Linker zwischen den beiden Domänen anstatt aus 4 Wiederholungen einer Glycin4Serin Einheit nur aus 3 Wiederholungen.
(siehe Abb. 4.6B).
4. Ergebnisse
38
4.1.4.4. Periplasmatische Expression der scFv-Antigen-Fusionsproteine in E. coli
Die periplasmatische Expression der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Fusionsproteine
erfolgte nach IPTG-Induktion in mit den Expressionsvektoren transformierten E. coli Bakterien (Stamm BL21) für ca. 20 h bei 26 °C unter osmotischen Stress 220. Durch die Zugabe der
kompatiblen Solute Sorbitol und Glycin-Betain sollten die Fusionsproteine korrekt gefaltet
werden. Mit Hilfe des pelB Leaders gelangte das translatierte Protein in das Periplasma der
Bakterien, aus dem es anschließend extrahiert und affinitätschromatographisch über seinen Nterminalen Strep-Tag aufgereinigt wurde. Die Fusionsproteine wurden dann in einem
Coomassie-gefärbten PAA-SDS-Gel in den Elutionsfraktionen 2 und 3 in der erwarteten
Größe detektiert (siehe Abb. 4.8). Zum spezifischen Nachweis der anti-DEC-205scFvMAGE-A3-Peptid-Konstrukte wurden Western Transfer Experimente mit einem spezifischen
Antikörper gegen den 6xHis-Tag durchgeführt (siehe Abb. 4.8).
E2
A
E2
E3
E2
B
E3
E2
75 kDa
50 kDa
50 kDa
50 kDa
50 kDa
35 kDa
35 kDa
35 kDa
30 kDa
30 kDa
30 kDa
30 kDa
E2
E2
E3
75 kDa
75 kDa
50 kDa
50 kDa
35 kDa
75 kDa
anti-His
Coomassie
E3
75 kDa
75 kDa
35 kDa
C
E3
Coomassie
anti-His
E3
35 kDa
30 kDa
30 kDa
Coomassie
anti-His
Abb. 4.8: Detektion der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Fusionsproteine im Coomassie-gefärbten PAA-SDS-Gel sowie in Western Transfer Experimenten. Nach der Aufreinigung der antiDEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Proteine über ihren Strep-Tag wurden die Elutionsfraktionen 2 und 3
(E2 bzw. E3) auf ein SDS-Gel aufgetragen. Der Nachweis des anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKLKonstrukts (A), des anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD-Konstrukts (B) sowie des anti-DEC-205scFvMAGE-A3-LP-Konstrukts (C) erfolgte im Coomassie-gefärbten SDS-Gel (Coomassie) und in Western
Transfer Experimenten mit einem gegen den His-Tag gerichteten Antikörper (anti-His).
Mit Hilfe eines BSA-Standards wurde die Konzentration der Fusionsproteine im PAA-SDSGel abgeschätzt. Im Durchschnitt wurden 23 µg anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL, 19 µg
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD und 3 µg anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-LP pro Liter
Expressionskultur erhalten.
4. Ergebnisse
39
4.1.4.5. Spezifische Bindung der in E. coli hergestellten scFv-Antigen-Konstrukte
Die Überprüfung der Bindung der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte an mDC
erfolgte durchflusszytometrisch. Dazu wurden mDC mit 5 µg/ml der anti-DEC-205scFvMAGE-A3-Peptid-Fusionsproteine inkubiert. Der Nachweis der Fusionsproteine erfolgte
dann mit einem gegen den His-Tag-gerichteten Primärantikörper und einem PE-konjungierten
Sekundärantikörper.
A anti-DEC-205scFvMAGE-A3-KKL
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-EVD
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-LP
mDC
FACS-Puffer
Konstrukt
B anti-DEC-205scFvMAGE-A3-KKL
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-EVD
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-LP
CHO 16-10
CHO-DEC-205
C mDC
CHO 16-10
CHO DEC-205
Zellzahl
IgG2b-FITC
anti-DEC-205-FITC
Fluoreszenzintensität
Abb. 4.9: Durchflusszytometrische Bestimmung der spezifischen Bindung der anti-DEC205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte. A) mDC (schwarze Histogramme) wurden mit 5 µg/ml antiDEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt, anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD-Konstrukt oder anti-DEC205scFv-MAGE-A3-LP-Konstrukt inkubiert. Die Konstrukte wurden anschließend mit einem anti-HisTag-Primärantikörper sowie einem PE-konjungierten Sekundärantikörper nachgewiesen. Als Negativkontrolle wurden DC nur mit FACS-Puffer inkubiert (weiße Histogramme). B) Zu CHO 16-10- (weiße
Histogramme) sowie CHO DEC-205-Zellen (schwarze Histogramme) wurde 5 µg/ml anti-DEC205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt, anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD-Konstrukt oder anti-DEC205scFv-MAGE-A3-LP-Konstrukt zugegeben. Die Bindung wurde wie in (A) nachgewiesen. C) Die
DEC-205-Expression von mDC, CHO 16-10- und CHO DEC-205-Zellen wurde durchflusszytometrisch
mit einem anti-DEC-205-FITC-Antikörper (schwarze Histogramme) nachgewiesen. Als Negativkontrolle wurden die Zellen mit dem IgG2b-FITC-Isotypen inkubiert (weiße Histogramme).
Alle 3 hergestellten anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte banden an mDC (Abb.
4.9A). Dabei wurde eine ähnlich hohe mittlere Floureszenzintensität detektiert wie bei der
Färbung, in der mDC mit dem parentalen anti-DEC-205-Antikörper inkubiert wurden (Abb.
4.9C, links). Zum Nachweis der antigenspezifischen Bindung der Fusionsproteine wurden
Zellen der DEC-205-transfizierten Zelllinie CHO DEC-205 (siehe Abb. 4.9C, rechts) mit 5
4. Ergebnisse
40
µg/ml der verschiedenen Fusionsproteine inkubiert und mit Hilfe des anti-His-Tag Primärantikörpers und des PE-konjungierten Sekundärantikörpers nachgewiesen. Als Negativkontrolle
wurde zu CHO 16-10-Zellen, die DEC-205 nicht exprimierten (Abb. 4.9C, Mitte), die antiDEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Fusionsproteine zugegeben. Wie in Abb. 4.9 zu erkennen,
banden die Konstrukte nur an Zellen der DEC-205-positiven Zelllinie (Abb. 4.9B). Daraus
wurde auf eine antigenspezifische Bindung der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte geschlossen.
4.1.4.6. 0egativer Einfluss von LPS auf iDC
Erste Vorversuche mit dem in E. coli produzierten anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsprotein zeigten, dass die mit dem unbehandelten sowie mit dem hitze-inaktivierten Konstrukt inkubierten iDC nach der Inkubation mit dem Konstrukt reiften, was an einer Steigerung der Expression von CD25, CD83 und CD80 zu sehen war (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich produzierten die DC nach Inkubation mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt hohe Mengen an IL-6, IL-10, TNF und IFNγ (Daten nicht gezeigt). Diese Effekte traten
unabhängig davon auf, ob das Konstrukt unbehandelt oder hitze-inaktiviert war und wurden
daher nicht durch das DEC-205-Targeting ausgelöst. Die Ergebnisse eines LAL-Assays der
Firma Profos ergaben, dass die anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Proteinlösung wegen der
Produktion in E. coli 2.200 EU/ml LPS enthielt. Durch diese Verunreinigung wurde die Reifung und die Zytokinproduktion der DC höchstwahrscheinlich ausgelöst.
Um zu überprüfen, wie sensibel iDC auf LPS reagieren, wurden in einem weiteren Experiment iDC für 48 Stunden mit verschiedenen Endkonzentrationen an LPS inkubiert. Die Expression der Oberflächenmarker CD25 und CD83 wurde nach 24- und 48-stündiger Inkubationszeit durchflusszytometrisch bestimmt. Dabei stellte es sich heraus, dass eine LPS-Konzentration von 100 pg/ml (1 EU/ml, endotoxin unit) die CD25-Expression und eine LPSKonzentration von 1 ng/ml (10 EU/ml) die CD83-Expression erhöhte (Abb. 4.10A-D, schwarze Balken). Dieser Effekt wurde nach einer 48-stündigen Inkubationszeit noch verstärkt (Abb.
4.10A-D, graue Balken). Zusätzlich wurde die Zytokinproduktion der mit LPS inkubierten
DC untersucht. Wie in Abb. 4.10E-H zu sehen, induzierte die LPS-Inkubation die Sekretion
der Zytokine IL-8, IL-6, TNF und IFNγ. Wie schon bei der Expression der Oberflächenmarker CD25 und CD83 war eine LPS-Konzentration von nur 102 - 103 pg/ml (1-10 EU/ml) nötig, um die erhöhte Zytokinproduktion auszulösen. Auffallend war, dass die detektierbare
4. Ergebnisse
41
A
B
CD25
70
spezifische MFI
spezifische MFI
80
60
50
40
30
20
10
0
106
105
104
103
102
10
1
48 h
15
10
5
106
105
104
positive Zellen [%]
positive Zellen [%]
D 120
CD25
100
80
60
40
20
0
106
105
104
103
102
103
102
10
1
0
10
1
0
10
1
0
10
1
0
LPS [pg/ml]
LPS [pg/ml]
C
24 h
20
0
0
CD83
25
10
1
100
80
60
40
20
0
0
CD83
106
105
104
LPS [pg/ml]
103
102
LPS [pg/ml]
F
E
70
8
IL-6 [ng/ml]
IL-8 [ng/ml]
60
50
40
30
20
6
4
2
10
0
106
105
104
103
102
10
1
0
0
106
105
104
50
300
IFNγγ [pg/ml]
H 350
TNF [ng/ml]
G 60
40
30
20
10
0
103
102
LPS [pg/ml]
LPS [pg/ml]
250
200
150
100
50
106
105
104
103
102
LPS [pg/ml]
10
1
0
0
106
105
104
103
102
LPS [pg/ml]
Abb. 4.10: Einfluss von LPS auf den Phenotyp und das Zytokinsekretionsprofil von iDC. iDC
wurden in Medium mit unterschiedlichen Endkonzentrationen an LPS inkubiert. Nach 24- und 48-stündiger Inkubation wurde sowohl die CD25- (A, C) als auch die CD83-Expression (B, D) durchflusszytometrisch bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte der spezifischen MFI und der Prozentsatz an positiven Zellen +/- Standardabweichung aus 3 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Zusätzlich wurde die Sekretion von IL-8 (E), IL-6 (F), TNF (G) und IFNγ (H) nach 24- und 48-stündiger Inkubation ermittelt. Gezeigt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung von 3 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
4. Ergebnisse
42
Menge an TNF und IFNγ nach 48 Stunden wieder zurückging (Abb. 4.10G und H). Diese Ergebnisse zeigten, dass bereits geringe Mengen an LPS ausreichen, um die Zytokinsekretion
sowie die Reifung von DC zu induzieren. Daher wurde entschieden, die anti-DEC-205scFvMAGE-A3-Peptid-Konstrukte und die anti-MCSPscFv-MAGE-A3-Peptid-Kontrollkonstrukte
in der Säugerzelllinie 293T zu produzieren, um eine LPS-Kontamination der Fusionsproteine
zu vermeiden.
4.1.4.7. Expression der scFv-Antigen-Konstrukte in 293T-Zellen
Zur Expression der Fusionsproteine wurden 293T-Zellen mit der CaPO4-Methode transient
mit den entsprechenden pSecTag2-HygroC-Strep-anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-HISoder den entsprechenden pSecTag2-HygroC-Strep-anti-MCSPscFv-MAGE-A3-Peptid-HISVektoren transfiziert und bei 37 °C inkubiert. Zusätzlich wurden Ansätze mitgeführt, bei denen 293T-Zellen ohne DNA transfiziert wurden. Diese diente später als Negativkontrolle bei
den DC-Beladungsexperimenten (solvent control). Als Positivkontrolle wurden 293T-Zellen
mit einem GFP-Konstrukt transfiziert und die Transfektionseffizienz 48 Stunden später durchflusszytometrisch bestimmt. Durchschnittlich waren zwischen 80 und 90 % der 293T-Zellen
mit dem GFP-Vektor transfiziert und fluoreszierten grün (Abb. 4.11).
Transfektion ohne DNA-Vektor
Zellzahl
Transfektion mit GFP-Vektor
Fluoreszenzintensität
Abb. 4.11: Transfektion der 293T-Zellen. 293T-Zellen wurden mit der CaPO4-Methode mit einem
GFP-Vektor (grünes Histogramm) oder ohne DNA (weißes Histogramm) transfiziert. Nach 48 Stunden
wurden die Zellen geerntet und die Transfektionseffizienz durchflusszytometrisch bestimmt.
Am Tag 3, 5, 6 und 7 nach der 293T-Transfektion wurden die Überstände geerntet und die
Fusionsproteine affinitätschromatographisch mit Hilfe ihrer His-Tags aufgereinigt. Das antiDEC-205scFv-MAGE-A3-KKL- und das anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD-Konstrukt sowie die dazugehörigen MCSP-spezifischen Kontrollkonstrukte wurden in einem Coomassiegefärbten PAA-SDS-Gel in der jeweiligen erwarteten Größe detektiert (Abb. 4.12). Zusätzlich
wurden sie in Western Transfer Experimenten sowohl über ihren Strep- als auch über ihren
His-Tag nachgewiesen (Abb. 4.12). Das anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-LP-Konstrukt konnte
in den 293T-Zellen nicht exprimiert werden (Daten nicht gezeigt) und wurde im Rahmen der
4. Ergebnisse
43
Arbeit nicht weiter verfolgt. Aus diesem Grund wurde das dazugehörige Kontrollkonstrukt
nicht in 293T-Zellen produziert.
Die Konzentration der Fusionsproteine wurde wiederum mit Hilfe eines BSA-Standards im
PAA-SDS-Gel abgeschätzt. Im Durchschnitt wurden 120 µg anti-DEC-205scFv-MAGE-A3KKL, 82 µg anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD, 151 µg anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL
und 186 µg anti-MCSPscFv-MAGE-A3-EVD pro Liter 293T-Überstand aufgereinigt.
E1
A
E2
E1
E2
E1
E2
50 kDa
35 kDa
E1
B
75 kDa
50 kDa
50 kDa
50 kDa
35 kDa
35 kDa
35 kDa
30 kDa
30 kDa
30 kDa
30 kDa
anti-His
Coomassie
E1
C
E2
E1
E2
anti-Strep
E1
50 kDa
Coomassie
anti-Strep
E2
E2
anti-Strep
E1
E2
50 kDa
35 kDa
30 kDa
30 kDa
anti-His
E1
E1
75 kDa
35 kDa
30 kDa
E2
anti-His
E2
75 kDa
50 kDa
35 kDa
30 kDa
E1
D
75 kDa
35 kDa
Coomassie
E2
75 kDa
50 kDa
E1
E2
75 kDa
75 kDa
75 kDa
Coomassie
anti-His
anti-Strep
Abb. 4.12: Detektion der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte und der antiMCSPscFv-MAGE-A3-Peptid-Kontrollkonstrukte im Coomassie-gefärbten PAA-SDS-Gel sowie
in Western Transfer Experimenten. Nach der Aufreinigung der Fusionsproteine über ihren His-Tag
wurden die Elutionsfraktionen 1 und 2 (E1 bzw. E2) auf ein SDS-Gel aufgetragen. Der Nachweis des
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukts (A), des anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD-Konstrukts
(B), des anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukts (C) und des anti-MCSPscFv-MAGE-A3-EVD-Konstrukts (D) erfolgte im Coomassie-gefärbten SDS-Gel (Coomassie) und in Western Transfer Experimenten mit einem gegen den His-Tag (anti-His) oder Strep-Tag gerichteten Antikörper (anti-Strep).
4.1.4.8. Spezifische Bindung der in 293T-Zellen hergestellten scFv-Antigen-Konstrukte
Der Nachweis der Bindung der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Fusionsproteine erfolgte durchflusszytometrisch an iDC und mDC, welche über eine hohe DEC-205-Expression verfügten (Abb. 4.13A). Zur Überprüfung der Kontrollkonstrukte stand die MCSP+ Zelllinie
A2058 zur Verfügung (Abb. 4.13A). Um die Bindung der Fusionsproteine überprüfen zu können, wurden iDC, mDC sowie A2058-Zellen mit jeweils 1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGEA3-KKL-Konstrukt,
anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL-Kontrollkonstrukt,
anti-DEC-
205scFv-MAGE-A3-EVD-Konstrukt sowie mit 1 µg/ml anti-MCSPscFv-MAGE-A3-EVDKontrollkonstrukt inkubiert. Die Fusionsproteine wurden entweder über einen anti-His-Tag
gerichteten Primärantikörper und einen Ziege anti-Maus IgG-PE Sekundärantikörper
4. Ergebnisse
A
iDC
44
mDC
A2058
IgG2b-FITC oder gαm-PE
parentaler Antikörper
B
iDC
mDC
A2058
anti-His-tag + gαm-PE
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL
anti-His-tag + gαm-PE
anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL
anti-STREP-PE
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD
anti-STREP-PE
anti-MCSPscFv-MAGE-A3-EVD
C
parentaler
anti-DEC-205 Ab
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-KKL
anti-DEC-205scFvMAGE-A3-EVD
Zellzahl
CHO 16-10
CHO DEC-205
Fluoreszenzintensität
Abb. 4.13: Durchflusszytometrische Bestimmung der spezifischen Bindung der anti-DEC205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte und anti-MCSPscFv-MAGE-A3-Peptid-Kontrollkonstrukte.
A) iDC und mDC wurden mit dem anti-DEC-205-FITC Antikörper gefärbt. Die MCSP-Expression auf
den A2058-Zellen wurde mit dem gegen MCSP-gerichteten 9.2.27 monoklonalen Antikörper und einem PE-konjungierten Sekundärantikörper Antikörper (gαm-PE) nachgewiesen (schwarze Histogramme). Als Negativkontrolle wurden die Zellen entweder mit dem IgG2b-FITC (iDC, mDC) oder dem
gαm-PE Antikörper (A2058) inkubiert. B) Zum Nachweis der Bindung der Fusionsproteine, wurden
iDC, mDC und A2058-Zellen mit jeweils 1 µg/ml der verschiedenen Konstrukte inkubiert. Die Detektion
erfolgte entweder über den anti-His-Tag gerichteten Primärantikörper und einem PE-konjungierten Sekundärantikörper (MAGE-A3-KKL-Konstrukt) oder über den anti-Strep-PE Antikörper (MAGE-A3-EVDKonstrukt; schwarze Histogramme). Als Negativkontrolle wurden die Zellen entweder mit dem PE-konjungierten Sekundärantikörper oder mit dem anti-Strep-PE Antikörper inkubiert (weiße Histogramme).
C) CHO 16-10- (weiße Histrogramme) sowie CHO DEC-205-Zellen (schwarze Histogramme) wurden
entweder mit dem anti-DEC-205-PE Antikörper oder mit 1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKLKonstrukt oder dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD-Konstrukt inkubiert. Der Nachweis der Bindung der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte erfolgte wie in (B).
4. Ergebnisse
45
(MAGE-A3-KKL-Konstrukt), oder über einen Strep-PE Antikörper (MAGE-A3-EVD-Konstrukt) nachgewiesen. Wie in Abb. 4.13B gezeigt, banden die anti-DEC-205scFv-MAGE-A3Peptid-Konstrukte sowohl an iDC als auch an mDC, aber nicht an Zellen der DEC-205-negativen Zelllinie A2058. Die Kontrollkonstrukte hingegen banden nur an Zellen der MCSP-positiven Zelllinie A2058 (Abb. 4.13B). Um nachzuweisen, dass die anti-DEC-205scFv-MAGEA3-Peptid-Konstrukte nur spezifisch an DEC-205 binden, wurden Zellen der DEC-205-transfizierten CHO DEC-205 Zelllinie und die der DEC-205-negativen CHO 16-10 Zelllinie mit 1
µg/ml der Konstrukte inkubiert. Die Bindung der Fusionsproteine wurde entweder mit einem
anti-His-Tag-gerichteten Primärantikörper und dem PE-konjungierten Sekundärantikörper
(MAGE-A3-KKL-Konstrukt) oder mit einem anti-Strep-PE Antikörper (MAGE-A3-EVDKonstrukt) durchflusszytometrisch analysiert. Die Bindung der anti-DEC-205scFv-MAGEA3-Peptid-Konstrukte war DEC-205-spezifisch, da die Fusionsproteine nur an Zellen der
DEC-205-transfizierte Zelllinie banden (Abb. 4.13C). Dabei wurde eine ähnlich starke Bindung ermittelt wie bei Inkubation der Zellen mit dem parentalen Antikörper (Abb. 4.13C).
In den nachfolgenden Versuchen wurde nur mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKLKonstrukt sowie dem dazugehörigen Kontrollkonstrukt weitergearbeitet, um zunächst überprüfen zu können, ob durch DEC-205-Targeting eine effiziente MHC-Klasse-II-Präsentation
erreicht werden kann.
4.1.4.9. Keine Veränderung des DC-Phenotyps und -Zytokinsekretionsprofils sowie der DCMigrationskapazität nach DEC-205-Targeting
Für den späteren Einsatz in der Immuntherapie ist es wichtig, dass das DEC-205-Targeting
von DC keinen negativen Einfluss auf deren Phänotyp, Zytokinsekretionsprofil sowie deren
Migrationskapazität hat. Außerdem könnte eine induzierte Zytokinsekretion sowie Reifung
der DC die Ergebnisse in den folgenden Versuchen verfälschen. Um dies auszuschließen,
wurde zuerst ein möglicher Einfluss des DEC-205-Targetings auf den DC-Phänotyp analysiert. Hierfür wurden iDC und mDC für 48 Stunden mit 1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGEA3-KKL-Konstrukt oder mit 1 µg/ml anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL-Kontrollkonstrukt inkubiert. Ein Teil der iDC wurden nach 24-stündiger Inkubation während der restlichen 24
Stunden mit dem Zytokincocktail gereift (iDCm). Anschließend wurde die Expression der
Oberflächenmarker CD25, CD70, CD83 und DEC-205 durchflusszytometrisch untersucht.
Wie in Abb. 4.14 zu sehen, war kein Unterschied im Phänotyp zwischen DC, welche mit dem
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt inkubiert wurden, und DC, zu denen das
Kontrollkonstrukt anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL gegeben wurden, zu sehen. Die niedrige-
4. Ergebnisse
46
re DEC-205-Expression auf iDCm im Vergleich zu der auf mDC (Abb. 4.14) kann dadurch
erklärt werden, dass die mDC zum Zeitpunkt der Messung vor 72 Stunden gereift wurden und
die iDCm nur 24 Stunden vorher. Während dieses Zeitraumes erhöhte sich die DEC-205-Expression auf den DC, was schon in Abb. 4.4 zu erkennen war. Außerdem kann man erkennen,
dass mDC eine erhöhte CD70-Expression im Vergleich zu iDCm aufweisen (Abb. 4.14). Die
Expessionstärke des Reifungsmarkers CD83 auf mDC nahm im Vergleich zu den iDCm bereits ab (Abb. 4.14). Beide Effekte konnten auch beobachtet werden, wenn DC ohne Zugabe
von Konstrukten kultiviert wurden (Daten nicht gezeigt). Daher wurden diese Effekte nicht
durch die Inkubation der Zellen mit den Konstrukten ausgelöst. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Inkubation von DC mit den scFv-Antigen-Konstrukten keine Veränderung des
DC-Phenotyps bewirkte.
50
CD25
40
30
20
10
spezifische MFI
0
40
DK MK DK MK DK MK
CD70
30
20
10
0
DK MK DK MK DK MK
70
60
50
40
30
20
10
0
70
60
50
40
30
20
10
0
CD83
iDC
iDCm
mDC
DK MK DK MK DK MK
DEC-205
DK MK DK MK DK MK
DC inkubiert mit
Abb. 4.14: DEC-205-Targeting beeinflusst nicht den DC-Phenotyp. iDC und mDC wurden für 48
Stunden mit 1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL- (DK) oder 1 µg/ml anti-MCSPscFv-MAGE-A3KKL-Kontrollkonstrukt (MK) inkubiert. Ein Teil der iDC wurden nach 24-stündiger Beladung für weitere
24 Stunden mit dem Zytokincocktail gereift (iDCm). Die CD25-, CD83-, CD70- und DEC-205-Expression der iDC, iDCm und mDC wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte
+/- Standardfehler von 4 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
In einem weiteren Experiment wurde ein möglicher Effekt des DEC-205-Targeting auf das
Zytokinsekretionsprofil der DC analysiert. Hierzu wurden iDC und mDC für 24 Stunden mit
1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt inkubiert oder zu den Zellen wurde
dasselbe Volumen an Medium oder solvent control, welcher aus dem aufgereinigten Überstand ohne Vektor-transfizierter 293T-Zellen bestand (siehe Kapitel 4.1.4.7 und Material und
Methoden siehe 6.2.3), zugegeben.
Im Anschluss wurden die in das Medium abgegebenen Zytokine bestimmt. Das DEC-205Targeting induzierte keine Änderungen in der Sekretion der Zytokine IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10,
4. Ergebnisse
47
TNF und IL12p70 (Abb. 4.15). Des Weiteren wurde keine Veränderung im Zytokinsekretionsprofil der mDC, welche mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt inkubiert wurden, beobachtet (Daten nicht gezeigt). Aus diesen Ergebnissen wurde ersichtlich,
dass das DC-Zytokinsekretionsprofil durch die Inkubation mit dem anti-DEC-205scFv-
Konzentration [ng/ml]
MAGE-A3-KKL-Konstrukt nicht beeinflusst wurde.
40
30
20
10
0.6
0.4
0.2
0
Medium
solvent control
DK
IL-8
IL-1β
IL-6
IL-10
TNF IL-12p70
Abb. 4.15: DEC-205-Targeting beeinflusst nicht das DC-Zytokinsekretionsprofil. Unreife (iDC)
wurden für 24 Stunden mit 1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL (DK) oder mit demselben Volumen an Medium oder solvent control inkubiert. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die in den Überstand abgegebenen Zytokine bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardfehler von 6 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
Um DC für eine DC-Impfungsstrategie einsetzten zu können, müssen diese über eine gute Migrationskapazität verfügen, um von der Injektionsstelle in der Haut zum Lymphknoten wandern zu können. Dabei spielt der C-C Chemokinrezeptor Typ 7 (CCR7) eine wichtige Rolle:
Die CCR7-Expression der DC bewirkt zusammen mit anderen Faktoren die Wanderung der
DC entlang eines Chemokingradienten ihrer Liganden CCL19 (CC-motif ligand 19; MIP-3β)
und CCL21 zu den lymphatischen Gefäßen und den T-Zell-Regionen in den sekundären lymphatischen Organen
221,222
. Um sicherzustellen, dass das DEC-205-Targeting von DC die
CCR7-vermittelte Migration nicht beeinträchtigt, wurden iDC und mDC für 48 Stunden mit 1
µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt oder mit demselben Volumen an Medium behandelt. Die iDC wurden nach 24 Stunden für weitere 24 Stunden gereift (iDCm).
Anschließend wurde die CCR7-Expression bestimmt (Abb. 4.16).
Die Inkubation sowohl der iDCm als auch der mDC mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3KKL-Fusionsproteins bewirkte keine Veränderung der CCR7-Expression (Abb. 4.16A), jedoch exprimierten mDC mehr CCR7 als iDCm. Zusätzlich zur CCR7-Expression wurde die
Migrationsfähigkeit der mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt inkubierten
DC zu einem CCL19-Gradienten in einem Migrationsexperiment bestimmt
223
. Dazu wurden
iDCm und mDC, welche entweder mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt
inkubiert wurden oder zu denen dasselbe Volumen an Medium zugegeben wurde, in die obere
Kammer einer Transwellplatte gegeben. Der Boden dieser Kammer besteht aus einer Mem-
4. Ergebnisse
48
bran, welche über 5 µm Poren verfügt, durch die die DC entlang eines Chemokingradienten in
die untere Kammer migrieren können. Nach 2-stündiger Kultivierung wurde analysiert, wie
viel Prozent der DC durch die Membran in die untere Kammer, welche CCL19 versetzten
Medium enthielt, gewandert waren (zu). Als Negativkontrolle wurde weder in die untere noch
in die obere Kammer CCL19 zugegeben (negativ) oder CCL19 wurde direkt zu den DC gege-
spezifische MFI
A
20
CCR7
15
10
5
0
- + - +
iDCm mDC
B
migrierte Zellen [%]
ben (anti).
70
60
50
40
30
20
10
0
negativ
anti
zu
-
+
iDCm
-
+
mDC
Abb. 4.16: DEC-205-Targeting beeinflusst nicht die CCR7-Expression und das Migrationsverhalten von DC. iDC und mDC wurden für 48 Stunden mit 1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL
(+) oder ohne Konstrukt (-) inkubiert. Die iDC wurden nach 24-stündiger Beladung für weitere 24 Stunden mit dem Zytokincocktail gereift (iDCm). Anschließend wurde die CCR7-Expression durchflusszytometrisch analysiert (A). Gezeigt sind die Mittelwerte +/- Standardfehler von 5 (iDCm) bzw. 7 (mDC)
unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Zusätzlich wurden die mit dem anti-DEC205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt inkubierten DC auf ihre CCR7-vermittelte Migrationskapazität untersucht (B). Dazu wurden die iDC und mDC entweder mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKLKonstrukt inkubiert oder es wurde dieselbe Menge an Medium zu den Zellen gegeben. Anschließend
wurden diese DC in einem Standard-Transwell-Migrationsexperiment eingesetzt, um ihre Migrationsfähigkeit zum Chemokin CCL19 (zu) bestimmen zu können. Um die spontane Migrationsrate zu ermitteln, wurden DC auch ohne CCL19 in der oberen oder unteren Kammer des Transwells kultiviert (negativ), oder zusammen mit CCL19 (anti) in der Kammer. Dargestellt ist der Durchschnitt +/- Standardfehler von 3 (iDCm) bzw. 5 (mDC) unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
Abbildung 4.16B zeigt, dass sowohl iDCm als auch mDC, welche mit dem anti-DEC205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt inkubiert wurden, die gleiche Migrationskapazität aufwiesen wie iDCm bzw. mDC, zu denen nur Medium zugegeben wurde. In Übereinstimmung
mit der nachgewiesenen CCR7-Expression (Abb. 4.16A), war die Migrationskapazität der
mDC höher als die der iDCm. Zusammenfassend kann man sagen, dass das DEC-205Targeting von DC keinen negativen Einfluss auf deren Migrationsverhalten ausübte.
4.1.4.10. Effiziente MHC-Klasse-II-Beladung von DC durch DEC-205-Targeting
Als nächstes wurde untersucht, ob das DEC-205-Targeting von DC zu einer effizienten
MHC-Klasse-II-Präsentation des MAGE-A3-Peptides führt. Dazu wurden iDC und mDC für
48 Stunden mit 1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt (MAGE-A3-Beladung) oder derselben Menge an anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL-Kontrollkonstrukt (entsprechende Kontrolle) inkubiert. Ein Teil der iDC wurden nach 24-stündiger Inkubation für
4. Ergebnisse
49
die restlichen 24 Stunden mit dem Zytokincocktail gereift (iDCm). Anschließend wurden die
DC mit MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen CD4+ T-Zellen, welche durch Elektroporation mit
MAGE-A3/HLA-DP4-TZR-kodierender RNA hergestellt worden waren, kokultiviert. Nach
16- bis 18-stündiger Kultivierung wurde die IL-2-Sekretion ermittelt, welche als Maß für die
DC-Stimulationseffizienz diente. Wie aus Abbildung 4.17A ersichtlich, führte das DEC-205Targeting von iDC, iDCm und mDC zur Aktivierung der MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen
T-Zellen (Abb. 4.17A, schwarze Balken). Die abgegebene IL-2-Menge war dabei signifikant
erhöht im Vergleich zu den Ansätzen, bei welchen T-Zellen mit DC stimuliert wurden, die
mit dem Kontrollkonstrukt inkubiert wurden (Abb. 4.17A, graue Balken). Diese Ergebnisse
zeigten, dass das DEC-205-Targeting von DC tatsächlich zur Präsentation des im Fusionsprotein enthaltenen MAGE-A3-Peptides auf MHC-Klasse-II-Molekülen führt und eine antigenspezifische T-Zell-Stimulation auslöst. Dabei verfügten durch DEC-205-Targeting beladene
iDCm über die höchste Kapazität antigenspezifische T-Zellen zu stimulieren (Abb. 4.17A).
Zusätzlich wurde in diesem Experiment das DEC-205-Targeting mit zwei gängigen DC-anti
genbeladungsstrategien – der RNA-Elektroporation und der direkten Peptidbeladung – ver
A
***
0,8
1,2
0,8
***
**
MAGE-A3 Beladung
entsprechende Kontrolle
0,6
***
***
**
*
0,4
IL-10/IL-2
IL-2 [ng/ml]
1,6
B
*
*
0,4
0,2
0
0
iDCm
mDC
DEC-205-Targeting
EP
iDC
C
m
iD DC DC
i
m
Peptid
+
Abb. 4.17: Zytokinsekretion nach Stimulation MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischer CD4 T-Zellen
mit DC welche auf unterschiedliche Weise mit MAGE-A3 beladen wurden. A) Vergleich der Stimulationskapazität von DC welche durch DEC-205-Targeting, RNA-Elektroporation (EP) oder direkte
Peptidbeladung mit dem Tumorantigen MAGE-A3 beladen wurden. iDC und mDC wurden für 48 Stunden mit 1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt oder mit 1 µg/ml anti-MCSPscFv-MAGEA3-Kontrollkonstrukt (als entsprechende Kontrolle) inkubiert. Nach 24 Stunden wurde ein Teil der iDC
für die restlichen 24 Stunden mit dem Zytokincocktail gereift (iDCm). Zusätzlich wurden mDC mit
MAGE-A3-DCLAMP-RNA oder MAGE-A3-RNA (entsprechende Kontrolle) elektroporiert, oder mit dem
MAGE-A3/HLA-DP4-Peptid oder dem NY-ESO-1/HLA-DP4-Kontrollpeptid (entsprechende Kontrolle)
beladen. Anschließend wurden diese auf unterschiedliche Weise mit MAGE-A3-beladenen DC ver+
wendet, um MAGE-A3/HLA-DP4-spezifische autologe CD4 T-Zellen zu stimulieren, welche durch
+
TZR-RNA-Elektroporation hergestellt wurden. Die IL-2-Sekretion der spezifischen CD4 T-Zellen wurde nach 18-stündiger Koinkubation bestimmt. B) Zusätzlich wurde das IL-10 zu IL-2 Verhältnis nach
Aktivierung der spezifischen T-Zellen mit durch DEC-205-Targeting beladenen iDC, iDCm und mDC
berechnet. Angegeben sind die Signifikanzwerte, welche mit dem Mann-Whitney-Test (Graphpad
Prism) berechnet wurden. *, p < 0,05; **, p < 0,005; ***, p < 0,001.
4. Ergebnisse
50
glichen. Dazu wurden 24 Stunden reife mDC mit MAGE-A3-DCLAMP-RNA elektroporiert.
Die C-terminale Targeting-Sequenz des DCLAMP bewirkt den Transport des translatierten
MAGE-A3-Proteins zu den Endosomen der DC, was die Präsentation von MAGE-A3-Peptiden auch in MHC-Klasse-II ermöglicht (siehe 4.2.3;
168
). Als Negativkontrolle wurden DC
mit derselben Menge an MAGE-A3-RNA elektroporiert (entsprechende Kontrolle). Die Zellen wurden 24 Stunden nach Elektroporation zur Stimulation von MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen CD4+ T-Zellen verwendet. Zur direkten Peptidbeladung der DC wurden diese für 3
Stunden mit dem MAGE-A3/HLA-DP4-Peptid oder dem NY-ESO-1/HLA-DP4-Kontrollpeptid (entsprechende Kontrolle) bei 37 °C im Brutschrank inkubiert, bevor eine Stimulation der
spezifischen T-Zellen erfolgte. Wie in Abb. 4.17A erkennbar, bewirkten DC, welche durch
RNA-Elektroporation oder direkte Peptidbeladung mit MAGE-A3 beladen wurden, eine Stimulation der MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen T-Zellen (Abb. 4.17A, schwarze Balken).
Dabei war die IL-2-Sekretion signifikant erhöht im Vergleich zu der von T-Zellen, welche mit
DC kultiviert wurden, die mit der entsprechenden Kontrolle (MAGE-A3-RNA bzw. NYESO-1/HLA-DP4-Peptid) behandelt wurden. Das DEC-205-Targeting von iDCm führte jedoch zu einer signifikant verbesserten Stimulationseffizienz gegenüber der RNA-Elektroporation und der direkten Peptidbeladung (Abb. 4.17A). Zusätzlich wurde gezeigt, dass auch iDC
und mDC, welche durch DEC-205-Targeting mit dem MAGE-A3-Epitop beladen wurden, eine erhöhte Stimulationskapazität im Vergleich zu RNA-elektroporierten und peptidbeladenen
DC aufwiesen. Dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant (Abb. 4.17A).
Ziel der DC-Impfung ist die Immunantwort des Körpers gegen einen Tumor zu initiieren oder
zu verbessern. Es ist jedoch bekannt, dass die Verwendung von iDC stattdessen Toleranz induzieren kann (siehe Kapitel 2.1.4). Ein wichtiges Schlüsselzytokin für die Toleranzinduktion
ist IL-10. Aus diesem Grund wurde in den Kokulturen der durch DEC-205-Targeting beladenen DC und der spezifischen T-Zellen die IL-10-Sekretion im Verhältnis zur IL-2-Sekretion
bestimmt, welche bedeutend für die Initiierung einer Immunantwort ist (Abb. 4.17B). Dabei
wurde ersichtlich, dass die iDC ein signifikant erhöhtes IL-10 zu IL-2 Verhältnis im Vergleich zu den iDCm und mDC aufwiesen (Abb. 17.4B). Da durch DEC-205-Targeting beladene iDC bei einer möglichen DC-Impfung Toleranz induzieren könnten, ist die Verwendung
dieser DC-Population unratsam.
4. Ergebnisse
51
4.1.4.11. Dosisabhängige Effizienz der Antigenbeladung von DC durch DEC-205Targeting
Um zu ermitteln, welche Konzentration an anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt
für eine effiziente Antigenbeladung durch DEC-205-Targeting nötig ist, wurden iDCm mit
verschiedenen Konzentrationen an anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt inkubiert.
