Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und
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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Abteilung Immunologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Spezifische Eliminierung von Tumorzellen durch T-Zellen: Bedeutung der T-Zellvorläuferfrequenz INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt im Februar 2003 von Dan Potthoff geboren in Göttingen Dekan: Professor Dr. M. Schumacher 1. Gutachter: Professor Dr. sc. nat. H. Pircher 2. Gutachter: PD Dr. S. Benz Jahr der Promotion: 2003 Für meine Familie Inhaltsverzeichnis Seite I Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung........................................................................... 1 Summary.......................................................................................... 2 2. Abkürzungen ................................................................................... 3 3. Einleitung......................................................................................... 6 3.1 Das Immunsystem ............................................................................................ 6 3.1.1 Das unspezifische/angeborene Immunsystem.................................................... 6 3.1.2 Das spezifische/erworbene Immunsystem ......................................................... 7 3.2 Stimulation von T-Lymphozyten .................................................................... 8 3.2.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)................................................. 8 3.2.2 Antigenerkennung und Aktivierung von T-Lymphozyten................................. 9 3.3 Effektormechanismen von T-Lymphozyten ................................................ 11 3.4 Autoimmunität und Toleranz von T-Lymphozyten.................................... 12 3.5 Tumorimmunologie........................................................................................ 13 3.5.1 Tumorantigene ................................................................................................. 14 3.5.2 Immunantwort auf Tumoren ............................................................................ 15 3.5.2.1 T-Zell vermittelte Tumorabwehr...................................................................... 16 3.5.3 Möglichkeiten von Tumoren die Immunabwehr zu umgehen ......................... 16 3.5.4 Immuntherapie von Tumoren........................................................................... 17 3.6 Fragestellung................................................................................................... 18 3.7 Das 3LL-A9GP33 Tumormodell ...................................................................... 19 3.8 ALB1-tg Mäuse............................................................................................... 20 4. Material und Methoden................................................................ 21 4.1 Mäuse............................................................................................................... 21 4.2 Zelllinien.......................................................................................................... 21 4.3 Virus ................................................................................................................ 21 4.4 Peptide ............................................................................................................. 22 4.5 Zellbiologische Methoden .............................................................................. 22 4.5.1 Medien.............................................................................................................. 22 4.5.2 Kultivierung von Tumorzellen ......................................................................... 22 4.5.3 Subkutane Injektion von Tumorzellen ............................................................. 22 4.5.4 Bestimmen der Wachstumskinetik von Tumoren anhand der Tumorgröße .... 23 Inhaltsverzeichnis Seite II 4.5.5 Isolierung und Aufarbeitung der subkutan gewachsenen Tumoren................. 23 4.5.6 Erstellen einer Einzelzellsuspension ................................................................ 23 4.5.7 Virus Injektion und in vivo Stimulation ........................................................... 23 4.5.8 In vitro Stimulation von TCR-tg T-Zellen ....................................................... 24 4.5.9 Zytotoxizitätstest (CTL-Test)........................................................................... 24 4.6 Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie ............................................ 25 4.6.1 Puffer für Durchflußzytometrie........................................................................ 25 4.6.2 Verwendete Antikörper .................................................................................... 25 4.6.3 Färbung von Zellen aus lymphatischen Organen............................................. 25 4.6.4 Analyse von Lymphozyten aus peripherem Blut ............................................. 26 4.6.5 GP33/Db MHC-Klasse I Tetramer-Färbung..................................................... 26 4.6.6 Anfärbung von Zellen mittels intrazellulärem Farbstoff CFSE ....................... 26 4.6.7 Adoptiver Transfer von Zellen......................................................................... 26 4.7 Histologie......................................................................................................... 27 4.7.1 Kryokonservierung von entnommenen Tumoren ............................................ 27 4.7.2 Erstellen histologischer Gewebeschnitte.......................................................... 27 4.7.3 Immunhistologie............................................................................................... 27 4.7.3.1 Verwendete Antikörper .................................................................................... 27 4.7.3.2 Immunfärbung von Gewebeschnitten .............................................................. 27 5. Ergebnisse ...................................................................................... 29 5.1 Charakterisierung der GP33-spezifischen CD8 T-Zellantwort in ................ B6-, ALB1-tg und H8-tg Mäuse .................................................................... 29 5.2 LCMV-immunisierte ALB1-tg Mäuse können H8-tg Milzzellen ................. abstoßen........................................................................................................... 32 5.3 Wachstum von 3LL-A9 und 3LL-A9GP33 Zellen in B6- und ......................... ALB1-tg Mäusen ............................................................................................ 33 5.4 Wachstum von 3LL-A9GP33 Zellen in ALB1-tg Mäusen ................................ nach LCMV-Infektion ................................................................................... 36 5.5 GP33-spezifische T-Zellen können in 3LL-A9GP33-Tumortragenden ........... ALB1-tg Mäusen nicht nachgewiesen werden............................................. 37 5.6 Wirkung einer akuten LCMV-Infektion auf das Wachstum von ................. 3LL-A9GP33 Tumorzellen ............................................................................... 38 5.7 Adoptiver Transfer von aktivierten TCR-tg Zellen in ALB1-tg Mäuse ... 39 5.7.1 Adoptiver Transfer von in vivo aktivierten TCR-tg Zellen.............................. 40 Inhaltsverzeichnis Seite III 5.7.2 Adoptiver Transfer von in vitro aktivierten TCR-tg Zellen............................. 40 5.8 Adoptiver Transfer von naiven TCR-tg Zellen ........................................... 41 5.9 Immunhistologie der Tumoren ..................................................................... 44 5.9.1 Infiltration von hämatopoietischen Zellen in 3LL-A9 und ................................. 3LL-A9GP33 Tumore ......................................................................................... 44 5.9.2 Infiltration von transferierten TCR-tg Zellen in 3LL-A9GP33 Tumore............. 44 5.10 Analyse der TCR-tg Zellen in tumortragenden ALB1-tg Mäusen ............ 48 5.11 TNF als Effektormolekül ............................................................................... 51 5.12 IFN-γ als Effektormolekül ............................................................................. 52 6. Diskussion ...................................................................................... 53 6.1 Induktion von GP33-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten............. 53 6.2 Wachstum von 3LL-A9GP33 Tumoren .......................................................... 55 6.3 Möglichkeiten den etablierten 3LL-A9GP33 Tumor zu eliminieren............ 56 6.3.1 Virusinfektion tumortragender ALB1-tg Mäusen reduziert ................................ Tumorwachstum............................................................................................... 56 6.3.2 Adoptiver Transfer von aktivierten TCR-tg Zellen in tumortragende ................ ALB1-tg Mäuse reduziert Tumorwachstum .................................................... 57 6.3.3 Adoptiver Transfer von naiven TCR-tg Zellen in ALB1-tg Mäuse schützt ....... vor Tumorzellwachstum................................................................................... 57 6.4 Erhöhung der Vorläuferfrequenz tumorspezifischer T-Zellen führt ........... zur Tumorzellelimination .............................................................................. 58 6.5 Mechanismen der T-Zell vermittelten Tumorabwehr ................................ 59 6.5.1 Infiltration von TCR-tg T-Zellen führt zur Tumorzellelimination................... 59 6.5.2 Einfluss von IFN-γ und TNF der TCR-tg Zellen auf .......................................... das Tumorzellwachstum................................................................................... 61 6.5.3 Hemmung der Tumor-Angiogenese durch TCR-tg T-Zellen .......................... 62 6.6 Aktivitätsparameter TCR-tg T-Zellen ......................................................... 63 7. Literaturverzeichnis ..................................................................... 66 8. Lebenslauf...................................................................................... 77 9. Danksagung ................................................................................... 78 1. Zusammenfassung 1 1. Zusammenfassung Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen in unserer Gesellschaft. Bei Immunantworten gegen entartete Zellen besitzen CD8 T-Zellen eine wesentliche Bedeutung. Doch immer wieder sind T-Zell vermittelte Immunantworten auf Tumoren erfolglos und ein Tumorwachstum kann nicht verhindert werden. Tumoren entwickeln sich aus körpereigenem Gewebe und exprimieren Antigene, welche vom Immunsystem nicht als genügend fremd erkannt werden. Hierdurch wird eine erfolgreiche Aktivierung des Immunsystems erschwert und ein Tumorwachstum kann ungehindert stattfinden. Um eine solche Situation nachzustellen, wurde das transfizierte Lewis Lungen Karzinom 3LL-A9GP33 und ein spezielles Mausmodell (ALB1-transgene Mäuse) ausgewählt. 3LL-A9GP33 Tumorzellen exprimieren das GP33 T-Zellepitop des Virus der lymphozytären Choriomeningitis (LCMV), welches als Tumor Assoziiertes Antigen (TAA) dient. ALB1-tg Mäuse exprimieren GP33 auf den Hepatozyten und zu einem geringeren Anteil im Thymus. Die Expression des GP33 Transgens im Thymus der ALB1-tg Mäuse führt zu einer partiellen Deletion von GP33spezifischen T-Zellen. Bei durchflusszytometrischer Analyse von Lymphozyten aus LCMVinfizierten C57BL7/6 (B6-Mäusen) und ALB1-tg Mäusen mittels GP33/Db MHC-Klasse I Tetramere zeigte sich, dass die Anzahl aktivierter GP33-spezifischer T-Zellen in den ALB1-tg Mäusen im Vergleich zu B6 Wildtyp Mäusen auf ein Drittel reduziert ist. Dieses Resultat deutet darauf hin, das die Vorläuferfrequenz von GP33-spezifischen T-Zellen in den ALB1-tg Mäusen vermindert ist. Subkutan injizierte 3LL-A9GP33 Tumorzellen werden in B6 Mäusen vollständig abgestossen, hingegen wachsen subkutan injizierte 3LL-A9GP33 Tumorzellen in ALB1-tg Mäuse zu vollständigen Tumoren aus. Dies deutet darauf hin, dass die Frequenz von GP33-spezifischen T-Zellen entscheidend ist für die erfolgreiche Abstossung von 3LL-A9GP33 Tumoren. Adoptiver Transfer von aktivierten und naiven GP33-spezifischen T-Zell Rezeptor transgenen Zellen (TCR-tg) in tumortragende ALB1-tg Mäuse wurde angewandt, um die TZell vermittelte Tumorabwehr in Abhängigkeit von der Vorläuferfrequenz GP33-spezifischer T-Zellen zu untersuchen. Durch adoptiven Transfer von TCR-tg Zellen wurde die Anzahl tumorspezifischer T-Zellen in den ALB1-tg Mäusen erhöht. Es zeigte sich, dass die Erhöhung der Vorläuferfrequenz GP33-spezifischer T-Zellen zur Abstossung von 3LL-A9GP33 Tumorzellen in ALB1-tg Mäusen führt. Des Weiteren konnten direkt GP33-spezifische TCRtg T-Zellen immunhistochemisch im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass die Vorläuferfrequenz von GP33-spezifischen T-Zellen entscheidend ist für eine