Als Negativkontrolle wurden DC mit denselben Konzentrationen an Hitze-inaktivierten Konstrukt, 10 µg/ml und 1 µg/ml anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL-Kontrollkonstrukt oder demselben Volumen an Medium oder solvent control behandelt. Nach 48-stündiger Inkubationszeit wurden die DC dazu verwendet, um MAGE-A3/HLA-DP4-spezifische CD4+ T-Zellen zu
stimulieren. Die IL-2-Sekretion wurde nach 16- bis 18-stündiger Kokultivierung ermittelt. Die
Beladung der iDCm mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt führte wiederum zur Aktivierung der spezifischen T-Zellen, welche dosisabhängig IL-2 sekretierten (Abb.
4.18, schwarze Quadrate). Bei der Inkubation der iDCm mit dem Kontrollprotein müsste etwa
100x mehr Protein zugegeben werden, um die gleiche IL-2-Sekretion wie bei der Beladung
mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Konstrukt zu erhalten. (Abb. 4.18, schwarze Dreiecke). Wurde das anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt in Konzentrationen von
0,01 µg/ml bis 1 µg/ml eingesetzt, korrelierte die Stimulationskapazität der DC mit der verwendeten Konstruktmenge (Abb. 4.18). Zwischen 1 µg/ml und 3 µg/ml blieb die Stimulationskapazität annähernd gleich, stieg aber bei einer Verwendung von 10 µg/ml weiter an.
Allerdings wurde bei dieser Konzentration auch die unspezifische Aufnahme der Kontrollkonstrukte (anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL; Hitze-inaktiviertes anti-DEC-205scFv-MAGE-
IL-2 [ng/ml]
2,0
1,5
Medium
solvent control
1,0
DK
DK (inaktiviert)
0,5
MK
0
10
3
1
0,3
0,1
0,03
0,01
0
Konstrukt [µg/ml]
+
Abb. 4.18: Dosisabhängige IL-2-Sekretion MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischer CD4 T-Zellen nach
Stimulation mit durch DEC-205-Targeting beladenen DC. iDCm wurden für 48 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen an aktiven und inaktivierten anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL (DK), 10
µg/ml und 1 µg/ml anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL (MK) oder demselben Volumen an Medium oder
solvent control inkubiert. Anschließend wurden diese DC verwendet, um MAGE-A3/HLA-DP4-spezifi+
+
sche autologe CD4 T-Zellen zu stimulieren. Die IL-2-Sekretion der spezifischen CD4 T-Zellen wurde
nach 18-stündiger Koinkubation bestimmt. Gezeigt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung 4 unabhängig voneinander durchgeführter Versuche.
4. Ergebnisse
52
A3-KKL, Abb. 4.18) erkennbar. Daher sollte 1 µg/ml die beste Konzentration an anti-DEC205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt für das DEC-205-Targeting von DC sein.
4.1.4.12. Effiziente Antigenbeladung von Melanompatienten-mDC durch DEC-205Targeting
In weiteren Experimenten wurde untersucht, ob auch DC, welche aus dem Blut von Patienten
mit Malignen Melanom generiert wurden, durch DEC-205-Targeting mit Tumorantigen beladen werden können. Für diese Versuche wurden DC von 5 verschiedenen Patienten verwendet,
welche in Tabelle 4.2 aufgelistet sind. Die DC wurden dabei unter GMP-Bedingungen (good
manufacturing practice) in der Universitätshautklinik Erlangen generiert. Dabei wurden die
Monozyten entweder durch Dichtegradientenzentrifugation und anschließende Adhärenz an
Plastik oder durch Elutration
224
angereichert. Die nachfolgenden Versuche wurden nur mit
mDC durchgeführt, da diese DC-Population in ausreichender Menge zur Verfügung stand.
Zunächst wurde die DEC-205-Expression durchflusszytometrisch ermittelt, um sicherzustellen, dass die Patienten-mDC ausreichend DEC-205 auf der Oberfläche exprimieren. Außerdem wurde der Reifungszustand der mDC durch die Expression des Reifungsmarkers CD83
bestimmt.
Tabelle 4.2: Geschlecht, Alter und Krankheitsstadium der Melanompatienten sowie die verwendete Herstellungsart und der Reifungsstatus der Melanompatienten-mDC
Patient
Geschlecht
Alter
a
Stadium
a
Distale Metastasen
b
DC-Generierung
c
% DEC-205
d
MFI DEC-205
c
% CD83
d
MFI CD83
a
1
F
73
IV
M1a
Adhärenz
97
210
96
91
2
M
52
IV
M1c
Elutra
98
244
97
50
3
F
65
IIIc
Adhärenz
96
238
93
59
4
M
66
IV
M1b
Adhärenz
93
193
98
143
5
F
46
IV
Elutra
92
92
88
63
225
nach Balch et al.
DC-Generierung aus Monozyten, welche durch Elutration (counterflow elutriation system) oder durch
Dichtegradientenzentrifugation und anschließender Adhärenz an Plastik angereichert wurden
c
Prozent an DEC-205- oder CD83-positiven DC
d
MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) über Hintergrund
b
Alle Melanompatienten-mDC wiesen eine hohe DEC-205-Expression und einen guten Reifungszustand auf (siehe Tabelle 4.2, Abb. 4.19C und D). Daher sollte es möglich sein, diese
DC durch die DEC-205-Targeting-Strategie mit dem MAGE-A3-Peptid zu beladen.
4. Ergebnisse
53
Zusätzlich zur CD83- und DEC-205-Expression wurde die Expression der Oberflächenmarker
CD25 und CD70 durchflusszytometrisch ermittelt (Abb. 4.19). Dabei viel auf, dass im Vergleich zu DC, welche aus dem Blut gesunder Spender (weiße Balken) generiert wurden, die
CD70-Expression signifikant reduziert war (Abb. 4.19B, schwarze Balken). Die CD25-Expression hingegen war bei den Patienten-mDC signifikant erhöht (Abb. 4.19A, schwarze Balken). Um diesen Unterschied näher zu untersuchen, wurde von denselben 5 Patienten nochmals eine geringe Menge an Blut abgenommen, um dieses Mal die DC unter Verwendung des
Herstellungsprotokolls der Arbeitsgruppe (Vollblut, allogenes Plasma im Medium anstatt
Leukapherese, autologes Plasma im Medium) zu generieren. Wie in Abb. 4.19 ersichtlich, war
die CD70-Expression dieser DC (Abb. 4.19B, graue Balken) gleichwertig der der DC, welche
aus dem Blut gesunder Spender generiert wurden. Möglicherweise lag der Unterschied in der
CD70-Expression in der unterschiedlichen Generierung der DC. Die CD25-Expression hingegen wurde durch die unterschiedliche Generierung nicht beeinflusst (Abb. 4.19A).
B
CD25
60
40
20
0
C
30
100
% positive Zellen
spezifische MFI
**
*
75
50
25
100
***
20
**
10
0
% positive Zellen
*
80
CD70
spezifische MFI
A
75
D
25
0
DEC-205
*(T)**(U)
60
40
20
0
75
250
200
50
25
0
150
100
50
0
*(U)
100
% positive Zellen
80
300
spezifische MFI
100
100
% positive Zellen
spezifische MFI
120
**
50
0
CD83
***
75
50
25
0
Gesunde Spender, Monozyten-Anreicherung über Adhärenz, Kultivierung in Medium mit allogenem Plasma
Melanompatienten, Monozyten-Anreicherung über Adhärenz / Elutration (GMP), Kultivierung in Medium mit autologem Plasma
Melanompatienten, Monozyten-Anreicherung über Adhärenz, Kultivierung in Medium mit allogenem Plasma
Abb. 4.19: CD25-, CD70-, CD83- und DEC-205-Expression von mDC, die auf unterschiedliche
Weise aus Blut gesunder Spender oder Melanompatienten generiert wurden. mDC wurden entweder aus dem Blut gesunder Spender in der Arbeitsgruppe generiert (weiße Balken), oder aus Blut
von Melanompatienten unter GMP-Bedingungen (schwarze Balken) oder in der Arbeitsgruppe (graue
Balken). Die mDC wurden anschließend auf ihre CD25- (A), CD70- (B), CD83- (C) und ihre DEC-205Expression (D) durch Färbung mit entsprechenden Antikörper und Durchflusszytometrie untersucht.
Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardfehler aus 5 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. T: Signifikanzwerte berechnet mit dem Student´s T-Test; U: Signifikanzwerte berechnet
mit dem Mann-Whitney-Test; *, p < 0,05; **, p < 0,005; ***, p < 0,001.
4. Ergebnisse
54
Um zu überprüfen, ob Patienten-mDC durch die DEC-205-Targeting-Strategie mit dem
MAGE-A3-Peptid beladen werden können, wurden Patienten-mDC verwendet, die unter
GMP-Bedingungen hergestellt wurden. Dazu wurden die Patienten-mDC für 48 Stunden mit
1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt inkubiert, oder mit 1 µg/ml antiMCSPscFv-MAGE-A3-KKL-Kontrollkonstrukt oder demselben Volumen an Medium oder
solvent control. Anschließend wurde die Stimulationskapazität mit Hilfe von autologen
MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen CD4+ T-Zellen bestimmt. Wie in Abb. 4.20 dargestellt,
führte die Inkubation der DC mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt zur
MAGE-A3-Präsentation auf den DC, da die spezifischen T-Zellen antigenspezifisch IL-2 sekretierten (Abb. 4.20A). Die Sekretion war dabei signifikant erhöht im Vergleich zur abgegebenen IL-2-Menge von T-Zellen, welche mit DC stimuliert wurden, die mit Medium, der
solvent control oder dem Kontrollkonstrukt (entsprechende Kontrolle) inkubiert wurden (Abb.
4.20A).
IL-2
Zytokinkonzentration [ng/ml]
A
0,6
*
*
*
TNF
*
0,25
*
*
*
0.20
0,4
IFNγγ
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0,8
0,15
0,10
0,2
1,2
*
MAGE-A3-Beladung
entsprechende Kontrolle
Medium / sc
0,4
0,50
0
B 0,3
0
*
*
*
*
0,3
0
*
*
0,5
0,4
0,2
0,2
0,1
0,1
0
0
*
*
*
0,3
0,2
0,1
M
ed sc
Ta
e
rg
ti
ng
p
Pe
t id
M
0
ed sc
Ta
e
rg
ti
ng
p
Pe
ti
de
M
ed sc
Ta
e
rg
t in
g
Pe
pt
id
Abb. 4.20: Melanompatienten-mDC lassen sich durch DEC-205-Targeting effizient mit MHCKlasse-II-Antigen beladen. A) Stimulationskapazität von durch DEC-205-Targeting beladenen Melanompatienten-mDC. Aus dem Blut von Melanompatienten hergestellte mDC wurden mit dem Tumorantigen MAGE-A3 durch DEC-205-Targeting (Targeting) oder durch direkte Zugabe des MAGEA3/HLA-DP4-Peptides (Peptid) beladen. Als Negativkontrolle wurden Zellen mit dem anti-MCSPscFvMAGE-A3-KKL-Kontrollkonstrukt (entsprechende Kontrolle), dem NY-ESO-1/HLA-DP4-Kontrollpeptid
(entsprechende Kontrolle) oder mit demselben Volumen an Medium (Med) oder solvent control (sc) inkubiert. Diese verschieden behandelten DC wurden anschließend verwendet, um autologe MAGE+
A3/HLA-DP4-spezifische CD4 T-Zellen zu stimulieren. Nach einer 18-stündigen Kokultivierung wurde
die IL-2-, TNF- und IFNγ−Sekretion im Überstand der Kokulturen ermittelt. Die Mittelwerte +/- Standardfehler der Experimente, welche mit DC der Patienten 1, 2, 3 und 4 durchgeführt wurden, sind gezeigt. B) Stimulationskapazität der durch DEC-205-Targeting beladenen Melanompatienten-mDC nach
Kryokonservierung. Die verbliebenen DC von (A) wurden nach den unterschiedlichen Behandlungen
eingefroren. Nach dem Auftauen wurden diese DC in Stimulationen mit allogenen MAGE-A3/HLA+
DP4-spezifischen CD4 T-Zellen eingesetzt. Die in den Überstand abgegebenen Zytokine wurden wie
in (A) ermittelt. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardfehler der Versuche, welche mit DC der
Patienten 2, 3, 4 und 5 durchgeführt wurden. Die Signifikanzwerte wurden mit dem Mann-WhitneyTest berechnet. *, p < 0,05; **; p < 0,005; ***, p < 0,001.
4. Ergebnisse
55
Zusätzlich wurde eine signifikant erhöhte Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine
TNF und IFNγ im Überstand der Kokulturen nachgewiesen, in der durch DEC-205-Targeting
beladene DC verwendet wurden (Abb. 4.20A). Zum Vergleich wurden auch mDC mit dem
MAGE-A3/HLA-DP4-Peptid und dem NY-ESO-1/HLA-DP4-Kontrollpeptid (entsprechende
Kontrolle) beladen. Zwar führten auch die MAGE-A3/HLA-DP4-Peptid-beladen en DC zur
Stimulation der spezifischen T-Zellen, jedoch zu einem geringeren Maß als die DC,
welche durch DEC-205-Targeting mit dem MAGE-A3-Peptid beladen wurden (Abb. 4.20A).
Für einen möglichen späteren klinischen Einsatz ist es notwendig, dass DC nach der Antigenbeladung eingefroren werden können und nach dem Auftauen noch funktionsfähig sind. Um
zu überprüfen, ob durch DEC-205-Targeting beladene DC ihre Stimulationskapazität auch
nach Kryokonservierung beibehalten, wurden einige der DC aus dem vorherigen Experiment
nach der Behandlung eingefroren. Nach dem Auftauen wurden die DC verwendet um allogene MAGE-A3/HLA-DP4-spezifische CD4+ T-Zellen, welche wiederum durch TZR-RNAElektroporation hergestellt wurden, zu stimulieren. Wie in Abb. 4.20B dargestellt, behielten
die durch DEC-205-Targeting beladenen DC ihre Stimulationskapazität bei, jedoch war die
detektierbare IL-2- und IFNγ-Produktion um die Hälfte bis zu einem Drittel geringer als wenn
frische DC verwendet wurden. Wiederum führte das DEC-205-Targeting von DC zu einer höheren Stimulationskapazität als die direkte Peptidbeladung (Abb. 4.20B).
Es ist sehr wichtig, dass durch DEC-205-Targeting beladene DC die Proliferation spezifischer
T-Zellen induzieren können. Daher wurde in einem weiteren Experiment analysiert, ob Patienten-mDC, welche durch DEC-205-Targeting mit MAGE-A3-Peptid beladen wurden,
MAGE-A3/HLA-DP4-spezifische CD4+ T-Zellen zur Proliferation anregen können. Dazu
wurden T-Zellen 4 Stunden nach Elektroporation mit der MAGE-A3/HLA-DP4-TZR-kodierenden-RNA mit dem Fluoreszenzfarbstoff CFSE gefärbt. Diese wurden anschließend mit DC
kokultiviert, welche vorher mit der solvent control, dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKLKonstrukt, dem anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL-Kontrollkonstrukt (Negativkontrolle), dem
MAGE-A3/HLA-DP4-Peptid oder dem NY-ESO-1/HLA-DP4-Kontrollpeptid (Negativkontrolle) inkubiert wurden. Nach 3 Tagen wurde die Proliferation der spezifischen T-Zellen anhand der CFSE-Verdünnung durchflusszytometrisch ermittelt. Sowohl DC, welche durch
DEC-205-Targeting mit MAGE-A3-Peptid beladen wurden, als auch solche, die mit dem
MAGE-A3-Peptid inkubiert wurden, induzierten die Proliferation der antigenspezifischen TZellen (Abb. 4.21A). Diese antigenspezifische Proliferation war auch noch an Tag 5 messbar
(Daten nicht gezeigt). Die Inkubation der spezifischen T-Zellen, welche mit der solvent
control, dem Kontrollkonstrukt oder dem Kontrollpeptid inkubiert wurden, führten zu keiner
4. Ergebnisse
56
antigenspezifischen Proliferation (Abb. 4.21A). Zudem waren auch durch DEC-205Targeting beladene sowie MAGE-A3/HLA-DP4-peptidbeladene DC, welche nach der Behandlung kryokonserviert wurden, in der Lage, die Proliferation allogener, MAGE-A3/HLADP4-spezifischer CD4+ T-Zellen zu induzieren (Abb. 4.21B).
Proliferation [%]
A
B
50
*
40
*
*
50
*
*
*
40
30
30
20
20
10
0
10
0
g
tin
e
rg
Ta
sc
sc
id
pt
e
P
MAGE-A3 Beladung
sc
Ta
g
tin
e
rg
id
pt
e
P
Negativkontrolle
Abb. 4.21: Die Inkubation mit durch DEC-205-Targeting beladenen Melanompatienten-mDC in+
duzierte die Proliferation MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischer CD4 T-Zellen. Aus dem Blut von Melanompatienten hergestellte mDC wurden mit dem Tumorantigen MAGE-A3 durch DEC-205-Targeting
(Targeting) oder durch direkte Zugabe des MAGE-A3/HLA-DP4-Peptides (Peptid) beladen. Als Negativkontrolle wurden Zellen mit dem anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL-Kontrollkonstrukt (Negativkontrolle),
dem NY-ESO-1/HLA-DP4-Kontrollpeptid (Negativkontrolle) oder mit demselben Volumen an solvent
control (sc), inkubiert. Diese verschieden behandelten DC wurden direkt nach der Behandlung (A)
oder nach Kryokonservierung (B) mit autologen (A) oder allogenen (B) MAGE-A3/HLA-DP4-spezifi+
schen CD4 T-Zellen kokultiviert, welche vorher mit dem Fluoreszenzfarbstoff CFSE gefärbt wurden.
Nach 3 Tagen wurde der Prozentsatz an proliferierten T-Zellen durch Bestimmung der CFSE-Verdünnung durchflusszytometrisch ermittelt. Gezeigt sind die Mittelwerte +/- Standardfehler der Experimente,
welche mit DC der Patienten 1, 2, 3 und 4 (A) bzw. der Patienten 2, 3, 4 und 5 (B) durchgeführt wurden. Angegeben sind die Signifikanzwerte, welche mit dem Mann-Whitney-Test (Graphpad Prism) berechnet wurden. *, p < 0,05.
Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, dass das DEC-205-Targeting von DC, die aus
dem Blut von Melanompatienten generiert wurden, zur Präsentation des Tumorantigens
MAGE-A3 auf den DC führt. Des Weiteren wurde demonstriert, dass diese DC nach der Beladung ohne Verlust ihrer T-Zell-Stimulationskapazität kryokonserviert werden konnten. Daher stellt das DEC-205-Targeting eine Alternative zur direkten Peptidbeladung für die Herstellung von DC für die Immuntherapie dar.
4. Ergebnisse
57
4.2. Etablierung eines schnellen und robusten Protokolls zur Klonierung
und funktionellen Charakterisierung von T-Zell-Rezeptoren
T-Zell-Rezeptoren (TZR) sind sowohl bedeutend für die klinische Anwendung im Rahmen einer adaptiven T-Zell-Immuntherapie als auch für die präklinischen Forschung. Wie in Kapitel
4.1.2 beschrieben, wurden T-Zellen, welche mit dem MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen oder
MAGE-A3/HLA-A1-spezifischen TZR transfiziert wurden, zum Nachweis der Antigenpräsentation auf DC verwendet. Diese haben gegenüber T-Zell-Klonen, welche oftmals zum
„Scannen“ der Antigenpräsentation eingesetzt werden, den Vorteil, dass sie in einer konstanten Qualität hergestellt werden können und daher ein äußerst verlässliches Auslesesystem darstellen. Der Einsatz dieser spezifischen T-Zellen ermöglichte nicht nur den Nachweis der Antigenpräsentation, sondern eine Quantifizierung der Antigenpräsentationstärke. Dies ermöglichte den Vergleich der Effizienz verschiedener DC-Antigenbeladungsstrategien (siehe Kapitel 4.1.4.10). Um die Präsentation verschiedenster Tumorantigene in unterschiedlichen MHCMolekülen auf DC nachweisen zu können, ist ein großes TZR-Repertoire unabdingbar, da
TCR-transfizierte T-Zellen nur jeweils spezifisch einen bestimmten MHC-Peptid-Komplex
auf DC erkennen können. Jedoch war die Identifizierung und Klonierung der TZR-α- und -βKetten bisher sowohl zeitaufwendig als auch kostenintensiv, da für jede mögliche α- und βKette eine spezifische PCR-Reaktion durchgeführt werden musste (z.B. im Falle des MAGEA3/HLA-DP4-spezifischen TZR). Um diesen Prozess zu vereinfachen, wurde im Rahmen der
Arbeit zusammen mit zwei weiteren im Labor beschäftigten Doktoranden, Christian Hofmann
und Stefanie Hoyer, ein universell anwendbares PCR-Protokoll entwickelt. Des Weiteren
wurde ein NFAT-basiertes Jurkat-T-Zell-Testsystem etabliert, um neu klonierte TZR schnell
und zuverlässig funktionell charakterisieren zu können.
4.2.1. Die PCR-Strategie zur Klonierung unbekannter TZR
Zur Identifizierung und Klonierung unbekannter TZR wurde ein PCR-Protokoll entwickelt,
dass in Abbildung 4.22 am Beispiel der α-Kette dargestellt ist. Zur reversen Transkription
und anschließenden Amplifikation der cDNA wurde auf ein Protokoll von Harris et al.
226
zurückgegriffen, die eine verbesserte Synthese und Amplifikation von cDNA aus Tumorzellen beschreiben. Zur Klonierung eines TZR wird zunächst die komplette mRNA, welche aus
einem T-Zell-Klon isoliert wurde, in der „Erststrang-Synthesereaktion“ in cDNA umgeschrieben. Dazu wird ein 64T-Primer verwendet, welcher an den PolyA-Schwanz der mRNA bindet.
Nachdem die reverse Transkriptase das 5´ Ende der RNA erreicht hat, hängt dieses Enzym
4. Ergebnisse
58
überhängende, definierte Cytosine an das 3´ Ende der cDNA an. Anschließend kann das zugegebene „capswitch“ Oligonukleotid, welches mit 3 Guaninen beginnt, an die angehängten
Cytosine hybridisieren. Die Polymerase verwendet nun dieses Oligonukleotid als neue Matrize, um die cDNA-Synthese fortzusetzen. Die cDNA verfügt jetzt sowohl über ein definiertes
3´ als auch 5´ Ende (Abb. 4.22; Erststrang-Synthesereaktion). Daher kann in einer weiteren
PCR-Reaktion (komplette cDNA PCR), die komplette cDNA mit Hilfe des T7-capswitchPrimers, welcher sich an die Sequenz des „capswitch“ Oligonukleotids anlagert, sowie des
64-T-Primers, der an die Sequenz des revers transkribierten PolyA-Schwanzes bindet, amplifiziert werden (Abb. 4.22; Komplette cDNA PCR).
Erststrang-Synthesereaktion
5’NTR
Capswitch
ggg
PolyA
AAAAAAAAAA
ccc
64T-Primer
Vα
3’NTR
Cα
Komplette cDNA PCR
5’NTR
Vα
3’NTR
Cα
Capswitch ccc
PolyT
T7-Capswitch
64T-Primer
TZR-spezifische PCR
5’NTR
Vα
3’NTR
Cα
T7-Capswitch ccc
PolyT
5’-Primer
Cα 3 UTR-Primer
Sequenzierung
5’NTR
5’-Primer
Vα
Cα
ccc
Cα near var-Primer
Abb. 4.22: TZR-PCR-Strategie. Strategie zur Amplifikation der TCR-α- und -β-Ketten-Gene. (dargestellt ist die Strategie für die α-Kette). 5´NTR: 5´ nicht-translatierte Region, 3´NTR: 3’ nicht-translatierte
Region, Vα: variable Region, Cα: konstante Region, PolyA: PolyA-Schwanz. Detaillierte Beschreibung
siehe Text.
Mit Hilfe des Harris-Protokolls kann so die komplette cDNA eines T-Zell-Klons amplifiziert
werden. Um nun aus dieser die TZR-kodierenden DNA-Sequenzen zu amplifizieren, wurde
eine universell anwendbare PCR zur Amplifikation der α- und eine zur Amplifikation der βKette etabliert. Dabei erfolgt die Amplifikation der α-Kette mit dem 5`Primer und dem Cα
3`UTR-Primer, welcher in der konstanten Region der α-Kette bindet (Abb. 4.22; TZR-spezifische PCR). Die β-Kette hingegen wird mit dem 5`Primer und zwei 3`-bindenden Primern,
4. Ergebnisse
59
welche sich entweder an Sequenzen in der konstanten Region der β1-Kette (Cβ1 3`UTR-Primer) oder der β2-Kette (Cβ2 3`UTR-Primer) anlagern, amplifiziert. Zur Identifizierung des
Subtypes der variablen Domäne des TZR werden die PCR-Produkte anschließend mit Primern,
welche näher an der joining-Region der TZR-Ketten (Cα near var oder Cβ near var) binden,
sequenziert (Abb. 4.22; Sequenzierung). Die Information über den variablen Domänen-Subtyp ermöglicht dann die Klonierung der α- und β-Kette eines TZR.
4.2.2. Identifizierung eines HIVgag/HLA-A2-spezifischen und zweier MelanA/HLA-A2spezifischer TZR mit Hilfe der TZR-PCR-Strategie
Zur Etablierung des PCR-Protokolls wurden aus einem HIVgag/HLA-A2-spezifischen TZell-Klon (Durchführung der Klonierung Christian Hofmann) und zwei MelanA/HLA-A2spezifischen T-Zell-Klonen (MelanA/HLA-A2-spezifischer T-Zell-Klon JZ, Durchführung
Stefanie Hoyer und MelanA/HLA-A2-spezifischer T-Zell-Klon 11/33, Durchführung Katrin
Birkholz) die jeweiligen α- und β-Ketten der TZR kloniert. Dazu standen 330.000 Zellen des
HIVgag/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons, 5 x 106 Zellen des MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons JZ und 300.000 Zellen des MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons
11/33 zur Verfügung. Zunächst wurde die RNA aus den Zellen der verschiedenen T-Zell-Klone isoliert. Da für die Umschreibung in cDNA nur maximal 1 µg RNA eingesetzt werden sollte, wurde die RNA-Konzentration vor der Durchführung der ersten PCR-Reaktion mit einen
Photometer bestimmt. Zur reversen Transkription der RNA wurde in einem ersten Schritt der
64-T-Primer und das „capswitch“ Oligonukleotid zugefügt, um das Hybridiseren des 64-TPrimers mit der RNA zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt wurde die reverse Transkriptase zugegeben, um die cDNA zu synthetisieren, an die sich das capswitch-Oligonukleotid anlagern konnte. Die cDNA wurde in einer weiteren PCR-Reaktion mit Hilfe der oben beschriebenen Primer amplifiziert und zur Qualitätskontrolle in einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt (Abb. 4.23A). Die amplifizierte cDNA aller 3 analysierten T-Zell-Klone war auf dem
Agarosegel erkennbar, wobei cDNA-Moleküle unterschiedlichster Größe sichtbar wurden
(Abb. 4.23A). Dies zeigte, dass mit diesem Protokoll unterschiedlich lange mRNA revers
transkripiert und anschließend amplifiziert werden konnte (Abb. 4.23A). Jedoch variierte die
Menge der erhaltenen cDNA (Abb. 4.23A). Im nächsten Schritt wurden für jeden T-Zell-Klon
eine α- und eine β-Ketten-spezifische PCR-Reaktion durchgeführt, wobei die cDNA 1:10
oder 1:100 verdünnt als Matrize eingesetzt wurde. Die amplifizierte DNA kodierend für die
TZR α-Kette sowie jene kodierend für die TZR β-Kette wurde mit einer erwarteten Größe
von ca. 900 Bp (Abb. 4.23B) bzw. ca. 1000 Bp (Abb. 4.23C) in einem 1 %-igen Agarosegel
4. Ergebnisse
60
nachgewiesen. Die erhaltenen PCR-Produkte waren länger als die publizierten Angaben für
α- und β-Ketten, da in der PCR-Reaktion auch die 5´ nicht-translatierte Region mit amplifiziert wurde.
A
1
2
3
B
1
2
3
3,0 kBp
2,0 kBp
1,0 kBp
C
1
2
3
1,0 kBp
0,8 kBp
1,0 kBp
0,8 kBp
0,5 kBp
0,5 kBp
0,5 kBp
E
D
Abb. 4.23: Qualität und Quantität der amplifizierten cDNA. A) Die amplifizierten cDNAs der drei TZell-Klone wurden in einem 1 %-igen Agarosegel analysiert. Nach der Durchführung der TZR-spezifischen PCR-Reaktion wurden die Produkte für die α- (B) und β-Kette (C) überprüft. Dargestellt sind die
Ergebnisse, die mit 1/100 verdünnter cDNA als Matrize erhalten wurden. Spur 1: HIVgag/HLA-A2-spezifischer Klon, Spur 2: MelanA/HLA-A2-spezifischer Klon JZ, Spur 3: MelanA/HLA-A2-spezifischer
Klon 11/33. Bp: Basenpaare. Das PCR-Produkt der α-Ketten-spezifischen PCR des MelanA/HLA-A2spezifischen T-Zell-Klons JZ wurde vor der Sequenzierung aufgereinigt (D), wohingegen das Produkt
der α-Ketten-spezifischen PCR des MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons 11/33 (E) ohne vorherige Aufreinigung analysiert wurde.
Die PCR-Produkte wurden entweder direkt mit den Primern Cα near var oder Cβ near var sequenziert oder vorher durch Isolation aus dem Gel aufgereinigt. Beide Methoden führten zu
einer sicher lesbaren DNA-Sequenz, obwohl in der Sequenz des nicht aufgereinigten PCRProduktes Hintergrundsignale erkennbar waren (Abb. 4.23D und E).
Die Sequenzierungen ermöglichten die Bestimmung des Subtyps der variablen Domäne der
TZR-Ketten nach der Nomenklatur von Arden et al.
227
. Die identifizierten variablen Domä-
ne-Subtypen sind in Tabelle 4.3 aufgelistet.
Tabelle 4.3: Identifizierte TZR α und β variable Domäne-Subtypen nach der Nomenklatur von
227
Arden et al. .
T-Zell-Klon
Referenz
TZR Vα
α Subtyp
TZR Vβ
β Subtyp
HIV gag
208
AV2S3A2T
BV22S1A1N1
MelanA JZ 21638
Andersen, unveröffentlicht
AV2S1A2
BV14S1
MelanA 11/33
228
AV10S1A2
BV7S3A2T
4. Ergebnisse
61
Die Bestimmung der α und β variablen Domäne-Subtypen der TZR ermöglichte die Entwicklung spezifischer Primer, die über Restriktionsschnittstellen zur Klonierung verfügten, welche
zur Amplifikation der TZR-kodierenden cDNA aus der kompletten cDNA eingesetzt wurde.
Anschließend wurde die erhaltene cDNA in den RNA-Produktionsvektor pGEM4Z kloniert,
um die in-vitro-Transkription der TZR-kodierenden RNA zu ermöglichen.
4.2.3. Das Jurkat-T-Zell-Testsystem
Zur funktionellen Charakterisierung klonierter TZR werden diese normalerweise in ex-vivoisolierte T-Zellen transferiert und deren Funktion mit Hilfe von Zytokinproduktions-, Proliferations- und Zytotoxizitätsexperimenten überprüft. Da diese experimentellen Ansätze sowohl
zeit- als auch kostenintensiv sind, sollte im Rahmen der Arbeit ein neues Testsystem etabliert
werden, mit dessen Hilfe man die Funktionalität von TZR schnell, zuverlässig und kostengünstig überprüfen kann. Hierzu wurde ein Testsystem mit Jurkat-T-Zellen entwickelt (Vorarbeiten Diplomarbeit Birgit Schultz), welches auf folgendem Prinzip basiert: Die antigenspezifische Aktivierung von T-Zellen führt zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT
(nuclear factor of activated T cells), was wiederum die Expression von Zytokinen sowie die
Aktivierung weiterer Proteine nach sich zieht
229
. Im etablierten Testsystem wurde diese
NFAT-Aktivierung ausgenützt, um die Funktionalität von TZR zu überprüfen. Anstatt exvivo-isolierter T-Zellen wurde die T-Zelllinie Jurkat verwendet, welche leicht in Zellkultur zu
halten ist
230
und durch RNA-Elektroporation mit dem zu untersuchenden TZR transfiziert
werden kann. Da einige TZR das CD8-Molekül als Korezeptor benötigen, wurde auch ein
CD8-transgener Subklon der Jurkat T-Zellline verwendet. Zusätzlich zur Elektroporation der
TZR-kodierenden-RNA wurde ein NFAT-Transluc-Plasmid, welches das Leuchtkäfer-Luziferasegen unter Kontrolle eines NFAT-induzierbaren Promotors enthält, in die Jurkat-T-Zellen eingebracht. Nach antigenspezifischer Stimulation der Jurkat-T-Zellen kommt es zur Aktivierung von NFAT, welcher dann an das NFAT-enhancer Element bindet und so die Transkription des Luziferasegens auf dem NFAT-Transluc-Plasmid induziert. Die Menge an translatierter Luziferase wurde anschließend luminometrisch quantifiziert und diente als Indikator
für eine erfolgte Stimulation der Jurkat-T-Zellen und damit auch für die Funktionalität des
eingebrachten TZR. Da mit diesem Test auch die Stärke der Jurkat-T-Zell-Stimulation ermittelt werden kann, sollte mit diesem Test auch eine Aussage über die Qualität des eingebrachten TZR möglich sein. Die Aussagefähigkeit des neuen Testsystems wurde im Folgenden anhand der drei klonierten TZR überprüft.
4. Ergebnisse
62
APZ
MHC
Peptid
TZR
Jurkat
T-Zelle
Aktivierung
NFAT
Abb. 4.24: Prinzip des Jurkat-T-Zell-Testsystems. Beschreibung siehe Text. APZ: antigenpräsentierende Zelle, NFAT-EE: NFAT-enhancer Element, roter gebogener Pfeil: Expression des Luziferasegens.
4.2.4. Funktionelle Charakterisierung der neu klonierten TZR mit Hilfe des Jurkat-TZell-Testsystems
Die neu klonierten TZR wurden mit dem Jurkat-T-Zell-Testsystem funktionell charakterisiert.
Die Elektroporationsbedingungen für die Jurkat-T-Zellen waren in der Diplomarbeit von
Birgit Schultz etabliert worden. Durch Elektroporation der TZR-α- und -β-Ketten-kodierenden RNA wurden die klonierten TZR des HIVgag/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons, des
MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons 11/33 und des MelanA/HLA-A2-spezifischen TZell-Klons JZ in CD4+ und CD8+ Jurkat-T-Zellen transferiert. Gleichzeitig wurde das Transluc-Plasmid in die Jurkat-T-Zellen eingebracht. Vier Stunden nach Elektroporation wurden
die Jurkat-T-Zellen mit T2-A1-Zellen, welche vorher mit den entsprechenden Peptiden oder
mit dem HIVpol-Peptid als Kontrolle beladen wurden, im Verhältnis 1:1 stimuliert. Als Positivkontrolle dienten Jurkat-T-Zellen, die mit Phorbol-Myristat-Azetat (PMA) und Ionomycin
behandelt wurden, wodurch NFAT TZR-unabhängig aktiviert wurde. Nach 16-stündiger Ko-
4. Ergebnisse
63
inkubation wurden die Zellen geerntet und lysiert. Nach Zugabe des Substrates (Luziferin)
wurde die Biolumineszenz gemessen. Zur Ermittlung der spezifischen Luziferaseaktivität
wurde die Luziferaseproduktion, die mit peptidbeladenen T2-A1-Zellen als Stimulatorzellen
ermittelt wurde, in Relation zur Luziferaseproduktion gesetzt, welche mit unbeladenen T2A1-Zellen als Stimulatorzellen erhalten wurde.
CD4+
CD8+
spezifische Luziferaseaktivität
HIV gag TZR
MelanA JZ TZR
MelanA 11/33 TZR
80
80
80
60
60
60
40
40
40
20
20
20
0
0
0
25
25
25
20
20
20
15
15
15
10
10
10
5
5
5
0
0
KontrollPeptid
HIV gag
Peptid
Kontrollpeptid
MelanA
wt
Peptid
MelanA
ana
Peptid
0
Kontrollpeptid
MelanA
wt
Peptid
MelanA
ana
Peptid
Zielzellen beladen mit
Abb. 4.25: Funktionelle Charakterisierung der neu klonierten TZR mit dem Jurkat-T-Zell-Test+
+
system. CD4 und CD8 Jurkat-T-Zellen wurden mit RNA, welche die klonierten TZR des
HIVgag/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons, des MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons JZ oder des
MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons 11/33 kodiert, und dem Transluc-Vektor elektroporiert. Vier
Stunden nach Elektroporation wurden die Jurkat-T-Zellen mit T2-A1-Zellen, welche mit dem entsprechenden Peptid oder dem Kontrollpeptid beladen wurden, kultiviert. Die Aktivierung der Jurkat-TZellen wurde nach 16-stündiger Inkubation durch Messung der Luziferaseaktivität bestimmt. Dargestellt ist die spezifische Luziferaseaktivität (gemessene Luziferaseaktivität, die mit peptidbeladenen
T2-A1-Zellen erhalten wurde / gemessene Luziferaseaktivität, welche mit unbeladenen T2-A1-Zellen
ermittelt wurde). wt: wildtyp; ana: analog. Gezeigt ist der Mittelwert von drei unabhängig voneinander
durchgeführten Experimenten. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
Wie in Abbildung 4.25 dargestellt, waren alle drei neu klonierten TZR im Jurkat-T-Zell-Testsystem funktionell. Die Aktivierung der Jurkat-T-Zellen war antigenspezifisch, da diese nur
durch T2-A1-Zellen stimuliert wurden, welche mit dem entsprechenden Peptid beladen wurden. Der HIVgag-spezifische TZR ist funktionell unabhängig vom CD8-Molekül, da Luziferaseaktivität sowohl bei Stimulation von CD4+ als auch CD8+ Jurkat-T-Zellen, welche mit dem
HIVgag/HLA-A2-spezifischen TZR ausgestattet wurden, messbar war (Abb. 4.25). Im Gegensatz dazu profitierten die beiden MelanA-spezifischen TZR von der Expression des CD8Korezeptors (Abb. 4.25). Die antigenspezifische Aktivierung der CD4+ und CD8+ Jurkat-TZellen, welche mit MelanA/HLA-A2-TZR-kodierender RNA elektroporiert wurden, wurde
durch die Verwendung des MelanA-Analogpeptides, welches eine höhere Affinität zu HLAA2-Molekülen aufweist, verstärkt (Abb. 4.25). Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass der
4. Ergebnisse
64
HIVgag-spezifische TZR über die beste Funktionalität verfügt, gefolgt von dem MelanA-spezifischen TZR des MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons JZ und dem MelanA-spezifischen TZR des MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons 11/33.