stattfindende Abstossungsreaktion von 3LL-A9GP33 Tumorzellen. Summary 2 Summary Cancer is one of the major causes of death. In successful immune responses against tumors CD8 T cells play a crucial role. Nevertheless CD8 T cell responses against tumors are often ineffective and do not prevent tumor progression. Tumor cells are of host origin and often will not be recognized by the immune system as foreign. Thus effective activation of immune cells fails and tumor progression results. A model of the transfectant Lewis Lung Carcinoma 3LLA9GP33 and a special mouse model (ALB1-transgene mice) were chosen to mimic this situation. The 3LL-A9GP33 tumor cells express the gp33 T cell eitope of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) as a tumor associated antigen (TAA). The ALB1-tg mousestrain expresses gp33 on hepatocytes and at a lower level in the thymus. Expression of gp33 transgen in the thymus of the ALB1-transgenic mice leads to partial deletion of the gp33-specific T cells. Fluorescent activated cell sorter (FACS) analyses with gp33/Db MHCclass I Tetramers of lymphocytes from LCMV-infected C57BL/6 mice (B6 mice) and ALB1tg mice showed reduced numbers of activated gp33-specific T cells in ALB1-tg mice compared to B6 mice. This shows that the precursor frequency of gp33-specific T cells in ALB1-tg mice is reduced compared to B6 mice. Subcutaneousely injected 3LL-A9GP33 tumor cells in B6 mice were completely rejected, whereas after subcutaneously injection of 3LLA9GP33 tumor cells into ALB1-tg mice tumor growth can be observed. This demonstrates that the frequency of activated gp33-specific CD8 T cells in these mice is important for T cell mediated tumor rejection of the 3LL-A9GP33 tumor cells. To vary the precursor frequency of gp33-specific T cells in the ALB1-tg mice an adoptive transfer model was developed. Activated and naive T cell receptor-transgenic (TCR-tg) T cells specific for the gp33-antigen were adoptively transfered to tumor bearing mice. This adoptive transfer of TCR-tg cells effectively increased the number of tumor specific T cells in ALB1-tg mice and 3LL-A9GP33 tumor cells were then rejected. Furthermore gp33-specific TCR-tg T cells could be observed in tumor sections from tumor bearing mice. Thus increasing the percursor frequency of gp33specific T cells is crucial for successful rejection of 3LL-A9GP33 tumor cells. 2. Abkürzungen 3 2. Abkürzungen Abb Abbildung Ag Antigen Ak Antikörper APC Antigenpräsentierende Zelle AS Aminosäure B6 C57BL/6 B6 IFN-γ-/- Interferon-γ defiziente B6-Maus B6 TNF-/- TNF defiziente B6-Maus B16 Melanomzelllinie B16GP33 GP33-exprimierende B16-Melanomzelllinie Bio Biotin °C Grad Celsius CD cluster of differentiation CEA Karzinoembryonales Ag CFSE 5,6-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidyl-Ester CTL Zytotoxischer T-Lymphozyt DC Dendritische Zelle DMEM Dulbecco´s Modified Essential Medium DMSO Dimethylsulfoxid EBV Ebstein Barr Virus EL-4 Mauslymphomzelllinie FITC Fluoresceinisothiocyanat FKS fötales Kälberserum FSC forward scatter (Zellgrösse) G418 Genticinsulfat GMCSF Granulozyten-Makrophagen Kolonie stimulierender Faktor GP Glykoprotein GP33 Peptid KAVYYNFATM des Glykoproteins von LCMV h Stunde H8 Mauslinie die GP33 auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert HPV Humanes Papilloma Virus Hsp Hitze-Schock-Protein 2. Abkürzungen 4 IFN-γ Interferon gamma IgM Immunglobulin M IL Interleukin IMDM Iscove´s Modified Essential Medium IP-10 IFN-γ induzierbares Protein-10 i.v. intravenös l Liter LAK Lymphokin aktivierte Killerzellen LCMV Leukozytäres Choriomeningitisches Virus M Molar m Milli µ Mikro mAb „monoklonal Anitbody“ monoklonaler Antikörper MCP makrophage chemoatractant protein MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) Mig IFN-γ induziertes Monokin min Minute MIP macrophage inflammatory protein n Nano NaCl Natriumchlorid NK-Zelle Natürliche Killer Zelle NO Stickstoffmonoxyd NP 396 Nukleoprotein des LCMV mit den Peptiden396-404 FQPQNGQFI OVA Ovalbumin PBS Phosphate Buffer Saline (Phosphat gepufferte Saline) PE Phycoerythrin pfu Plaque forming unit pH negativer dekadischer Logarithmus der Protonenmolarität P/S Penicillin/Streptomycin rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur s.c. subkutan 2. Abkürzungen 5 SSC sideward scatter (Zellgranularität) TAA Tumorassoziiertes Antigen TAP Transporter associated with antigen processing TCR T-Zell Rezeptor TCR-tg T-Zell Rezeptor transgen tg transgen TGF-β Transforming growth factor-β TH1 Typ 1 CD4 T-Helferzelle TH2 Typ 2 CD4 T-Helferzelle TNF Tumor-Nekrose-Faktor U Unit 3LL-A9 Murines Lungenzellkarzinom „Lewis Lung“ 3LL-A9GP33 GP33-exprimierendes murines Lungenkarzinom 3. Einleitung 6 3. Einleitung 3.1 Das Immunsystem Ständig ist der Organismus einer Vielzahl von pathogenen Keimen, wie Viren, Bakterien, Parasiten und Pilzen, aber auch körpereigener entarteter Zellen ausgesetzt. Sie können das Gleichgewicht des Körpers stören. Daraus resultieren Beeinträchtigungen von Funktionsabläufen. Um dies zu umgehen, entwickelte sich im Laufe der Evolution das Immunsystem, welches zur Bekämpfung von krankheitserregenden Faktoren dient. Das Immunsystem besteht aus einer Vielzahl von zellulären und sekretorischen Bestandteilen. Die unterschiedlichen Wege der Abwehr werden, je nach Art der pathogenen Substanz, zur Bekämpfung eingesetzt. Sie können sich durch Summation ergänzen. Das Immunsystem lässt sich in zwei funktionelle Einheiten einteilen: Das angeborene, unspezifische Immunsystem und das adaptive, erworbene Immunsystem. 3.1.1 Das unspezifische/angeborene Immunsystem Das unspezifische Immunsystem bildet die erste Instanz der Immunabwehr des Körpers gegen eine pathogene Substanz. Zu den Abwehrmechanismen gehören u. a. physikalische Barrieren, Zellen und Zytokine. Physikalische Barrieren wie die Haut und Schleimhäute, die z.B. im Magen-Darm-Trakt, in den Atemwegen oder im Urogenitaltrakt vorkommen, schützen vor dem Eindringen des Erregers. Die Regulation des pH-Wertes oder die Fähigkeit, Schleim aus Zellen abzusondern, der die Erreger einschließt und über Flimmerhärchen aus dem Körper herausbefördert, spielt eine wichtige Rolle. Zellen des unspezifischen Immunsystems zirkulieren in der Blutbahn und sind im Gewebe anzutreffen. Makrophagen und neutrophile Granulozyten phagozytieren eingedrungende Erreger. Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) können virusinfizierte Zellen oder Tumorzellen lysieren und sind in der Lage, Makrophagen zu aktivieren. Sekretorische Proteine zirkulieren im Blut, wie z.B. Faktoren des alternativen Weges des Komplementsystems. Zytokine werden von aktivierten Zellen sezerniert und dienen der Signalvermittlung, im Sinne der Aktivierung und Rekrutierung von weiteren Immunzellen. Somit können drei wesentliche Mechanismen der unspezifischen Abwehr unterschieden werden: Sekretion, Endozytose und Signalvermittlung. 3. Einleitung 7 Das unspezifische Immunsystem ist mit seiner Spezifität bereits in der Keimbahn festgelegt und wird auf nachfolgende Generationen vererbt. Rezeptoren, wie z.B. „Toll like receptors“ (TLR), die pathogene Keime erkennen und eine Immunantwort auslösen, sind genetisch festgelegt, und ihre Anzahl ist aufgrund der begrenzten Menge von Genen limitiert (1) . Nicht jedes einzelne, mögliche Antigen soll erkannt werden, sondern vielmehr einige wenige, die jedoch von vielen Pathogenen gemeinsam exprimiert werden (60) . Hinzu kommt die wichtige Aufgabe, das erworbene Immunsystem zu aktivieren und die Zellen an den Ort der Entzündung zu locken, um eine additive Wirkung beider Systeme zu erzielen. 3.1.2 Das spezifische/erworbene Immunsystem Das spezifische Immunsystem reagiert zeitlich gesehen später als das Unspezifische. Mindestens drei bis fünf Tage werden benötigt, um eine Aktivität zu erreichen, die ausreicht, eine Infektion zu bekämpfen. Die Hauptkomponenten des erworbenen Immunsystems bestehen aus einer Population der Leukozyten, den Lymphozyten. In Form von T-Zellen und B-Zellen zirkulieren sie durch die Blutbahn und durch das lymphatische Gewebe. In den Lymphknoten und der Milz (sekundäre lymphatische Organe) treffen sie auf eine Vielzahl von Zellen, mit denen sie in engen Kontakt treten können. Mit Hilfe von Adhäsionsmolekülen und Rezeptoren sind sie in der Lage, an antigen-präsentierende Zellen (APC) zu binden. Treffen sie in den sekundären lymphatischen Organen auf das für sie spezifische Antigen kommt es zur Aktivierung. T- und B-Zell-Rezeptoren sind nicht wie beim unspezifischen Immunsystem durch die Keimbahn determiniert. Das menschliche Genom enthält ca. 75.000 bis 100.000 Gene. Die Anzahl an T- und B-Zell-Rezeptoren im Körper beträgt ungefähr 1014 bis 1015. Sie sind nicht genetisch festgelegt und können nicht an die nächste Generation vererbt werden. Im Laufe seines Lebens muss jedes Individuum den spezifischen immunologischen Schutz selbst ausbilden (60). T- und B-Zellen können durch verschiedene Oberflächenmoleküle und Effektormechanismen unterschieden werden. T-Zellen sind für die zellvermittelte Immunität zuständig, die über zellgebundene Peptide ausgelöst wird. Im Gegensatz dazu werden B-Zellen über lösliche Antigene aktiviert. Sie differenzieren z.T. zu Plasmazellen und sezernieren spezifische Antikörper gegen das Pathogen, bzw. seine Antigene. Dies wird als humorale Abwehr bezeichnet. Zur Aktivierung des spezifischen Immunsystems wird die Hilfe des unspezifischen Immunsystems benötigt. Interaktionen mit T- und B-Zellen über inflammatorische 3. Einleitung 8 Substanzen, wie den Zytokinen und damit die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren sind unabdingbar. Während einer Immunantwort im Körper differenzieren einige Lymphozyten zu sogenannten Gedächtniszellen. Bei erneuter Exposition mit dem gleichen Antigen verläuft ihre Immunantwort zeitlich gesehen schneller und effektiver als die Primärantwort. 3.2 Stimulation von T-Lymphozyten 3.2.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Die physiologische Funktion von MHC-Molekülen besteht in der Präsentation von Peptiden an T-Zellen. Sie sind feste Bestandteile, die für die T-Zell Aktivierung mitverantwortlich sind. Fremde Peptide werden von T-Zellen über ihren T-Zell-Rezeptor (TCR) nur dann erkannt, wenn sie von körpereigenen MHC-Molekülen präsentiert werden. Dieser Mechanismus wird als MHC-Restriktion bezeichnet (121). Bei MHC-Molekülen handelt es sich um membranständige Glykoproteine der Immunglobulinsuperfamilie, die beim Menschen im HLA-Genlocus und bei der Maus im H-2 Genlocus kodiert sind (52). Es gibt zwei verschiedene MHC Genprodukte, MHC-Klasse I- und MHC-Klasse II-Moleküle. MHC- Klasse I Moleküle kommen auf nahezu allen kernhaltigen Zellen des Organismus vor. MHC-Klasse II Moleküle werden nur auf Zellen des Immunsystems exprimiert, wie Dendritischen Zellen (DC), B-Zellen oder professionellen APCs. MHC-Klasse I Moleküle bestehen aus einer polymorphen α-Kette, die aus drei Anteilen (α1α3 Domänen) besteht und einer nichtpolymorphen β2-Mikroglobulinkette. Die α1- und α2Domäne dienen der Bindung von Peptiden aus dem Zytosol der Zelle (9) . Die α3-Domäne dient als Bindungsstelle für den CD8 Korezeptor von T-Zellen. Proteine werden im Zytosol durch das Proteasom in Peptide gespalten und mit einem „Transporter Associated with Antigen Processing“ (TAP) in das Endoplasmatische Retikulum (ER) befördert (105) . Die Bindung von Peptiden im MHC-Klasse I Molekül findet im ER der Zelle statt. Der Komplex aus Antigen und MHC-Klasse I Molekül wird nun über den Golgi-Apparat weitertransportiert und via Exozytose an die Zelloberfläche transportiert. Dort kann nun die Erkennung und Aktivierung von CD8+ T-Zellen stattfinden. Die MHC-Klasse II Moleküle bestehen aus einer polymorphen α-Kette (α1- und α2-Domäne) und einer polymorphen β-Kette (β1- und β2-Domäne). Die α1- und β1-Domäne bilden die Bindungsstelle von extrazellulären Peptiden, die mittels Endozytose in die Zelle 3. Einleitung 9 aufgenommen werden. Nach Abschnürung des MHC-Klasse II Moleküls aus dem ER in Autophagosomen kommt es zur Verschmelzung mit Endosomen, die fremde Peptide gespeichert haben (73) . Der MHC-Klasse II-Peptid-Komplex wird nun an die Oberfläche der Zelle transportiert und ist verantwortlich für die Aktivierung von CD4+ T-Zellen. Folglich präsentieren MHC-Klasse I- und MHC-Klasse II Moleküle zwei unterschiedliche Arten von Antigenen an T-Zellen. Der MHC-Klasse I-Peptid-Komplex prozessiert endogene Antigene. Sie kommen intrazellulär im Zytosol der Zelle vor, wie z.B. virale Antigene. Der MHC-Klasse II-Peptid-Komplex präsentiert exogene Antigene. Dies sind extrazelluläre Ag, welche durch Endozytose in die Zelle aufgenommen werden. Hierzu zählen z.B. bestimmte bakterielle Antigene. Die zwei MHC-Molekül-Ag-Komplexe werden von verschiedenen Subpopulationen der T-Zellen erkannt. Der MHC-Klasse I-Ag-Komplex wird von CD8+ TZellen erkannt, der MHC-Klasse II-Ag-Komplex von CD4+ T-Zellen. 3.2.2 Antigenerkennung und Aktivierung von T-Lymphozyten Die Antigenerkennung und Aktivierung der T-Lymphozyten findet in den sekundären lymphatischen Organen statt. Nach Aktivierung reifen sie zu Effektorzellen heran und wandern anschließend an den Ort der Infektion. T-Lymphozyten erkennen ihr spezifisches Antigen über den TCR, wenn es ihnen von einer aktivierten APC im MHC-Komplex präsentiert wird. Der TCR besteht bei über 95% der TZellen aus zwei gebundenen, transmembranären Polypeptidketten, einer α-Kette und einer βKette (αβ T-Zellen). Sie sind durch Disulfidbrücken kovalent miteinander verbunden und ähneln dem Antikörper bindenden Fragment (Fab) von Immunglobulinen. 65% der αβ TZellen im Blut sind CD4+ und 35% der Zellen CD8+. Bei ca. 5% der T-Zellen bestehen statt einer α- und β-Kette eine γ- und eine δ-Kette (γδ T-Zellen). Sie befinden sich überwiegend in der Mukosa und anderen Epithelien und werden deshalb als intraepitheliale Lymphozyten bezeichnet. Sie spielen u.a. eine Rolle bei der Immunantwort auf einige Tumoren (30). Der TCR liegt nicht wie bei Antikörpern in löslicher Form vor, sondern ist membranständig. Bei der Aktivierung müssen sowohl eine stabile Adhäsion zwischen der T-Zelle und der APC, als auch die Transduktion von Aktivierungssignalen gewährleistet sein. Diese Schritte werden durch verschiedene Moleküle auf der T-Zelle vermittelt: Durch die Bindung von L-Selektin (CD62L) an CD34 und GlyCAM-1 auf den Venulen mit hohem Endothel haften die T-Zellen im Lymphknoten. Wenn ein spezifisches Antigen durch eine APC im MHC Molekül präsentiert wird, dienen die Korezeptoren CD4 und CD8 der Erkennung der MHC-Klasse I/II Moleküle. Durch die Bindung von TCR und CD4 oder CD8 3. Einleitung 10 an den MHC-Peptid-Komplex der APC, wird ein erstes Signal über den Molekülkomplex CD3 vermittelt. Er ist für die biochemische Signaltransduktion in der T-Zelle mitverantwortlich, die zur Aktivierung führt. Akzessorische Moleküle auf der T-Zelle, wie CD2 und verschiedene Integrine (z.B. LFA-1 oder VLA-4) ermöglichen eine stabile Adhäsion zwischen den Zellen. Sie binden an Liganden auf der APC, z.B. LFA-3 (bindet an CD2) und ICAM-1,-2 und –3 welche an LFA-1 binden. Ohne ein zweites kostimulatorisches Signal zwischen der T-Zelle und einer APC kommt es, auch bei erkanntem spezifischen Antigen, nicht zur Aktivierung der T-Zelle, sondern zur Induktion von Anergie des T-Zell Klones (89) . Als kostimulatorische Moleküle auf T-Zellen kommen vor allem CD28 und CTLA-4 vor. Sie besitzen Strukturhomologie, wirken jedoch antagonistisch. Als Liganden dienen die beiden Moleküle B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86), die überwiegend auf aktivierten APCs exprimiert werden. Erkennt eine T-Zelle ihr spezifisches Antigen über den TCR und seinen Korezeptor CD8, wird durch die zusätzliche Bindung von B7 mit CD28 das Signal zur Proliferation gegeben. Ebenso wird die Synthese von Interleukin-2 (IL-2) und die Expression von antiapoptotischen Proteinen erhöht. Bei Bindung von CTLA-4 an B7 Moleküle kommt es zur Terminierung der T-Zell Antwort (15) . Die Aktivierung der T-Zelle führt zur verstärkten Synthese und Sezernierung von IL-2 und der vermehrten Expression des IL-2 Rezeptors (IL2R). Er wird in drei Ketten unterteilt, IL-2Rα (CD25), IL-2Rβ (CD122) und IL-2Rγ (CD132). IL-2 wirkt autokrin und stimuliert die Proliferation und Expansion des Antigen-spezifischen T-Zell-Klons (klonale Expansion). Ergebnis der Aktivierung ist die Differenzierung der naiven T-Zellen in Effektor- und Gedächtniszellen. CD8+ T-Zellen differenzieren zu zytotoxischen T-Zellen (CTL), CD4+ T-Zellen differenzieren in zwei Subtypen von THelferzellen (TH). Die Differenzierung ist abhängig vom Einfluß sezernierter Zytokine. Welche kostimulatorischen Zytokine ausgeschüttet werden, ist abhängig von der Art des infektiösen Agens und dem Mechanismus der Infektion. TH1-Zellen bilden sich unter Einfluß von IL-12 aus, das von aktivierten Makrophagen oder NK-Zellen bei einer Infektion mit intrazellulären Erregern sezerniert wird. TH2-Zellen entstehen unter Einfluß von IL-4, das bei extrazellulären Infektionen mit Parasiten oder Allergenen freigesetzt wird. Unterschieden werden beide TH-Zelltypen durch die Sekretion von Zytokinen im Verlaufe einer Immunantwort. TH1-Zellen sezernieren überwiegend IFN-γ, IL-2 und TNF-α. und TH2-Zellen sezernieren überwiegend IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13. Nach ihrer Differenzierung wandern die Effektorzellen an den Ort der Infektion. Adhäsionsmoleküle dienen zur Anheftung und Migration der Effektorzellen in das Gewebe, bzw. zur Stabilisierung der Bindung von APC. Zu ihnen gehören Integrine, wie das VLA-4, 3. Einleitung 11 das über Fibronektine wie VCAM-1 an Endothelien oder an APC bindet. Auch hier spielt das LFA-1 eine bedeutende Rolle. Das Selektin CD 62L wird herabreguliert, es kommt zur vermehrten Expression von CD 62E und –P. CD44, ein membranständiges Glykoprotein, wird auf kürzlich aktivierten- und Gedächtnis T-Zellen verstärkt exprimiert und ist verantwortlich für das Verbleiben der Effektorzellen am Ort von extravasalen Infektionen. 3.3 Effektormechanismen von T-Lymphozyten Aktivierte T-Lymphozyten wandern über das Blut an den Ort der Infektion. Die Migration in das Gewebe wird nicht durch das präsentierende Antigen bestimmt, sondern vielmehr durch die vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen am Ort der Infektion. Treffen aktivierte T-Lymphozyten erneut auf ihr spezifisches Antigen, welches ihnen via aktivierten APC präsentiert wird, kommt es zum Auslösen der Effektormechanismen. CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen besitzen unterschiedliche Effektormechanismen und Funktionen. Wichtig ist, dass eine antagonistische Komponente zwischen den beiden TH-Zellpopulationen, zu tragen kommt. IFN-γ und IL-4 bzw. IL-10 hemmen sich in ihrer Wirkung, so dass die Effektorfunktionen von TH1- und TH2-Zellen antagonisiert werden (71) . Zusätzlich dienen unspezifische Effektorzellen, wie Makrophagen, Granulozyten und NK-Zellen des Immunsystems zur Vervollständigung der Immunantwort, denen z.B. bei der Tumorimmunologie eine große Bedeutung zukommt. CD4+ TH1-Zellen sezernierten IL-2 und IFN-γ. Dadurch stimulieren sie direkt CD8+ T-Zellen. IFN-γ besitzt des weiteren die Funktion, Makrophagen zu aktivieren. Ein Rezeptorkomplex CD40L auf der TH-Zelle agiert mit CD40 auf APC und B-Lymphozyten und kann diese aktivieren. Sekretion von TNF-α kann unter anderem neutrophile Granulozyten aktivieren. CD4+ TH2-Zellen erzielen über ihre Zytokinsekretion hauptsächlich eine IgE bzw. eine eosinophil- und mastzellvermittelte Immunantwort. Zytotoxische