Um sicherzustellen, dass das Jurkat-T-Zell-Testsystem verlässliche Ergebnisse über die TZRFunktionalität liefert und diese mit den Ergebnissen von ex-vivo-generierten T-Zellen korrelieren, wurde die Funktionalität der TZR auch in Zytokinsekretions- und Proliferationsexperimenten überprüft. Dazu wurden die TZR durch RNA-Elektroporation in ex-vivo-generierte
CD8+ T-Zellen eingebracht. Vier Stunden nach Elektroporation wurden die Zellen mit peptidbeladenen, T2-A1-Zellen, welche zur Unterdrückung ihrer spontanen Zytokinproduktion UV
bestrahlt wurden, über Nacht im Verhältnis 1:1 kultiviert und die sekretierten Zytokine im
Überstand bestimmt.
MelanA JZ TZR
MelanA 11/33 TZR
16
4 16
4 16
4
12
3 12
3 12
3
8
2
8
2
8
2
4
1
4
1
4
1
0
0
0
0
0
KontrollPeptid
HIV gag
Peptid
KontrollPeptid
MelanA
wt
Peptid
MelanA
ana
Peptid
KontrollPeptid
MelanA
wt
Peptid
MelanA
ana
Peptid
TNF
IL-2 [ng/ml]
TNF/ IFNγ [ng/ml]
ZytokinProduktion
HIV gag TZR
IFNγ
IL-2
0
Zielzellen beladen mit
+
Abb. 4.26: Zytokinproduktion der TZR-transfizierten CD8 T-Zellen nach antigenspezifischer
+
Stimulation. CD8 T-Zellen wurden mit TZR-RNA elektroporiert und anschließend mit T2-A1-Zellen
inkubiert, welche mit dem HIVgag-, MelanA-Wildtyp-, oder MelanA-Analogpeptid beladen wurden (wie
angegeben). Nach Stimulation über Nacht wurden die Zytokine im Überstand bestimmt. wt: wildtyp;
ana: analog. Dargestellt ist der Mittelwert von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
CD8+ T-Zellen, welche mit einem der drei TZR ausgestattet wurden, sekretierten nach antigenspezifischer Stimulation IFNγ−, TNF- und IL-2 (Abb. 4.26). Dabei korrelierte die gemessene Zytokinmenge mit der Höhe der zuvor ermittelten spezifischen Luziferaseaktivität (Vergleich Abb. 4.25 und Abb. 4.26), da CD8+ T-Zellen, welche mit der HIVgag/HLA-A2-TZRkodierenden RNA elektroporiert wurden, die größte Zytokinmenge sekretierten, und T-Zellen,
welche mit dem aus dem MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon JZ isolierten TZR ausgestattet wurden, die zweithöchste Zytokinproduktion aufwiesen, gefolgt von T-Zellen, die
den aus dem MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon 11/33 gewonnen TZR exprimierten
(Abb. 4.26). Wie auch schon im Jurkat-T-Zell-Testsystem induzierten MelanA-Analogpeptidbeladene T2-A1-Zellen eine höhere Aktivierung der T-Zellen als MelanA-Wildtyppeptid-beladene T2-A1-Zellen (Abb. 4.26). In Korrelation mit den Ergebnissen des Jurkat-T-Zell-Test-
4. Ergebnisse
65
systems wurden CD8+ T-Zellen, welche mit dem TZR des MelanA/HLA-A2-spezifischen TZell-Klons 11/33 ausgestattet wurden, von Wildtyppeptid-beladenen T2-A1-Zellen kaum stimuliert (Abb. 4.26).
Als zusätzliches Auslesesystem zur funktionellen Charakterisierung der klonierten TZR wurde ein Proliferationsexperiment durchgeführt. Dazu wurden die drei TZR in CD8+ T-Zellen
transferiert. Vier Stunden nach Elektroporation wurden die Zellen mit dem fluoreszierenden
Farbstoff CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) markiert. Die CFSE-Markierung ermöglichte es, die Proliferation von Zellen durchflusszytometrisch zu bestimmen, da
sich bei jeder Zellteilung die Menge an Farbstoff pro Zelle halbiert. Die CFSE-markierten TZellen wurden anschließend mit T2-A1-Zellen, welche mit den entsprechenden Peptiden oder
dem Kontrollpeptid beladen wurden, im Verhältnis 1:1 kultiviert. Nach 3 Tagen wurden die
Zellen geerntet und mit einem anti-CD8-Antikörper angefärbt, um die CD8+ T-Zellen von den
T2-A1-Zellen unterscheiden zu können. Die Proliferationrate der T-Zellen wurde dann durchflusszytometrisch ermittelt.
Zellzahl
HIV gag TZR
MelanA JZ TZR
MelanA 11/33 TZR
150
150
150
120
120
120
90
90
90
60
60
60
30
30
30
0
0
100
101
102
103
104
0
100
HIV gag Peptid
101
102
104
103
100
Zellzahl
MelanA wt Peptid
102
103
104
MelanA wt Peptid
150
150
120
120
90
90
60
60
30
30
0
100
101
0
101
102
103
104
MelanA ana Peptid
100 101
102
103
104
MelanA ana Peptid
Zielzellen beladen mit
+
Abb. 4.27: Proliferation der TZR-transfizierten CD8 T-Zellen nach antigenspezifischer Stimula+
tion. CD8 T-Zellen wurden mit den verschiedenen TZR-RNA elektroporiert und vier Stunden nach
der Elektroporation mit CFSE markiert. Anschließend wurden die T-Zellen mit T2-A1-Zellen, welche
mit den entsprechenden Peptiden (schwarze Histogramme) oder dem Kontrollpeptid (graue Histogramme) beladen wurden, kultiviert. Nach drei Tagen wurde die Proliferation der T-Zellen durch die
Bestimmung der CFSE-Verdünnung am FACS ermittelt. wt: wildtyp; ana: analog. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment stellvertretend für drei unabhängig voneinander durchgeführte Versuche.
Wie in Abbildung 4.27 dargestellt, proliferierten die TZR-transfizierten CD8+ T Zellen antigenspezifisch. Die Proliferation der Zellen konnte auch noch am Tag 6 nachgewiesen werden
(Daten nicht gezeigt). Erneut war die Funktionalität der CD8+ T-Zellen, welche mit dem
HIVgag-spezifischen TZR transfiziert worden waren, höher als die der T-Zellen, welche mit
den beiden MelanA-spezifischen TZR ausgestattet worden waren (Abb. 4.27). In Überein-
4. Ergebnisse
66
stimmung mit den Ergebnissen des Jurkat-T-Zell-Testsystems und des Zytokinproduktionsexperimentes führte die Stimulation mit T2-A1-Zellen, die mit MelanA-Analogpeptid beladenen
waren, zu einer höheren Proliferationsrate als die Stimulation mit Zellen, die das MelanAWildtyppeptid trugen (Abb. 4.27). Die Proliferation CD8+ T-Zellen, welche mit dem TZR des
MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons 11/33 ausgestattet wurden, war nach Stimulation
mit MelanA-Wildtyppeptid-beladenen T2-A1-Zellen kaum messbar (Abb. 4.27). Zusammenfassend kann man sagen, dass die beiden funktionellen Experimente, welche mit ex-vivo-generierten CD8+ T-Zellen durchgeführt wurden, die Ergebnisse des Jurkat-T-Zell-Testsystems
bestätigten. Dies zeigte, dass das neu etablierte Jurkat-T-Zell-Testsystem ein Verfahren darstellt, welches nicht nur kostengünstig und schnell durchführbar ist, sondern auch verlässliche
Angaben über die Funktionalität von TZR liefert.
4.2.5. Vergleich der Avidität der MelanA-spezifischen TZR-transfizierten T-Zellen
Wie in Abbildung 4.26 und 4.27 gezeigt, unterschieden sich die T-Zellen, welche mit einem
der neu klonierten TZR transfiziert wurden, in ihrer Effizienz nach antigenspezifischer Stimulation Zytokine zu produzieren und zu proliferieren. Dies korrelierte mit den Ergebnissen, die
mit Hilfe des Jurkat-T-Zell-Testsystems erhalten wurden (Abb. 4.25). Um zu bestimmen, ob
die unterschiedliche Funktionalität durch unterschiedliche T-Zell-Avidität erklärt werden
kann, wurde in einem weiteren Versuch die ED50 ermittelt, welche als die Peptidkonzentration
definiert ist, bei der die Hälfte der maximalen spezifischen Zytokinproduktion beobachtet
wird. Je niedriger der ermittelte ED50-Wert ist, umso höher ist die funktionelle Avidität der
verwendeten T-Zellen. In der Arbeit wurden zwei unterschiedliche MelanA-spezifische TZR
kloniert, welche dasselbe T-Zell-Epitop mit unterschiedlicher Effizienz erkennen. Daher kann
mit diesen MelanA-spezifischen T-Zellen untersucht werden, ob der funktionelle Unterschied
sich auf eine unterschiedliche funktionelle Avidität der T-Zellen zurückführen lässt. Zur Bestimmung der Avidität wurden CD8+ T-Zellen, welche entweder mit dem aus dem
MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon JZ oder mit dem aus dem MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon 11/33 isolierten TZR ausgestattet wurden, mit T2-A1-Zellen stimuliert,
die mit unterschiedlichen Konzentrationen an MelanA-Wildtyp- oder MelanA-Analogpeptid
beladen wurden. Anschließend wurde die IL-2-Sekretion im Überstand bestimmt (Abb. 4.28).
Erneut produzierten die T-Zellen, welche mit dem aus dem MelanA/HLA-A2-spezifischen TZell-Klon 11/33 gewonnenen TZR transfiziert wurden, geringere Mengen an IL-2 (Abb.
4.28). Im Vergleich zu der Stimulation mit dem Analogpeptid war eine etwa 100-fach höhere
Wildtyppeptid-Konzentration nötig, um eine gleich hohe Zytokinproduktion induzieren zu
4. Ergebnisse
67
können (Abb. 4.28). Die Avidität konnte nur Anhand der Stimulation mit MelanA-Analogpeptid-beladenen T2-A1-Zellen ermittelt werden, da die Sättigung bei der Stimulation mit
MelanA-Wildtyppeptid-beladenen T2-A1-Zellen nicht erreicht wurde (Abb. 4.28). Die funktionelle Avidität der T-Zellen, welche mit dem TZR des MelanA/HLA-A2-spezifischen TZell-Klons JZ transfiziert wurden, (ED50 = 2,7 +/- 0,4 ng/ml, Durchschnitt aus drei Versuchen
+/- Standardabweichung) war signifikant erhöht im Vergleich zur Avidität der T-Zellen, welche mit dem TZR des MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons 11/33 ausgestattet wurden
(ED50 = 15,8 +/- 2,4 ng/ml).
MelanA-Wildtyppeptid
IL-2 [ng/ml]
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
106
105
104
103
102
101
Peptidkonzentration [pg/ml]
TZR kloniert aus T-Zell-Klon JZ
TZR kloniert aus T-Zell-Klon 11/33
MelanA-Analogpeptid
7
100
0
0
+ MelanA-Pepitd
106
105
104
103
102
101
Peptidkonzentration [pg/ml]
TZR kloniert aus T-Zell-Klon JZ
TZR kloniert aus T-Zell-Klon 11/33
100
0
+ Kontrollpeptid
Abb. 4.28: T-Zellen, welche mit unterschiedlichen MelanA-spezifischen TZR transfiziert wurden,
+
wiesen eine unterschiedliche funktionelle Avidität auf. CD8 T-Zellen wurden mit dem TZR, isoliert aus dem MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon JZ oder dem TZR isoliert aus dem
MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons 11/33, transfiziert. Anschließend wurde eine Stimulation mit
T2-A1-Zellen, welche mit unterschiedlichen Konzentrationen an MelanA-Wildtyppeptid oder MelanAAnalogpeptid (ausgefüllte Symbole) oder mit einem Kontrollpeptid (offene Symbole) beladen wurden,
durchgeführt. Nach einer Kokultivierung über Nacht wurde im Überstand der Zellen die IL-2-Zytokinproduktion gemessen. Um die funktionelle Avidität zu ermitteln, wurde die Peptidkonzentration bestimmt, welche mit der halb maximalen Zytokinproduktion korrelierte (ED50, gestrichelte Linien). Der
Durchschnitt von drei unabhängigen Versuchen +/- Standardabweichung ist dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigten, dass die höhere Funktionalität der CD8+ T-Zellen, welche mit dem
aus dem MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon JZ isolierten TZR ausgestattet wurden
gegenüber T-Zellen, welche den TZR enthielten, der aus dem MelanA/HLA-A2-spezifischen
T-Zell-Klon 11/33 isoliert wurde, sich wirklich auf eine höhere funktionelle Avidität der TZellen zurückführen lässt. Diese Daten spiegelten wiederum das Ergebnis aus dem Jurkat-TZell-Testsystem wieder.
4. Ergebnisse
68
4.2.6. Spezifische und aviditätsabhängige Erkennung von MelanA-positiven
Tumorzellen durch MelanA-spezifische T-Zellen
Da die Avidität TZR-transfizierter T-Zellen die Erkennung von Tumorzellen beeinflussen
kann, wurde in einem weiteren Experiment analysiert, ob T-Zellen welche mit den zwei verschiedenen MelanA-spezifischen TZR ausgestattet wurden, MelanA-positive Tumorzellen unterschiedlich gut erkennen können. Dazu wurden T-Zellen, welche mit dem TZR, isoliert aus
dem MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon JZ, oder dem TZR, gewonnen aus dem
MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon 11/33, mit Zellen der MelanA+/HLA-A2+ Tumorzelllinie Mel526 kultiviert und die induzierte Zytokinproduktion der T-Zellen bestimmt. Als
Negativkontrolle diente die MelanA-positive, aber HLA-A2-negative Tumorzelllinie Colo829.
Die Versuche ergaben, dass tatsächlich CD8+ T-Zellen, welche mit dem aus dem
MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons JZ gewonnenen TZR transfiziert wurden, über
zehn Mal mehr IL-2 produzierten als T-Zellen, welche mit dem aus dem MelanA/HLA-A2spezifischen T-Zell-Klon 11/33 isolierten TZR ausgestattet wurden, wenn sie mit der Mel526Zellen kokultiviert wurden (Abb. 4.29). Nur eine schwache Zytokinproduktion war messbar,
wenn Colo829-Zellen zur Stimulation verwendet oder ohne RNA-elektroporierte T-Zellen
eingesetzt wurden (Abb. 4.29).
IL-2 [pg/ml]
300
Keine RNA
250
MelanA JZ-TZR-RNA
200
MelanA 11/33-TZR-RNA
150
100
50
0
Colo829
Mel526
Abb. 4.29: MelanA TZR-transfizierte T-Zellen erkannten je nach ihrer funktionellen Avidität
+
+
MelanA Tumorzellen unterschiedlich gut. CD8 T-Zellen wurden mit RNA kodierend für TZR, welche entweder aus dem MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon JZ oder dem MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon 11/33 isoliert wurden, oder ohne RNA elektroporiert. Nach Stimulation mit Zellen
der MelanA-positiven, und HLA-A2-positiven Tumorzelllinie Mel526 oder mit Zellen der MelanA-positiven, HLA-A2-negativen Tumorzelllinie Colo829 wurde die IL-2-Produktion gemessen. Dargestellt ist
ein repräsentatives Experiment aus 3 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass tatsächlich TZR-transfizierte CD8+ T-Zellen, welche eine hohe
funktionelle Avidität aufwiesen, besser durch Tumorzellen stimuliert werden konnten, als
TZR-transfizierte CD8+ T-Zellen mit einer geringeren funktionellen Avidität. Bereits im Jurkat-T-Zell-Testsystem induzierten die T-Zellen welche mit dem aus dem MelanA/HLA-A2spezifischen T-Zell-Klon 11/33 gewonnenen TZR transfiziert wurden, eine geringere spezifi-
4. Ergebnisse
69
sche Luziferaseaktivität als T-Zellen, welche mit dem TZR, gewonnen aus dem
MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon JZ, transfiziert wurden. Demnach geben die Ergebnisse des Jurkat-T-Zell-Testsystems sogar Aufschluss darüber, wie effizient Tumorzellen,
die das Antigen in physiologischer Dichte präsentieren, von TZR-transfizierten T-Zellen erkannt werden können.
In dieser Arbeit wurde eine TZR-PCR-Strategie etabliert, mit deren Hilfe drei unbekannte
TZR sowohl kostengünstig als auch schnell kloniert wurden. Dabei waren alle TZR, welche
mit dieser Methode kloniert wurden, funktionell. Des Weiteren wurde zur schnellen und kostengünstigen funktionelle Charakterisierung von TZR erfolgreich ein Jurkat-T-Zell-Testsystem entwickelt, dass verlässliche Ergebnisse über die TZR-Funktionalität lieferte, die mit den
Ergebnissen aus Experimenten mit ex-vivo-generierten T-Zellen korrelierten. Daher stellt dieses Testsystem eine Alternative zu den kosten- sowie zeitintensiven Versuchen mit ex-vivogenerierten T-Zellen dar.
4. Ergebnisse
70
4.3 Herstellung und funktionelle Charakterisierung MHC-unabhängiger
ErbB2- und CEA-spezifischer T-Zellen
scFvs ermöglichen die Herstellung von MHC-unabhängigen tumorspezifischen T-Zellen (siehe Kapitel 2.3.2). Dazu wurden chimäre TZR (cTZR) entwickelt, die aus einem gegen ein Tumorantigen gerichteten scFv und einer oder mehreren T-Zell-Signaldomänen bestehen. Bisher
wurden cTZR durch retrovirale Transduktion in T-Zellen eingebracht, was jedoch zu einer
langlebigen Autoimmunität und zu irreversiblen genetischen Veränderungen in der T-Zelle
führen kann. Da der Transfer von cTCR in T-Zellen durch RNA-Elektroporation nur zur transeinten Expression des cTCR führt, kann es zu keinen irreversiblen Schäden in der T-Zelle
kommen und das Risiko einer langlebigen Autoimmunität wird deutlich reduziert. Daher sollte im Rahmen der Arbeit cTZR durch RNA-Elektroporation in T-Zellen eingeführt und deren
Funktionalität mit der von retroviral transduzierten T-Zellen verglichen werden.
Zur Bearbeitung dieses Themas wurde ein ErbB2-spezifischer cTZR von Prof. Kershaw
und ein CEA-spezifischer cTZR von Prof. Abken
231
113
zur Verfügung gestellt. Beide cTZR la-
gen zunächst in Vektoren zur retroviralen Transduktion vor und wurden in der Arbeitsgruppe
in das RNA-Produktionsplasmid pGEM4Z umkloniert, um durch in-vitro-Transkription
cTZR-kodierende RNA herstellen zu können. In Abbildung 4.30 sind der ErbB2-spezifische
cTZR (Abb. 4.30A) und der CEA-spezifische cTZR (Abb. 4.30B) schematisch dargestellt.
ErbB2 scFv + myc-Tag
A
ErbB2-CD28-ζ
CD8α
α-Teil
TM/ID CD28
ID CD3ζ
ζ
B
CEA scFv
Fc-Teil
TM/ID CD28
ID CD3ζ
ζ
BW431/26scFv-Fc-CD28-ζ
Abb. 4.30: Schematische Darstellung des ErbB2- und des CEA-cTZR. Dargestellt sind der ErbB2spezifische cTZR (A; ErbB2-CD28-ζ) und der CEA-spezifische cTZR (B; BW431/26scFv-Fc-CD28-ζ).
Fc-Teil: IgG1-CH2CH3-Domäne, TM: Transmembrandomäne, ID: intrazelluläre Domäne, CD3ζ:
CD3ζ-Kette, CD8α-Teil: Hinge-Region des humanen CD8-Moleküls.
Beide cTZR bestanden aus den entsprechenden scFv, die entweder über einen CD8α-Anteil
oder über einen IgG1-Fc-Teil (CH2CH3) an die Signaldomäne des cTZR fusioniert wurden.
Die Signaldomänen beider cTZR setzten sich aus der Transmembran- und intrazellulären Domäne des CD28-Moleküls und aus der intrazellulären Domäne der CD3ζ-Kette zusammen.
Eine spätere Detektion der cTZR ermöglichte ein myc-Tag im C-terminalen Ende des ErbB2spezifischen cTZR (Abb. 4.30A) oder der IgG1-Fc-Teil im CEA-spezifischen cTZR (Abb.
4.30B).
4. Ergebnisse
71
4.3.1. Transiente Expression des ErbB2- und des CEA-spezifischen cTZR
Um zu überprüfen, ob T-Zellen durch RNA-Elektroporation mit einem cTZR ausgestattet
werden können, wurden CD4+ und CD8+ T-Zellen mit ErbB2- oder CEA-cTZR-kodierender
RNA elektroporiert. Als Negativkontrolle dienten T-Zellen, welche ohne RNA elektroporiert
wurden. Vier Stunden nach Elektroporation wurde die Expression der cTZR mit einem gegen
den myc-Tag gerichteten oder einem gegen den Fc-Teil gerichteten Antikörper durchflusszytometrisch bestimmt.
A
CD4+ T-Zellen
92%
CD8+ T-Zellen
Elektroporation ohne RNA
Elektroporation mit cTZR RNA
95%
B
Zellzahl
89%
82%
M1
Fluoreszenzintensität
+
+
Abb. 4.31: ErbB2- und CEA-cTZR-Expression auf CD4 und CD8 T-Zellen nach RNA-Elektropo+
+
ration. CD4 und CD8 T-Zellen wurden mit ErbB2- (A) oder CEA- (B) cTZR-kodierender RNA elektroporiert. Vier Stunden nach der Elektroporation wurde der ErbB2-cTZR mit einem anti-myc-Tag Antikörper und der CEA-cTZR mit einem anti-Fc Antikörper durchflusszytometrisch nachgewiesen (schwarze
Histogramme). Als Negativkontrolle dienten T-Zellen, welche ohne RNA elektroporiert wurden (graue
Histogramme). Dargestellt ist ein repräsentatives aus mindestens 3 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
Wie in Abbildung 4.31 erkennbar, konnten beide cTZR nach RNA-Elektroporation auf CD4+
und CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden. Dabei exprimierten 83,0 ± 6,4 % der CD4+ T-Zellen und 89,7 ± 1,9 % der CD8+ T-Zellen den ErbB2-spezifischen cTZR, sowie 82,1 ± 8,3 %
der CD4+ T-Zellen und 81,4 ± 6,4 % der CD8+ T-Zellen den CEA-spezifischen cTZR (Durchschnitt +/- Standardabweichung aus 3 Versuchen; Abb. 4.31).
Um zu beweisen, dass die RNA-Elektroporation nur eine transiente Expression der cTZR hervorruft, wurde die Expressionskinetik der cTZR bestimmt. Dazu wurden CD4+ und CD8+ TZellen mit ErbB2- oder CEA-cTZR-kodierenden RNA elektroporiert und die Expression der
cTZR nach 4, 24, 48, 72, 144 und 216 Stunden bestimmt. Dabei wurde die stärkste Expression des ErbB2-spezifischen und des CEA-spezifischen cTZR nach 4 und 24 Stunden gemessen (Abb. 4.32A und B). Anschließend ging die Expression der cTZR kontinuierlich zurück
und war an Tag 9 nach Elektroporation durchflusszytometrisch auf der Zelloberfläche nicht
4. Ergebnisse
72
mehr nachweisbar (Abb. 4.32A und B). Die RNA-Elektroporation führte somit effizient zu
cTZR-exprimierenden CD4+ und CD8+ T-Zellen. Dabei war die Expression der cTZR transient.
B
A
300
60
spezifische MFI
spezifische MFI
70
50
40
30
20
10
0
4
24
48
72
144
Zeit nach Elektroporation [h]
216
CD4+ T-Zellen
250
CD8+ T-Zellen
200
150
100
50
0
4
24
48
72
144
216
Zeit nach Elektroporation [h]
+
+
Abb. 4.32: ErbB2- und CEA-cTZR-Expressionskinetik auf CD4 und CD8 T-Zellen nach RNA+
+
Elektroporation. CD4 (schwarze Rauten) und CD8 (weiße Kreise) T-Zellen wurden mit ErbB2- (A)
oder CEA- (B) cTZR-kodierender RNA elektroporiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Expression des ErbB2-cTZR (A) mit einem anti-myc-Tag Antikörper und die des CEA-cTZR (B) mit einem anti-Fc Antikörper durchflusszytometrisch bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte der spezifischen MFI (MFI cTZR-RNA elektroporierte T-Zellen - MFI ohne RNA-elektroporierte T-Zellen) +/Standardfehler von 3 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
4.3.2. Antigenspezifische Zytokinsekretion der ErbB2- und CEA-spezifischen T-Zellen
Um zu überprüfen, ob T-Zellen nach der Elektroporation mit cTZR-kodierender RNA das entsprechende Antigen erkennen, wurden die RNA-transfizierten CD4+ und CD8+ T-Zellen mit
antigenexprimierenden und antigennegativen Tumorzellen kokultiviert. Dazu wurden im Vorfeld verschiedene Tumorzelllinien auf ihre ErbB2- und CEA-Expression durchflusszytometrisch untersucht. Zellen der Tumorzelllinie SK-OV-3 exprimierten ErbB2, waren aber
CEA-negativ (Abb. 4.33). MDAMB 468-Zellen hingegen waren ErbB2-negativ und KATO
III-Zellen wiesen CEA auf ihrer Oberfläche auf (Abb. 4.33). Somit standen sowohl ErbB2und CEA-positive Zielzellen, als auch antigennegative Zellen für die folgenden Versuche zur
Verfügung.
Zunächst wurde die Funktionalität der cTZR-transfizierten T-Zellen in Zytokinsekretionsexperimenten überprüft. Dazu wurden Zellen der ErbB2-positiven Zelllinie SK-OV-3, sowie
Zellen der ErbB2-negativen Zelllinie MDAMB 468 zur Stimulation ErbB2-cTZR-transfizierter T-Zellen verwendet. Um zu überprüfen, ob die ErbB2-cTZR-transfizierten T-Zellen antigenspezifisch Tumorzellen erkennen können, wurde in einigen Ansätzen auch lösliches
ErbB2-Protein zugegeben, um kompetitiv die Bindung der ErbB2-spezifischen T-Zellen an
ErbB2 auf der Tumorzelle zu hemmen.
4. Ergebnisse
73
SK-OV-3
MDAMB 468
Isotyp
ErbB2-Antikörper
KATO III
SK-OV-3
Zellzahl
Isotyp
CEA-Antikörper
Fluoreszenzintensität
Abb. 4.33: ErbB2- und CEA-Expression verschiedener Tumorzelllinien. Die ErbB2-Expression der
Tumorzellen SK-OV-3 und MDAMB 468 und die CEA-Expression der Tumorzellen KATO III und SKOV-3 wurde mit einem ErbB2-spezifischen oder einem CEA-spezifischen Antikörper durchflusszytometrisch nachgewiesen (schwarze Histogramme). Als Negativkontrolle wurden die Zellen mit dem entsprechenden Isotyp-Antikörper inkubiert (weiße Histogramme). Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment von mindestens 3 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
Zur Analyse der CEA-cTZR-transfizierten T-Zellen diente die CEA-positive Zelllinie KATO
III und die CEA-negative Zelllinie SK-OV-3. Als Negativkontrolle wurden T-Zellen mitgeführt, welche ohne RNA elektroporiert wurden. Nach einer 16- bis 18-stündigen Stimulation
der cTZR-transfizierten T-Zellen wurde die T-Zell-Aktivierung anhand der ausgeschütteten
Zytokine bestimmt. Die ErbB2-cTZR-transfizierten CD4+ und CD8+ T-Zellen sekretierten
nach der Stimulation mit den ErbB2-positiven SK-OV-3-Tumorzellen die Zytokine IL-2, TNF
und IFNγ, bei der Kokultivierung mit den ErbB2-negativen MDAMB 468-Tumorzellen hingegen nicht (Abb. 4.34A, schwarze Balken). Die ErbB2-spezifischen T-Zellen erkannten spezifisch das ErbB2-Antigen, da die Zytokinproduktion der T-Zellen durch die Zugabe des löslichen ErbB2-Proteins blockiert wurde (Abb. 4.34A, graue Balken).
CD4+ und CD8+ T-Zellen, welche mit CEA-cTZR-kodierender RNA elektroporiert wurden,
wurden ebenfalls antigenspezifisch aktiviert und produzierten nach der Stimulation mit CEApositiven KATO III-Zellen IL-2, TNF und IFNγ (Abb. 4.34B, schwarze Balken). Die Kokultivierung mit CEA-negativen SK-OV-3-Zellen hingegen induzierte keine Zytokinsekretion
(Abb. 4.34B). Wie erwartet wurden T-Zellen, welche ohne RNA elektroporiert wurden, von
keiner der verwendeten Tumorzellen zur Zytokinproduktion angeregt (Abb. 4.34A und B,
weiße Balken). In keinen Ansatz konnte eine spezifische Produktion von IL-4, IL-6 und IL-1β
durch die cTZR-transfizierten T-Zellen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen durch die Elektroporation cTZR-
4. Ergebnisse
74
kodierender RNA umprogrammiert werden können, spezifische Zielantigene auf Tumorzellen
erkannten und daraufhin proinflammatorische Zytokine produzierten.
ErbB2-cTZR
A
5
keine RNA
0,6
ErbB2-cTZR
0,4
ErbB2-cTZR + Block
0,2
nb
nb
4
keine RNA
3
CEA-cTZR
2
1
0
2,5
10
2,0
8
IL-2 [ng/ml]
IL-2 [ng/ml]
0
IFNγγ [ng/ml]
IFNγγ [ng/ml]
0,8
1,5
1,0
0,5
nb
0
nb
4
2
9
TNF [ng/ml]
0,9
0,6
0,3
nb
0
Effektorzelle CD4
Zielzelle
6
0
1,2
TNF [ng/ml]
CEA-cTZR
B
CD8
SK-OV-3
CD4
nb
CD8
MDAMB 486
6
3
0
CD4
CD8
KATO III
CD4
CD8
SK-OV-3
+
+
Abb. 4.34: Zytokinsekretion der ErbB2- und CEA-cTZR-transfizierten CD4 und CD8 T-Zellen
+
+
nach Stimulation mit antigenexprimierenden Tumorzellen. CD4 sowie CD8 T-Zellen wurden mit
ErbB2- (A) oder CEA- (B) cTZR-kodierender RNA elektroporiert. Nach 4 Stunden wurden die ErbB2cTZR-transfizierten T-Zellen mit ErbB2-positiven SK-OV-3- und ErbB2-negativen MDAMB 468-Zellen
inkubiert, die CEA-cTZR-transfizierten T-Zellen mit CEA-positiven KATO III- und CEA-negativen SKOV-3-Zellen (schwarze Balken). Bei den Kokulturen mit ErbB2-cTZR-transfizierten T-Zellen wurde in
einigen Ansätzen das rekombinante lösliche ErbB2-Protein zugegeben, um den Rezeptor spezifisch
zu blockieren (graue Balken; Block). T-Zellen, welche ohne RNA elektroporiert wurden, dienten als
Negativkontrolle (weiße Balken). Nach einer 16- bis 20-stündigen Kokultivierung wurde die Sekretion
von IFNγ, IL-2 und TNF bestimmt. n.b.: nicht bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment
von 3 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen.
4.3.3. Spezifische Tumorzelllyse durch cTZR-R:A-elektroporierte CD8+ T-Zellen
Die Hauptaufgabe zytotoxischer CD8+ T-Zellen ist das Töten von Zielzellen nach spezifischer
Erkennung des Antigens. Daher wurde in weiteren Versuchen analysiert, ob T-Zellen, welche
durch RNA-Elektroporation mit cTZR ausgestattet wurden, antigenpositive Tumorzellen lysieren können. Um dies zu untersuchen, wurden Chromlyseversuche durchgeführt. CD8+ T-
4. Ergebnisse
75
Zellen wurden entweder mit dem ErbB2-cTZR oder mit dem CEA-cTZR transfiziert. Die
ErbB2-spezifischen CD8+ T-Zellen wurden mit den ErbB2+ SK-OV-3-Zellen 4 bis 6 Stunden
inkubiert, wobei bei einigen Ansätzen wiederum das lösliche ErbB2-Protein zugegeben wurde.
Die CEA-positiven KATO III-Zellen sowie die CEA-negativen SK-OV-3-Zellen wurden zusammen mit CEA-cTZR-transfizierten CD8+ T-Zellen inkubiert. Dabei wurden Zielzellen mit
Effektorzellen in unterschiedlichen Verhältnissen eingesetzt. Als Negativkontrolle wurden TZellen mitgeführt, welche ohne RNA elektroporiert wurden. Die Tumorzellen wurden vor ihrer Inkubation mit den T-Zellen mit radioaktivem Chrom markiert, um anhand der freigesetzten Chrommenge den prozentualen Anteil der durch die T-Zellen lysierten Tumorzellen ermitteln zu können.
ErbB2-cTZR
25
ErbB2-cTZR auf
SK-OV-3
20
keine RNA auf
SK-OV-3
15
ErbB2-cTZR auf
SK-OV-3 + Block
10
B
Lyse [%]
Lyse [%]
A
CEA-cTZR
25
CEA-cTZR auf
KATO III
20
keine RNA auf
KATO III
15
CEA-cTZR auf
SK-OV-3
10
5
5
0
0
1:60
1:20
1:6
Zielzellen : Effektorzellen
1:2
1:60
1:20
1:6
1:2
Zielzellen : Effektorzellen
+
+
Abb. 4.35: Spezifische Lyse durch cTZR-RNA-elektroporierte CD8 T-Zellen. CD8 T-Zellen wurden mit ErbB2- (A, Quadrate, Rauten) oder CEA- (B, Dreiecke) cTZR-kodierender RNA oder ohne
RNA (A, B, Kreise) elektroporiert. Nach 24 Stunden wurde die Zytotoxizität gegenüber den ErbB2-positiven und CEA-negativen SK-OV-3-Zellen (weiße Symbole) sowie den CEA-positiven KATO-III-Zellen (schwarze Symbole) in einem Chromlyseversuch bestimmt. ErbB2-cTZR-transfizierte T-Zellen
wurden zusätzlich noch mit dem rekombinanten löslichen ErbB2-Protein inkubiert (A, Karos; Block).
Die verwendeten Verhältnisse der Zielzellen zu den Effektorzellen sind angegeben. Daten zeigen den
Mittelwert aus Triplikaten +/- Standardabweichung eines repräsentativen von insgesamt 4 voneinander unabhängig durchgeführten Experimenten.
Die ErbB2-cTZR-transfizierten CD8+ T-Zellen lysierten die ErbB2+ SK-OV-3-Zellen, wobei
die Menge an lysierten Zellen mit der Menge an eingesetzten T-Zellen korrelierte (Abb.
4.35A, weiße Quadrate). Dabei erfolgte die Lyse der Tumorzellen antigenspezifisch, da diese
durch die Zugabe des löslichen ErbB2-Proteins blockiert wurde (Abb. 4.35A, weiße Karos).
Auch die mit dem CEA-cTZR-transfizierten CD8+ T-Zellen lysierten antigenspezifisch CEApositive Tumorzellen, wobei wiederum die Verwendung einer höheren Anzahl von Effektorzellen zu einer höheren Lyserate führte (Abb. 4.35B, schwarze Dreiecke). T-Zellen, welche
ohne RNA elektroporiert wurden, lysierten weder die ErbB2-positive SK-OV-3-Zellen noch
4. Ergebnisse
76
die CEA-positive KATO III-Zellen (Abb. 4.35A und B, Kreise). Mit diesen Ergebnissen wurde deutlich, dass CD8+ T-Zellen, welche durch RNA-Transfer mit einem cTZR ausgestattet
wurden, antigenspezifisch Tumorzellen lysieren.
4.3.4. Vergleich der Funktionalität retroviral transduzierter und R:A-elektroporierter
CEA-cTZR-exprimierender CD8+ T-Zellen
In den oben beschriebenen Versuchen wurde gezeigt, dass T-Zellen effizient durch Elektroporation cTZR-kodierender RNA mit einer neuen Antigenspezifität ausgestattet werden konnten.
Jedoch stellte sich die Frage, ob die durch RNA-Transfektion hergestellten T-Zellen genauso
effizient sind wie T-Zellen, welche durch retrovirale Transduktion generiert wurden. Dazu
wurde in Kooperation mit Dr. Hombach und Prof. Abken (Köln) CEA-cTZR-exprimierende
CD8+ T-Zellen miteinander verglichen, welche entweder durch RNA-Elektroporation oder
durch retrovirale Transduktion aus Zellen des gleichen Spenders hergestellt wurden. Die
Elektroporation der CD8+ T-Zellen mit CEA-cTZR-kodierender RNA erfolgte in Erlangen,
ebenso wie die Isolierung der T-Zellen, welche für die retrovirale Transduktion benötigt wurden. Die retrovirale Transduktion der CD8+ T-Zellen sowie der direkte Vergleich der RNAelektroporierten mit den retroviral transduzierten T-Zellen erfolgte durch Dr. Hombach in
Köln. Nach Elektroporation der CD8+ T-Zellen mit CEA-cTZR-RNA exprimierten 85,1 %
der T-Zellen den CEA-spezifischen cTZR, wohingegen nach retroviraler Transduktion nur
40,1 % der Zellen positiv für den CEA-cTZR waren (Daten nicht gezeigt). Anschließend wurden die CEA-spezifischen CD8+ T-Zellen zusammen mit Zellen der CEA-positiven Tumorzelllinie LS174T oder Zellen der CEA-negativen Tumorzelllinie Colo320 kokultiviert, wobei
die T-Zellen in verschiedenen Verhältnissen zu ihren Zielzellen eingesetzt wurden. Als Negativkontrolle wurden unmodifizierte T-Zellen mitgeführt. Die IFNγ-Sekretion wurde anschließend in einem ELISA ermittelt.
Wie in Abbildung 4.36 dargestellt, produzierten sowohl die retroviral transduzierten (Abb.
4.36B) als auch die RNA-elektroporierten (Abb. 4.36C) CD8+ T-Zellen nach Stimulation mit
den CEA-positiven LS174T-Zellen IFNγ, wobei die Menge an sekretiertem Zytokin mit zunehmender Menge an zugegebenen Effektorzellen anstieg. Bei der Inkubation der CEA-spezifischen CD8+ T-Zellen mit CEA-negativen Colo320-Zellen war keine oder nur geringere
Zytokinproduktion messbar (Abb. 4.36B und C). Unbehandelte T-Zellen sekretierten weder
nach der Inkubation mit CEA-positiven noch mit CEA-negativen Zellen IFNγ (Abb. 4.36A).
4. Ergebnisse
77
A
B
ohne
0,8
C
retroviral
0,8
RNA
0,8
IFNγγ [ng/ml]
LS174T
0,6
0,6
0,4
0,4
0,4
0,2
0,2
0,2
0,6
Colo320
0
0
2,5
5
10
0
2,5
5
10
2,5
5
10
Anzahl der T-Zellen / 103
+
Abb. 4.36: IFNγ-Sekretion der cTZR-RNA-elektroporierten und retroviral transduzierten CD8 T+
Zellen. CD8 T-Zellen wurden entweder nicht modifiziert (A), mit OKT3 und IL-2 aktiviert und retroviral
mit dem CEA-cTZR transfiziert (B) oder mit CEA-cTZR-kodierender RNA elektroporiert (C). Die IFNγ+
4
Sekretion der CD8 T-Zellen wurde nach 48-stündiger Inkubation mit 2 x 10 CEA-positiven LS174TZellen (Rauten) oder CEA-negativen Colo320-Zellen (Quadrate) gemessen. Dargestellt ist der Mittelwert von Triplikaten +/- Standardabweichung eines repräsentativen von 3 unabhängig voneinander
durchgeführten Experimenten.
Bei einem eventuellen Einsatz in der Immuntherapie müssen T-Zellen nach der Injektion zunächst den Tumor erreichen und in ihn einwandern, bevor sie ihre zytotoxische Aktivität entfalten können. Daher ist es unabdingbar, dass die reprogrammierten T-Zellen ihre lytische
Aktivität für eine ausreichende Zeit beibehalten. Dies ist bei retroviral transduzierten T-Zellen
wahrscheinlich, da die cTZR-Expression auf diesen Zellen stabil ist. Im Gegensatz dazu führt
die RNA-Elektroporation zu einer transienten Expression des cTZR. Um zu überprüfen, ob
RNA-transfizierte CD8+ T-Zellen ihre spezifische lytische Aktivität nach ihrer Aktivierung
über eine längere Zeit aufrechterhalten, wurde die längerfristige Zytotoxizität der T-Zellen ermittelt. Dazu wurden CD8+ T-Zellen wiederum durch RNA-Elektroporation oder durch retrovirale Transduktion mit dem CEA-cTZR ausgestattet. Vier Stunden nach Elektroporation mit
cTZR-kodierender RNA exprimierten 93,0 % der T-Zellen den CEA-cTZR. Nach 2-tägiger
Aktivierung der RNA-elektroporierten T-Zellen mit dem anti-CD3 Antikörper (OKT3) und
IL-2 exprimierten noch 82,5 % der CD8+ T-Zellen den CEA-cTZR (Daten nicht gezeigt).
Hingegen waren nur 33,5 % der T-Zellen nach der retroviralen Transduktion positiv für den
CEA-cTZR (Daten nicht gezeigt). Die RNA-transfizierten sowie die retroviral transduzierten
CD8+ T-Zellen wurden anschließend mit CEA-positiven LS174T-Zellen sowie mit CEA-negativen Colo320-Zellen für 2 Tage kokultiviert, wobei die T-Zellen in verschiedenen Verhältnissen zu ihren Zielzellen eingesetzt wurden. Anschließend wurde die Vitalität der Zellen in
einem XTT-basierten kolorimetrischen Verfahren gemessen. Die CEA-positiven Tumorzellen
4. Ergebnisse
78
wurden sowohl durch die RNA-elektroporierten (Abb.4.37B) als auch durch die retroviral
transduzierten CD8+ T-Zellen lysiert (Abb. 4.37A), wohingegen die CEA-negativen Colo320Zellen von keiner der eingesetzten T-Zell-Populationen lysiert werden konnten (Abb. 4.36A
und B). Ungefähr doppelt so viele RNA-elektroporierte T-Zellen waren nötig, um die gleiche
zytotoxische Aktivität wie retroviral transduzierte T-Zellen zu erreichen. Unbehandelte CD8+
T-Zellen bewirkten keine Lyse der Tumorzellen (Abb. 4.36A und B).
A
Colo 320 (CEA- )
LS174T (CEA+ )
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
Vitalität [%]
120
0
0
1,25
2,5
5
10
1,25
2,5
5
10
B
LS174T (CEA+ )
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
Vitalität [%]
Colo320 (CEA- )
120
0
0
2,5
5
10
20
2,5
5
10
20
Anzahl an T-Zellen / 103
TZR-transfizierte T-Zellen
unbehandelte T-Zellen
Abb. 4.37: Antigenspezifische Lyse der cTZR-RNA-elektroporierten und retroviral transduzier+
+
ten CD8 T-Zellen. CD8 T-Zellen wurden mit anti-CD3 Antikörper (OKT3) und IL-2 aktiviert und anschließend retroviral mit dem CEA-cTZR transduziert (A, Quadrate). Alternativ wurden T-Zellen mit
CEA-cTZR-RNA elektroporiert und anschließend für 2 Tage mit OKT3 und IL-2 aktiviert (B, Quadrate).
Anschließend wurden die CEA-spezifischen T-Zellen sowie unbehandelte T-Zellen (A, B, Rauten) für
4
48 Stunden mit 2,5 x 10 CEA-positiven LS174T-Zellen oder CEA-negativen COLO320-Zellen kokultiviert. Die Vitalität der Zielzellen wurde kolorimetrisch in einem XTT-Versuch ermittelt. Dargestellt ist
der Mittelwert aus Triplikaten +/- Standardabweichung eines repräsentativen von 6 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
4. Ergebnisse
79
Diese Ergebnisse zeigten, dass CD8+ T-Zellen, welche durch Elektroporation CEA-cTZR-kodierender RNA hergestellt wurden, selbst nach 2-tägiger Stimulation antigenpositive Tumorzellen lysierten. Allerdings waren schätzungsweise zweimal so viele RNA-elektroporierte TZellen nötig um dieselbe zytotoxische Aktivität zu erreichen wie bei Verwendung retroviral
transduzierter T-Zellen.
In diesem Teilprojekt der Arbeit wurde gezeigt, dass durch den Transfer cTZR-kodierender
RNA CEA- und ErbB2-spezifische T-Zellen hergestellt werden können, welche durch antigenpositive Tumorzellen aktiviert wurden und diese lysieren konnten. Obwohl die Aktivität
dieser spezifischen T-Zellen etwa um die Hälfte geringer war als die retroviral transduzierter
T-Zellen, stellen cTZR-RNA-elektroporierte T-Zellen eine aussichtsreiche Alternative zu retroviral transduzierten T-Zellen dar, da keine irreversiblen genetischen Veränderungen in den
T-Zellen auftreten können und die Gefahr langlebiger Autoimmunität stark reduziert ist.
5. Diskussion
80
5. Diskussion
Verbesserte Therapieoptionen sowie eine frühere Diagnose führten in den letzten Jahrzehnten
zu einer erhöhten Überlebensrate von Krebspatienten (Robert-Koch-Institut 2004). Dennoch
stellten Tumorerkrankungen die zweithäufigste Todesursache in Deutschland im Jahre 2008
dar, an der 114.855 Männer und 99.452 Frauen verstarben (Statistisches Bundesamt
Deutschland). Besonders in den letzten Jahren nahm der Einsatz antikörperbasierter Therapeutika zur Behandlung maligner Erkrankungen stetig zu. Mittlerweile sind verschiedene klonale Antikörper (mAb) von der FDA (food and drug administration) zur Krebstherapie zugelassen wie zur Behandlung von Lymphomen (Rituximab: MabThera®, Alemtuzumab:
MabCampath®, Gemtuzumab: Mylotarg®, Ibritumomab tiuxetan: Zevalin®, Tositumomab:
Bexxar®), des Mammakarzinoms (Trastuzumab: Herceptin®) und des Kolonkarzinoms
(Cetuximab: Erbitux®, Bevacizumab: Avastin®, Panitumumab:Vectibix®). Auch der Einsatz
von scFvs (single chain Fragment variable) anstatt der Verwendung kompletter mAb gewinnt
in der Immuntherapie maligner Erkrankungen immer mehr an Bedeutung. So wird die Wirksamkeit mehrerer scFv-basierter Therapeutika wie Immuntoxine
scFv
236-238
232-235
oder bispezifische
in klinischen Studien getestet. Diese antikörperbasierten Immuntherapeutika ent-
falten ihre Wirkung entweder durch Rekrutierung von Effektorzellen oder durch effektorunabhängige Mechanismen wie Blockieren oder Signalisieren oder als Immunkonjungate (siehe
Einleitung 2.3.1). Die Eigenschaften von mAb sowie von scFvs können aber auch in zellulären, therapeutischen Ansätzen wie der Immuntherapie mit Dendritischen Zellen (DC; 2.3.2)
oder T-Zellen (2.3.3) ausgenützt werden. So wurden in der vorliegenden Arbeit scFv-Antigen-Konstrukte hergestellt, mit deren Hilfe humane aus Monozyten generierte Dendritische
Zellen (DC) mit Tumorantigen (TA) beladen werden können. Diese scFv-Antigen-Konstrukte könnten dazu dienen, um DC in vitro mit TA zu beladen und die Zellen dann als DC-Impfstoff in der Tumorimmuntherapie einzusetzen. Eine weitere Option wäre die Konstrukte zum
in-vivo-Targeting von DC zu verwenden (siehe 5.1). Ein verlässliches System um die Präsentation von TA auf DC nachzuweisen, stellt die Verwendung von T-Zellen dar, welche durch
Elektroporation von T-Zell-Rezeptor (TZR) α- und β-Ketten-kodierenden RNA mit einer
neuen Antigenspezifität ausgestattet wurden. Um die Klonierung unbekannter TZR aus TZell-Klonen zu erleichtern und die Funktionalität der neu klonierten TZR zu überprüfen, wurde in dieser Arbeit eine PCR-Klonierungsstrategie sowie ein vereinfachtes Testsystem entwickelt (siehe 5.2). Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von scFvs als Immuntherapeutika
stellen chimäre TZR (cTZR) dar, welche aus einer scFv-basierten Bindungsdomäne und einer
5. Diskussion
81
oder mehreren Signaldomänen bestehen. Die Funktionalität von cTZR-transfizierten T-Zellen
wurde in einem weiteren Teilprojekt dieser Arbeit analysiert, wobei überprüft wurde, ob TZellen, welche durch RNA-Elektroporation mit einem cTZR ausgestattet wurden, eine ähnliche lytische Aktivität aufweisen wie T-Zellen welche durch retrovirale Transduktion mit dem
selben cTZR transfiziert wurden (siehe 5.3).
5.1. DEC-205-Targeting als alternative Antigenbeladungsstrategie von DC
DC induzieren in ihrer Rolle als antigenpräsentierende Zelle (APC) die T-Zell-Immunantwort
gegen einen Erreger oder andere Antigene und sind maßgeblich an der Regulation der T-ZellImmunantwort beteiligt. Dabei können DC entweder eine Immunantwort oder Toleranz gegenüber einem Antigen auslösen
239
. Ein Tumor kann nur dann entstehen, wenn das Immun-
system die entarteten Zellen nicht erkennt oder nicht eliminieren kann. Dabei können Tumorzellen auf mehreren Wegen die Induktion einer Immunantwort unterdrücken. So können sie
die Differenzierung und die Reifung von DC blockieren oder deren Apoptose auslösen 240-242.
Außerdem können Tumore anti-apoptotische Mechanismen entwickeln, die bewirken, dass
DC keine Tumorproteine aus sterbenden Tumorzellen internalisieren und dann präsentieren
können, was dazu führt, dass die Immunantwort gegen einen Tumor entweder nicht ausgelöst
oder nicht verstärkt werden kann 74,75. Da in Tumoren ein immunsuppressives Milieu vorliegt,
erhalten DC nach Antigenaufnahme keinen zusätzlichen Stimulus, was zur Folge hat, das diese DC Toleranz gegenüber dem Tumor induzieren können 4. Außerdem werden maligne entartete Körperzellen vom Immunsystem oftmals nicht erkannt, da im Organismus Toleranz gegenüber Selbstantigenen aufrechterhalten werden muss, um eine schädliche Autoimmunität zu
vermeiden. All diese Eigenschaften eines Tumors bewirken, dass das Immunsystem einen Tumor oftmals nicht wirkungsvoll bekämpfen kann. In den letzten Jahren wurde versucht, die
immunregulierenden Eigenschaften von DC zur Tumortherapie einzusetzen, um die Toleranz
des Immunsystems gegenüber den Tumorantigenen zu brechen und damit die Immunantwort
gegen den Krebs zu verbessern. Dazu wurden DC-Impfstoffe hergestellt, deren Effizienz zurzeit in klinischen Studien getestet wird
16,149,164,166,243-245
. Ein anderer Ansatz ist das in-vivo-
Targeting von DC, bei dem die Zellen mit Hilfe von Antikörper-Antigen-Konstrukten mit Tumorproteinen beladenen werden können. So wurde in mehreren Arbeiten gezeigt, dass das
Targeting des Endozytoserezeptors DEC-205, der auf verschiedenen murinen sowie humanen
DC-Subpopulationen exprimiert wird, antigenspezifische T-Zell-Antworten induzieren kann
172-174
. Die meisten Versuche wurden mit murinen DC durchgeführt, das DEC-205-Targeting
von humanen DC wurde erst in zwei Arbeiten analysiert 195,199, wobei beide Gruppen DC mit
5. Diskussion
82
viralen Antigenen beluden. Um weitere Informationen über DEC-205-Targeting humaner DC
zu erhalten, wurde in der vorliegenden Arbeit die Beladung humaner DC mit Hilfe von scFvTA-Konstrukten etabliert und die Effizienz dieser Beladungsstrategie mit zwei weiteren bereits in klinischen Studien angewandten Beladungsstrategien, der Elektroporation definierter
TA-RNA und der direkten Peptidbeladung, verglichen.
5.1.1. Konstruktion geeigneter anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-PeptidFusionsproteine
Zur Beladung humaner aus Monozyten generierter DC wurden zunächst Fusionsproteine aus
einem gegen das humane DEC-205 gerichteten scFv und verschiedenen MAGE-A3-Peptiden
konstruiert. MAGE-A3 ist ein so genanntes cancer-testis-Antigen, das in vielen Tumoren exprimiert wird 151,152,246, aber nicht in normalem Gewebe außer in Zellen des fötalen Eierstocks
und des Hodens. Daher stellt dieses TA ein geeignetes Zielantigen in der Tumorimmuntherapie dar. Es wurden 3 verschiedene Fusionsproteine hergestellt, welche entweder zur Beladung
von MHC-Klasse-I-Molekülen (anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD), oder zur Beladung von
MHC-Klasse-II-Molekülen (anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL), oder zur simultanen Beladung von MHC-Klasse-I- und -II-Molekülen (anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-LP) der DC mit
MAGE-A3-T-Zell-Epitopen führen sollten (Tabelle 4.1). Dabei wurden die MAGE-A3Peptide so gewählt, dass sie in MHC-Molekülen präsentiert werden, welche häufig in der kaukasischen Bevölkerung auftreten. So wird das MAGE-A3-KKL-Peptid auf dem am häufigsten
vorkommenden MHC-Klasse-II-Molekül, dem HLA-DP4, präsentiert 247. Auch HLA-A1-Moleküle, auf denen das MAGE-A3-EVD-Peptid gezeigt wird, ist mit 14,2 % ein häufig in der
Bevölkerung auftretendes MHC-Klasse-I-Molekül
248
. Das anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-
LP-Fusionsprotein enthält sogar mehrere verschiedene MAGE-A3-T-Zell-Epitope, welche auf
HLA-A1, -A2, -B35, -B40 (HLA-Klasse-I) und HLA-DP4, -DQ6 (HLA-Klasse-II) präsentiert
werden können. Da die in den Fusionsproteinen enthaltenen MAGE-A3-Peptide in MHC-Molekülen präsentiert werden, die häufig in der Kaukasischen Bevölkerung auftreten, wären die
Fusionsproteine bei einem späteren klinischen Einsatz breit einsetzbar. Im Gegensatz zu den
bisherigen Antikörper-Antigen-Konstrukten, welche zur Beladung humaner DC verwendet
wurden
195,199
, enthielten die in dieser Arbeit hergestellten Fusionsproteine einen DEC-205-
spezifischen scFv. Dieser weist gegenüber kompletten mAb Vorteile auf. So kann es bei Verwendung mAb zu einer Immunantwort gegen den Fc-Anteil des Antikörpers kommen oder
zur Aufnahme der Antikörper-Antigen-Konstrukte über deren Fc-Teil durch andere Körperzellen 185. Diese Effekte werden durch die Verwendung eines scFvs vermieden.
5. Diskussion
83
5.1.2. Herstellung der Fusionsproteine in E. coli und in 293T-Zellen
Die Fusionsproteine wurden zunächst in E. coli produziert und mit Hilfe ihres Strep-Tags aufgereinigt (Abb. 4.8). Zwar konnte die Bindung der drei anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte an DC nachgewiesen werden (Abb. 4.9), jedoch waren die Fusionsproteine
stark mit Lipopolysacchariden (LPS) kontaminiert, so dass sie nicht für weitere in-vitro-Experimente verwendet werden konnten. Da LPS an TLR-4 (toll-like receptor 4) auf den DC
bindet
4,250
249
und über einen MyD88 abhängigen Signalweg u.a. die Reifung von DC induziert
, hätte die LPS-Kontamination der Fusionsproteine die Ergebnisse der in-vitro-Experi-
mente verfälscht. Bereits eine geringe LPS-Konzentration von 0,1 – 1 ng/ml reichte aus, um
die Reifung von DC und die Sekretion verschiedener Zytokine zu induzieren (Abb. 4.10). Aus
diesem Grund wurden die anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Fusionsproteine in 293T-Zellen
hergestellt und eine mögliche LPS-Kontamination mit Hilfe eines LAL-Tests überprüft
16,149,244,251
. Die Fusionsproteine anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL und anti-DEC-205scFv-
MAGE-A3-EVD konnten in 293T-Zellen erfolgreich produziert werden (Abb. 4.12), wobei
mit 120 µg des anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Proteins sowie 82 µg des anti-DEC205scFv-MAGE-A3-EVD-Proteins pro Liter 293T-Zellüberstand nur relativ geringe Mengen
aufgereinigt wurden. Jedoch ist es bekannt, dass die Ausbeute an scFv-Fusionsproteinen stark
vom jeweils verwendeten Konstrukt abhängt. So variierten in einer Arbeit von Peipp et al. die
erhaltenen Ausbeuten an scFv-GFP und scFv-DsRed-Fusionsproteinen zwischen 50 µg und 3
mg pro Liter 293T-Zellüberstand 252. Um die Ausbeute an Fusionsprotein für eine spätere klinische Anwendung zu erhöhen, könnte das 293T-Transfektionsprotokoll sowie die Aufreinigung des Proteins noch modifiziert werden. So wäre die Verwendung von 293T-Zellen denkbar, die stabil mit den Fusionsproteinen-kodierenden Expressionsvektoren transfiziert sind,
sowie die Aufreinigung der Fusionsproteine mit einem automatisierten, chromatographiebasiertem Proteinaufreinigungssystem (ÄKTA; 253). Des Weiteren wäre es möglich, die Fusionsproteine im großen Rahmen in E. coli herzustellen und das kontaminierende LPS nachträglich
zu entfernen. Prinzipiell konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Herstellung der Fusionsproteine in E. coli möglich ist. Die Entfernung des LPS war im Rahmen der Doktorarbeit
jedoch nicht durchführbar, da nur geringe Proteinmengen erhalten wurden und beim Entfernen des LPS zuviel Fusionsprotein verloren gegangen wäre. Das anti-DEC-205scFv-MAGEA3-LP-Fusionsprotein konnte in 293T-Zellen leider nicht hergestellt werden. Möglicherweise
konnte das Protein in der Zelle auf Grund seiner Tertiärstruktur nicht richtig gefaltet werden.
Zwar konnte dieses Fusionsprotein in E. coli produziert werden, jedoch war die Ausbeute mit
3 µg pro l Liter Expressionskultur sehr gering. Die Größe dieses Fusionsproteins mit ungefähr
5. Diskussion
84
50 kDa sollte eigentlich nicht dazu führen, dass das Protein nicht in 293T-Zellen hergestellt
werden kann, da gezeigt wurde das auch größere Fusionsproteine wie bispezifische scFv mit
55-60 kDa 254 oder scFv triabodies mit ungefähr 90 kDa 157 in 293T-Zellen produziert werden
können. Zusätzlich zu den anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Fusionsproteinen wurden
gegen MCSP gerichtete MAGE-A3-Fusionsproteine erfolgreich in 293T-Zellen hergestellt
(Abb. 4.12). Mit Hilfe dieser Kontrollproteine, die nur spezifisch an MCSP-positive A2058Zellen, aber nicht an DC banden (Abb. 4.13), konnte in in-vitro-Experimenten nachgewiesen
werden, dass die Beladung der DC mit MAGE-A3 über DEC-205-vermittelte Endozytose erreicht wurde und nicht durch unspezifische Aufnahme der Fusionsproteine.
5.1.3. Auslesesystem zur Messung der Antigenpräsentation auf DC
In der Literatur erfolgte der Nachweis der Antigenpräsentation auf DC oftmals durch die Verwendung von antigenspezifischen T-Zell-Klonen oder mit Hilfe von TCR-ähnlichen Antikörpern, jedoch ist dies oft problematisch (siehe 5.2). Ein weitaus verlässlicheres Auslesesystem
stellt der Einsatz von spezifischen T-Zellen dar, welche durch Elektroporation der TZR αund β-Ketten-kodierenden RNA in ausreichender Menge und gleich bleibender Qualität hergestellt werden können
208,255,256
. So war es möglich, mit Hilfe von T-Zellen, welche mit ei-
nem MAGE-A3/HLA-A1-spezifischen oder mit einem MAGE-A3/HLA-DP4-spezifischen
TZR ausgestattet wurden, die Präsentation von exogen zugegebenen MAGE-A3-Peptiden
oder endogen prozessierten MAGE-A3 auf HLA-A1- oder HLA-DP4-Molekülen nachzuweisen (Abb. 4.2 und Abb. 4.3). Dabei bewirkte die Elektroporation der DC mit MAGE-A3DCLAMP-RNA zusätzlich zur Präsentation des MAGE-A3-Proteins auf HLA-A1-Molekülen
auch eine auf HLA-DP4-Molekülen, was darauf hindeutet, dass DCLAMP den Transport des
MAGE-A3-Proteins zu den Endosomen der DC induziert 168. Zusätzlich zu IL-2 als Indikator
für die T-Zell-Aktivierung können weitere Zytokine wie IL-10, TNF und INFγ mit diesem
System bestimmt werden, welche Hinweise auf den Typ der durch die DC induzierten
Immunantwort liefert. Damit stellen die RNA-elektroporierten T-Zellen ein verlässliches Auslesesystem dar, mit dessen Hilfe die MAGE-A3-Antigenbeladung von DC analysiert und somit die Effizienz des DEC-205-Targetings zur Antigenbeladung untersucht werden konnte.
5. Diskussion
85
5.1.4. Das DEC-205-Targeting mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL
-Fusionsprotein bewirkte eine effiziente MHC-Klasse-II-Präsentation
Für eine erfolgreiche Immuntherapie zur Behandlung von Tumoren sind nicht nur tumorspezifische CD8+ T-Zellen nötig, sondern auch antigenspezifische CD4+ T-Zellen. Dennoch lag der
Fokus in den letzten Jahren hauptsächlich auf den Einsatz zytotoxischer CD8+ T-Zellen
257
.
Die DEC-205+ DC-Subpopulationen in Mäusen scheinen auf die Kreuzpräsentation von Proteinen spezialisiert zu sein, da hauptsächlich CD8+ T-Zell-Antworten nach DEC-205Targeting ausgelöst wurden
79,187,191
, jedoch wurden auch CD4+ T-Zell-Antworten nach dem
DEC-205-Targeting beobachtet 193,197. Kürzlich wurde außerdem gezeigt, dass DEC-205+ DC
in der Milz darauf spezialisiert sind, FoxP3+ regulatorische T-Zellen zu induzieren 196. In der
zytoplasmatischen Domäne des DEC-205-Endozytoserezeptors ist ein lysosomales TargetingMotiv enthalten, welches den Zugang zum MHC-Klasse-II-pathway erlaubt
180
. Daher sollte
auch eine effiziente Antigenpräsentation von MAGE-A3-Peptiden auf MHC-Klasse-II-Molekülen nach dem Targeting von DEC-205 mit anti-DEC-205scFv-Antigen-Fusionsproteinen
möglich sein. Trotzdem wurde bisher nur in einer Studie mit humanen DC gezeigt, dass CD4+
T-Zell-Antworten nach dem DEC-205-Targeting humaner DC induziert werden können
199
.
Wegen dieser mangelnden Erfahrung sowie dem Bedarf an hoch effizienten Methoden MHCKlasse-II-Moleküle mit Tumorpeptiden zu beladen, wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst
die Beladungseffizienz des anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsproteins analysiert,
welches ein MAGE-A3-Peptid enthält, dass auf HLA-DP4-Molekülen präsentiert wird.
Sowohl aus Monozyten generierte iDC als auch mDC zeichneten sich durch eine hohe Expression von DEC-205 aus (Abb. 4.4). Daher wurde untersucht, ob sich beide DC-Populationen durch das anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsprotein mit MAGE-A3 beladen
lassen. Zusätzlich wurde eine Kondition mitgeführt, bei der die iDC während des DEC-205Targetings gereift wurden (iDCm), um die in-vivo-Situation im Körper zu imitieren (siehe unten). Zunächst wurde jedoch ein möglicher Einfluss des anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKLKonstrukts auf den Phenotyp, das Zytokinsekretionsprofil sowie auf das Migrationsverhalten
der DC untersucht. Dabei wurden keine Unterschiede in der Oberflächenexpression verschiedener Reifungsmarker zwischen durch DEC-205-Targeting beladene DC und DC, welche mit
dem Kontrollpeptid inkubiert wurden, gefunden (Abb. 4.14). Besonders von Bedeutung ist,
dass die Inkubation der DC mit dem anti-DEC-205-MAGE-A3-KKL-Konstrukt keine IL-10Sekretion der DC auslöste (Abb. 4.15), da bekannt ist, dass dieses Zytokin zur de-novo-Induktion von regulatorischen T-Zellen und zur Immunsuppression beiträgt
103
. Für eine spätere
klinische Anwendung ist es unabdingbar, dass DC nach dem DEC-205-Targeting ihre Migra-
5. Diskussion
86
tionsfähigkeit beibehalten. Zum einen ermöglicht dies bei Anwendung ex-vivo-beladener DC
die Wanderung der DC von der Injektionsstelle zum lymphatischen Gewebe, aber auch beim
Targeting in vivo der DC ist es nötig, dass die DC ihre Fähigkeit zur Migration aufrechterhalten. Unter anderem wird die Migration von DC zu T-Zell-reichen Regionen über das Chemokin MIP-3β (CC ligand 19, CCL19) gesteuert, welches dort in hohen Mengen exprimiert wird
258,259
. MIP-3β ist ein Ligand des Chemokinrezeptors CCR7 (CC chemokine receptor 7,
260
).
Da besonders reife DC über eine hohe CCR7-Expression verfügen, wird so die Wanderung
der DC zu den lymphoiden Blutgefäßen und den T-Zell-Regionen in den sekundären lymphoiden Organen gesteuert
14,221,222,261
. Nach der Inkubation der DC mit dem anti-DEC-
205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsprotein war weder die CCR7-Expression noch die Fähigkeit der DC entlang des CCL19-Gradienten zu wandern, verändert (Abb. 4.16). Dieses Ergebnis würde einen späteren Einsatz durch DEC-205-Targeting beladener DC prinzipiell möglich
machen.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das DEC-205-Targeting von humanen, aus Monozyten
generierten DC mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsproteins in vitro zur
Präsentation des im DEC-205-Targeting-Konstrukt enthaltenen Antigens führt, da die antigenspezifischen T-Zellen hohe Mengen an IL-2 produzierten (Abb. 4.17). Die Inkubation der
DC mit dem Kontrollprotein hingegen induzierte keine Zytokinproduktion (Abb. 4.17). Bemerkenswerterweise induzierten DC, welche während des DEC-205-Targetings gereift wurden (iDCm), die höchste Aktivierung der antigenspezifischen T-Zellen (Abb. 4.17). Dies
könnte dadurch erklärt werden, dass diese Variante der Beladung die Situation im menschlichen Körper imitiert, in der unreife DC während sie auf ein Antigen treffen zusätzlich einen
Reifungsstimulus erhalten und dann eine Immunantwort gegen einen Erreger/Antigen einleiten
239
. Zwar konnten auch iDC erfolgreich durch das DEC-205-Targeting mit dem MAGE-
A3/HLA-DP4-Peptid beladen werden, jedoch induzierten diese eine höhere Produktion des
Zytokins IL-10 im Verhältnis zu IL-2 (Abb. 4.17). Die Verwendung dieser DC könnte daher
zur Toleranzinduktion anstatt zur Induktion einer Immunantwort gegenüber dem Tumor führen. Dies korreliert auch mit den Beobachtungen anderer Forscher, welche über Toleranzinduktion nach in-vivo-DEC-205-Targeting muriner DC mit Antikörper-Antigen-Konstrukten
berichteten
187,190,196,262
. Daher sollten durch DEC-205-Targeting beladene iDCm und mDC
für DC-Impfungen geeigneter sein als iDC, da diese DC-Populationen in vitro gereift werden
und ein besseres IL-10 zu IL-2 Verhältnis nach antigenspezifischer T-Zell-Stimulation induzieren (Abb. 4.17). Für eine effiziente Antigenbeladung war nur eine Konzentration von 1
µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt nötig (Abb. 4.18). Diese Konzentration
5. Diskussion
195
87
oder sogar 5 µg/ml 199 waren auch beim DEC-205-Targeting mit mAb-Antigen-Konstruk-
ten nötig. Zwar führte die Stimulation der spezifischen T-Zellen mit DC, welche mit 10 µg/ml
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsprotein inkubiert wurden, zur höchsten IL-2Produktion, jedoch induzierte auch die Stimulation mit DC, welche mit der selben Konzentration an Kontrollkonstrukt inkubiert wurden, die Produktion von IL-2 (Abb. 4.18). Sehr wahrscheinlich führte die Verwendung einer so hohen Proteinkonzentration zu einer unspezifischen Aufnahme der Konstrukte.
5.1.5. DEC-205-Targeting induzierte eine effizientere MHC-Klasse-II-Prä
sentation als R:A-Elektroporation und direkte Peptidbeladung
In der Universitätshautklinik in Erlangen wird zurzeit in klinischen Studien die Wirksamkeit
von DC-Impfungen getestet, bei denen ex-vivo-generierte DC injiziert werden, die durch
Elektroporation antigenkodierender RNA oder durch direkte Zugabe von Peptiden mit einem
TA beladen wurden. Da das DEC-205-Targeting nicht nur für in-vivo-Targeting von DC sondern auch zur in-vitro-Beladung verwendet werden könnte, wurde die Effizienz des DEC205-Targetings mit der Effizienz dieser bereits in klinischen Studien verwendeten Beladungsstrategien verglichen. Das DEC-205-Targeting von DC, besonders gerade reifender DC, resultierte in einer signifikant erhöhten MHC-Klasse-II-Präsentation gegenüber DC, welche mit
MAGE-A3-DCLAMP-RNA elektroporiert wurden, obwohl ein optimiertes RNA-Elektroporationsprotokoll 169 sowie eine hohe RNA-Konzentration verwendet wurde (Abb. 4.17). Auch
das Beladen von mDC durch direkte Zugabe des MAGE-A3/HLA-DP4-Peptides, welches in
hoher Konzentration eingesetzt wurde, war weniger effektiv als das DEC-205-Targeting (Abb.
4.17). Es wird umso offensichtlicher, dass das DEC-205-Targeting von DC der direkten
Peptidbeladung überlegen ist, wenn man bedenkt, dass 156x weniger Moleküle anti-DEC205scFv-MAGE-A3-KKL eingesetzt wurden als Moleküle MAGE-A3/DP4-Peptid. Diese Ergebnisse decken sich mit den Resultaten von Gurer et al, die zeigten, dass das DEC-205Targeting humaner DC mit einem anti-DEC-205mAb-EBNA-1-Konstrukt zu einer höheren
IFNγ-Sekretion CD4+ T-Zellen führte als peptidbeladene DC 199. Obwohl gezeigt wurde, dass
iDC besser mit MHC-Klasse-II-Peptiden beladen werden können als mDC 263, wurde in dieser
Arbeit durch DEC-205-Targeting beladene DC mit peptidbeladenen mDC verglichen, da iDC
in der Immuntherapie auf Grund der Gefahr der Toleranzinduktion nicht eingesetzt werden
sollten.
5. Diskussion
88
5.1.6. DEC-205-Targeting führte zur effizienten MHC-Klasse-II-Präsentation auf aus Melanompatientenblut generierten DC
In dieser Arbeit wurde auch untersucht, ob DC, welche aus dem Blut von Patienten mit Malignem Melanom generiert wurden, durch Targeting des DEC-205-Endozytoserezeptors mit
Antigen beladen werden können. Diese Analyse war wichtig, da Zellen von Krebspatienten
oft einen beeinträchtigten Phänotyp besitzen oder in ihrer Funktionalität eingeschränkt sein
könnten 264-266. Da die aus Leukaphereseprodukten generierten Patienten-mDC über eine hohe
DEC-205-Expression verfügten (Abb. 4.19, Tabelle 4.2), wurde in dieser Arbeit überprüft, ob
die Antigenbeladung dieser DC möglich ist. Bei Analyse der Expression des kostimulatorischen Moleküls CD70 fiel auf, dass die Expression von CD70 auf den Patienten-DC signifikant niedriger war als auf DC, welche aus dem Blut gesunder Spender generiert wurden (Abb.
4.19). Dies schien jedoch an dem unterschiedlichen Herstellungsprotokoll der Patienten-mDC
zu liegen, da bei Verwendung des Protokolls, welches zur DC-Generierung aus dem Blut gesunder Spender angewendet wurde, die Patienten-DC ebensoviel CD70 auf der Oberfläche
exprimierten wie die gesunder Spender (Abb. 4.19). Mögliche Ursachen für diesen Unterschied in der CD70-Expression könnte die Verwendung von Medium mit allogenen statt mit
autologem Plasma sein. Außerdem wurde bei dem Protokoll für die DC-Generierung aus dem
Blut gesunder Spender die Monozyten aus Vollblut isoliert, wohingegen für die DC-Generierung der Patienten-DC Leukaphereseprodukte verwendet wurden. Die Expressionsstärke des
Aktivierungsmarkers CD25 war bei den Patienten-DC signifikant erhöht (Abb. 4.19), egal ob
die DC-Generierung nach dem Protokoll zur DC-Generierung aus dem Blut gesunder Spender
oder aus Leukaphereseprodukten von Melanompatienten erfolgte. Was die erhöhte CD25-Expression auf Patienten-DC verursachte, wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht näher analysiert,
aber sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.
Obwohl bei den Experimenten mit DC, hergestellt aus dem Blut gesunder Spender das DEC205-Targeting von reifenden Zellen zur effizientesten T-Zell-Stimulation führte (Abb. 4.17),
wurden 24 Stunden gereifte Patienten-mDC verwendet, da diese in ausreichender Menge zur
Verfügung standen. Außerdem sind die Ernte und die Beladung von mDC mit anti-DEC205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsproteinen besonders unter GMP-Bedingungen (good
manufacturing practice), die Grundvoraussetzung zur Durchführung klinischer Studien sind,
leichter durchführbar. Auch die Beladung der aus Patientenblut generierten mDC mit dem
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsproteins führte zu einer effizienten MHC-Klasse-II-Präsentation des Peptides (Abb. 4.20). Zwar wurden keine signifikanten Unterschiede zu
5. Diskussion
89
peptidbeladenen DC induzierten IL-2-Sekretion beobachtet, jedoch führte das DEC-205Targeting zur stärkeren Aktivierung der antigenspezifischen T-Zellen.
Für eine mögliche, spätere Anwendung als DC-basierter Impfstoff, ist es nötig, dass durch
DEC-205-Targeting beladene DC kryokonserviert werden können, um den Impfstoff wiederholt verabreichen zu können. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob DC ihre
T-Zell-Stimulationskapazität beibehalten, wenn sie nach dem DEC-205-Targeting eingefroren
werden. Zwar wurde ungefähr halb soviel IL-2 und IFNγ detektiert als wenn frische DC zur
Stimulation antigenspezifischer T-Zellen verwendet wurden, jedoch war die Stimulationskapazität der kryokonservierten durch DEC-205-Targeting beladenen DC erneut höher als die
der kryokonservierten peptidbeladenen DC (Abb. 4.20). Daher wären durch DEC-205Targeting beladene DC prinzipiell für eine spätere Anwendung als DC-Impfstoff geeignet.
Zusätzlich wurde gezeigt, dass DC, welche durch DEC-205-Targeting mit TA beladen wurden, auch die Proliferation antigenspezifischer T-Zellen auslösen können (Abb. 4.21). Dies ist
wichtig, da DC in einer späteren Immuntherapie auch die Proliferation spezifischer T-Zellen
induzieren müssen, um eine effiziente T-Zell-Immunantwort gegen einen Tumor einleiten zu
können.