T-Lymphozyten benutzen überwiegend drei Effektormechanismen, um Zielzellen zu zerstören. Hierzu zählen die Sekretion von zytotoxischen Molekülen (Zytokine), die Calcium abhängige- und die Calcium unabhängige kontakt-vermittelte Zytotoxizität. Zu den Zytokinen, die Toxizität vermitteln, zählen TNF-α und IFN-γ. Sie werden in unmittelbarer Nähe zu den Zielzellen sezerniert. Beim Calcium abhängigen Weg werden bei Effektorzell-Zielzell-Kontakt zytotoxische Granula sezerniert, die vor allem Perforin und Granzyme enthalten. Perforin ist ein Protein, welches in der Lage ist kleine Poren/Kanäle in der Zielzelle zu formen, was zur Lyse der 3. Einleitung 12 Zielzelle führt. Unter Granzymen versteht man neutrale Serin Proteasen, die Apoptose in der Zielzelle induzieren. Der Calcium unabhängige Mechanismus verläuft über die Ligaton von Fas/FasL (CD95/CD95L). Fas ist ein Mitglied der TNF-Rezeptor Familie. FasL wird auf der Oberfläche der Effektorzelle exprimiert und es kommt bei Kontakt mit dem Fas Rezeptor der Zielzelle zur Induktion von Apoptose (92). Nekrotische Zellbestandteile oder apoptotische Zellen sind normalerweise nicht in der Lage, eine APC in den vollständig aktivierten Zustand zu bringen. Um eine CD8+ T-Zellantwort zu induzieren, kann eine APC über die Ligation von CD40L/CD40 mit einer TH1-Zelle aktiviert werden. Sie kann nun exogen aufgenommenes Ag über MHC-Moleküle präsentieren und CD8+ T-Zellen aktivieren. Diesen Mechanismus bezeichnet man auch als Cross-Präsentation, die Aktivierung der CD8+ T-Zelle als Cross-Priming (3, 7, 8, 43, 45, 86, 111). 3.4 Autoimmunität und Toleranz von T-Lymphozyten Theoretisch können durch das Rearrangement der Gene 109 verschiedene antigenspezifische T-Zell-Rezeptoren ausgebildet werden. Hierunter fallen auch einige, die auf körpereigene Antigene, sogenannte Autoantigene, reagieren. Sie werden normalerweise in der Entwicklung der T-Zellen deletiert oder neutralisiert. Dieser Vorgang wird als Toleranz bezeichnet. Kommt es jedoch nicht zu einer Ausschaltung dieser Zellen, kann es zu Autoimmuneffekten kommen. Hauptmechanismus der T-Zell Toleranz ist die Depletion von selbstreaktiven T-Zellen im Thymus. Heranreifende T-Zellen wandern vom Knochenmark in den Thymus um dort auszureifen. Im Thymus werden ihnen eine Vielzahl von endogenen Antigenen mittels MHCMolekülen präsentiert. Besitzen diese Zellen eine starke Affinität zu den MHC-AgKomplexen und erkennen sie körpereigene Antigene, kommt es zur Vermittlung von apoptotischen Signalen. Somit sterben die autoreaktiven T-Zellen im Thymus ab. Dieser Mechanismus wird als zentrale Toleranz bezeichnet (50) . Zellen, die eine schwache Affinität zu den MHC-Ag-Komplexen aufweisen werden positiv selektioniert und gehen ebenfalls in Apoptose. Es werden nicht alle körpereigenen Proteine im Thymus präsentiert. Viele Selbst-Antigene verbleiben in der Peripherie und führen nicht zur Deletion von spezifischen T-Zellen im Thymus. Folglich muss es einen zweiten Mechanismus geben, der die Aktivierung von selbstreaktiven T-Zellen verhindert. Hierzu dient die Ausbildung der peripheren Toleranz. Zu den Mechanismen der peripheren Toleranz gehören die Ignoranz oder Deletion von T-Zellen, 3. Einleitung 13 Regulation der T-Zell Antwort im Sinne von Anergie und Inhibition, und die Supression und Deviation der T-Zell Antwort (99). Die einfachste Möglichkeit der Peripheren Toleranz ist die Vermeidung von Kontakt zwischen dem Antigen und der T-Zelle. Dies kommt in immunpriviligierten Geweben wie Auge und Testes vor. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass die T-Zelle nicht aktiviert werden kann. Die Expression von Antigenen ist nicht stark genug oder es fehlen kostimulatorische Signale. Nur im aktivierten Zustand sind die T-Lymphozyten in der Lage, in das Gewebe einzuwandern und damit auf ihr spezifisches Antigen zu treffen. Dies versteht man unter dem Begriff der peripheren Ignoranz (67, 69). Ein weiterer Mechanismus der peripheren Toleranz ist die Deletion der T-Zellen außerhalb des Thymus. Bei Stimulation mit einer sehr hohen Dosis an Antigen kommt es zur Deletion von T-Zellen (26) . Das Fehlen von Kostimulatoren oder Wachstumsfaktoren bei der T- Zellaktivierung führt zum Absterben der Zelle (2) . Die Eigenschaft von T-Zellen nach Antreffen ihres spezifischen Antigens IL-2 zu produzieren, kann fehlen. In diesem Falle gelten sie als nicht aktiviert. Dieser Zustand wird als Anergie bezeichnet (49). Mechanismen der zentralen- und peripheren Toleranz können auf unterschiedliche Art und Weise gebrochen werden. Hierbei entsteht das Phänomen der Autoimmunerkrankungen. Eine Möglichkeit ist die Aktivierung von selbstreaktiven T-Zellen die im Rahmen einer Infektion auftreten können. Durch strukturelle Ähnlichkeiten zwischen dem fremden Ag und körpereigenen Peptiden kann es zum Auftreten autoimmunologischer Phänomene kommen. Dies wird diskutiert für Krebserkrankungen Erkrankungen wie Diabetes Mellitus Typ I, Arthritis oder (117) . Auch für Multiple Sklerose wird diese Hypothese diskutiert (48) . Gewebezerstörung und die damit verbundene Freisetzung von Autoantigenen kann zur Aktivierung von selbstreaktiven T-Zellen führen (62). 3.5 Tumorimmunologie Krebs ist heute eine der häufigsten Todesursachen in unserer Gesellschaft. Die Entartung einer köpereigenen Zelle zu einer malignen/transformierten Zelle bildet die Grundlage für das Entstehen eines soliden Tumors. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die zur Transformation einer Zelle führen können. Spontane Entartung, Transformation durch virale und bakterielle Einflüsse, chemikalische Noxen oder genetische Disposition sind nur einige Beispiele. Dem Immunsystem kommt eine entscheidende Bedeutung in der Abwehr von Krebszellen zu. In jedem Organismus entstehen permanent entartete Zellen, die jedoch durch das Immunsystem kontrolliert und eliminiert werden. Diese umstrittene Hypothese bezeichnet man als Konzept 3. Einleitung der Immunsurveillance von Tumoren steht 14 (14) , die jedoch neuerdings wieder in der Diskussion (41, 96) . Die Rolle des Immunsystems bei der Anti-Tumorantwort konnte erstmals eindeutig in Versuchen gezeigt werden, die mit Inzucht-Mäusen durchgeführt wurden. Durch dermale Applikation der Chemikalie Methylcholantren (MCA) wurde ein Tumor induziert. Der entstandene Tumor wurde den Tieren entfernt und entweder in eine tumorfreie, syngene Maus oder zurück in die zuvor tumortragende Maus transplantiert. Hierbei zeigte sich, dass der Tumor in den zuvor tumorfreien Tieren wuchs, während er in den zuvor tumortragenden Mäusen abgestoßen wurde. Hinzu kam die Beobachtung, dass durch adoptiven Transfer von CD8+ T-Zellen der tumortragenden Tiere in syngene Mäuse ein Schutz gegenüber dem Auswachsen des Tumors bestand und es ebenfalls zur Abstoßung des transplantierten Tumors kam (32, 44) . Neben CD8+ T-Zellen für die Tumorabwehr besitzten auch andere Immunzellen, wie CD4+ T-Zellen, NK-Zellen und Dendritische Zellen eine entscheidende Bedeutung. Für B-Zellen und Makrophagen wird dies weiterhin diskutiert. 3.5.1 Tumorantigene Damit entartete Zellen eine effektive CD8+ T-Zell vermittelte Immunantwort des Organismus auslösen, müssen sie spezifische Tumorantigene exprimieren. Dies konnte aus den oben genannten Versuchen geschlossen werden. Eine Vielzahl von verschiedenen Tumorantigenen sind bis heute isoliert worden. Meistens sind es Ag, die ebenfalls auf nicht entarteten Zellen exprimiert werden, jedoch bei Entartung einem veränderten Expressionsmuster auf der Zelle unterliegen. Des weiteren besteht die Möglichkeit alle, in einem Tumor transkribierten Gene, zu detektieren und eine cDNA-Sammlung zu erstellen. Nach Transfektion in MHC-Klasse I Molekül+ Zellen können deren Ag-spezifische T-Zell-Klone ausfindig gemacht werden (22) . Diese antigen wirkenden Peptide werden als Tumorassoziierte Antigene (TAA) bezeichnet (110) . Die Antigene können in Gruppen eingeteilt werden, durch ihre immunogene Eigenschaft und das Potential eine Tumorabstoßung zu vermitteln, unterschieden werden (39): - Gruppe 1 Antigene: Sie sind das Resultat einer somatischen Mutation der Zelle mit unveränderten Genprodukten. Die Mutation ist zufällig und spontan. Ihre Antigene sind spezifisch für ein Individuum und wiederholen sich nicht. Sie besitzen starke immunogene Eigenschaften mit hoher T-Zell Affinität und keiner Toleranzinduktion. Hierzu zählt MUT-1, ein TAA, eines in der Maus wachsenden Lungenkarzinoms (Lewis Lung Carcinoma). Es ist aus einer Punktmutation des Connexin 37 Proteins entstanden (56). 3. Einleitung 15 - Gruppe 2 Antigene: Dies sind TAA, die von Tumorzellen exprimiert werden, aber nicht in den normalen Zellen vorkommen. Sie können in zwei Subgruppen untereilt werden. Die erste Gruppe unterliegt Veränderungen, die aus mutierten oder translozierten Onkogenen entstehen. Sie sind nicht auf ein Individuum begrenzt, stark immunogen und besitzen eine hohe T-ZellAffinität. Dazu gehören Mutationen des Tumorsuppressorgens p53 oder des Onkogens Ras. Die zweite Gruppe besteht aus Mutationen, die mit viralen Antigenen assoziiert sind. Hierbei exprimiert der Tumor virale Antigene, z.B. bei Epstein Bar Virus assoziierten Lymphomen oder bei Humanem Papilloma Virus assoziierten Zervix-Karzinom, die beim Menschen vorkommen können. - Gruppe 3 Antigene: Die TAA gehören, wie die Gruppe 2 zu den Antigenen, die nicht auf ein Individuum begrenzt sind. Sie kommen nicht in allen Geweben vor, sondern sind auf einen bestimmten Gewebetyp begrenzt. Sie werden auch als „Stille Gene“ bezeichnet, die nur in immunpriviligierten Regionen, wie Testes, Plazenta und Retina translatiert werden (37, 94, 103) . Hierzu zählen die Ag der MAGE, GAGE und BAGE Familie, die beim Menschen auf einigen Melanomen und Karzinomen exprimiert werden (13) . Dazu zählen auch onkofetale Antigene, wie z.B. das α-Fetoprotein oder das Karzinoembryonale Ag (CEA), die nicht im adulten Organismus synthetisiert werden. Bei der Maus gehört P1A in diese Gruppe (108). - Gruppe 4 Antigene: Sie werden als Differenzierungs-Antigene bezeichnet und sind, wie die Gruppe 3, auf nur einen bestimmten Gewebetyp begrenzt. Sie sind schwach immunogen und weisen eine partielle Toleranz auf. Ihre T-Zell-Affinität ist nur sehr gering ausgeprägt. Zu ihnen gehören z.B. die TAA MART-1, Melan A, GP100 oder Thyrosinase, die von Melanozyten der Haut und von Melanomen exprimiert werden. 3.5.2 Immunantwort auf Tumoren Auch bei der Immunabwehr von transformierten Zellen spielen das Angeborene und Erworbene Immunsystem eine bedeutende Rolle. Nach den ersten Versuchen mit transplantierten MCA induzierten Tumoren ging man davon aus, das T-Zellen die Abwehr vermitteln (32) . Doch auch unspezifische Abwehrmechanismen besitzen eine tragende Rolle. Hierzu zählen unter anderem NK-Zellen, die in der Lage sind, MHC-Klasse I Molekül defiziente Tumorzellen und Metastasen abzutöten (114) . Sie wirken über die Sekretion von Perforin und Zytokinen wie IFN-γ zytotoxisch auf die Tumorzelle. Makrophagen setzen nach Aktivierung TNF-α oder NO frei und können auf diese Weise Apoptose in transformierten 3. Einleitung 16 Zellen induzieren. Auch γδ-T-Zellen konnten als Effektorzellen bei der Tumorabwehr nachgewiesen werden (88) . Zu den Zellen des erworbenen Immunsystems gehören B-Zellen, die Antikörper gegen Epitope auf den transformierten Zellen bilden können. Dies konnte z.B. für EBV assoziierte Lymphome nachgewiesen werden. Ak binden an die Lymphomzelle und vermitteln deren Apoptose (79). Dendritische Zellen können über MHC-Klasse I und II Moleküle Ag präsentieren, die CD8+ T-Zellen oder CD4+ T-Zellen über die Ligation von CD40/CD40L aktivieren können (96). Eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von T-Zellen spielt die Anzahl von tumorspezifischen T-Lymphozyten im T-Zellrepertoire (10). 3.5.2.1 T-Zell vermittelte Tumorabwehr Die T-Zell vermittelte Tumorabwehr erfolgt durch Aktivierung der antigenspezifischen TZelle, wozu die beiden kostimulatorischen Signale von der aktivierten APC vermittelt werden müssen. Nach der Differenzierung der T-Zelle zur CTL und Erkennung von TAA auf einer transformierten Zelle, benötigt sie keine weiteren kostimulatorischen Signale, um ihre Effektorfunktionen auszuüben. Die CD8+ T-Zell vermitteltete Tumorabwehr basiert im wesentlichen auf den Mechanismen, die auch bei der Abwehr von Infektionen eingesetzt werden. Lyse der Tumorzellen und die Sekretion von inflammatorischen Zytokinen gehören zu den Hauptmechanismen. Hierunter fällt die Ca2+-abhängige Freisetzung von Granuolen, die Perforin und Granzyme enthalten, und die Auslösung des programmierten Zelltodes über die Interaktion von CD95/CD95L oder die Ausschüttung des regulatorischen Zytokines IFNγ. Im Falle von IFN-γ wird eine direkte antitumoröse Wirkung, durch Hemmung des Tumorwachstums, Angiostase oder Zerstörung der Tumorzelle diskutiert. Zusätzlich vermittelt IFN-γ eine stimulatorische Wirkung auf weitere Zellen des angeborenen und erworbenen Immunsystems, wie NK-Zellen oder Makrophagen (77). Die Sekretion des Zytokines TNF-α durch CD8+ T-Zellen, scheint einen antitumorösen Effekt zu besitzen (81). 