5.1.7. Ausblick
Im Rahmen der Arbeit wurde gezeigt, dass die Inkubation von DC mit dem anti-DEC205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsprotein die Präsentation des MAGE-A3-Peptides in MHCKlasse-II-Molekülen bewirkt. Jedoch wurde die Effizienz des anti-DEC-205scFv-MAGE-A3EVD-Konstruktes, was zur Präsentation des MAGE-A3-Proteins in HLA-A1-Molekülen führen sollte, noch nicht analysiert. Prinzipiell sollte es aber möglich sein, eine MHC-Klasse-IPräsentation zu erhalten, nachdem schon viele Wissenschaftler gezeigt haben, dass das DEC205-Targeting hauptsächlich CD8+ T-Zell-Antworten induziert
79,187,191,195,199
und DEC-205+
murine DC auf die Kreuzpräsentation von Proteinen spezialisiert zu sein scheinen
79
. Daher
sollte in weiterführenden Versuchen analysiert werden, ob die Inkubation von DC mit dem
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-EVD-Konstrukt zur Präsentation des MAGE-A3-Peptides in
HLA-A1-Molekülen führt. Außerdem wäre es interessant zu untersuchen, ob die simultane
Beladung der DC mit dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL- und dem anti-DEC-205scFvMAGE-A3-EVD-Konstrukt eine gleichzeitige MHC-Klasse-I- sowie -II-Präsentation induziert. Möglich wäre auch die Herstellung von DEC-205scFv-Antigen-Konstrukten, bei denen
mehrere T-Zell-Epitope des Antigens C-terminal an den scFv fusioniert sind. Leider konnte
das anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-LP-Fusionsprotein im Rahmen der Arbeit nicht erfolg-
5. Diskussion
90
reich in 293T-Zellen exprimiert werden. Im Prinzip ist es aber möglich, längere Peptide oder
Proteindomänen C-terminal an einen scFv zu klonieren, da bereits scFv-Immuntoxine, bispezifische scFvs oder auch trispezifische Antikörper hergestellt wurden 157,237,267. Die Beladung
von DC mit nur einem Antigen, wie es bei dem anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Fusionsprotein der Fall wäre, könnte Selektionsdruck auf den zu behandelnden Tumor ausüben, was
zur Entstehung von antigennegativen Tumorzellen führen könnte. Diese Tumoren wären dann
durch diese Therapie nicht mehr behandelbar
268-270
. Um dies zu verhindern, könnten anti-
DEC-205scFv-Antigen-Fusionsproteine konstruiert werden, welche Epitope verschiedener
Tumorantigene enthalten. Mahnke et al. zeigten, dass es möglich ist, murine DC mit zwei verschiedenen Antigenen durch anti-DEC-205-Antikörper-Antigen-Konstrukte zu beladen 189.
Es wurden schon einige klinische Studien durchgeführt, bei denen Patienten Antigen zusammen mit Adjuvans verabreicht wurde, was indirekt die Aufnahme des Antigens durch DC und
deren anschließende Reifung auslösen sollte
173
. Jedoch wurden noch keine Studien initiiert,
bei denen humane DC über spezifische Konstrukte direkt beladen wurden. Experimente mit
Mäusen sowie in-vitro-Experimente mit humanen DC zeigten jedoch schon viel versprechende Ergebnisse, die darauf schließen lassen, dass in-vivo-Targeting humaner DC in der Krebsimmuntherapie anwendbar wäre. Bevor jedoch diese Behandlungsstrategie in der Klinik angewendet werden kann, ist es nötig, die verschiedenen DC-Subpopulationen in Patienten besser
zu definieren sowie die Expression und Funktion von DEC-205 auf anderen Körperzellen zu
untersuchen, um unerwünschte Effekte wie eine Toleranzinduktion durch spezialisierte DCSubpopulationen zu vermeiden
172,196
. Eine weitere Voraussetzung, um in-vivo-Targeting hu-
maner DC durchführen zu können, sind in-vitro-Analysen wie diese vorliegende Arbeit, um
die Antigenbeladung durch Targeting von Endozytoserezeptoren systematisch zu analysieren
und zu optimieren. Dabei wäre ein nächster wichtiger Schritt, die Effizienz des DEC-205Targeting an DEC-205+ DC zu analysieren, welche direkt aus gesunden Spendern sowie aus
Tumorpatienten isoliert wurden. Damit könnte untersucht werden, ob das in-vitro-Targeting
nicht nur mit aus Monozyten generierten DC funktioniert, sondern auch mit in vivo vorkommenden DC. In den letzten Jahren deutete immer mehr darauf hin, dass sich inflammatorische
DC sowie TipDC (TNF und iNOS-produzierende DC) in der Maus aus Monozyten entwickeln 49,271,272. Somit kommen aus Monozyten abgeleitete DC auch in der Natur vor. In der
vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass durch DEC-205-Targeting beladene DC die Proliferation und die Zytokinsekretion antigenspezifischer T-Zellen, welche durch Elektroporation
spezifischer TZR-RNA hergestellt wurden, induzieren können. Es wäre aber noch wichtig zu
analysieren, ob auch die Proliferation und Zytokinproduktion von T-Zellen, welche ex vivo
5. Diskussion
91
aus dem Blut von Tumorpatienten isoliert wurden, durch DEC-205-Targeting beladene DC
ausgelöst werden kann. Allerdings müsste bei dieser Art von Analysen berücksichtigt werden,
dass in diesen Patienten bereits antigenspezifische T-Zellen vorhanden sein können.
Die ex-vivo-Beladung von DC erlaubt die Produktion einer patientenspezifischen DC-Impfung, bei der DC mit einem klar definierten und kontrollierbaren reifen Phenotyp eingesetzt
werden
172
. Die Impfung von Patienten mit durch DEC-205-Targeting beladenen, ex-vivo-ge-
nerierten DC würde einen wertvollen Einblick in die Quantität und die Qualität der induzierten antigenspezifischen T-Zellen (z.B. Effektorzellen vs. regulatorische T-Zellen) liefern, indem die induzierten Immunantworten durch verschiedenste Immunomonitoring-Techniken
wie ELISPOT-Experimente, Tetramerfärbungen oder PCR-Analysen untersucht werden
273
.
Diese Erfahrungen würden dazu beitragen, das in-vivo-Targeting von DC zu verbessern und
um darüber entscheiden zu können, ob diese Technik wirklich effektiver ist als andere Impfstrategien.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das DEC-205-Targeting von aus Monozyten generierten DC eine effiziente MHC-Klasse-II-Präsentation von MAGE-A3-Peptid auf HLADP4-Molekülen bewirkt. Dabei hatte das Fusionsprotein keinen negativen Effekt auf den Phänotyp, das Zytokinsekretionsprofil sowie auf die Migrationsfähigkeit der DC. Auch DC, welche aus dem Blut von Patienten mit Malignem Melanom generiert wurden, konnten durch
DEC-205-Targeting mit TA beladen werden. Die Stimulationskapazität dieser DC blieb nach
der Kryokonservierung bestehen. Dabei führte das DEC-205-Targeting zu einer signifikant
verbesserten MHC-Klasse-II-Antigenpräsentation der DC gegenüber der direkten Peptidbeladung und der Elektroporation TA-kodierender RNA. Auf Grund dieser Ergebnisse stellt das
DEC-205-Targeting humaner DC als Antigenbeladungsmethode einen viel versprechenden
Ansatz in der Krebstherapie dar und wird in Zukunft hoffentlich dazu beitragen, die Behandlung von Tumoren zu optimieren.
5.2. Vereinfachte Klonierung von TZR und deren funktionelle Analyse mit
dem Jurkat-T-Zell-Testsystem
Der beste Weg, um die Effizienz verschiedener Strategien zur TA-Beladung von DC analysieren und miteinander vergleichen zu können, ist der direkte Nachweis der Präsentation der TAPeptide auf der Oberfläche der DC. Dies kann z.B. durch die Verwendung von TZR-ähnlichen Antikörpern (TCR-like antibodies), welche spezifisch einen MHC-Peptid-Komplex auf
DC binden, erfolgen 274. Jedoch ist die Menge an spezifischen MHC-Peptid-Komplexen oft zu
5. Diskussion
92
gering, um die Präsentation durchflusszytometrisch nachzuweisen (Beobachtung im Haus)
und es steht nur eine sehr geringe Auswahl an entsprechenden Antikörpern mit ausreichender
Affinität zur Verfügung. Eine weitere Option ist der Einsatz von antigenspezifischen T-ZellKlonen. Diese sind aber nur bedingt für den Nachweis der TA-Präsentation einsetzbar, da sie
schwer in der Zellkultur zu halten sind und instabile funktionelle Charakteristiken aufweisen
können
275
. Eine Alternative stellt die Herstellung von T-Zell-Klon-ähnlichen T-Zellen dar,
die durch Elektroporation von T-Zellen mit TZRα- und -β-Ketten-kodierender RNA generiert
wurden 209. Mit Hilfe solcher antigenspezifischer T-Zellen war es möglich, zum einen die Antigenpräsentation auf DC nachzuweisen, zum anderen verschiedene Antigenbeladungsstrategien miteinander zu vergleichen (siehe 5.1). Um die Präsentation verschiedenster TA in unterschiedlichen MHC-Molekülen auf DC nachwiesen zu können, ist jedoch ein großes TZR-Repertoire unabdingbar, da TCR-transfizierte T-Zellen nur jeweils spezifisch einen bestimmten
MHC-Peptid-Komplex auf DC erkennen können. Daher ist es wichtig, TZR aus T-Zell-Klonen mit einer schnellen und einfachen Methode klonieren zu können.
Doch TZR sind nicht nur bedeutend in der präklinischen Forschung, sondern werden auch in
der adaptiven Immuntherapie eingesetzt (siehe 2.3.4). So gewinnt die Herstellung von T-Zellen mit einer neuen Antigenspezifität, welche durch den Transfer von TZR generiert wurden,
immer mehr an Bedeutung in der Immuntherapie von Tumoren und Infektionskrankheiten
276,277
. Um eine Immuntherapie mit T-Zellen durchführen zu können, ist es ebenso nötig, Zu-
gang zu einer großen Auswahl an verschiedenen TZR zu haben, welche unterschiedliche Antigene erkennen, die auf verschiedenen HLA-Haplotypen präsentiert werden 278.
Die Klonierung von TZR aus T-Zell-Klonen war bisher äußerst zeitaufwendig. Da jede TZRkodierende-RNA wegen der somatischen Rekombination ein unterschiedliches 5` Ende aufweist, benötigte man bisher viele PCR-Reaktionen, um die 46 bzw. 67 variablen Regionen der
α- und β-Kette zu identifizieren
110
. Erschwerend kommt hinzu, dass T-Zell-Klone oftmals
mit T-Zellen kontaminiert sind, welche sich aus Feeder-Zellen ableiten und ihre eigenen TZR
besitzen. Des Weiteren bestehen „T-Zell-Klone“ oft aus einem Gemisch aus T-Zellen mit derselben Antigenspezifität und nicht aus T-Zellen mit nur einem antigenspezifischen TZR. Diese Faktoren machen es sehr schwierig unter Verwendung der üblichen Methoden TZR-kodierende-RNA aus T-Zell-Klonen zu isolieren und zu amplifizieren. Um TZR auch ohne das Wissen um das 5` Ende der RNA klonieren zu können, kann auf Techniken wie RACE, Marathon
oder auf die capswitch-Methode
279-281
ten Protokolle selten preisgegeben 281.
zurückgegriffen werden, jedoch wurden die detaillier-
5. Diskussion
93
5.2.1. Die neu etablierte TZR-PCR-Strategie erlaubt ein schnelles und einfaches
Klonieren unbekannter TZR aus T-Zell-Klonen
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde nun in Zusammenarbeit mit zwei weiteren in der
Arbeitsgruppe beschäftigten Doktoranden, Stefanie Hoyer und Christian Hofmann, eine TZRPCR-Strategie etabliert, welche auf der verbesserten capswitch-Methode von Harris et al.
226
basiert. Dabei wurde die Methode so modifiziert, dass jeweils der häufigste und daher dominante TZR-Subtyp eines „T-Zell-Klones“ identifiziert und kloniert werden kann. Die Strategie
wurde erfolgreich für 3 verschiedene TZR, einen HIV-spezifischen und zwei MelanA-spezifische TZR, angewendet. Die TZR-PCR-Strategie ist einfach und schnell durchzuführen, da nur
3 PCR-Reaktionen (Gesamt-cDNA-PCR, spezifische TZR-PCR, Schnittstellen-PCR) nötig
sind, um eine TZR-α- oder -β-Kette zu klonieren. Die letzte PCR-Reaktion kann sogar weggelassen werden, da die vorherige Sequenzierungsreaktion genügend Information liefert, um
die entsprechende cDNA zu synthetisieren, weil die kompletten hypervariablen Regionen sowie die angrenzenden Anteile der konstanten und variablen Regionen sequenziert werden.
5.2.2. Das robuste Jurkat-T-Zell-Testsystem ermöglicht eine schnelle und funktionelle
Charakterisierung neu klonierter TZR
Gerade aus verunreinigten T-Zell-Präparationen, bei denen vorher keine Vereinzelung der TZellen vorgenommen wurde, können TZR-kodierende-cDNAs amplifiziert werden, die entweder ein steriles Transkript oder die TZR-α- und/oder -β-Kette kontaminierender T-Zellen
kodieren. Daher kann es passieren, dass α− und β-Ketten unterschiedlicher TZR kloniert werden und daher nicht die gewünschte Antigenspezifität der T-Zellen erhalten wird, wenn die TZellen mit dieser TZR-α- und -β-Ketten-kodierender RNA elektroporiert werden. Auch wenn
der hergestellte TZR das richtige Antigen erkennt, ist es möglich, dass die Affinität des TZR
nicht ausreicht, um die Antigenpräsentation auf DC nachweisen zu können. Daher wurde im
Rahmen der Arbeit ein schneller und robuster Test entwickelt, um die antigenspezifische
Funktionalität neu klonierter TZR analysieren zu können, ohne dass wie früher auf Primärmaterial zurückgriffen werden muss
211,282
. Statt T-Zellen und DC zu verwenden, wurde die T-
Zelllinie Jurkat und die TAP-defiziente TxB Zellhybrid Zelllinie T2-A1 verwendet, die beide
leicht in der Zellkultur zu halten sind. Außerdem wird in dem etablierten Testsystem auf zeitintensive Methoden wie die Herstellung TZR-kodierender retroviraler Vektoren und deren retrovirale Transduktion in T-Zellen, sowie die Expansion und Selektion der transduzierten TZellen verzichtet 283. Stattdessen wurden Standardmethoden wie die Elektroporation von RNA
5. Diskussion
94
und DNA und die Bestimmung der Luziferaseaktivität mit Hilfe eines Luminometers verwendet. Da nicht nur eine CD4+ Jurkat-T-Zelllinie, sondern auch ein CD8-transgener Subklon der
T-Zelllinie Jurkat zur Verfügung stand, kann mit dieser Methode auch zwischen CD8-abhängigen und CD8-unabhängigen TZR unterschieden werden.
Die Funktionalität der 3 neu klonierten TZR wurde mit dem neu etablierten Jurkat-T-ZellTestsystem erfolgreich analysiert. Dabei konnte mit Hilfe dieses Tests nicht nur eine qualitative Aussage über die TZR-Funktionalität getroffen werden, sondern er lieferte auch quantitative Ergebnisse. Im Jurkat-T-Zell-Testsystem wurden für den HIV-spezifischen TZR und für
die beiden MelanA-spezifischen TZR unterschiedlich starke spezifische Luziferaseaktivitäten
ermittelt (Abb. 4.2.5), welches mit den Ergebnissen aus dem Zytokinproduktion- (Abb. 4.2.6)
und Proliferationsexperimenten (Abb. 4.2.7) sowie mit der bestimmten funktionellen Avidität
der TZR-transfizierten T-Zellen (Abb. 4.28) korrelierte. Außerdem lieferte der Test Hinweise
auf die Fähigkeit der TZR-transfizierten T-Zellen, endogen prozessiertes Antigen auf Tumorzellen zu erkennen (Abb. 4.29). Diese Ergebnisse zeigten, dass das Jurkat-T-Zell-Testsystem
ein verlässlicher und informativer Test ist, um die Funktionalität neu klonierter TZR schnell
zu analysieren. Dabei ersetzt er teuere Proliferations- und Zytotoxizitätsexperimente, bei denen auf Primärmaterial zurückgegriffen werden muss. Mit Hilfe dieses Tests kann nun schnell
darüber entschieden werden, ob ein neu klonierter TZR zum Nachweis der Antigenpräsentation auf DC eingesetzt werden kann.
5.3. Chimäre T-Zell-Rezeptoren
Die Verwendung von scFv-Antigen-Konstrukten bewirkte eine effiziente Beladung von DC
mit TA (siehe 5.1.). scFv ermöglichen aber auch die Konstruktion chimärer TZR (cTZR),
welche aus einem scFv als Bindedomäne und einer Signaldomäne bestehen (siehe Abb. 4.33).
T-Zellen, welche mit einem cTZR ausgestattet wurden, können – je nach Spezifität des verwendeten Antikörperderivats – antigenpositive Tumorzellen erkennen und lysieren. Dabei ist
die Erkennung nicht auf Peptide beschränkt, welche in MHC-Molekülen präsentiert werden,
wie es bei TZR-transfizierten T-Zellen der Fall ist. Diese MHC-unabhängige Erkennung von
Tumorzellen ermöglicht die Erkennung einer breiten Palette molekularer Strukturen auf Tumorzellen, die spezifischer für malignes Gewebe sind. Mit Hilfe dieser cTZR-transfizierten TZellen können auch nicht-proteinhaltige Antigene oder alternativ glykosylierte Proteinvarianten, welche durch die oftmals in Tumoren auftretende veränderte post-translationelle Glykosylierung entstehen, erkannt werden
284
. Der Einsatz von cTZR, welche alternativ glyko-
sylierte Proteine erkennen, kann daher die Spezifität gegenüber dem Tumor verbessern, wie
5. Diskussion
95
am Beispiel des stark glykosylierten Tumormarkers MUC1 gezeigt wurde
285
. Im Gegensatz
zu natürlichen TZR, kann es zu keiner Paarung des cTZR mit einer endogenen TZR-α- oder β-Kette kommen. Dies kann beim Einbringen eines herkömmlichen TZR in T-Zellen zum einem zu einer Verdünnung des gewollten TZR führen, zum anderen kann eine neue, unbekannte Antigenspezifität der TZR-transfizierten T-Zellen entstehen
203
. Dies wird durch den Ein-
satz von cTZR vermieden.
Die Wirksamkeit von cTZR-transfizierten T-Zellen wurde in vielen in-vitro-Experimenten,
sowie in Mausmodellen nachgewiesen (siehe 2.3.4 und
203
). Außerdem wurden bereits klini-
sche Studien mit cTZR-modifizierten T-Zellen zur Immuntherapie initiiert (siehe 2.3.4). Bisher wurden nur cTZR in klinischen Studien eingesetzt, welche retroviral mit dem entsprechenden cTZR transduziert wurden 203. Um die von retroviral transduzierten T-Zellen ausgehenden Gefahren zu eliminieren, sollte im Rahmen dieses Teilprojektes cTZR über RNA-Elektroporation in T-Zellen eingebracht und deren Funktionalität mit retroviral transduzierten T-Zellen verglichen werden.
5.3.1. cTZR-R:A-transfizierte T-Zellen erkannten und lysierten antigenspezifisch
Tumorzellen
In dieser Arbeit wurde durch den Transfer cTZR-kodierender-RNA MHC-unabhängige CEAund ErbB2-spezifische CD4+ sowie CD8+ T-Zellen hergestellt. Die RNA-Elektroporation
wurde zuerst verwendet, um die Expression von TA in DC zu ermöglichen 286,287 oder um die
Funktion dieser Zellen zu manipulieren 169,171. Anschließend wurde die RNA-Elektroporation
auch dazu verwendet, um T-Zellen mit einer neuen Antigenspezifität auszustatten 207,209,210,282.
Sowohl die durch RNA-Transfer hergestellten ErbB2-spezifischen als auch die CEA-spezifischen T-Zellen wurden antigenspezifisch von Tumorzellen aktiviert (Abb. 4.34) und konnten
antigenexprimierende Zellen lysieren (Abb. 4.35). Der verwendete CEA-spezifische cTZR
bindet nur an die membrangebundene Variante des CEA
288
und nicht an die lösliche CEA-
Variante, welche in großen Mengen im Serum vieler Patienten mit Magen-Darm-Krebs auftritt
289
. Diese Spezifität verhindert die Blockierung des CEA-cTZR und ist unabdingbar für
eine später mögliche Verwendung in der adaptiven T-Zell-Therapie. Mit diesen Ergebnissen
wurde gezeigt, dass der Transfer cTZR-kodierender RNA zur Herstellung funktioneller antigenspezifischer T-Zellen verwendet werden kann. Diese Ergebnisse bestätigen die Arbeiten
von Rabinovich et al., welche zeigen konnten dass T-Lymphozyten, welche durch RNAElektroporation mit einem CD19-spezifischen cTZR ausgestattet wurden, Zytotoxizität ge-
5. Diskussion
96
genüber antigenpositiven Tumorzellen aufwiesen
290
. Des Weiteren konnten ErbB2-cTZR-
RNA-elektroporierte T-Zellen das Tumorwachstum in einem Mausmodell inhibieren 291.
5.3.2. R:A-transfizierte T-Zellen vs. retroviral transduzierte T-Zellen
Die Verwendung RNA-elektroporierter T-Zellen besitzt einige Vorteile gegenüber dem Einsatz retroviral transduzierter T-Zellen. Die RNA-Transfektion ist im Vergleich zur retroviralen Transduktion sehr schnell durchführbar und führt zu mehr als 80 % cTZR-positiver T-Zellen (Abb. 4.31). Diese hohe Ausbeute an cTZR-positiven T-Zellen würde die vorherige Selektion und ex-vivo-Expansion der generierten antigenspezifischen T-Zellen unnötig machen, da
bereits aus einer Lymphophorese, bei der bis zu 2 x 109 CD8+ T-Zellen isoliert werden können
292
, genügend cTZR-exprimierende T-Zellen für die adaptive Immuntherapie generiert werden
könnten. Aber auch eine kurze Expansion mit IL-2 und OKT-3 dieser Zellen unter bestimmten Umständen wäre vor der Elektroporation möglich und wurde im Rahmen der Diplomarbeit von Christian Krug in der Arbeitsgruppe bereits erprobt. Im Gegensatz dazu ist die extensive Expansion CD8+ T-Zellen, welche oftmals vor einer retroviralen Transduktion von TIL
durchgeführt werden muss (siehe 2.3.4), nicht ratsam und sollte vermieden werden, da sich
die T-Zellen zu Effektor-Gedächtniszellen entwickeln könnten, was eine reduzierte Effektorfunktion sowie eine niedrige anti-Tumoraktivität zur Folge hätte 293,294.
Ein weiterer Vorteil RNA-transfizierter T-Zellen ist die transiente Expression des cTZR, welche am Tag 9 nach der RNA-Elektroporation nicht mehr auf der Oberfläche der T-Zellen
nachgewiesen werden konnte (Abb. 4.32). Durch den Transfer modifizierter T-Zellen können
unbeabsichtigte Autoimmunreaktionen auftreten. Die Gefahr von autoreaktiven, mit einer
neuen Antigenspezifität ausgestatteten T-Zellen wurde in einer klinischen Studie mit Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom offensichtlich. T-Zellen, welche retroviral mit einem carbonic-anhydrase-IX-spezifischen cTZR transduziert wurden, zerstörten antigenexprimierende Zellen des Gallengangs und lösten damit eine schwere Lebertoxizität aus
295
. Der
Einsatz von RNA-transfizierten T-Zellen jedoch würde eine auftretende Autoreaktiviät der TZellen zeitlich begrenzen, da die cTZR nach 9 Tagen nicht mehr auf der Zelloberfläche exprimiert werden (Abb. 4.32). Wissenschaftler versuchen mittlerweile, die Gefahr retroviral transduzierter T-Zellen zu begrenzen, indem so genannte „Selbstmordgene“ in die T-Zellen eingebracht werden
296-298
, um diese Zellen bei einer auftretenden Autoraktivität eliminieren zu
können. Jedoch ist es fraglich, ob wirklich alle autoreaktiven T-Zellen mit solchen Methoden
entfernt werden können. In einer kürzlich veröffentlichen Studie führte die Verwendung von
T-Zellen, welche retroviral mit einem ErbB2-spezifischen cTZR ausgestattet wurde, zum Tod
5. Diskussion
97
des behandelten Patienten. Der in dieser Studie verwendete cTZR war ein cTZR der dritten
Generation (siehe 5.3.3), welcher über eine CD28 und eine 4-1BB kostimulatorische Domäne
verfügte, um die Zytokinproduktion und die lytische Aktivität der cTZR-transfizierten T-Zellen zu erhöhen
186
. Die transferierten T-Zellen gelangten nach der intravenösen Injektion in
die Lunge des Patienten und sekretierten nach Aktivierung durch Lungenepithelzellen, welche
geringe Mengen an ErbB2 exprimieren, verschiedenste Zytokine wie IFNγ, GM-CSF, TNF,
IL-6 und IL-10
299
. Bereits bei einer klinischen Studie mit einem bispezifischen Antikörper,
welcher gegen ErbB2 und FcγRIII gerichtet war, wurden in einigen der behandelten Patienten
Nebenwirkungen einschließlich Atemnot mit arterieller Sauerstoffentsättigung und Hypotonie
sowie ein Anstieg von TNF im Serum dieser Patienten beobachtet 300. Im Gegensatz zu therapeutischen Antikörpern, deren Halbwertszeit im Serum begrenzt ist, proliferieren cTZR-transfizierte T-Zellen nach Antigenstimulation und verstärken damit die – in diesem Fall – schädliche Immunantwort. Möglicherweise war auch die Menge an injizierten T-Zellen zu hoch, da –
im Gegensatz zu anderen Studien mit cTZR-transfizierten T-Zellen –hoch wirksame T-Zellen
verwendet wurden, welche durch den Transfer eines cTZR der dritten Generation generiert
wurden
299
. Um schwere Nebenwirkungen in klinischen Studien mit cTZR-transfizierten T-
Zellen künftig zu vermeiden, sollten in diesen zunächst geringere Mengen von T-Zellen eingesetzt werden, welche den cTZR transient exprimieren.
Die transiente Expression des cTZR nach RNA-Transfer hat aber auch Nachteile: cTZR-transfizierte, lytische CD8+ T-Zellen können nur in einem kurzen Zeitraum durch antigenexprimierende Tumorzellen aktiviert werden. Außerdem führt der Verlust der cTZR-Expression
zum Verlust der neu vermittelten Antigenspezifität, wohingegen die retrovirale Transduktion
die klonale Expansion der transduzierten T-Zellen erlaubt, ohne dass in den ersten Wochen
die Expression des eingeführten cTZR verloren geht
301
. Aus diesem Grund müssten durch
RNA-Transfer hergestellte cTZR-exprimierende T-Zellen bei einer möglichen Anwendung
als adaptive Immuntherapie wiederholt in die Patienten injiziert werden, damit über einen längeren Zeitraum die lytische Aktivität der cTZR-transfizierten T-Zellen in einem Patienten aufrecht erhalten werden kann. Ein weiterer Nachteil gegenüber retroviral transduzierten T-Zellen ist, dass die cTZR-transfizierten T-Zellen selbst kein langlebiges immunologisches Gedächtnis ausbilden können. Allerdings könnte dies über epitope spreading geschehen 302.
Obwohl die transiente Expression der cTZR in den T-Zellen Vorteile hinsichtlich einer sicheren Anwendung in der Immuntherapie bringt, ist es fraglich, ob die T-Zellen rechtzeitig die antigenpositiven Tumorzellen erreichen können, wenn sie intravenös verabreicht werden. Allerdings wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass RNA-transfizierte T-Zellen nicht nur 4 Stunden
5. Diskussion
98
nach der Elektroporation antigenspezifisch IFNγ sekretieren (Abb. 4.36), sondern dass sie
selbst nach 2-tägiger Aktivierung antigenpositive Tumorzellen lysieren und somit ihre lytische Aktivität nach der Injektion in die Patienten noch für mindestens zwei Tage aufrechterhalten können. Eine Möglichkeit die Zeit, die die T-Zellen benötigen, um auf ihre Zielzellen
zu treffen zu reduzieren, wäre die direkte Injektion der T-Zellen in den Tumor, wenn dieser an
einer zugänglichen Stelle positioniert ist. Außerdem würde so auch die benötigte Anzahl an
cTZR-transfizierten T-Zellen verringert werden. Bei intravenöser Applikation sind das
homing sowie die lokale Expansion der eingebrachten T-Zellen entscheidend für den Erfolg
einer adaptiven T-Zell-Immuntherapie. Die Injektion der T-Zellen direkt in den Tumor würde
diese Problematik umgehen. Wenn durch die adaptive T-Zell-Immuntherapie das immunsuppressive Milieu im Tumor durchbrochen werden würde, könnte dann durch die Immuntherapie epitope spreading induziert werden, welches mit einem positiven klinischen Verlauf korrelieren würde 303. Die IFNγ-Produktion sowie die lytische Aktivität der retroviral transduzierte T-Zellen waren etwa doppelt so hoch wie die der RNA-transfizierten T-Zellen (Abb. 4.36
und Abb. 4.37). Die Aktivität letzterer könnte aber optimiert werden, indem entweder der verwendete cTZR oder die eingesetzte cTZR-kodierende RNA
304
weiter verbessert wird, oder
die T-Zellen in einem anderen Aktivierungszustand verwendet werden.
Da beim RNA-Transfer keine Verwendung von zusätzlichen Vektorelementen benötigt wird,
kann keine Integration ins Genom erfolgen. Im Gegensatz dazu führt die retrovirale Transduktion eines Transgens zur Integration des Proviruses in die DNA der Wirtszelle. Diese retrovirale Integration kann auch innerhalb oder in der Nähe von Genen statt finden, welche den
Zellzyklus kontrollieren. So kann z.B. der Provirus Tumorsuppressor-kodierende Gene durch
Integration zerstören, oder die Integration führt zur konstitutiven Aktivierung von Protoonkogenen. Diese Problematik wurde in einer klinischen Studie mit Patienten, welche an schweren
kombinierten Immundefekt (severe combined immunodeficiency, SCID) leiden, ersichtlich.
Die Injektion von autologen retroviral transduzierten hematopoietischen Stammzellen führte
in einigen Patienten zu leukämieartigen Symptomen, welche durch die Integration des Proviruses in das LMO-2-Onkogen ausgelöst wurde 305,306. Das Risiko einer malignen Transformation von ausdifferenzierten T-Zellen ist zwar wesentlich geringer
307-309
, jedoch kann es nicht
ausgeschlossen werden, dass es in Einzelfällen auftreten könnte.
5.3.3. Ausblick
Obwohl es sich bei dem vorliegenden cTZR bereits um einen cTZR der zweiten Generation
handelt, bei dem die Effektorfunktion durch die Verwendung der Transmembran- und intra-
5. Diskussion
99
zellulären Domäne des kostimulatorischen Moleküls CD28 bereits verbessert wurde 213, könnte dessen Funktion weiter optimiert werden. So führte der Einbau der src-Kinase Lck zu einer
verbesserten cTZR-Funktionalität
310
. Diese Kinase scheint die Kreuzvernetzung des CD4-
oder CD8-Korezeptors mit dem cTZR zu fördern, was die Phosphorylierung der tyrosinbasierten Aktivierungsmotive des cTZRs begünstigt und somit die Wirksamkeit des cTZR verstärkt
203
. Die Verwendung von bispezifischen cTZR, welche gleichzeitig zwei verschiedene
TA binden können, würde die Spezifität der cTZR-transfizierten T-Zellen gegenüber einen
Tumor erhöhen. Die Funktionalität eines CEA- und TAG-72-spezifischen, bispezifischen
cTZR wurde bereits in vitro analysiert 311. Außerdem könnte die Funktionalität des CEA-spezifischen sowie des ErbB2-spezifischen cTZR in anderen Immunzellen wie CD56+ CD3- NKZellen, Neutrophilen Granulozyten oder Makrophagen überprüft werden, da bereits gezeigt
wurde, dass die spezifische lytische Aktivität dieser Zellen durch cTZR-Transfer verbessert
wurde 312-314.
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass es möglich ist, T-Zellen durch RNA-Transfer
mit einem cTZR auszustatten und das diese T-Zellen annähernd die gleiche Funktionalität
aufweisen wie retroviral transduzierte T-Zellen. Daher wäre es interessant, diese T-Zellen in
klinischen Studien zu testen, zumal bei der Verwendung RNA-elektroporierter T-Zellen weitaus geringere gesetzliche Vorlagen erfüllt werden müssen als bei der Verwendung retroviral
transduzierter Zellen, da es sich nicht um Gentherapie handelt. Möglich wäre auch ein 2-Stufen-Therapiemodel, in dem sowohl durch RNA-Transfer hergestellte antigenspezifische TZellen als auch retroviral transduzierte T-Zellen verwendet werden. Dabei könnten zunächst
cTZR-RNA-elektroporierte T-Zellen injiziert werden, um die Effizienz der antigenspezifischen T-Zellen gegenüber dem Zielantigen überprüfen zu können. Wenn die T-Zellen sich als
effizient herausstellen sowie keine schädliche Autoreaktivität beobachtet wird, könnte in einem zweiten Schritt retroviral mit demselben cTZR transduzierte T-Zellen verabreicht werden,
um dann die Vorteile retroviral transduzierter T-Zellen nützen zu können.
5.4. Abschließender Kommentar
Die erfolgreiche Behandlung von Tumoren stellt trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung
immer noch eine der größten Herausforderung der heutigen Zeit dar. Zwar wurden in den letzten Jahrzehnten bereits große Fortschritte erzielt, jedoch ist immer noch Bedarf an innovativen Therapieansätzen vorhanden. Im Rahmen der Arbeit wurden u.a. zwei unterschiedliche,
scFv-basierte Ansätze zur Behandlung verschiedenster Tumorarten etabliert und analysiert.
Zum einen wurde gezeigt, dass mit Hilfe eines DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstruktes
5. Diskussion
100
in vitro eine effiziente MHC-Klasse-II-Präsentation des TA MAGE-A3 erzielt werden konnte.
Zum anderen wurde die Funktionalität von cTZR, welche einen scFv als antigenbindende Domäne besitzen, analysiert. Dabei konnten T-Zellen, welche über RNA-Transfer mit dem cTZR
ausgestattet wurden, antigenpositive T-Zellen spezifisch erkennen und lysieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass scFv äußerst vielseitig in therapeutischen Ansätzen eingesetzt werden können. Daher könnten diese immunologischen „Werkzeuge“ in der Zukunft dazu beitragen, den
Behandlungserfolg maligner Erkrankungen zu verbessern.
6. Material und Methoden
101
6. Material und Methoden
6.1. Material
6.1.1. Arbeitsmaterialien
Tabelle 6.1: Arbeitsmaterialien
Material
Firma, Stadt, Land
24-Well Transwell-Platten
Corex-Röhrchen, Cat. Nr. 00156
Counterplatte
Dialyseschläuche (MW 6.000-8.000)
Elektroporationsküvetten, 4 mm, 2 mm
FACS-Röhrchen
Falcons (15 ml, 50 ml)
Gewebekulturflaschen (steril, 25, 75, 175 cm2)
Gewebekulturplatten (steril, 6-, 12-, 24-, 48-, 96-Well)
Flachboden
Gewebekulturplatten (steril, 96-Well) Rundboden
Gewebekulturschalen
Inserts (Porengröße 5 µm)
Kryokonservierungsbehälter
Kryokonservierungsröhrchen
Kulturröhrchen
Küvetten zur OD-Messung
MACS Apparatur
MACS separation columns MS/LS
Neubauer-Zählkammer
Nitrozellulose-Membran (0,2 µm)
Parafilm
PCR-Reaktionsgefäße
Petrischalen (Bakterienkultur)
Pipetten, steril (1 ml, 5 ml, 10 ml 25 ml)
Pipettenspitzen (10 µl)
Pipettenspitzen (10 µl, 100 µl, 1000 µl)
Pipettenspitzen, gestopft (1-10 µl, 1-20 µl, 1-100 µl,
100-1000 µl)
Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2 ml)
Reaktionsgefäße (2 ml)
Reaktionsgefäßständer
Rotilab-Aufbewahrungsbox
Spritzen mit Luer Aufsatz
Sterile Einweghandschuhe, Nitril, Digital N powderfree
Sterile Einweghandschuhe, Peha Soft powderfree
Sterilfilter
Zellkulturschalen (293T-Transfektion)
Zentrifugenbecher
Nunc, Rochester, New York, USA
DuPont Instruments, Bad Homburg
Perlin Elmar, Waltham, Massachusetts, USA
Spectra Por, Breda, die Niederlande
Peqlab, Erlangen
Greiner, Kremsmünster
Greiner, Kremsmünster
Nunc, Wiesbaden
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
Nunc, Wiesbaden
Nalagene, Rochester, New York, USA
Nunc, Wiesbaden
Simport, Beloeil, Kanada
Eppendorf, Hamburg
Miltenyi, Bergisch-Gladbach
Miltenyi, Bergisch-Gladbach
Roth, Karlsruhe
Schleicher und Schuell, Dassel
Schubert + Weiss, München
Starstedt, Numbrecht
Greiner, Kremsmünster
Corning Incorporated, New York, USA
VWR, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Star Lab GmbH, Ahrensburg
Peqlab, Erlangen
Eppendorf, Hamburg
Nunc, Wiesbaden
Roth, Karlsruhe
BD, Heidelberg
Hartmann, Heidenheim
Hartmann, Heidenheim
Nunc, Wiesbaden
Greiner, Kremsmünster
Nalgene, Rochester, New York, USA
6.1.2. Laborgeräte
Tabelle 6.2: Laborgeräte
Gerät
Firma, Stadt, Land
Brutschrank, BRRD 6220 (Zellkultur)
Brutschrank/Schüttler, Innova 4200
Durchflusszytometer, FACS-scan
Eismaschine
Elektroporator, Gene Pulser II
Elektroporator, Gene Pulser XCell
Feinwage, BP2100D
Heraeus, Hanau
New Brunswick Scientific, Edison, USA
BD, Heidelberg
Scotsman, Maintal
BioRad, München
BioRad, München
Satorius, Göttingen
6. Material und Methoden
Gelkammern, Min-Sub CellGT
Grobwage, BP2100
Horizontalschüttler, Duromax 1030
Horizontalschüttler, Innova 44
Kühlschränke
Megafuge 2.RS
Mikroskop, DMIL
Mikrowelle Privileg 8018
Nass-Transferapparat Protean II Cell and System
PCR-Maschine Biometra Personal Cyler
PCR-Maschine Cyclone 25
PCR-Maschine PTC-200
Photometer
Pipettboy
Pipetten
Plastiksäulchen (zur Proteinaufreinigung)
Reinstwassersystem
Schikanekolben (0,5 l)
SDS-Gelkammern (Mighty Small II SE250/260)
Sorvall Evolution RC
Spannungsquelle
Sterilbank (HeraSafe)
Tischzentrifuge 5417
Biometra (UV-Inaktivierung)
UV-Meter (Multiple Light Cabinett)
Vortexer (MS1 Minishaker)
Wallac 1420 Luminometer
Wallac 1450 Micro beta plus
Wasserbad
Röntgenfilm-Entwickler Curic 60
Zentrifuge AllegraTMX-12R
Zentrifuge Multifuge 3-SR
102
BioRad, München
Satorius, Göttingen
Heidolph, Schwabach
New Brunswick Scientific, Edison, USA
Liebherr, Bulle, Schweiz
Heraeus, Hannau
Leica, Wetzlar
Privileg, Quelle, Nürnberg
BioRad, München
Biometra, Göttingen
Peqlab, Erlangen
MJ Research, BioRad, München
Eppendorf, Hamburg
Hirschmann-Laborbedarf, Eberstadt
VWR, Darmstadt
Gilson, Bad Camberg
Eppendorf, Hamburg
BioRad, München
Millipore, Billerica, Massachusetts, USA
Schott Duran, Wertheim/Main
Hoefer, Holliston, USA
Thermo, Waltham, Massachusetts, USA
BioRad, München
Heraeus, Hanau
Eppendorf, Hamburg
Biometra, Göttingen
Biozym, Oldendorf
IKA, Staufen
Perkin Elmer, Waltham, USA
Wallac, Turku, Finnland
Thermo, Waltham, Massachusetts, USA
Agfa, Köln
Beckman Coulter, Krefeld
Heraeus, Hanau
6.1.3. Chemikalien
Tabelle 6.3: Chemikalien
Chemikalie
Firma, Stadt, Land
4-Nitrophenyl-b-D-glucoronid
Na251CrO4
Acrylamidmix (30 %)
Amoniumperoxidsulfat, APS
Ampicillin
Ladepuffer
Bromphenolblau
BSA (für Western Transfer Experimente)
BSA 1 mg/ml (Proteinstandard)
Calciumchlorid
Chloroquin
Coomassie-Brilliant Blue
Desthiobiotin
Dikaliumhydrogenphosphat
Dinatriumhydrogenphosphat
DNA-Leiter (100 Bp, 1kBp)
dNTPs
ECL-Reagenz
EDTA
Essigsäure
Ethanol, 70%, 99,9 %
Ethidiumbromid (10 mg/ml)
Glukose
Glycerin
Glycin
Glycin-Betain
Fluka, Sigma-Aldrich, Steinheim
MP Biomedicals Inc., Illkirch, Frankreich
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Fluka, Sigma-Aldrich, Steinheim
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
NEB, Frankfurt am Main
BD Clontech, Heidelberg
Pierce, Thermo, Waltham, Massachusetts, USA
Sigma-Adrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Amresco, Solon, Ohio, USA
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
6. Material und Methoden
HABA
Hefeextrakt
Imidazol
IPTG
Isoamylalkohol
Isopropanol
Kaliumacetat
Kaliumdihydrogenphosphat
Kanamycin
KCl
LB-Agar
LB-Medium
LPS (E. coli 055:B5)
Luziferin
Methanol
Milchpulver
MOPS
NaCl
Natriumacetat
Natriumazid
Natriumdihydrogenphosphat
Natriumhydroxid
n-Butanol
Ni-NTA-Agarose
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol
Rainbow Standard RPN800
RNA-Leiter
Saccharose
SDS
Sorbitol
Strep-Tactin Sepharose Perlen
Szintilationsflüssigkeit
TEMED
Tris-Base
Triton X-100
Trypanblau
Trypton
Tween 20
Zinkchlorid
103
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Promega, Madison, USA
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Qiagen, Hilden
Roth, Karlsruhe
Amersham, GE Europe, München
Invitrogen, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
IBA, Göttingen
Perlin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA
Roth, Karslruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
Promega, Mannheim
Fluka, Sigma-Aldrich, Steinheim
6.1.4. Zellkulturmedien und Zusätze
Tabelle 6.4: Zellkulturmedien und Zusätze
Medium/Zusatz
Firma, Stadt, Land
10xTrypsin
CFSE
D-MEM (Glutamax, 4,5g/l D-Glucose, Pyruvat)
DMSO
DPBS (1x)
ErbB2/Fc rekombinantes Protein
FCS
Geneticin
Gentamycin
Glucoselösung, Glucosteril 40 %
Hepes Puffer, 1 M, pH 6,5-7,5
HSA 20%
Humanes Plasma
Lonza, Verviers, Belgien
Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe
Gibco Invitrogen, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Lonza, Verviers, Belgien
R&D Systems, Wiesbaden
PAA, Pasching, Österreich
Gibco Invitrogen, Karlsruhe
PAA, Pasching, Österreich
Fresenius, Bad Homburg
PAA, Pasching, Österreich
Baxter, Unterschleißheim
freiwillige gesunde Spender und Melanompatienten
(Leukapheresen, Blutabnahme)
Lonza, Verviers, Belgien
Sigma-Aldrich, Steinheim
Lonza, Verviers, Belgien
PAA, Pasching, Österreich
Invitrogen, Karlsruhe
Lonza, Verviers, Belgien
Sigma-Aldrich, Steinheim
Humanes Serum
Ionomycin
L-Glutamin
Nicht-essentielle Aminosäuren (100x)
OptiMEM
Penicillin-Streptomycin
PMA
6. Material und Methoden
104
RPMI 1640
Natriumpyruvat
β-Mercaptoethanol (2-ME)
Lonza, Verviers, Belgien
PAA, Pasching, Österreich
Gibco, Invitrogen, Karlsruhe
6.1.5. Zytokine und Chemokine
Tabelle 6.5: Zytokine und Chemokine
Zytokin
Firma, Stadt, Land
CCL19
GM-CSF
IL-1β
IL-2
IL-4
IL-6
IL-7
PGE-2
TNF
Peptrotech, Hamburg
CellGenix, Freiburg
CellGenix, Freiburg
Proleukin®, Chiron, Novartis, Hannover
CellGenix, Freiburg
CellGenix, Freiburg
Peprotech, Hamburg
Pfizer, Puurs, Belgien
Bender, Wien, Österreich
6.1.6. Peptide
Tabelle 6.6: Peptide
Peptid
MHC-Molekül
AS-Sequenz
Firma, Stadt, Land
HIV p17 (gag)
HIV RT (pol)
MAGE-A3168-176
MAGE-A3243-258
MelanA ana
MelanA wt
NY-ESO-1157-170
HLA-A2
HLA-A2
HLA-A1
HLA-DP4
HLA-A2
HLA-A2
HLA-DP4
SLYNTVATL
ILKEPVHGV
EVGPIGHLY
KKLLTQHFVQENYLEY
ELAGIGILTV
EAAGIGILTV
SLLMWITQCFLPVF
Sigma Genosys, Steinheim
Sigma Genosys, Steinheim
Clinalpha Merck, Darmstadt
Clinalpha Merck, Darmstadt
Sigma Genosys, Steinheim
EMC, Tübingen
Clinalpha Merck, Darmstadt
6.1.7. Kommerziell erhältliche Kits
Tabelle 6.7: Kommerzielle Kits
Kit
Firma, Stadt, Land
chemisch kompetente XL1-Blue E. coli
Cytofix/Cytoperm
Endofree Plasmid Maxiprep Kit
Gel Extraction Kit
Human Inflammation Kit CBA
Human TH1/TH2 CBA
Luciferase Assay System
Micro-Beads (anti-CD8, anti-CD4, anti-PE)
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit
peqGold Trifast
QIAquick Miniprep Kit
QIAquick PCR Purification Kit
Rneasy Mini Kit
Site-directed mutagenesis Kit
Stratagene, Heidelberg
BD Biosciences, Heidelberg
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
BD Biosciences, Heidelberg
BD Biosciences, Heidelberg
Progmega, Madison, USA
Miltenyi, Bergisch-Gladbach
Ambion/Applied Biosystems, Austin, Texas, USA
Peqlab, Erlangen
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Stratagene, Heidelberg
6. Material und Methoden
105
6.1.8. Enzyme und deren Puffer
Tabelle 6.8: Enzyme
Enzym
Zugehöriger Puffer
Firma, Stadt, Land
Advantage 2 Polymerase
Pfu Polymerase (2,5 U/µl)
Powerscript Reverse Transcriptase
T4-Ligase (20.000 U/ml)
Advantage buffer (10x)
Pfu buffer (10x)
First strand buffer (5x)
Ligasepuffer
BD Clontech, Heidelberg
BD, Heidelberg
BD Clontech, Heidelberg
Stratagene, Heidelberg
Die Restriktionsenzyme wurden alle vom Hersteller NEB (Frankfurt am Main) bezogen.
6.1.9. Antibiotika
Tabelle 6.9: Antibiotika
Vektor
Antibiotikum
Konzentration
pAK400
pet27b-anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid
pF143-GFP
pGEM4Z-5`NTR-XXX-3`NTR
pSecTag2-HygroC-anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid
pSecTag2-HygroC-anti-MCSPscFv-MAGE-A3-Peptid
Chloramphenicol
Kanamycin
Ampicillin
Ampicillin
Ampicillin
Ampicillin
1 µg/ml
250 µg/ml
1 µg/ml
1 µl/ml
1 µg/ml
1 µg/ml
6.1.10. Vektoren
Tabelle 6.10: Vektoren
Puffer
Firma/Person, Stadt, Land
Transluc Vektor
pAK400 MCSPHL
pSAMEN-ErbB2-CD28-ζ
pBullet-κL-BW431/26scFv-F-CD28-ζ
pF143-GFP
pet27b-Strep-anti-DEC-205scFv-Peptid-His
pGEM4Z-MAGE-A3-64A
pGEM4Z-5`NTR-sig-hu-Survivin-DClamp-3`NTR
pGEM4Z-5`UTR-sig-MAGE-A3.DC.LAMP-3`UTR
pSeqTag2-HygroC-Strep-4G7mutxCD16mut
Panomics, Freemont, USA
Prof. G. Fey, Erlangen
Prof. M. Kershaw, Melbourne, Australien
Prof. H. Abken, Köln
Prof. G. Fey, Erlangen
Prof. G. Fey, Erlangen
Argos Therapeutics, Durham, North Carolina, USA
Prof. K. Thielemans, Brüssel, Belgien
Prof. K. Thielemans, Brüssel, Belgien
Prof. G. Fey, Erlangen
6.1.11. Software
Tabelle 6.11: Software
Software
Hersteller, Stadt, Land
Excel, Word, Powerpoint
Graphpad Prism
Vector NTI
Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA
GraphPad Software, Californien, USA
Invitrogen, Karlsruhe
6.1.12. Puffer und Lösungen
6.1.12.1. Puffer und allgemeine Medien für die Zellkultur
Tabelle 6.12: Verwendete Puffer und allgemeine Medien für die Zellkultur
Puffer/Medium
Bestandteile
4-Nitrophenyl-b-Dglucoronide-Lösung
0,01 M 4-Nitrophenyl-b-D-glucoronide
0,1 M Natriumacetat-Lösung pH 4,0
6. Material und Methoden
106
Einfriermedium
100 ml
11 % HSA
10 % Glucose
4 % DMSO
FACS-Puffer
500 ml DPBS (1x)
1 % FCS (hitze-inaktiviert für 30 min bei 56 °C)
0,02 % Natriumazid
MACS-Puffer
500 ml DPBS (1x)
0,5 % HSA
Migrationsmedium
RPMI 1640
1 % Humanserum
1 % BSA
1 % Penicillin-Streptomycin
1 % L-Glutamin
vor Gebrauch frisch zugeben:
300 IU/ml GM-CSF
250 U/ml IL-4
PBS-EDTA
500 ml DPBS (1x)
0,2 M EDTA
6.1.12.2. Allgemeine Puffer und Medien für Molekularbiologische Arbeiten
Tabelle 6.13: Verwendete allg. Puffer und Medien für Molekularbiologische Arbeiten
Puffer
Bestandteile
Menge
2xYT
pH 7,2
NaCl
Hefeextrakt
Trypton
5 g/l
10 g/l
16 g/l
Laufpuffer TAE (50x),
pH 8,1; 1 l
Tris-Base
Essigsäure
0,5 M EDTA (pH 8,0)
242 g
57,1 ml
100 ml
LB-Agar (nach Lennox)
pH 7,1; l l;
autoklavieren
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
Agar-Agar
10 g
5g
5g
15 g
LB-Medium
(nach Lennox)
pH 7,1; 1 l
autoklavieren
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
10 g
5g
5g
MOPS-Puffer
1 l; steril filtern
MOPS
41,8 g
in 700 ml RNAse freiem Wasser lösen, auf pH 7 mit
2M NaOH-Lösung einstellen
anschließend
1 M Natriumacetat
0,5 M EDTA (pH 8)
20 ml
20 ml
PBS (10x)
pH 7,2
KCl
Na2HPO4
KH2HPO4
2,7 mM
4,3 mM
1,4 mM
SOB-Medium
1 l; autoklavieren
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
20 g
5g
0,5 g
SOC-Medium
1 l; autoklavieren
SOB-Medium
2 M Glukose
10 ml
100 µl
TB-Medium
Trypton
12 g/l
6. Material und Methoden
Hefeextrakt
Glycerin
Kalium-Phosphat-Puffer
107
10 g/l
2%
10 %
6.1.12.3. Puffer für Proteinexpression, -aufreinigung und -detektion
Tabelle 6.14: Verwendete Puffer für Proteinexpression, -aufreinigung und -detektion
Puffer/Lösung
α-His-TBS
pH 7,4
Bestandteile
Tris-HCl
NaCl
Menge
10 mM
150 mM
α-His-TBS-TweenTrition-Puffer
pH 7,4
Tris-HCl
NaCl
Tween 20
Triton X-100
20 mM
500 mM
0,05 %
0,2 %
Coomassie-Entfärber
Methanol
Essigsäure
30 %
10 %
CoomassieFärbelösung
Methanol
Essigsäure
Coomassie Brilliant Blue
45 %
10 %
0,25 %
His-Dialysepuffer
pH 8
NaH2PO4
NaCl
Imidazol
50 mM
300 mM
10 mM
His-Elutionspuffer
pH 8
NaH2PO4
NaCl
Imidazol
50 mM
300 mM
250 mM
His-Waschpuffer
pH 8
NaH2PO4
NaCl
Imidazol
50 mM
300 mM
20 mM
Kalium-PhosphatPuffer
KH2PO4
K2HPO4
185 mM
714 mM
PeriplasmaExtraktionspuffer
Tris-HCl
Saccharose
EDTA
100 mM
500 mM
1 mM
SDS-Sammelgel
(12 %)
MQ
30 % Acrylamidmix
1 M Tris pH 6,8
10 % SDS Lösung
10 % APS Lösung
TEMED
6,8 ml
1,7 ml
1,25 ml
0,1ml
0,1 ml
0,01 ml
SDS-Trenngel
(12 %)
MQ
30 % Acrylamidmix
1,5 M Tris pH 8,8
10 % SDS Lösung
10 % APS Lösung
TEMED
8,2 ml
10 ml
6,3 ml
0,25 ml
0,25 ml
0,01 ml
Strep-Elutionspuffer
pH 8
Tris-HCl
NaCl
100 mM
150 mM
6. Material und Methoden
108
EDTA
Desthiobiotin
1 mM
2,5 mM
Strep-Waschpuffer
pH 8
Tris-HCl
NaCl
EDTA
100 mM
150 mM
1 mM
STRIP-Puffer
pH 2,5; exakt; 0,5 l
Glycin
NaCl
7,5 g
5,8 g
Transferpuffer 1x
MQ
Methanol
Transferpuffer 10x
700 ml
200 ml
100 ml
SDS-Probenpuffer
(6x)
Tris-HCl
SDS
β-Mercaptoethanol
Glycerin
Bromphenolblau
NaCl
1M
20 %
2%
50 %
0,2 %
137 nM
SDS-Probenpuffer
(2x)
Verdünnung des 6x-SDS-Probenpuffers mit Wasser
StrepRegenerationspuffer
pH 8
Tris-HCl
NaCl
EDTA
HABA
100 mM
150 mM
1 mM
1 mM
Transferpuffer 10x
Glycin
Tris-HCl
2,2 M
200 mM
6.1.13. Bakterienstämme
Tabelle 6.15: Bakterienstämme
Bakterienstamm
Firma/Person, Stadt, Land
chemisch-kompetente XL1-Blue
elektrisch-kompetente XL1-Blue
E. coli BL21 (DE3)
Stratagene, Heidelberg
Stratagene, Heidelberg
Invitrogen, Groningen, die Niederlande
6.1.14. Kultivierung von Zelllinien
Tabelle 6.16: Zelllinien und deren Kultivierung
Zellen
Kurzbeschreibung
Medium
Referenz
293T
A2058
CHO 16-10
CHO DEC-205
D-MEM
D-MEM
CHO
CHO +
Geneticin
R10
R10
Prof. G. Fey, Erlangen
Hautklinik, Erlangen
Prof. G. Fey, Erlangen
Prof. D. Dudziak, Erlangen
HIV gag T-Zell-Klon
Jurkat-T-Zellen (CD4+)
Jurkat-T-Zellen (CD8+)
Humane embryonale Nierenzellline
Melanom-Zelllinie
Chin. Hamster-Ovarien-Zellline
Chin. Hamster-Ovarien-Zelllinie, DEC205+
CEA- humane Magenkrebs-Zelllinie
Melanom-Zelllinie (MelanA+, HLA-A1+,
HLA-A2-)
T-Zell-Klon, erkennt HLA-A2-Epitop
T-Zelllinie
Transgene T-Zelllinie, Subklon Jrt/MA
KATO III
CEA+ humane Magenkrebs-Zelllinie
R10
R10 +
Hygromycin
D-MEM
LS174T
CEA+ humane kolorektale
R10
COLO-320
Colo829
ATCC
Prof. J. Banchereau, Dallas,
USA
208
Prof. G. Fey, Erlangen
315
S. Santegoets, T. de Gruijl,
VUMC, Amsterdam
ATCC
6. Material und Methoden
109
M14
Adenokarzinom-Zelllinie
Humane Melanomzelllinie
M14 MCSP
Humane Melanomzelllinie, MCSP+
MDAMB 468
ErbB2- humane Brust-AdenokarzinomZelllinie
Melanom-Zelllinie (MelanA+, HLA-A2+)
T-Zell-Klon, erkennt HLA-A2-MelanAEpitop
T-Zell-Klon, erkennt HLA-A2- Epitop
ErbB2+ humane EierstockAdenokarzinom Zellline
TAP-defiziente TxB Zell Zell-Hybridom
Mel 526
MelanA T-Zell-Klon
JZ 21638
MelanA T-Zell-Klon11/33
SK-OV-3
T2-A1
R10
R10 +
Geneticin
D-MEM
Prof. S. Ferrone, Buffalo,
New York, USA
Prof. S. Ferrone
Prof. H. Fickenscher, Kiel
R10
-
Prof. E. Schultz, Marburg
Prof. M. Andersen, Herlev
Dänemark
R10
228
R10
S. Santegoets, T. de Gruijl,
VUMC, Amsterdam
Prof. E. Schultz, Marburg
6.1.15. Kultivierung von primären Zellen
Tabelle 6.17: Primäre Zellen und deren Kultivierung
Zellen
Generierung
Medium
CD4+ T-Zellen
CD8+ T-Zellen
DC (gesunde Spender)
DC (Melanompatienten)
CD4 MACS
CD8 MACS
Adhärenz
Adhärenz/Elutra
MLPC oder R10 (CEA-cTZR-Expressionskinetik: + IL-7)
MLPC oder R10 (CEA-cTZR-Expressionskinetik: + IL-7)
DC-Medium mit allogenem Plasma, + GM-CSF/IL-4
DC-Medium mit autologem /allogenen Plasma + GM-CSF/IL-4
6.1.16. Medien für Primäre Zellen und Zelllinien
Tabelle 6.18: Medien für die Kultivierung von primären Zellen und Zelllinien
Medium
Bestandteile
CHO-Medium
500 ml RPMI 1640
10 % FCS (hitze-inaktiviert für 30 min bei 56 °C)
1 % Penicillin-Streptomycin
1 mM Natriumpyruvat
1 mM L-Glutamin
für die Zelllinie CHO DEC-205 wurde 400 µl/ml Geneticin zugegeben
DC-Medium
500 ml RPMI 1640
1 % Plasma (allogen oder autolog, aus Leukapheresen, hitze-inaktiviert für 30 min bei 56 °C)
1 % 200 mM L-Glutamin
0,04 % Gentamycin
D-MEM
500 ml D-MEM
10 % FCS (hitze-inaktiviert für 30 min bei 56 °C)
1 % Penicillin-Streptomycin
MLPC
500 ml RPMI 1640
10 % humanes Serum (hitze-inaktiviert für 30 min bei 56 °C)
1 % 200 mM L-Glutamin
1 % 1 M Hepes Puffer
1 % Natrimpyruvat
1 % nicht-essentielle Aminosäuren
0,04 % Gentamycin
R10
500 ml RPMI 1640
10 % FCS (hitze-inaktiviert für 30 min bei 56 °C)
1 % 200 mM L-Glutamin
1 % Penicillin-Streptomycin
0,2 % 1 M Hepes Puffer
0,04 % β-Mercaptoethanol (2-ME)
für die Zelllinie M14 MCSP wurde 160 µl/ml Geneticin zugegeben
6. Material und Methoden
110
6.1.17. Antikörper
Tabelle 6.19: Antikörper
Antikörper
Firma/Person
Verdünnung
anti human IgG F(ab`)2-PE
anti-6xHistidin-Tag
anti-CEA-FITC
anti-Her2/neu-PE
anti-human CCR7-FITC
anti-human CD14-PE
anti-human CD25-PE
anti-human CD70-PE
anti-human CD83-PE
anti-human CD8-PE
anti-human DEC-205
anti-human DEC-205-FITC
anti-human DEC-205-PE
anti-human MAGE-A3 (U.57b)
anti-Maus IgG2b-FITC
anti-Maus IgG2b-PE
anti-MCSP mAb (9.2.27)
anti-myc-Tag-Alexa Flour 588
anti-Strep-HRP
anti-Strep-Tactin-PE
IgG1-FITC
IgG1-PE
IgG2a-FITC
IgG2a-PE
IgG3-PE
Ziege anti-Maus Fc HRP
Ziege anti-Maus IgG-PE
Southern Biotech, Birmingham USA
Qiagen, Hilden
Abcam, Cambridge, UK
BD, Heidelberg
R&D Systems, Wiesbaden
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
eBioscience, Frankfurt
BD, Heidelberg
Prof. Spangoli, Basel, die Schweiz
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
Prof. S. Ferrone, Buffalo, USA
Cell signaling, Boston, USA
IBA, Göttingen
IBA, Göttingen
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
BD, Heidelberg
eBioscience, Frankfurt
Dianova, Hamburg
BD, Heidelberg
0,1 µg/ml
1:100/1:2000
1:100
1:100
1:25
1:50
1:50
1:10
1:50
1:100
1:50
1:50
1:50
1:5
1:100
1:50
5 µg/ml
1:100
1:4000
1:200
1:100
1:100
1:50
1:50
1:100
1:5000
1:200
6.1.18. Oligonukleotide
Tabelle 6.20: Oligonukleotide
Verwendung und :ame
Erststrang-Synthesereaktion
64T-Primer*
„Capswitch“ Oligonukleotid*
Gesamt-cD$A PCR
T7-Capswitch-Primer*
TZR-spezifische PCR
5`-Primer*
BV15-Primer
Cα 3´UTR-Primer
Cβ1 3´UTR-Primer
Cβ2 3´UTR-Primer
2. TZR-spezifische PCR
AV2S3A1TS2S1-Primer
BV14-Primer
HCA
Valpha 10
Vb7
HCB beta 1
Sequenzierungsprimer
Cα near var-Primer
(TZR a-Kette)
Cβ near var-Primer
(TZR b-Kette)
pST2SeqRev Primer
T7
Schnittstellen-PCR
JZ TCRαrest
Sequenz
CGATAAAAGCTCCGGGGATAACAGAT63VN
AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG
TTATACGACTCACTATAGGGAGGAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT
AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACG
ATGGCCTCCCTGCTCTTCTTCTG
CTGTCTTACAATCTTGCAGATC
CACTTCCAGGGCTGCCTTC
TGACCTGGGATGGTTTTGGAGCTA
ATGATGA(AT)ATCCTTGAGAGTTTTACT
ATGGGCCCCCAGCTCCTTG
CTCTCTCGAGGGATCCTCAGCTGGACCACAGCCGCAGC
ATGGTCCTGAAATTCGTGTCC
ATGGGCTGCAGGCTGCTCTGCTGT
CTCTCTCGAGGGATCCCTGCCTTCAGAAATCCT
TTTAGAGTCTCTCAGCTGGTACACGG
TTCCCATTCACCCACCAGCTCAG
CACCTTCCAGGGTCAAGGAAG
CTCGAGTAATACGACTCACTATAGG
CATCTAGATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTAGT
6. Material und Methoden
Cα3´UTR Xho
JZ TCR βrest
HCB2 XhoI EcoRI
AV2S3A1S1S2 rest
Cα 3`NTRxho
BV Consxba
HCBaltxho
HCA
V alpha 10 rest
HCVB beta 1
Vb7 rest
Site-directed mutagenesis
Alpha T>C for
Alpha T>C rev
Beta S>C for
Beta S>C rev
Klonierung scFv-AntigenKonstrukte
MAGE-KKL 5`
MAGE-KKL 3`k
MAGE-EVD 5`
MAGE-EVD 3` k
MAGE-LP 5`
MAGE-LP 3` k
111
CTCTCGAGCATCTTGCAGATCTCAGCTGGACCACA
CATCTAGATGGGCCCCCAGCTCCTTG
GGAATTCCTCGAGGGATCGCTAGCCTCTGGAATCCT
CCTGATCATGAATGATGA(AT)ATCCTTGAGAGTTTTAC
CTCTCGAGCATCTTGCAGATCTCAGCTGGACCACA
CATCTAGAATGGGCACCAGGCTCCTCTGCTGGG
CTCTCGAGGCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTCTTGACCATGG
s.o.
CCGGATCCTCTAGAATGGTCCTGAAATTCTCCGTGTCCA
s.o.
CCGGATCCTCTAGAATGGGCTGCAGGCTGCTCTGCTGTG
GATGTGTATATCACAGACAAATGCGTGCTAGACATGAGGTCTATGG
CCATAGACCTCATGTCTAGCACGCATTTGTCTGTGATATACACATC
GTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCC
GGCTGCGGGTCTGTGCAGACCCCACTGTGCAC
GGCCGCAGATCCCAAGAAGCTGCTCACCCAACATTTCGTGCAGGAAAACT
ACCGGAGTACC
TCGAGGTACTCCAGGTAGTTTTCCTGCACGAAATGTTGGGTGAGCAGCTTC
TTGGGATCTGC
GGCCGCACTGATGGAAGTGGACCCCATCGGCCACTTGTACC
TCGAGGTACAAGTGGCCGATGGGGTCCACTTCCATCAGTGC
AGGTGCGGCCGCAAGTAGGAAGGTGGCCGAGTTGGTTCATTTTCTG
TGGCTCGAGAACGAGGGCCCTTGGACCCCACAGGAATTCATAGCC
Die Oligonukleotide wurden von der Firma MWG oder von Argos Therapeutics (markiert mit *) bezogen. (V=
A,G,C; N= A,C,G,T)
6. Material und Methoden
112
6.2. Methoden
6.2.1. Zellbiologische Methoden
6.2.1.1. Allgemeine Anmerkungen
Bedingungen im Zellkultur-Brutschrank
37 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit
Zentrifugation
Die Zentrifugation der T-Zellen, der NAF (non-adherent fraction) sowie der verschiedenen
Zelllinien erfolgte bei 1000 U/min und die der DC bei 800 U/min bei 21 °C (soweit nicht anders angegeben) für 10 min (accel. 9, decel. 9) in der Multifuge 3-SR (Heraeus) oder in der
AllegraTMX-12R (Beckman Coulter).
Zählen der Zellen
Zur Zellzahlbestimmung wurden 10 µl Zellsuspension mit 10 µl Trypanblau vermischt und in
eine Neubauer-Zählkammer gegeben. Es erfolgte eine Auszählung von zwei der vier Großquadrate (mit jeweils 16 Kleinen). Anschließend wurde die Zellzahl anhand folgender Formel
berechnet: gezählte Zellen der zwei Großquadrate x Volumen der Zellsuspension x 10.000.
Kryokonservierung von Zellen und Zelllinien
Die abzentrifugierten Zellen wurden in 20 % HSA (4 °C) und Einfriermedium (4 °C) im Verhältnis 1:1 resuspendiert. Das Gemisch wurde in Kryokonservierungsröhrchen überführt und
in einer mit Isopropanol-gefüllten Einfrierbox bei -80 °C eingefroren. Das Isopropanol in der
Einfrierbox gewährleistet eine schonende Abkühlung der Zellen um etwa 1°C/Min.
Auftauen von Zellen
Zum Auftauen der Zellen wurden diese in RPMI (RT) resuspendiert und die Zellen sofort abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde im entsprechenden Medium aufgenommen.
6. Material und Methoden
113
6.2.1.2. Isolierung der primären Zellen
Lymphoprep-Gradient zur Isolation von PBMCs
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) wurden aus dem Blut freiwilliger Spender oder
Melanompatienten durch die Durchführung einer Dichtegradienten-Zentrifugation mit dem
Reagenz Lymphoprep isoliert. Dazu wurde das abgenommene Blut im Verhältnis 2:1 mit warmen PBS vermischt. Anschließend wurde 15 ml Lymphoprep, welches in 50 ml Falcon-Röhrchen vorgelegt wurde, mit 30-35 ml des Blut-PBS-Gemisches überschichtet und bei 1500
U/min (accel. 4/ decel. 2) bei 21 °C für 30 min abzentrifugiert. Danach wurde ca. 50 % des
Plasmas (oberste Schicht) abgesaugt und der Lymphozytenring und das restliche Plasma in
neue 50 ml Falcon-Röhrchen überführt, wobei jeweils die Lymphozyten aus 2 Gradienten in
ein Röhrchen vereinigt wurden. Die Röhrchen wurden mit kalter PBS-EDTA-Lösung aufgefüllt und in einem ersten Waschschritt (1100 U/min (accel. 9 / decel. 4), 15 min, 4 °C) gewaschen. Die abzentrifugierten Zellen wurden in kaltem PBS-EDTA resuspendiert und jeweils
die Zellen zweier Röhrchen in 1 Falcon vereinigt, welches erneut mit PBS-EDTA (4 °C) aufgefüllt wurde. Es folgten drei weitere Waschschritte mit folgenden Zentrifugationsbedingungen: 2. Waschschritt: 900 U/min (accel. 9, decel. 7), 10 min, 4 °C, 3. Waschschritt 700 U/min
(accel. 9, decel. 2), 12 min, 4 °C), 4. Waschschritt: 800 U/min (accel 9, decel. 9), 10 min, 4
°C. Vor dem 4. Waschschritt wurden die Zellen in einem Gesamtvolumen von 50 ml RPMI
aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. Die Lymphozyten wurden anschließend in einer
Konzentration von 3-4 x 107 / 10 ml DC-Medium aufgenommen und jeweils 10 ml auf eine 10
cm Zellkulturschale gegeben. Nach einer 1-stündigen Adhärenzphase wurde die NAF abgenommen und die Zellkulturschale unter derhen noch 2x mit RPMI pur gespült. Zu den adhärenten Zellen (Monozyten, Makrophagen) wurde dann wieder 10 ml DC-Medium zugegeben.
Die abgenommene NAF wurde entweder eingefroren oder sofort zur Isolierung von CD4+
und/oder CD8+ T-Zellen mit Hilfe von MACS-Beads verwendet.
DC-Generierung und Reifung
Die Differenzierung der in der Plastik-adhärenten PBMC-Fraktion enthaltenen Monozyten erfolgte unter folgenden Fütterungsbedingungen:
Tag 0 (Tag der Isolation)
nach der Adhärenz wurden pro Zellkulturschale jeweils 10 ml
DC-Medium zugegeben
6. Material und Methoden
Tag 1
114
2 ml DC-Medium mit 800 IU/ml GM-CSF und 250 U/ml IL-4
(pro Zellkulturschale)
Tag 3 und 5
4 ml DC-Medium mit 800 IU/ml GM-CSF und 250 U/ml IL-4
(pro Zellkulturschale)
Tag 6 (Reifung)
200 IU/ml IL-1β (20 µl)
(pro Zellkulturschale)
1 µg/ml PGE-2 (10 µl)
1000 U/ml IL-6 (10 µl)
10 ng/ml TNFα (10 µl)
Standen weniger Zellen zur DC-Generierung zur Verfügung, wurden diese in entsprechend
weniger DC-Medium kultiviert und entsprechend des Volumens in Wells von Zellkulturplatten gegeben. Das Fütterungs- und Reifungsprotokoll wurde dem Ausgangsvolumen angepasst.
Wurden iDC für die Versuche benötigt, wurden die Zellen am Tag 6 nicht gereift, sondern bis
zu ihrer Verwendung im Brutschrank kultiviert.
Die Melanompatienten-mDC wurden - soweit nicht anders angegeben - durch das GMP-Personal aus Monozyten, welche aus Leukaphereseprodukten durch Elutration oder Dichtegradienten-Zentrifugation/Adhärenz-Technik angereichert wurden, generiert, wie in
224,255
be-
schrieben.
Isolierung der CD4+ und CD8+ T-Zellen aus frischer oder eingefrorener $AF, sowie aus der
Elutra Fraktion 3
CD4+ sowie CD8+ T-Zellen wurden aus der frischen oder eingefrorenen NAF oder aus der
Elutra-Fraktion-3 mit Hilfe von MACS-Beads gewonnen. Dazu wurden zunächst die eingefroren Zellen in RPMI getaut und die Zellzahl bestimmt. Nach einem Zentrifugationsschritt (4
°C) wurden die Zellen in MACS-Puffer (4 °C) resuspendiert und der Zentrifugationsschritt (4
°C) wiederholt. Anschließend wurden die Zellen in 8 µl MACS-Puffer (4 °C) und 1 µl CD4Beads oder 2 µl CD8-Beads pro 1 x 106 Zellen aufgenommen und für 15-20 min auf Eis inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen in 5 µl MACS-Puffer pro 1 x 106
Zellen resuspendiert und entweder auf eine MS-Säule (bis 5 x 107 Zellen) oder LS-Säule (ab 5
x 107 Zellen) gegeben, welche vorher in einer MACS-MultiStand Apparatur befestigt und mit
MACS-Puffer äquilibriert wurde. Nach 2-maligem Waschen mit MACS-Puffer nach Anleitung des Herstellers wurde die Säule von der Apparatur genommen und die Zellen mit
6. Material und Methoden
115
MACS-Puffer (2 ml MS-Säule, 10 ml LS-Säule) eluiert. Die Zellen wurden nach erfolgter
Zentrifugation in 1-2 x 107 Zellen/ml MLPC-Medium resuspendiert, welches 1 µl/ml IL-7
enthielt, und je nach erhaltenen Volumen in Gewebekulturschalen oder in entsprechend
großen Wells von Zellkulturplatten im Brutschrank kultiviert. Wurden aus derselben NAF sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen benötigt, erfolgte zuerst die Isolierung der CD8+ T-Zellen.
Aus der erhaltenen CD8-negativen Fraktion wurden nach einem weiteren Waschvorgang die
CD4+ T-Zellen nach oben beschriebenem Protokoll isoliert. Die T-Zellen wurden 16- bis 20
Stunden nach der Isolierung mit TZR- oder cTZR-kodierender RNA elektroporiert.
6.2.1.3. Kultivierung der primären Zellen
Nach der DC-Generierung wurden die Zellen in DC-Medium mit 800 IU/ml GM-CSF und
250 U/ml IL-4 in Zellkulturschalen oder in verschieden großen Wells von Zellkulturplatten in
einer Zelldichte von 1 x 106 /ml kultiviert. Für die Kultivierung von DC von gesunden Spendern wurde DC-Medium mit allogenen Plasma und für die Kultivierung von Melanompatienten-DC wurde DC-Medium mit autologen Plasma verwendet. Zum Vergleich der Melanompatienten-DC-Generierung im GMP-Labor und im RNA-Gruppen-Labor wurde auch DC-Medium mit allogenen Plasma verwendet. CD4+ und CD8+ T-Zellen wurden in MLPC-Medium
mit 1 µl/ml IL-7 gehalten. T-Zellen, welche mit dem CEA-spezifischen-cTZR ausgestattet
wurden, wurden zur Analyse der cTZR-Expression in R10-Medium mit 1 µg/ml IL-7 kultiviert. Bei Erstellung der Expressionskinetiken der cTZR wurde dem entsprechenden Medium
alle 2 Tage 1 µg/ml IL-7 und 5 ng/ml IL-15 zugegeben. Kokulturen von Stimulatorzellen (DC,
T2-A1-Zellen, die Tumorzelllinien Colo829, Colo320, LS174T, Mel526, SK-OV-3, MDAMB
468 oder KATO III) und TZR- oder cTZR-transfizierter T-Zellen erfolgten - soweit nicht anders angegeben – im Verhältnis 1:1 in MLPC-Medium mit 1 µg/ml IL-7. Kokulturen von T2A1- und Jurkat-T-Zellen erfolgten in R10-Medium, ebenfalls im Verhältnis 1:1.
Um den Einfluss von LPS auf den DC-Phenotyp sowie das Zytokinsekretionsprofil zu analysieren, wurden jeweils 500.000 DC zusammen mit unterschiedlichen Mengen an LPS (E. coli
055:B5, Sigma) in Wells einer 24-Well-Platte gegeben. Nach 24 und 48 Stunden wurde der
DC-Phenotyp und das Zytokinsekretionsprofil der DC durch Antikörper-Färbungen oder mit
Hilfe des Cytometric Bead Arrays (CBA) bestimmt (siehe unten).
6.2.1.4. Kultivierung der Zelllinien
Zweimal pro Woche wurden die T2-A1-Suspensionszellen in der Flasche gemischt und jeweils 1 bis 2 ml der Zellsuspension in eine neue Flasche überführt, welche mit dem entsprech-
6. Material und Methoden
116
enden Medium (siehe Tabellen 6.16 und 6.18) aufgefüllt wurde. Zur Kultivierung der adhärenten Zelllinien wurden die Zellen zweimal pro Woche durch 1x Trypsin (Colo829, Mel526,
293T, CHO 16-10, CHO DEC-205, KATO III, LS173T, SK-OV-3, COLO320 und MDAMB
468) oder durch 10 mM EDTA-PBS (A2058, M14 und M14 MCSP) abgelöst und anschließend herunterzentrifugiert. Die Zellpellets wurden in 10 ml Medium resuspendiert und
zwischen 0,5 und 2 ml der Zellsuspension in eine neue Flasche überführt, die mit dem entsprechenden Medium (siehe Tabellen 6.16 und 6.18) aufgefüllt wurde.
6.2.1.5. Beladung von Zellen mit Tumorantigen
T2-A1-Zellen, die in Zytokinsekretionsexperimenten zusammen mit Effektorzellen kokultiviert wurden, wurden vor der Beladung mit Tumorpeptiden UV-bestrahlt (0,005 J/cm2), um
die Produktion von Zytokinen durch die T2-A1-Zellen zu verhindern. Soweit nicht anders
vermerkt, wurden ca. 2 x 106 Zellen für 1 Stunde mit 1 µg/ml Peptid (Zytokinsekretionsexperiment) oder mit 10 µg/ml (Jurkat-T-Zell-Testsystem) in DC-Medium bei 37 °C im Brutschrank inkubiert, bevor sie in Stimulationsexperimenten eingesetzt wurden. Um DC durch
direkte Peptidbeladung mit Tumorantigen zu beladen wurden diese auf eine Zellkonzentration
von 1 x 106/ml in DC-Medium eingestellt und 10 µg/ml des entsprechenden Peptides zugegeben. Darauf folgte eine Inkubation von 3 h bei 37 °C im Brutschrank. mDC wurden auch
durch Elektroporation von MAGE-A3-RNA und MAGE-A3-DCLAMP-RNA mit MAGEA3-Peptid beladen (siehe Kapitel 6.2.1.7). Zur Beladung der DC mit MAGE-A3 durch DEC205-Targeting wurden iDC oder mDC auf eine Zellkonzentration von 1 x 106/ml in DC-Medium eingestellt und die entsprechenden Mengen an anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKLKonstrukt oder an anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL-Kontrollkonstrukt für 48 Stunden zugegeben, um die angegebene Endkonzentration im Medium zu erreichen. Als Kontrolle wurden
die DC mit dem entsprechenden Volumen an solvent control alleine oder mit Medium inkubiert. Ein Teil der iDC wurde nach 24-stündiger Inkubation für die restlichen 24 Stunden mit
dem Zytokincocktail, bestehend aus IL-1β, IL-6, PEG2 und TNF, gereift.
6.2.1.6. Elektroporation von primären Zellen und Zelllinien
Zuerst wurden die Zellen geerntet, gezählt und 1x mit RPMI pur (RT) und 1x mit OptiMEM
(RT) gewaschen. Anschließend wurden bis zu 8 x 106 (DC) oder 1 x 107 (T-Zellen, Jurkat-TZellen) in 100 µl OptiMEM (RT) aufgenommen und in eine 4 mm Küvette (min. Volumen
100 µl, max. Volumen 700 µl) überführt, in welche bereits die RNA (pro 100 µl Ansatz: 30
µg MAGE-A3-DCLAMP-RNA, 30 µg MAGE-A3-RNA; andere RNAs 15 µg) und beim
6. Material und Methoden
117
Jurkat-T-Zell-Testsystem zusätzlich der Transluc Vektor (5 µg) vorgelegt wurde. Die Elektroporation erfolgte mit den Bedingungen square wave bei 500 V für 1 ms (DC), 3 ms (Jurkat-TZellen) oder für 5 ms (T-Zellen). Nach erfolgter Elektroporation wurden die Zellen sofort in
das entsprechende Medium überführt und mindestens für 4 Stunden im Brutschrank inkubiert.
6.2.1.7. Bestimmung von Zytokinen im Überstand von Zellkulturen
Zur Bestimmung der produzierten Zytokine nach antigenspezifischer Stimulation wurden
50.000 Effektorzellen (T-Zellen ausgestattet mit einem TZR oder einem cTZR) mit 50.000
Stimulatorzellen (antigenbeladene DC, peptidbeladene T2-A1-Zellen, Tumorzellen) in 100 µl
MLPC-Medium mit IL-7 kultiviert. Nach 16- bis 20-stündiger Kokultivierung wurden die in
den Überstand abgegebenen Zytokine mit einem human TH1/TH2 CBA Kit nach Angaben des
Herstellers (BD) bestimmt. Alternativ wurden die Überstände mit einem enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) mit Hilfe von IFNγ-spezifischen Antikörpern analysiert
(Durchführung A. Hombach, Methodik unter 316).
Um das Zytokinsekretionsprofil von iDC und mDC zu bestimmen, wurden diese in DC-Medium kultiviert, zu denen Medium, solvent control oder 1 µg/ml anti-DEC-205scFv-MAGEA3-KKL-Konstrukt zugegeben wurde. Nach 24 und 48 h wurden die Zytokine im Überstand
mit Hilfe des Inflammation assay Kits (BD) nach Angaben des Herstellers ermittelt.
6.2.1.8. Zytotoxizitätsexperimente
Die Zytotoxizität der cTZR-transfzierten T-Zellen wurde in einen
51
Chromlyse-Versuch er-
mittelt. Dazu wurden zunächst die Zielzellen in 20 µl FCS resuspendiert und mit 100 µl radioaktiven Chrom für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in RPMI für 8
min bei 1200 U/min wurden die Zellen in MLPC-Medium resuspendiert. Dann wurden pro
Ansatz je 1.000 der
51
Chrom-markierten Zielzellen zu den bereits in MLPC-Medium vorge-
legten Effektorzellen im Verhältnis 1:60, 1:20, 1:7 und 1:3 in Vertiefungen einer 96-WellRundbodenplatte gegeben. Jeder Ansatz wurde als Triplikat durchgeführt. Um die maximal
mögliche Lyse zu ermitteln, wurden Zielzellen mit 1 %-iger Tritonlösung kultiviert. Für die
minimale Lyse wurden Zielzellen nur in Medium inkubiert. Anschließend wurde die Platte für
3 min bei 800 U/min abzentrifugiert und die Zellen für 4-6 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die
spezifische Lyse wurde aus der freigesetzten Radioaktivität wie folgt berechnet: (gemessene
Radioaktivität – Hintergrund-Radioaktivität) / (maximale Radioaktivität – Hintergrund-Radioaktivität) x 100 %.
6. Material und Methoden
118
Um die Langzeitzytotoxizität der durch RNA-Elektroporation oder retrovirale Transduktion
generierten cTZR-transfizierten T-Zellen miteinander zu vergleichen, wurden die cTZRRNA-elektroporierten T-Zellen 4 Stunden nach der Elektroporation mit OKT3 (100 ng/ml)
und IL-2 (400 U/ml) aktiviert. T-Zellen, welche retroviral transduziert wurden, wurden 2 Tage vor der Transduktion mit denselben Reagenzien aktiviert. Die TZR-transfizierten T-Zellen
wurden dann in unterschiedlichen Effektorzellen zu Zielzellen Verhältnissen für 48 Stunden
kokultiviert. Die spezifische Zytotoxizität wurde in einem XTT-basierten kolorimetrischen
Versuch analysiert (Durchführung A. Hombach, Methodik siehe 316).
6.2.1.9. Bestimmung der antigenspezifischen Proliferation von T-Zellen
CD8+ T-Zellen wurden 4 Stunden nach Elektroporation mit TZR-kodierender RNA mit dem
Fluoreszenzfarbstoff CFSE gefärbt. Dazu wurden die Zellen in einer Konzentration von 2 x
107 Zellen/ml in warmer PBS-Lösung resuspendiert und dasselbe Volumen an 5 µM CFSELösung (verdünnt in PBS) zugegeben. Nach einer 15-minütigen Inkubation (RT) wurde dasselbe Volumen an 20 %-igem humanem Serum zugefügt und die Zellen anschließend 2x mit
kaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden die CFSE-markierten T-Zellen im Verhältnis
1:1 mit antigenbeladenen oder unbeladenen Stimulatorzellen (T2-A1-Zellen, DC) in MLPCMedium kokultiviert, welches mit 10 ng/ml IL-7 und 50 ng/ml IL-2 versetzt war. Die Zellen
wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Da nach jeder Zellteilung die Menge an
CFSE pro Zelle abnimmt, konnte die Proliferationsrate der markierten T-Zellen am FACS ermittelt werden. CD8+ T-Zellen wurden mit einem anti-CD8-PE-Antikörper gefärbt, um diese
von den T2-A1-Zellen unterscheiden zu können. Die CD4+ T-Zellen wurden von DC anhand
ihrer Größe im FSC/SSC unterschieden.
6.2.1.10. Migrations- und ß-Glucoronidase-Experiment
Um die Migrationskapazität von DC zu analysieren, wurde ein Standard-Migrationsversuch
durchgeführt, in dem die Fähigkeit der DC entlang eines CCL19-Chemokingradienten zu
wandern analysiert wurde. Zunächst wurden die mit Medium oder anti-DEC-205scFvMAGE-A3-KKL-Konstrukt behandelten iDCm und mDC gezählt und je nach vorhandener
Zellzahl auf 1 x 106/ml oder 2 x 106/ml in Migrationsmedium eingestellt und die Zellen bis zu
ihrer Verwendung im Brutschrank inkubiert. In der Zwischenzeit wurden die 24-Well-Transwell-Platten (Nuclon) vorbereitet: Dazu wurde in die Inserts (Porengröße 5 µm, Costar Transwell Nr. 3421, Nunclon) 100 µl Migrationsmedium gegeben und diese in die Wells eingehängt, in die vorher jeweils 600 µl Migrationsmedium vorgelegt wurde. Nach einer 5- bis 10-
6. Material und Methoden
119
minütigen Inkubation im Brutschrank wurden die Inserts aus den Wells herausgenommen und
auf ein Papiertuch mit der Membran nach oben gestellt, um das Trocknen der Membran zu ermöglichen. Danach wurden die Inserts wieder in die Wells gehängt. Anschließend wurden die
Transwell-Platten wie folgt beladen, wobei pro DC-Kondition jeweils 3 verschiedene Doppelansätze angesetzt wurden: In die Inserts wurden entweder 100.000 oder 200.000 DC gegeben.
Bei den beiden negativen Ansätzen wurde kein CCL19-Chemokin ins Well gegeben (spontane Migration ohne Chemokin), wohingegen bei den beiden anti-Ansätzen (Migration gegen
den Chemokingradienten) 1 µl des Chemokins in das Medium des Inserts und bei den beiden
zu-Ansätzen (gerichtete Migration) 6 µl ins Well zugefügt wurde (Endkonzentration 100
ng/ml). Nach 2-stündiger Inkubation im Brutschrank wurden die gewanderten DC aus den
Wells geerntet und in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäße überführt. Zur Bestimmung der DCMigrationsrate wurde eine Eichkurve erstellt. Dazu wurden bei Experimenten, bei dem
200.000 DC pro Kondition zu Verfügung standen, 200.000, 150.000, 100.000 und 50.000 DC
in Reaktionsgefäße überführt, oder 100.000, 75.000, 50.000 und 25.000 DC, wenn nur
100.000 Zellen pro Kondition eingesetzt wurden.
Die Quantifizierung der gewanderten Zellen erfolgte über die Bestimmung ihrer ß-Glucoronidase-Aktivität. Dazu wurden die Zellen zunächst bei 10.000 U/min für 1-2 min bei RT abzentrifugiert und das Pellet zur Zelllyse in 25 µl PBS + 5 µl 1 % Triton X-100 resuspendiert.
Nach starkem Vortexen folgte ein weiterer Zentrifugationsschritt. Je 25 µl des resultierenden
Überstandes wurden in Vertiefungen einer 96-Well-Rundbodenplatte transferiert und 75 µl
der Glucoronidase-Substratlösung 4-Nitrophenyl-b-D-glucoronid zugegeben. Nach einer 1bis 2-stündigen Inkubation bei 37 °C wurde die Enzymreaktion durch Zugabe von 100 µl 0,1
M Glycin-Lösung pH10,0 blockiert, und so ein Farbumschlag des Mediums nach gelb induziert. Dieser Farbumschlag wurde am Wallac 1420 Luminometer (Absorption bei 405 nm; 0,1
s) gemessen. Anhand der erstellten Eichkurve wurde der prozentuelle Anteil der gewanderten
DC berechnet.
6.2.1.11. Jurkat-T-Zell-Testsystem
Zur Durchführung des Jurkat-T-Zell-Testsystems wurden zunächst CD4+ und CD8+ Jurkat-TZellen mit der entsprechenden TZR α- und -β-Ketten-kodierenden RNA und dem TranslucVektor elektroporiert. Vier Stunden nach Elektroporation wurden die Jurkat-T-Zellen mit unbeladenen oder peptidbeladenen T2-A1-Zellen im Verhältnis 1:1 kultiviert. Als Positivkontrolle wurden Jurkat-T-Zellen mit 50 ng/ml PMA (phorbol myristate acetate) und 500 ng/ml
Ionomycin stimuliert. Nach 16-stündiger Kokultivierung wurden die Zellen geerntet und mit
6. Material und Methoden
120
dem luciferase assay system der Firma Promega nach Angaben des Herstellers lysiert. Nach
Zugabe von 100 µl des Substrates Luziferin wurde die Luziferaseaktivität durch Messen der
Biolumineszenz am Wallac 1420 Luminometer bestimmt. Die antigenspezifische Luziferaseproduktion wurde wie folgt berechnet: erhaltene Luziferaseaktivität nach Stimulation mit
peptidbeladenen T2-A1-Zellen / erhaltene Luziferaseaktivität nach Stimulation mit unbeladenen T2-A1-Zellen.
6.2.1.12. FACS-Färbungen
Soweit nicht anders vermerkt, erfolgten die Färbungen in Vertiefungen von 96-Well-Rundbodenplatten in einem Volumen von 50 – 100 µl in FACS-Puffer auf Eis und im Dunkeln, sobald ein Fluoreszenz-konjungierter Antikörper zu den Zellen gegeben wurde. Zwischen den
einzelnen Inkubationsschritten wurden die Zellen in FACS-Puffer bei 1200 U/min für 7 min
bei 4 °C abzentrifugiert. Die angefärbten Zellen wurden mit einem FACScan Durchflusszytometer, welcher mit der CellQuest Software (BD) ausgestattet war, analysiert. Zur Auswertung
wurde die entsprechende Zellpopulation markiert, um sie von Zellschrott und anderen Zellen
abzugrenzen. Die spezifische mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) und der Prozentsatz an positiven Zellen errechnete sich aus der ermittelten MFI oder dem Prozentsatz positiver Zellen,
welche durch die Färbung mit dem spezifischen Antikörper ermittelt wurde, abzüglich der
Werte, welche durch die Kontrollfärbung erhalten wurden.
Oberflächen-FACS-Färbung
Für die Oberflächen-FACS-Färbungen wurden die Zellen geerntet und pro Färbung zwischen
104 und 5 x 105 Zellen in FACS-Puffer aufgenommen. Für den Nachweis der Bindung der
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte oder anti-MCSPscFv-MAGE-A3-PeptidKontrollkonstrukte wurden iDC, mDC sowie A2058-, CHO 16-10- und CHO DEC-205-Zellen mit 1 oder 5 µg/ml Konstrukt inkubiert. Der Nachweis der Fusionsproteine erfolgte entweder über einen gegen den 6xHistidin-Tag gerichteten Primärantikörper und einem Ziege antiMaus IgG-PE Sekundärantikörper oder über einen PE-markierten anti-Strep-Antikörper. Als
Kontrollfärbung wurden die Zellen nur mit den Sekundärantikörpern gefärbt.
Um die Bindung der parentalen Antikörper zu ermitteln, wurden iDC, iDCm, sowie CHO 1610-, CHO DEC-205-, und A2058-Zellen entweder mit einem anti-DEC-205-FITC-Antikörper,
einem anti-DEC-205-PE-Antikörper, oder mit einem unmarkierten anti-DEC-205-Antikörper
oder mit 5 µg/ml des murinen monoklonalen anti-MCSP-Antikörpers 9.2.27 (zur Verfügung
gestellt von M. Schwenkert, G. Fey, S. Ferrone) in Kombination mit dem Ziege anti-Maus
6. Material und Methoden
121
IgG-PE als Sekundärantikörper angefärbt. Als Kontrollfärbung wurden die Zellen mit dem
anti-IgG2b-FITC, anti-IgG2b-PE, oder nur mit dem Ziege anti-Maus IgG-PE Sekundärantikörper inkubiert.
Der DC-Phenotyp wurde mit folgenden Antikörpern untersucht: anti-DEC-205-FITC- oder
anti-DEC-205-PE-Antikörper, anti-CD14-PE-, anti-CD83-PE-, anti-CD25-PE-, anti-CD70PE- oder CCR7-FITC-Antikörper, oder den Isotypkontrollantikörpern anti-IgG2a-FITC, antiIgG2a-PE, anti-IgG2b-FITC, anti-IgG2b-PE, anti-IgG1-PE, oder anti-IgG3-PE.
Die ErbB2- und CEA-Expression verschiedener Tumorzellen wurde mit einem anti-CEAFITC-Antikörper und einem anti-Her2/neu-PE-Antikörper ermittelt. Als Negativkontrolle
wurden die Tumorzellen mit einem IgG1-FITC oder IgG1-PE Isotypen inkubiert.
Zur Bestimmung der Transfektionseffizienz der 293T-Zellen wurde die GFP-Expression im
FL1-Kanal des Durchflusszytometers gemessen. Als Negativkontrolle dienten 293T-Zellen,
welche mit einem Transfektionsgemisch ohne DNA transfiziert wurden.
Der gegen CEA-gerichtete BV431/26-scFv-Fc-CD28/CD3ζ-cTZR wurde durchflusszytometrisch mit dem anti-human IgG1 F(ab`)2-PE-Antikörper, der an die extrazelluläre IgG1CH2CH3-Domäne des cTZR bindet, nachgewiesen. Der Nachweis des scFv-anti-erbB2CD28ζ-cTZR erfolgte mit einem anti-myc-Tag-Alexa-Fluor-588-Antikörper, welcher an den
myc-Tag des cTZR bindet.
Intrazelluläre FACS-Färbung
Zum intrazellulären Nachweis von MAGE-A3- und MAGE-A3-DCLAMP-Protein wurden
300.000 Zellen pro Ansatz geerntet und bei 1.200 U/min für 7 min abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in 100 µl Cytofix/Cytoperm (BD) aufgenommen und für 20 min
bei 4 °C inkubiert. Nach einem Waschschritt in 250 µl Permwash (BD) wurden die Zellen in
50 µl Permwash pro Ansatz aufgenommen und zur Färbung in Vertiefungen einer 96-WellRundbodenplatte überführt. Dort erfolgte die Zugabe des FACS-Puffers oder des Primärantikörpers MAGE-A3 (U.57b Hybridomüberstand, bereitgestellt durch Prof. Spangoli, Basel, die
Schweiz). Nach einer 30-minütigen Inkubationszeit auf Eis und darauf folgenden zweimaligen Waschen mit Permwash, wurden die Zellen in 100 µl Permwash aufgenommen und der
Sekundärantikörper (Ziege anti-Maus IgG-PE, BD) zu den Zellen gegeben. Nach erneuter 30minütiger Inkubation folgten zwei weitere Waschschritte, bevor die Zellen vor der durchflusszytometrischen Analyse in 100 µl FACS-Puffer resuspendiert wurden.
6. Material und Methoden
122
6.2.2. Molekularbiologische Methoden
6.2.2.1. Klonierung der TZR nach der neu etablierten TZR-PCR-Strategie
Isolierung der Gesamt-R$A aus T-Zell-Klonen
Da der HIVgag/HLA-A2-spezifische T-Zell-Klon stark mit anderen Zellen kontaminiert war,
wurden die Zellen vor der RNA-Isolation mit einem PE-konjugierten HLA-A2-HIVgag-spezifischen Tetramer gefärbt und die HIVgag-spezifischen T-Zellen mit anti-PE Beads isoliert
(Durchführung und Methodik siehe Diplomarbeit Christian Hofmann). Anschließend wurde
die Gesamt-RNA des HIVgag-spezifschen T-Zell-Klons und des MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons 11/33 mit dem RNeasy Mini Kit und die des MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klon JZ mit dem peqGold Trifast Kit nach Angaben der Hersteller isoliert. Die
Konzentration der erhaltenen Gesamt-RNA wurde photometrisch bestimmt.
Reverse Transkription und Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Erststrang-Synthesereaktion
Zur cDNA-Synthese (Erststrang-Synthesereaktion) wurde folgende Reaktion durchgeführt:
1) Annealing
RNA
≤1 µg
64T-Primer
10 pmol
„Capswitch“ Oligonukleotid
10 pmol
RNAse-freies Wasser
ad 5-7 µl
Inkubation: 2 min bei 72 ° C, 1 min 4°C
2) Reverse Transkription
first strand buffer (5x)
2 µl
dTT (100 mM)
1 µl
dNTP (10 mM)
1 µl
Powerscript reverse Transkriptase
1 µl
Inkubation: 60 min bei 42 °C
6. Material und Methoden
123
Gesamt-cDNA-PCR
Pro 1 µl cDNA wurden folgende Reagenzien für die Gesamt-cDNA-PCR eingesetzt:
cDNA
1 µl
64T-Primer
20 pmol
T7-capswitch-Primer
20 pmol
dNTPs (10 mM)
1 µl
Advantage buffer (10x)
5 µl
Advantage 2 Polymerase
1 µl
RNAse-freies Wasser
39 µl
PCR-Programm:
95 °C
1:00 min
95 °C
0:05 min
65 °C
0:05 min
68 °C
6:00 min
4°C
∞
20 Zyklen
TZR-spezifische PCR
Die Amplifikation der TZR-α- und -β-Ketten der T-Zell-Klone erfolgte in der TZR-spezifischen PCR:
α-Kette
cDNA
2 µl (1:10 oder 1:100 verdünnt)
5´-Primer
20 - 40 pmol
Cα 3`UTR-Primer
20 pmol
dNTPs (10 mM)
1 µl
Advantage buffer (10x)
5 µl
Advantage 2 Polymerase
0,5 – 1 µl
RNAse-freies Wasser
ad 50 µl
PCR-Programm:
95 °C
5:00 min
95 °C
0:30 min
62 °C
0:45 min
72 °C
1:30 min
4°C
∞
30 Zyklen
6. Material und Methoden
124
β-Kette
cDNA
2 µl (1:10 oder 1:100 verdünnt)
5´-Primer
40 pmol
Cβ1 3`UTR-Primer
20 pmol
Cβ2 3`UTR-Primer
20 pmol
dNTPs (10 mM)
1 µl
Advantage buffer (10x)
5 µl
Advantage 2 Polymerase
1 µl
RNAse-freies Wasser
ad 50 µl
PCR-Programm:
95 °C
5:00 min
95 °C
0:30 min
63 °C
0:45 min
72 °C
1:30 min
4°C
∞
25-30 Zyklen
Amplifikation der Gesamt-TZR-spezifischen DNA
Zur Klonierung der α- und β-Ketten-kodierenden Gesamtsequenzen wurde im Fall des
MelanA/HLA-A2-spezifischen T-Zell-Klons 11/33 und des MelanA/HLA-A2-spezifischen TZell-Klons zunächst eine 2. spezifische PCR-Reaktion durchgeführt. Als Matrize diente hierzu die amplifizierte cDNA aus der 1. spezifischen TZR-PCR (Übersicht siehe Tabelle 6.21).
Zur Einführung von Restriktionsschnittstellen zur Klonierung der TZR-kodierenden cDNA in
den RNA-Produktionsvektor wurden Schnittstellen-PCRs durchgeführt. Als Matrize diente im
Fall des HIVgag-spezifischen TZR das PCR-Produkt der 1. spezifischen TZR-PCR, im Falle
der MelanA-spezifischen TZR die der 2. spezifischen TZR-PCR.
cDNA
1-2 µl (1:10, 1:100, oder 1:1000 verdünnt)
Primer 1*
20 pmol **
Primer 2*
20 pmol **
dNTPs (10 mM)
1-2 µl
Advantage buffer (10x) oder
5 µl
Pfu buffer (10x) ***
Advantage 2 Polymerase oder
0,5 - 1 µl
Pfu Polymerase ***
RNAse-freies Wasser
* Primerinformation siehe Tabelle 6.21
ad 50 µl
6. Material und Methoden
125
** Ausnahmen angegeben in Tabelle 6.21
*** Information über verwendetes Enzym sind in Tabelle 6.21 angegeben
PCR-Programm:
95 °C
5:00 min
95 °C
0:30 min
* °C
0:45 min
** °C
1:30 min
4°C
∞
25-30 Zyklen
* Annealing-Temperatur: siehe Tabelle 6.21
** Elongations-Temperatur: siehe Tabelle 6.21
Nachdem die Gesamt-TZR-kodierende DNA amplifiziert und mit den entsprechenden Restriktionsschnittstellen ausgestattet wurde, erfolgte die Klonierung in den mit den entsprechenden Enzymen verdautem pGEM4Z-5`NTR-xxx-3`NTR Vektor (siehe 6.2.2.4).
Tabelle 6.21: Übersicht über die verwendeten Primer, Primer-Annealing- und ElongationsTemperaturen in den 2. spezifischen PCRs sowie den Schnittstellen-PCRs
MelanA 11/33
α-Kette
MelanA JZ
HIV gag
β-Kette
α-Kette
β-Kette
α-Kette
β-Kette
AV2S3A1TS2
BV14
-
-
2. spezifische PCR
Primer 1
V alpha 10
Vb7
Primer 2
HCA
HCB beta 1
Cα 3`UTR
Cβ2 3`UTR
-
-
Annealing
59 °C
62 °C
58 °C
62 °C
-
-
Polymerase
Pfu
Elongation
1:30 min
S1
Pfu
-
1 min
1:30 min
JZ TCRαrest
JZ TCR βrest
Cα3´UTR Xho
HCB2 XhoI
Schnittstellen-PCR
Primer 1
HCA
HCB beta1
Primer 2
v alpha 10 rest
Vb7 rest
AV2S3A1S1S2
BV Consxba
rest
Cα 3`NTRxho
HCBaltxho
57 °C
67 ° C
EcoRI
Annealing
59 °C
Polymerase
Pfu
Elongation
1:30 min
62 °C
1 min
65 °C
65 °C
1min
6. Material und Methoden
126
6.2.2.2. Einführung einer zusätzlichen Disulfidbrücke in den MAGE-A3/HLA-DP4spezifischen TZR
Die α- und β-Kette des MAGE-A3/DP4-spezifischen TZR wurde nach dem Protokoll von
Cohen et al. 219 modifiziert. Dazu wurde mit Hilfe des site-directed mutagenesis Kit (Stratagene) nach folgendem PCR-Protokoll sowohl in die α-Kette als auch in die β-Kette ein zusätzliches Cystein eingebracht:
cDNA
10 ng des pGEM4Z-5`NTR-MAGE-A3/DP4α-3`NTR oder
pGEM4Z-5`NTR-MAGE-A3/DP4β-3`NTR Vektors
forward-Primer 1*
10 pmol
reverse-Primer 2**
10 pmol
dNTPs
10 pmol
Pfu buffer (10x)
5 µl
Pfu Polymerase
1 µl
RNAse-freies Wasser
ad 50 µl
* α-Kette: alpha T>C for, β-Kette: beta S>C for
** α-Kette: alpha T>C rev, β-Kette: beta S>C for
PCR-Programm:
95 °C
1:00 min
95 °C
0:30 min
55 °C
1:00 min
68 °C
6:00 min
4°C
∞
12 Zyklen
Anschließend folgte ein DpnI-Verdau des PCR-Ansatzes nach Angaben des Herstellers
Stratagene, bevor die DNA in chemisch-kompetente E. coli Bakterien transformiert wurde.
Nach Isolierung der Plasmid-DNA aus den Bakterien mit Hilfe des QIAquick Miniprep Kit
wurde die Einführung der Mutation durch Sequenzierung überprüft.
6.2.2.3. Klonierung der anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte und antiMCSP-MAGE-A3-Peptid-Kontrollkonstrukte
Die Klonierung des pet27b-Strep-anti-DEC-205-scFv-Peptid-His-Vektors erfolgte in der AG
Fey, welche die Sequenz, die für die variable Domäne der leichten und schweren Kette des
anti-humanen DEC-205 Antikörpers kodierte, von Prof. R. Steinman erhalten hatten. Zunächst wurde die für Strep-DEC-205-scFv-His-kodierende DNA-Sequenz über BstBI und
6. Material und Methoden
127
AgeI in den pSeqTag2-HygroC-Strep-4G7mutxCD16mut-Vektor (Prof. G. Fey, Erlangen)
kloniert, aus dem vorher die Sequenz für den bispezifischen scFv 4G7mutxCD16mut entfernt
wurde. Die verschiedenen MAGE-A3-Peptid-kodierenden DNA-Sequenzen wurden wie folgt
generiert: Zur Herstellung der MAGE-A3-KKL- und MAGE-A3-EVD-Peptid-kodierender
DNA wurden jeweils 2 Oligonukleotide hergestellt, welche einmal aus der 5`>3` und einmal
aus der 3`>5` Sequenz der entsprechenden MAGE-A3-Sequenz bestanden. Das Annealing der
entsprechenden Oligonukleotide (5` Oligonukleotid, 3` Oligonukleotid, siehe Tabelle 6.22)
erfolgte für 10 min bei 95 °C in der PCR-Maschine:
Tabelle 6.22: verwendete Oligonukleotide für das Oligonukleotid-Annealing
Konstrukt
MAGE-A3-KKL
MAGE-A3-EVD
Menge
5`Oligonukleotid
KKL 5`
EVD 5`
10 µl von 100 pmol
3`Oligonukleotid
KKL 3` k
EVD 3` k
10 µl von 100 pmol
Die Größe und Qualität der erhaltenen doppelsträngigen DNA-Sequenzen kodierend für die
MAGE-A3-Peptide wurden in einem 2,5 %-igem Agarosegel überprüft. Die DNA-Sequenz
kodierend für MAGE-A3-LP wurde aus dem Vektor pGEM4Z64A-MAGE-A3 (Argos
Therapeutics) unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
DNA
1 µl (1:100 Verdünnung des pGEM4Z64A-MAGE-A3-Vektors)
MAGE-A3-LP 3`
20 pmol
MAGE-A3-LP 5` k
20 pmol
dNTPs
10 pmol
Pfu buffer (10x)
5 µl
Pfu Polymerase
2 µl
RNAse-freies Wasser
ad 50 µl
PCR-Programm:
95 °C
5:00 min
95 °C
0:30 min
70 °C
0:30 min
72 °C
0:45 min
4°C
∞
30 Zyklen
Die amplifizierte MAGE-A3-LP-DNA wurde mit dem PCR purification Kit aufgereinigt, mit
den Restriktionsenzymen XhoI und $otI verdaut, und in einem 1 %-igem Gel aufgetrennt. Anschließend wurde die DNA mit einem Gel extraction Kit aus dem Gel isoliert und die DNA
6. Material und Methoden
128
danach gefällt, bevor sie in den XhoI- und $otI-verdauten pSecTag2-HygroC-Strep-antiDEC-205scFv-His-Vektor eingefügt wurde. Vor der Ligation der MAGE-A3-KKL- und
MAGE-A3-EVD-DNA in den XhoI- und $otI-verdauten pSecTag2-HygroC-Strep-anti-DEC205scFv-His-Vektor war kein Verdau der MAGE-A3-DNA notwendig, da die Oligonukleotide so gewählt wurden, dass bereits XhoI- und $otI-überstehende Enden vorhanden waren. Die
Ligationsansätze aus Vektor und MAGE-A3-KKL- oder MAGE-A3-EVD-DNA wurden gefällt, bevor diese in elektrokompetente XL1-Blue-Bakterien transformiert wurden. Die Transformationsansätze wurden auf ampicillinhaltigen Agarplatten ausplattiert. Die erhaltenen Bakterienklone wurden in LB-Medium kultiviert und die Plasmide mit Hilfe des QIAquick
Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert. Die Sequenzierung der DNA erfolgte mit dem
pST2SeqRev Primer nach Durchführung eines geeigneten Kontrollverdaue.
Um die anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Konstrukte auch in E. coli produzieren zu können, wurden die Konstrukte auch in den pet27b-Expressionsvektor kloniert. Hierzu wurden
die pSecTag2-HygroC-Strep-MAGE-A3-Peptid-His-Vektoren und der pet27b-Strep-antiDEC205-VL-VH-MCS-Peptid-Vektor mit den Restriktionsenzymen BstBI und AgeI verdaut
und die Ansätze auf einem 1 %-igem Gel aufgetragen. Nach Gelisolation der entsprechenden
Banden mit einem Gel Extraction Kit (Qiagen) wurden in den Vektor pet27b die verschiedenen anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Inserts eingefügt. Nach Fällung der DNA wurden
die Ligationsansätze in elektro-kompetente XL1-Blue-Bakterien transformiert. Aus den auf
kanamycinhaltigen Platten gewachsenen Bakterienklonen wurden die Plasmide isoliert und
diese nach einem erfolgreichen Kontrollverdau mit dem pST2SeqRev Primer sequenziert.
Die pSeqTag2-HygroC-Strep-MCSPhl-MAGE-A3-Peptid-His-Vektoren wurden wie folgt kloniert: Der Vektor pASK400 MCSPhl und die verschiedenen pSecTag2-HygroC-Strep-DEC205scFv-MAGE-A3-Peptid-His-Vektoren wurden mit dem Restriktionsenzym SfiI geschnitten und auf ein 1 %-igem Agarosegel aufgetragen. Die entsprechenden Banden wurden aus
dem Gel isoliert und die Sequenz des MCSPhl-spezifischen scFvs wurde in den pSecTag2HygroC-MAGE-A3-Peptid-Vektor ligiert. Nach einer Transformation in chemisch-kompetente XL1-Blue-Bakterien wurden die Plasmide aus den auf ampicillinhaltigen Agarplatten gewachsenen Bakterienklonen isoliert. Die Sequenzierung der Vektoren erfolgte mit dem
pST2SeqRev Primer.
6. Material und Methoden
129
6.2.2.4. Klonierungsmethoden
Aufreinigung der PCR-Produkte
Die PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick PCR purification Kit (Qiagen) nach Angaben
des Herstellers aufgereinigt. Die Elution der DNA erfolgte entweder mit dem im Kit enthaltenen EB-Puffer oder mit sterilem Wasser.
D$A-Fällung
Zur Anreicherung von DNA wurde entweder eine Kaliumacetat- oder eine Butanolfällung angewendet.
Kaliumacetat-Fällung
Zunächst wurde zu der zu fällenden DNA oder dem zu fällenden Ligationsansatz das 0,1fache Volumen an 3 M Kaliumacetatlösung (pH 5,6) und das 2,5-fache Volumen an 100 %
Ethanol zugegeben und das Gemisch für mindestens 1,5 Stunden bei -20 °C gefällt. Anschließend folgte ein Zentrifugationsschritt für 30 min bei 14.000 U/min bei 4 °C. Das Pellet
wurde unter denselben Zentrifugationsbedingungen 2x mit 100 %-igem Ethanol gewaschen,
bevor es unter der Sterilbank getrocknet wurde. Anschließend wurde die DNA in RNase-freiem Wasser aufgenommen.
Butanolfällung
Zu 20 µl eines Ligationsansatzes wurden 30 µl Wasser sowie 50 µl n-Butanol zugegeben und
das Gemisch gut gevortext. Nach einer 1-minütigen Inkubation bei RT folgte ein Zentrifugationsschritt bei 14.000 U/min für 10 min bei 4 °C. Das Pellet wurde dann unter der Sterilbank getrocknet und in 10 µl RNase und DNase freiem Wasser aufgenommen.
D$A-Verdau
Der Verdau von DNA (PCR-Produkte, Plasmide) zur Klonierung von Vektoren oder zu deren
Kontrolle und zur Linearisierung der RNA-Produktionsvektoren erfolgte mit Enzymen und
Puffern der Firma NEB unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen. Eine Übersicht
über die durchgeführten DNA-Verdaue ist in Tabelle 6.23 aufgelistet.
6. Material und Methoden
130
D$A-Gelelektrophorese
Die Auftrennung von PCR-Produkten und verdauten Vektoren erfolgte in einem ethidiumbromidhaltigen 1 %-igem oder 2,5 %-igem Agarosegel in horizontalen Laufkammern bei 80-100
V in 1x TAE-Puffer. Die Größen der DNA-Fragmente wurden mit Größenstandards der Firma
NEB (100 Bp-Leiter, 1 kBp-Leiter) abgeschätzt.
D$A-Extraktion aus Agarosegelen
Die Isolierung von DNA aus Agarosegelen erfolgte mit dem Gel extraction Kit (Qiagen) nach
Angaben des Herstellers. Die Elution der DNA erfolgte entweder mit dem im Kit enthaltenen
EB-Puffer oder mit DNase/RNase-freiem Wasser.
Ligation
Die Ligation von Insert-DNA in einem Vektor wurde in einem Vektor-Insert-Verhältnis von
1:10 in einem Gesamtvolumen von 20 µl durchgeführt. Verwendet wurde eine T4-Ligase mit
dem entsprechendem Puffer und Zusätzen nach Angaben des Herstellers. Die Reaktion erfolgte über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank oder für 3 h bei RT.
Tabelle 6.23: Verwendete Restriktionsenzyme zur Klonierung von Vektoren und deren Kontrollverdaue und zur Linearisierung von RNA-Produktionsvektoren
Funktion/Vektor
Klonierungsschritt/Herstellung Vektor
Enzym(e)
R0A-Produktionsvektor
pGEM4Z-5`NTR-MelanA JZ-α-Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-MelanA JZ-β -Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-MelanA 11/33-α-Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-MelanA 11/33-β-Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-HIVgag-α-Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-HIVgag-β -Kette-3`NTR
Einfügen der α-Kette
Einfügen der β -Kette
Einfügen der α-Kette
Einfügen der β -Kette
Einfügen der α-Kette
Einfügen der β -Kette
XbaI / XhoI
XbaI / XhoI
XbaI / XhoI
XbaI / XhoI
XbaI / XhoI
XbaI / XhoI
Linearisierung von R0A-Produktionsvektoren
pGEM4Z-5`NTR-MelanA JZ-α-Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-MelanA JZ-β -Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-MelanA 11/33-α-Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-MelanA 11/33-β-Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-HIVgag-α-Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-HIVgag-β -Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-MAGE-A3/HLA-DP4-α-Kette3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-MAGE-A3/HLA-DP4-β-Kette3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-BIDR/HLA-A1-α-Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-BIDR/HLA-A1-β -Kette-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-ErbB2-cTCR-3`NTR
pGEM4Z-5`NTR-CEA-cTCR-3`NTR
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid Vektoren
pet27b-Strep-anti-DEC-205scFv-His
pST2-Strep-4G7mutxCD16mut *
MAGE-A3-LP DNA
$otI
SpeI
SpeI
SpeI
SpeI
SpeI
SpeI
SpeI
SpeI
SpeI
SpeI
SpeI
pST2-Strep-anti-DEC-205scFv-His* & pet27b-Strep-antiDEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-His*
pST2-Strep-anti-DEC-205scFv-His*
pST2-Strep-anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-LP-His*
BstBI / AgeI
BstBI/ AgeI
XhoI/$otI
6. Material und Methoden
pST2-Strep-DEC-205scFv-His*
pST2-Strep-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-His*
pST2-Strep-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-His*
pAK00 MCSPhl*
131
pST2-Strep-anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-His*
pet27b-Strep-anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-His
pST2-Strep-anti-MCSP-MAGE-A3-Peptid-His*
pST2-Strep-anti-MCSP-MAGE-A3-Peptid-His*
XhoI/$otI
BstBI/AgeI
SfiI
SfiI
* pST2: pSecTag2-HygroC
Transformation in Bakterien
Die Transformation von Bakterien mit Plasmid wurde entweder durch chemische Transformation durchgeführt oder das Plasmid wurde durch Elektroporation in Bakterien eingebracht.
Chemische Transformation in XL1-Blue-Bakterien
Zu den aufgetauten, chemisch-kompetenten Bakterien wurden pro 100 µl Bakteriensuspension 1,7 µl β-Mercaptoethanol zugegeben und das Gemisch für 10 min auf Eis inkubiert. Im
Anschluss wurde der Ligationsansatz (20 µl) oder für eine Retransformation 1-2 µl des Plasmids zu den Bakterien gegeben und diese unter Anschnippen des Kulturröhrchens weitere 30
min auf Eis inkubiert. Darauf erfolgte ein Hitzeschock für 45 sec bei 42 °C. Danach folgte eine sofortige Zugabe von 900 µl warmem SOC-Medium und die Bakterien wurden erneut für 2
min auf Eis inkubiert. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei 37 °C im Schüttler wurden die
Bakterien auf LB-Platten, welche das entsprechenden Antibiotikum enthielten, ausplattiert
und über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.
Elektroporation von Bakterien
Zunächst wurde die DNA in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß vorgelegt und 50 µl der
frisch aufgetauten Bakterien zugegeben. Nach gutem Durchmischen und 1-minütiger Inkubation auf Eis wurde 350 µl eiskaltes MQ zugegeben und die Probe in eine eiskalte Elektroporationsküvette (2 mm) transferiert. Nach erfolgter Elektroporation mit 2,5 kV (Gene Pulser II,
Biorad) wurde 1 ml steriles und ebenfalls eiskaltes 2xYT-Medium zugegeben. Nach Transformation eines Ligationsansatzes wurden die Bakterien zunächst 1 h bei 37 °C im Schüttler
(Innova 4200) bei 220 U/min ohne Antibiotikaselektion inkubiert, bevor die Bakteriensuspension auf die entsprechenden antibiotikahaltigen Agarplatten ausgestrichen wurde. Die
Inkubation erfolgte dann über Nacht bei 37 °C im Brutschrank (Innova 4200).
6. Material und Methoden
132
Animpfen von Übernachtkulturen
Für die Plasmidminipräparation:
Von den ausplattierten Bakterien wurden Klone gepickt und über Nacht (ü.N.) in 4 ml LBMedium (+ Antibiotikum) bei 37 °C unter Schütteln inkubiert.
Für die Plasmidmaxipräparation:
Für Maxipreps wurden morgens kleine Mengen des entsprechenden Bakterien-GlycerinStocks in 4 ml LB-Medium (+ Antibiotikum) bei 37 °C inkubiert. Nachmittags wurde die
Vorkultur in 400 ml LB (+ Antibiotikum) überführt und ü.N. im Brutschrank weitergeschüttelt.
Ansetzen von Glycerin-Stocks
Glycerin-Stocks wurden aus 500 µl Übernachtkultur und 500 µl 80 %-iger Glycerinlösung
hergestellt. Die Glycerin-Stocks wurden bei -80 °C gelagert.
Plasmidpräparation (Miniprep und Maxiprep)
Zur Isolierung von Plasmiden wurde das QIAprep miniprep Kit oder das Endofree plasmid
Maxi Kit nach Angaben des Herstellers verwendet. Die Zentrifugationsschritte erfolgten in
Corexröhrchen in der Ultrazentrifuge. Abweichend von dem Herstellerprotokoll wurde ein zusätzlicher Waschschritt mit 100 %-igem Ethanol nach dem Waschschritt mit 70 %-igem Ethanol durchgeführt.
Sequenzierungen
PCR-Produkte und Plasmide wurden entweder von der Firma Sequiserve oder der Firma
Eurofins MWG sequenziert. Die jeweils verwendeten Primer sind in Tabelle 6.20 aufgeführt.
6.2.2.5. R0A-Produktion
Zur in-vitro-Transkription wurde zunächst je 100 µg RNA-Produktionsvektor (Maxiprep) mit
dem entsprechenden Enzym (siehe Tabelle 6.23) in einem Gesamtvolumen von 200 µl verdaut. Das linearisierte Plasmid wurde anschließend durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion
aufgereinigt. Dazu wurden zu 200 µl Verdauansatz 200 µl eines Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisches (25:24:1) zugegeben und das Gemisch nach 1-minütigem Vortexen bei
6. Material und Methoden
133
14.000 U/min für 2 min bei 4 °C abzentrifugiert. Die entstandene obere Phase (ca. 200 µl)
wurde abgenommen und im Verhältnis 1:1 mit einem Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch
(24:1) vermengt. Das Gemisch wurde erneut stark gevortext und anschließend abzentrifugiert.
Die obere Phase wurde wiederum abgenommen und mit 1/10 des Volumens an 3 M Kaliumacetat (pH 5,6) und 2,5 des Volumens an 100 %-igem Ethanol vermischt. Das Gemisch wurde
nach erneutem kräftigem Vortexen für mindestens eine Stunde bei – 20 °C gefällt. Danach
folgte eine Zentrifugation für 30 min bei 14.000 U/min (4°C). Das entstandene DNA-Pellet
wurde anschließend 2x mit je 500 µl 100 %-igem Ethanol gewaschen (Zentrifugation 5 min,
14.000 U/min, 4 °C) und getrocknet. Die DNA wurde in sterilem Wasser aufgenommen und
die Konzentration photometrisch bestimmt. Die in-vitro-Transkription erfolgte mit einem
Transkriptions-Kit (Ambion) nach Angaben des Herstellers. Die RNA wurde nach deren Aufreinigung mit dem RNeasy Mini Kit bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.
R$A-Agarosegel
Zur Größenbestimmung der generierten RNA wurde diese mit RNase/DNase-freiem Wasser
und Auftragspuffer gemischt und für 3 min bei 95 °C inkubiert. Anschließend wurden die
Proben auf ein 1 %-iges ethidiumbromidhaltiges Agarosegel gegeben und bei 80-100 V aufgetrennt, wobei MOPS-Laufpuffer verwendet wurde. Zur Größenbestimmung wurde die 0,5 –
10 kb RNA-Leiter (Invitrogen) eingesetzt.
6.2.3. Methoden zur Proteinexpression
6.2.3.1. Expression in E. coli
Zunächst wurde der entsprechende pet27b-Strep-DEC-205scFv-MAGE-A3-Peptid-Expressionsvektor in den E. coli Bakterienstamm BL21 transformiert und die Bakteriensuspension
auf kanamycinhaltigen Agarplatten ausgestrichen. Zur Expression der Fusionsproteine wurde
dann eine Vorkultur mit 45 ml TB-Medium, 5 ml Kalium-Phosphat-Puffer, ZnCl2 (Endkonzentration 0,5 M), Glukoselösung (Endkonzentration 1 %) und Kanamycinlösung (Endkonzentration 50 µg/ml) mit mehreren Klonen angeimpft und bei 30 °C bei 220 U/min ü.N. im
Horizontalschüttler inkubiert. Am nächsten Morgen wurde die Übernachtkultur in zehn 0,5-lSchikanekolben mit je 450 ml TB-Medium 50 ml Kalium-Phosphat-Puffer, ZnCl2 (Endkonzentration 0,5 M) und Kanamycinlösung (Endkonzentration 50 µg/ml) überimpft, so dass zu
Beginn eine optische Dichte (OD600) der Bakteriensuspension von 0,1 vorlag. Die Bakterien
wurden im Horizontalschüttler Innova 44 bei 28 °C inkubiert, bis die Bakteriensuspension ei-
6. Material und Methoden
134
ne OD600 von 1,3 – 1,6 erreicht hatte. Dann wurden die Bakterien durch Zugabe von 20 g
NaCl, 62,5 ml einer 4 M Sorbitollösung und einer Glycin-Betain-Lösung (Endkonzentration
10 mM) pro Kolben unter osmotischen Stress gesetzt und 1 h bei 26 °C im Horiziontalschüttler inkubiert. Darauf wurde die Expression der Fusionsproteine durch Zugabe einer IPTG-Lösung (Endkonzentration 2 mM) induziert. Die periplasmatische Expression erfolgte bei 26 °C
für ca. 20 h. Die Bakterien wurden am nächsten Tag in 1 l Zentrifugenbechern bei 4000
U/min für 20 min abzentrifugiert, das Pellet in Periplasma-Extraktionspuffer (200 ml/l) resuspendiert und 3 h langsam gerührt. Danach folgte ein Zentrifugationsschritt bei 12.000 U/min
bei 4 °C für 1 h in der Megafuge 2.0 RS. Anschließend wurde das Protein affinitätschromatographisch über den Strep-Tag aufgereinigt.
6.2.3.2. Expression in 293T-Zellen
Am Vortag der Transfektion wurden je 1 x 106 Zellen in 10 ml D-MEM in 10 cm Zellkulturschalen (Greiner) ausgesät und ü.N. im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Morgen wurde das Medium abgenommen und durch 8 ml warmes Medium ersetzt und die Zellen
für mind. 30 min bei 37 °C inkubiert. Für die Transfektion wurden pro Zellkulturschale 20 µg
(Expressionsvektoren) oder 5 µg GFP-Vektor (pF143-GFP, Prof. G. Fey) mit 2,5 M CaCl2
sowie 5 µl 100 mM Chloroquin in einem Eppendorf-Gefäß gemischt und mit MQ auf 1 ml
aufgefüllt. In ein 50 ml Falconröhrchen wurde pro Zellkulturschale 1 ml 2xHBS-Puffer vorgelegt, zu dem unter Luftblasenzufuhr tröpfchenweise das DNA-Calcium-Chloroquin-Gemisch
zugegeben wurde. Anschließend wurde pro Zellkulturschale jeweils 2 ml des Gemisches auf
den Zellen verteilt und die Zellen für 6-8 Stunden im Brutschrank kultiviert. Danach wurde
das Transfektionsmedium durch frisches D-MEM ersetzt. Am Tag 3, 5, 6 und 7 nach der
293T-Transfektion wurden die Überstände abgenommen, und bei 10.000 U/min bei 4 °C in
der Zentrifuge Sorvall Evolution RC zentrifugiert. Der Überstand wurde in Dialyseschläuche
(Spectra Por, MWCO 6-8.000) transferiert und bei 4 °C 3x gegen 1x anti-His-Dialysepuffer
dialysiert. Anschließend wurde das Protein über den His-Tag affinitäschromatographisch aufgereinigt.
6.2.3.3. Aufreinigung von Proteinen
Affinitätschromatische Aufreinigung über den Step-Tag
Die Aufreinigung der in E. coli produzierten Fusionsproteine erfolgte über ihren Strep-Tag.
Dazu wurde zu 1 l Periplasmaüberstand 1,5 ml Strep-Tactin Sepharose-Perlen (IBA) zugege-
6. Material und Methoden
135
ben und 2 h bei 4 °C langsam gerührt. Anschließend wurde der Überstand in 50 ml Falconröhrchen überführt, bei 3000 U/min bei 4 °C für 5 min in der Megafuge 2.0 RS abzentrifugiert
und die pelletierte Sepharose auf ein Säulchen (Biorad) gegeben. Nach zweimaligem Waschen mit 8 ml Strep-Waschpuffer wurde fünfmal mit 500 µl Strep-Elutionspuffer eluiert. Die
einzelnen Fraktionen wurden aufgefangen und bei 4 °C gelagert, bevor die Aufreinigung der
Proteine im Coomassie-gefärbten SDS-Gel und in Western Transfer Experimenten überprüft
wurde. Fraktionen, welche das entsprechende Fusionsprotein enthielten, wurden vereinigt und
gegen 1xPBS (hergestellt aus 10x PBS pH 7,4) unter Verwendung von Dialyseschläuchen der
Firma Spectra Por (6.000-8.000 MW) dialysiert.
Affinitätschromatische Aufreinigung über den His-Tag
In je 100 ml des gegen den anti-His-Dialysepuffer dialysierten 293T-Überstands wurde ü.N.
bei 4 °C je 100 µl Ni-NTA-Agarose (Qiagen) eingerührt. Anschließend wurde der Überstand
in 50 ml Falconröhrchen überführt und die Säule bei 1500 U/min in der Megafuge 2.0 RS für
5 min bei 4 °C abzentrifugiert. Anschließend wurden die abzentrifugierten Agarose-Perlen auf
eine Plastiksäule transferiert. Um eine LPS-Kontamination der Fusionsproteine zu vermeiden,
wurden die Säulchen am Tag vorher für 4 Stunden in 1 M NaOH-Lösung eingelegt und anschließend so lange mit MQ (steril, LPS frei) gespült, bis wieder ein pH von 7 erreicht wurde.
Die Trocknung der Säulchen erfolgte ü.N. Nachdem die Agarose-Perlen auf die Säule transferiert wurden, erfolgte ein viermaliges, gründliches Waschen mit jeweils 5 ml des HisWaschpuffers, um die LPS-Verunreinigungen der anti-His-Agarose zu entfernen. Die Elution
des Proteins erfolgte durch fünfmalige Zugabe des His-Elutionspuffers.
6.2.3.4. Protein-Gelelektrophorese
Diskontinuierliche Protein-Gelelektrophorese nach Laemmli
Für die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine wurden 12 %-ige Polyacrylamid
(PAA)-SDS-Gele verwendet, die aus Trenn- und Sammelgel bestanden (Zusammensetzung
siehe Tabelle 6.14). Je 20 µl der Proben wurden mit 5 µl SDS-Probenpuffer (2x) gemischt
und für 3 min bei 95 °C inkubiert. Anschließend wurde 10 µl dieses Gemisches in die vorher
ausgespülten Taschen des Gels gegeben. Als Standard diente der rainbow Standard (RPN800,
Amersham), von dem 5 µl aufgetragen wurden. Bis die Proben das Sammelgel erreicht hatten,
erfolgte die Gelelektrophorese bei 100 V, die restliche Zeit bei 150 V für ca. 90 min.
6. Material und Methoden
136
Coomassie-Färbung von Proteingelen
Nach erfolgter Gelelektrophorese wurde das Gel für ca. 2 min in Coomassie-Brillant-BlueFärbelösung in der Mikrowelle aufgekocht und anschließend für ca. 20 min auf dem Horizontalschüttler Duromax 1030 inkubiert. Das Gel wurde dann in Coomassie-Entfärber-Lösung
transferiert und so lange weiter geschüttelt, bis die Proteinbanden auf dem Gel gut sichtbar
waren.
6.2.3.5. Abschätzen von Proteinkonzentrationen
Die Abschätzung der Konzentration der aufgereinigten rekombinanten Proteine erfolgte mit
Hilfe eines BSA-Standards. Dazu wurden zunächst Verdünnungen von BSA in PBS in den
Konzentrationen von 4 µg/10 µl, 2 µg/10 µl, 1 µg/10 µl, 0,5 µg/10 µl und 0,25 µg/10 µl hergestellt. Anschließend wurden diese 1:2 in 2x SDS-Auftragspuffer verdünnt, so dass ein BSAStandard mit 2 µg/10 µl, 1 µg/10 µl, 0,5 µg/10 µl, 0,25 µg/10 µl und 0,125 µg/ 10 µl entstand.
Zusätzlich wurden 20 µl der abzuschätzenden Proben mit 4 µl 6x SDS-Auftragspuffer versetzt. Anschließend wurde 6 µl und 12 µl dieses Gemisches auf ein 12 %-iges PAA-SDS-Gel
aufgetragen, zusammen mit je 10 µl der angesetzten BSA-Standardproben. Die Proteine wurden anschließend mit Coomassie-Färbelösung angefärbt und die Konzentration der abzuschätzenden Proben mit Hilfe des BSA-Standards bestimmt.
6.2.3.6. Western Transfer Experimente
Die durch die Gelekelektrophorese aufgetrennten Proteine wurden auf eine Nitrozellulosemembran (Schleicher und Schuell) mit einer Porengröße von 0,2 µm mit dem Nass-Transferapparat Protean II Cell and System (Biorad) bei 400 mA für 35 min in 1x Transferpuffer
transferiert. Nach dem Blotvorgang wurde die Membran im anti-His-TBS-Puffer im Kühlschrank aufbewahrt.
$achweis der rekombinanten Proteine über den 6xHis-Tag
Die Membran wurde zunächst für 1 Stunde in 20 ml anti-His-TBS-Puffer mit 3 % BSA
blockiert, um eine unspezifische Bindung des Antikörpers zu verhindern. Anschließend wurde
in die Blockierlösung der murine anti-His-Antikörper in einer Verdünnung von 1:2000 zugegeben und der Blot eine weitere Stunde auf dem Horizontalschüttler geschüttelt. Danach wurde die Membran 3x für je 5 min mit jeweils 15 ml TBS/Tween/TritonX-Puffer gewaschen.
Daraufhin wurde der Ziege anti-Maus Fc HRP Antikörper in einer 1:5000 Verdünnung in 20
6. Material und Methoden
137
ml anti-His-TBS-Puffer mit 10 % Magermilchpulver für 1 Stunde mit der Membran auf dem
Horizontalschüttler inkubiert. Nach erneutem Waschen wurde zu der Membran das ECL-Reagenz zugegeben. Die HRP katalysiert dann die Oxidation von Luminol zu 3-Aminophtalat unter Lichtemission, welche durch die Entwicklung eines Röntgenfilms am Curix 60 (Agfa)
sichtbar gemacht werden kann.
$achweis der rekombinanten Proteine über den Strep-Tag
Zunächst wurde die Membran ü.N. bei RT in 20 ml PBS (1x) mit 3 % BSA und 0,5 % Tween
20 inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS mit 0,1 % Tween für jeweils 5 min erfolgte eine einstündige Inkubation mit dem anti-Strep-HRP-Antikörper, welcher in einer Verdünnung von 1:4000 eingesetzt wurde. Darauf folgten jeweils zwei 5-minütige Waschschritte
in 1xPBS mit 0,1 % Tween 20. Anschließend erfolgte die Entwicklung der Membran wie
oben beschrieben.
Strippen der Membran durch pH-Verschiebung
Um die Membran nach der Entwicklung mit dem anti-His-Antikörper noch mit einem antiStep-Antikörper entwickeln zu können, wurde die Membran zuvor durch Veränderung des
pH-Wertes von den vorher verwendeten Antikörpern befreit. Dazu wurde der Blot für 1 Stunde bei RT im STRIP-Puffer inkubiert, wobei die Lösung 4-5x ausgewechselt wurde. Anschließend wurde die Membran 3x für 10 min mit dem TBS/Tween/Triton-Puffer gewaschen,
bevor sie bis zur Inkubation mit dem anti-Strep-HRP-Antikörper in anti-His-TBS-Puffer bei 4
°C aufbewahrt wurde.
6.2.3.7. Überprüfung der Fusionsproteine auf LPS-Kontamination
Die Überprüfung der Fusionsproteine auf eine mögliche LPS-Kontamination erfolgte durch
den LAL-Test entweder durch die Firma Profos oder in Kooperation mit der AG
Bogdan/Schleicher aus der Infektionsmikrobiologie in Erlangen.
6.2.3.8. Lagerung der Fusionsproteine
Die Fusionsproteine wurden zur längeren Lagerung in 20 % Glycerin bei -20 °C eingefroren.
In der Regel wurden die Fusionsproteine aber frisch eingesetzt und bis zur Verwendung bei 4
°C gelagert.
6. Material und Methoden
138
6.2.4. Statistische Analysen
Die in den Experimenten erhaltenen Rohdaten wurden mit Hilfe der Software Excel oder
Graphpad Prism ausgewertet. Mit Hilfe des Mann-Whitney-Tests (U-Tests) und des Student´s
T-Tests wurden die Signifikanzwerte ermittelt. * p < 0,05, ** p< 0,005, *** p<0,001.
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Statistisches Bundesamt Deutschland
http://www.destatis.de/jetspeed/portal/cms/
7. Literaturverzeichnis
157
8. Abkürzungsverzeichnis
%
4-1BB
Abb.
ana
APC
AS
BDCA-2
BSA
BZR
C
ca.
CBA
CCL19 / CCL21
CCR7
CD
CD40L
C-DC
CDP
CDR
CEA
CFSE
CLR
cMAF
CO2
CTL
cTZR
CXCR3
D
DAMPs
DC
DCLAMP
DC-SIGN
DK
D-MEM
DMSO
DNA
dPBS
dTT
E.coli
EB
ECL
EDTA
EGF
ELISA
EP
ER
ErbB2
et al.
EVD
FACS
FcR
FCS
Fc-Teil
FDA
FITC
Foxp3
FSC
GFP
GM-CSF
Prozent
CD137
Abbildung
analog
antigenpräsentierende Zelle
Aminosäure
blood DC antigen 2
bovines Serum Albumin
B-Zell-Rezeptor
constant
cirka
cytometric bead array
CC-motif ligand 19/21
CC chemokine-receptor 7
cluster of differenciation
CD40-Ligand
klassische DC
comon DC precursor
complementarity determining region
carcinoembryonic antigen
carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
C-Typ-Lektin-Rezeptor
musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog
Kohlendioxid
zytotoxische T-Zelle
chimärer T-Zell-Rezeptor
CXC Chemokinrezeptor 3
diversity
damage-associated molecular pattern molecules
Denritische Zelle/n
DC-specific lysosome-associated membrane glycoprotein
dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin
anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL
Dulbecco´s modified Eagle´s medium
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Dulbeccos`s phosphate buffered saline
Dithiothreitol
Eschericha coli
Elution buffer
enhanced chemoluminescence
Ethylendiamintetraacetat
epithelial growth factor
enzyme-linked immunosorbent assay
Elektroporation
Endoplasmatischen Retikulum
erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2
et alii (und andere)
EVD-Peptid (MAGE-A3)
flourescence activated cell sorter
Fc-Rezeptoren
fetal calf serum
constant region of immunoglobulin
food and drug administration
flourescein isothiocyanate
forkhead box protein 3
forward scatter
green flourescent protein
Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor
7. Literaturverzeichnis
GMP
gp
H 2O
HBS
HCL
HEPES
HER2/neu
HIV
HLA
HMGB1
HRP
HSA
HSC
HSPs
HSVtk
iDC
IFN
Ig
Ii
IL
iNOS
intDC
IPTG
J
KKL
Konz.
LAL
LB
LC
L-DC
LMO-2
LP
LPS
MACS
MAGE
MCSP
mDC
M-DC
med
MelanA
MFI
MHC
MIIC
mind.
MIP-3β
MK
MLPC
MR
MMR
moDC
MOPS
MUC1
mut
MWCO
MyD88
NAF
NaOH
NFAT
Ni-NTA
NK-Zellen
NLRs
NY-ESO-1
158
good manufacturing practise
Glykoprotein
Wasser
HEPES saline buffer
Salzsäure
hydroxyethylpiperazine-ethanesulfonic acid
human epidermal growth factor receptor 2
human immunodeficiency virus
human leukocyte antigen
high-mobility group box 1
horse radish peroxidase
human serum albumin
hematopoietic stem cell
Hitzeschockproteine
Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase
unreife aus Monozyten generierte DC
Interferon
Immunglobulin
invarianten Kette
Interleukin
inducible isoform of nitric oxide synthase
interstitial DC
Isopropyl-Thio-Galaktosid
joining
KKL-Peptid (MAGE-A3)
Konzentration
Limulus-Amöbocyten-Lysat
Luria Broth
Langerhans-Zellen
lymphoid DC
nuclear LIM domain protein
langes Peptid (MAGE-A3)
Lipopolysaccharid
magnetic associated cell sorting
melanoma antigen encoding gene
Melanoma-assoziiertes Chondroitinsulfat Proteoglykan
reife aus Monozyten generierte DC
myeloiden DC
Medium
melanocyte antigen
mean flourescence intensity
major histocompatibility complex
MHC class II-enriched compartment
mindestens
macrophage inflammatory protein-3-beta
anti-MCSPscFv-MAGE-A3-KKL
multi-lineage progenitor cell
Mannoserezeptor
Makrophagen-Mannoserezeptor
monocyte derived dendritic cells
3-(N-Morpholino-)propansulfonsäure
Mucin 1
mutiert
molecular weight cut-off
myeloid differentiation primary response gene (88)
non-adherent fraction
Natriumhydroxid
nuclear factor of activated T cells
$i2+-nitrilotriacetic acid
Natürliche Killerzellen
nucleotide oligomerization domain ($OD)-like receptors
$ew York-esophagus 1
7. Literaturverzeichnis
OD
OKT-3
PAA
PAMPs
PBMCs
PCR
P-DC
PE
Pfu
PGE2
PMA
polyA
PRRs
RPMI
RT
RT-PCR
sc
scFv
SCID
SDS
SLO
SOB
SOC
SSC
Strep
TA
TAE
TAM
Taq
T-bet
TBS
TE
TILs
TipDC
TLR
TNF
TRAIL
Tris
TZR
u.a.
ü.N.
UV
V
VDJ
VH
VL
wt
XTT
YT
z.B.
159
optische Dichte
Orthoclone OKT3 (Antikörper muromonab-CD3)
Polyacylamid
pathogen-associated molecular patterns
peripheral blood mononuclear cells
polymerase chain reaction
plasmazytoide DC
Phycoerythrin
Pyrolobus fumarii
Prostaglandin 2
Phorbol-Myristat-Azetat
PolyA-Schwanz
pattern recognition receptors
Roswell Park Memorial Institute
Raumtemperatur
Reverse Transkriptase PCR
solvent control
single chain fragment variable
severe combined immunodeficiency
sodium dodecyl sulfate
sekundäre lymphatische Organe
super optimal broth
super optimal broth and sugar for catabolite expression
sideward scatter
Streptavidin
Tumorantigen
Tris-Acetat-EDTA
immunoreceptor tyrosine-based activation motif
Thermus aquaticus
T-box expressed in T-cells
tris buffered saline
Tris/EDTA
tumor infiltrating lymphocytes
TNF- und iNOS-produzierende DC
toll-like receptor
Tumor-Nekrose-Faktor α
T$F-related apoptosis-inducing ligand
Tris-hydoxymethylaminomethan
T-Zell-Rezeptor
unter anderem
über Nacht
ultraviolett
variable
variable diversity joining
vairable heavy chain
variable light chain
wildtyp
sodium 3´-[1-(phenylaminocarbonyl)- 3,4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro)
benzene sulfonic acid hydrate
yeast trypton
zum Beispiel
7. Literaturverzeichnis
160
Einheiten
°C
A
Bp
Da
EU
gr
h
IU
l
M
min
Mio
pH
Sek.
U
U/min
V
:ukleinsäuren/:ukleotide
Grad Celsius
Ampere
Basenpaare
Dalton
endotoxin unit
gramm
Stunde
international units
Liter
molar (M/l), molare Masse
Minute
Million
pondus hydrogeniii
Sekunde
unit
Umdrehungen/Minute
Volt
Aminosäuren
Alanin
Arginin
Asparagin
Aspartat
Cystein
Glutamat
Glutamin
Glycin
Histidin
Isoleucin
Leucin
Lysin
Methionin
Phenylalanin
Prolin
Serin
Threonin
Tryptophan
Tyrosin
Valin
A
R
N
D
C
E
Q
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
A
ATP
C
cDNA
DNA
dNTP
G
mRNA
RNA
T
Adenin
Adenosin-Triphosphat
Cytosin
complete DNA
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonukleotidtriphosphat
Guanin
messenger RNA
Ribonukleinsäure
Thymidin
Vorzeichen/Vorsätze
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Glu
Gln
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
k
m
µ
n
p
kilo
mili
mikro
nano
pico
103
10-3
10-6
10-9
10-12
Verwendete griechische Buchstaben
α
β
δ
ε
γ
η
ζ
alpha
beta
delta
epsilon
gamma
eta
zeta
9. Lebenslauf
161
9. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Beruf:
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Nationalität:
Konfession:
Familienstand:
Schulischer Werdegang:
1987 – 1991
1991 – 2000
Hochschulstudium:
2000 – 2005
Katrin Martina Birkholz
Diplom Biologin (Univ.)
01.08.1980
Erlangen
deutsch
evangelisch
ledig
Grundschule Brucker Lache, Erlangen
Emmy-Noether-Gymnasium, Erlangen
Schulabschluss: Abitur
Biologiestudium (Diplom) an der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg mit dem Hauptfach Genetik
Diplomarbeit am Lehrstuhl der Genetik an der FriedrichAlexander-Universität Erlangen Nürnberg bei Prof. G. Fey
Thema: Herstellung und funktionelle Charakterisierung
eines neuen Immuntoxins gegen das Melanoma
assoziierte Chondroitinsulfat Proteoglykan MCSP
Studienabschluss: Diplom Biologin
Auslandsaufenthalte:
2001
2005-2006
Promotion:
Seit 2006
5-wöchiges Praktikum im Pearcedale Conservation Park,
Australien
3-monatiger Auslandsaufenthalt in Australien
Doktorandin an der Universitätshautklinik, Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg
Betreuer: Prof. L. Nitschke, Lehrstuhl Genetik, FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Thema: scFv-basierte Immuntherapeutika als Werkzeuge in
der Krebsbehandlung
Akademische Förderung: seit Nov. 2008 Mitglied im Graduiertenkolleg des SFB 643
10. Eigene Puplikationen und wissenschaftliche Vorträge
162
10. Eigene Publikationen und wissenschaftliche Vorträge
Eigene Publikationen
Erstautorschaften
Birkholz K, Michael Schwenkert, Christian Kellner, Beatrice Schuler-Thurner, Georg Fey,
Gerold Schuler, Jan Dörrie, Niels Schaft. DEC-205-targeting of malignant melanoma patientderived dendritic cells with a scFv-MAGE-A3 construct results in efficient antigen
presentation (manuscript under revision; blood).
Birkholz K, Hombach A, Krug C, Reuter S, Kershaw M, Kämpgen E, Schuler G, Abken H,
Schaft N, Dörrie J. Transfer of mRNA encoding recombinant immunoreceptors reprograms
CD4+ and CD8+ T cells for use in the adoptive immunotherapy of cancer. Gene Ther. 2009
May; 16(5):596-604.
Geteilte Erstautorschaft
Birkholz K, Hofmann C, Hoyer S, Schulz B, Harrer T, Kämpgen E, Schuler G, Dörrie J,
Schaft. A fast and robust method to clone and functionally validate T-cell receptors. J
Immunol. Methods. 2009 Jul 31; 346(1-2):45-54.
Koautorenschaft
Schwenkert M, Birkholz K, Schwemmlein M, Kellner C, Kügler M, Peipp M, Nettelbeck
DM, Schuler-Thurner B, Schaft N, Dörrie J, Ferrone S, Kämpgen E, Fey GH.A single chain
immunotoxin, targeting the melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan, is a potent
inducer of apoptosis in cultured human melanoma cells. Melanoma Res. 2008 Apr ;18(2):7384.
Veröffentlichte Kongressberichte
Schaft N, Birkholz K, Hofmann C, Schmid M, Theiner G, Dörrie J. Dendritic cell
vaccination and other strategies to tip the balance of the immune system : DC2007 5th
International Meeting, July 16-18, Bamberg, Germany. Cancer Immunol Immunother. 2008
Jun; 57(6):913 28.
Dörrie J, Birkholz K, Schaft N. Strategies for immune intervention; from bench to bedside:
Symposium 2006 of the Collaborative Research Center "Strategies of cellular immune
intervention" July 17th-18th, Erlangen, Germany. Cancer Immunol Immunother. 2007 Oct;
56(10):1677-85. Epub 2007 Mar 29.
Wissenschaftliche Vorträge
Oktober 2009
Lange Nacht der Wissenschaften, Erlangen
„Beladung von Dendritischen Zellen zur Behandlung von
Tumoren“
März 2008
XXXV. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Deutscher
Dermatologen, Erlangen
„DC cancer vaccines: development of new strategies for
antigen loading“
10. Eigene Puplikationen und wissenschaftliche Vorträge
September 2007
37th Anual Meeting of the German Society of Immunology,
Heidelberg
“$ew strategies for antigen loading of human
DC”
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11. Danksagung
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11. Danksagung
Bei Herrn Prof. Dr. Schuler bedanke ich mich für die Überlassung des Hauptprojektes meiner
Dissertation, dem DEC-205-Targeting, sowie für die vielen Anregungen während meiner Zeit
an der Hautklinik. Außerdem möchte ich mich für die Erstellung des Zweitgutachtens dieser
Arbeit bedanken.
Mein besonderer Dank geht an meine beiden Arbeitsgruppenleiter, Herrn Dr. Niels Schaft und
Herrn Dr. Jan Dörrie, welche mich stets tatkräftig unterstützt haben. Dabei ließen sie mir viel
Freiraum in der Durchführung meiner Experimente, standen aber stets hilfreich bei Problemen
zur Seite.
Herzlich möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. L. Nitsche für die Betreuung meiner Arbeit
seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultät II der Universität Erlangen-Nürnberg bedanken,
sowie für seine Bemühungen in der Betreuungskomission im Rahmen des Graduiertenkollegs
643.
Bei Herrn Prof. Dr. A. Steinkasserer bedanke ich mich für seine Bemühungen im Rahmen der
Betreuungskomission des Graduiertenkollegs 643, sowie für die hilfreichen wissenschaftlichen Anregungen
Ich danke Herrn Prof. Dr. L. Nitschke, Herrn Prof. Dr. A. Steinkasserer und Herrn Prof. Dr. T.
Winkler für ihre Bereitschaft, mich bei meiner Verteidigung zu prüfen.
Bei Frau PD Dr. B. Schuler-Thurner bedanke ich mich für die Überlassung von Patientenmaterial, sowie für die hilfreichen Ratschläge während meiner Doktorarbeit.
Ein herzlicher Dank geht auch an Herrn Prof. E. Kämpgen für seine Unterstützung beim
cTZR-Projekt, sowie für die vielen interessanten Gespräche während meiner Doktorarbeit.
Bei Herrn Prof. Dr. G. Fey bedanke ich mich für die enge Zusammenarbeit beim DEC-205Targeting-Projekt und für die hilfreichen und interessanten wissenschaftlichen Diskussionen.
Herzlichen Dank auch an Herrn Dr. M. Schwenkert für die stetige Unterstützung in Expressionsfragen sowie Herrn Dr. C. Kellner für die Klonierungsstrategie der anti-DEC-205scFvMAGE-A3-Peptid-Fusionsproteine.
11. Danksagung
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Bei unseren weiteren Kooperationspartnern, Herrn Prof. Dr. H. Abken und Herrn Dr.
Hombach, sowie Herrn Prof. Dr. M. Kershaw möchte ich mich für die gute Zusammenarbeit
im Rahmen des cTZR-Projektes bedanken.
Des Weiteren danke ich Herrn Prof. Dr. R. Steinman, Herrn Prof. Dr. K. Thielemans, Herrn
Prof. Dr. P. van der Bruggen, Frau Prof. D. Dudziak, Argos Therapeutics sowie Prof. Dr. E.
Schultz für die Bereitstellung von Zelllinien und Konstrukten.
Bei Herrn Prof. Dr. M. Herrmann bedanke ich mich für die Organisation und sein Engagement als Vorsitzender des Graduiertenkollegs 643.
Frau. Dr. U. Schleicher sowie Herr Prof. Dr. C. Bogdan möchte ich für die Bestimmung von
LPS-Konzentrationen in meinen Proteinlösungen danken.
Herzlicher Dank auch an die Mitglieder der restlichen Arbeitsgruppen im „Schuppen“ und
Container. Besonders Frau Dr. I. Knippertz hat mir gerade zu Beginn meiner Doktorarbeit mit
Rat und Tat zur Seite gestanden. Allen Mitarbeitern des GMP-Gebäudes danke ich für ihre
Hilfe beim Patientenmaterial und ihre stetige Hilfsbereitschaft. Des Weiteren möchte ich mich
bei dem Pflegepersonal und bei allen Ärzten bedanken, die in den letzten Jahren für die reibungslose Blutabnahme vieler Blutspender sorgte, obwohl sie stets viel um die Ohren hatten.
Nicht zuletzt möchte ich meiner kompletten Arbeitsgruppe für die gemeinsamen vier Jahre
bedanken. Zum einem für die hilfreiche Unterstützung und gute Zusammenarbeit im Labor,
zum anderen für die vielen Unternehmungen außerhalb des Laboralltags wie unser Weihnachtsgrillen, Kino- oder Pizzaabende und natürlich diversen schönen Feiern ;o)!
Ganz besonders möchte ich mich bei meiner Familie bedanken. Sie zeigten stets großes Interesse an meiner Arbeit. Ohne die Unterstützung meiner Eltern wäre es mir nicht möglich gewesen, sowohl mein Biologiestudium als auch die angeschlossene Doktorarbeit zu vollenden.
Zuletzt möchte ich mich noch ganz herzlich bei meinem Freund Sven Brenner bedanken. In
den letzten Jahren haben wir die Anstrengungen des Biologiestudiums sowie der Doktorarbeit
stets zusammen gemeistert. Danke, dass Du immer da warst, wenn ich Dich gebraucht habe!
Jetzt geht das Leben erst richtig los!