3.5.3 Möglichkeiten von Tumoren die Immunabwehr zu umgehen Wie oben bereits beschrieben, gibt es eine Vielzahl von TAA, die von Tumorzellen exprimiert werden. Dennoch sind T-Zell-Antworten häufig ineffektiv und führen nicht zur Abstoßung eines bestehenden Tumors. Es gibt mehrere Gründe, die für diese Ursache verantwortlich sein könnten. Die meisten Tumore sind schwach immunogen. Ihnen fehlen starke TAA und sie werden in vielen Geweben des Körpers exprimiert. Gegenüber ihnen besteht eine Toleranz. 3. Einleitung 17 Häufig werden keine kostimulatorischen Moleküle von der Tumorzelle exprimiert, die zur Aktivierung von z.B. T-Zellen führen. Folglich werden sie vom Immunsystem ignoriert, weil sie nicht die Eigenschaften einer professionellen APC besitzen (120) oder es kommt zur Induktion von Anergie (98, 106). Eine von Poly Matzinger aufgestellte Theorie (Danger Theorie) besagt, dass viele Tumorzellen nicht als gefährlich für das Immunsystem erscheinen, da sie initial als gesunde Zellen heranwachsen und keine Stress-Signale aussenden, die APCs aktivieren (34) . Nichtstimulierte APC präsentieren Ag von lebenden Zellen ohne Kostimulation, welche zur Induktion von Toleranz führen (53) . Wenn T-Zellen auf TAA ohne Anwesenheit von aktivierten APC treffen, kommt es zur Inaktivierung oder Apoptose der TZelle, und das Immunsystem verliert die Möglichkeit zur effektiven Immunantwort gegen den Tumor (36, 83) . Dieser mögliche Mechanismus ist nicht für alle Tumoren zutreffend, auch das Gegenteil konnte bewiesen werden (66) . Zusätzlich gibt es Unterschiede in der Wachstumskinetik von Tumorzellen und der klonalen Expansion von tumorspezifischen TZellen. Somit kann sich ein Vorteil für die Progression des Tumorwachstums ergeben (19, 47) . Verschiedene Tumorzelllinien sind in der Lage ihre immunogenen Eigenschaften zu verändern oder herabzusetzen. Diese Varianten bilden sich aufgrund genetischer Instabilität häufig unter medikamentöser Therapie aus. Dazu zählt die Herabregulation von TAA, von CD95 (84) oder eine verminderte Expression von MHC-Klasse I Molekülen (11) . Hierdurch werden resistente Zellklone selektiert, die von tumorspezifischen T-Zellen nicht mehr erkannt werden. Ein weiterer Mechanismus dem Immunsystem zu entgehen, besteht in der Sekretion von suppressiven Faktoren wie TGF-β, IL-10 oder in der Expression von FasL (CD95L), durch die Tumorzelle. TGF-β hemmt die T-Zell Proliferation und die Differenzierung in CTL oder TH-Zellen. Zusätzlich werden T-Zell stimulatorische Funktionen von APC gehemmt (38, 42, 100) . 3.5.4 Immuntherapie von Tumoren Heutige Möglichkeiten in der Therapie von Karzinomen bestehen überwiegend in der operativen, strahlentherapeutischen und pharmakologischen Bekämpfung der Krebszellen. Mittels Chemotherapeutika sollen sowohl die Proliferation, als auch die Syntheseleistung der Krebszellen gehemmt werden. Sie greifen in den Zellzyklus ein. Da sie auch auf gesunde Zellen des Körpers wirken, wird ihr Einsatz durch das Auftreten von Nebenwirkungen limitiert. Das Gebiet der Immuntherapie gewinnt zunehmend an Bedeutung. Viele Immunantworten des Körpers auf Tumore verlaufen häufig ineffektiv und führen nicht zur Elimination eines Tumors und seiner Metastasen. Deshalb besteht ein besonderes Interesse an 3. Einleitung 18 der Entwicklung einer effektiven Immuntherapie gegen Krebszellen. Häufig führen Immuntherapien, wie andere Krebstherapien, nur zu einer teilweisen oder zeitlich begrenzten Regression von Tumoren. Zudem können erhebliche Nebenwirkungen bei der Therapie entstehen. Fieber, Magen-Darm-Störungen oder Autoimmunerscheinungen wie z.B. Vitiligo, Prostatitis, Diabetes oder Kardiomyopathie wurden beobachtet (40) . Bei der Immuntherapie versucht man sowohl über Stimulation des unspezifischen Immunsystems, als auch des spezifischen Immunsystems, Therapiemöglichkeiten zu entwickeln. Erfolgreiche Versuche machte man mit der Injektion von inflammatorischen Substanzen wie Endotoxinen, TNF-α und Interferonen in tumortragende Mäuse (16). Sie stimulieren unspezifisch das Immunsystem und dienen als polyklonale Aktivatoren von Lymphozyten. Die Verabreichung von anti-CD3Antikörpern in Versuchstiere konnte zeigen, dass diese eine unspezifische polyklonale Aktivierung von T-Lymphozyten erzielen. Die lokale Applikation von BCG (Bacillus Calmette-Guérin) an der Stelle des Tumorwachstums und dadurch vermittelte Regression des Tumors wurde lange Zeit erforscht (23). Die Stimulation des spezifischen Immunsystems kann über aktive und passive Immunsisierung erfolgen. Durch Verabreichung von apoptotischen Tumorzellen oder TAA in Adjuvantien kann es durch die Aktivierung von tumorspezifischen T-Zellen zu einer Regression des Tumors kommen. Apoptotische Tumorzellen setzen intrazelluläre Substanzen frei, wie z.B. Doppelstrang DNA oder Hitzeschockproteine (HSP), die eine durch „Cross-Presentation“ von Dendritischen Zellen vermittelte Aktivierung von TLymphozyten auslösen können (17, 104) . Durch adoptiven Transfer von tumorspezifischen T- Lymphozyten gelingt es, experimentell gewachsene Tumoren zu eliminieren (19, 47). Zusätzlich besteht die Möglichkeit Vorläuferzellen von DC zu isolieren, in vitro anzuzüchten, mit TAA zu beladen oder mit cDNA zu transfizieren und zu reinjizieren (54, 72). Genetische Transfektion oder Modifikation von Turmorzellen stellt eine weitere Möglichkeit dar. Es ist möglich eine Vakzinierung mit genetisch veränderten Zellen vorzunehmen, die eine vermehrte Expression von MHC- oder kostimulatorischen Molekülen wie CD80, CD86 und CTLA-4 aufweisen. Veränderungen im Sezernierungsmuster von Zytokinen wie IL-2, IFN-γ oder GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen Kolonie stimulierender Faktor), führen zu einer Stimulation des Spezifischen Immunsystems (96). Tumorspezifische monoklonale Ak werden bei dem Versuch der passiven Immunisierung gegen Krebszellen eingesetzt. 3.6 Fragestellung Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass das murine Lungenkarzinom 3LLA9GP33 bei s.c. Injektion in B6 Mäusen vollständig abgestoßen wird (78) . ALB1-tg Mäuse 3. Einleitung 19 besitzen eine besondere Eigenschaft, da sie eine partielle Toleranz gegenüber dem GP33Antigen aufweisen (112) . Das GP33-Antigen dient in unserem Tumormodell als TAA. Diese Voraussetzungen liefern Untersuchungsbedingungen, wie sie häufig bei der Tumorgenese vorliegen und dadurch die effektive Tumoreradikation verhindern. Es sollte untersucht werden, wie sich das Wachstum von 3LL-A9GP33 Tumorzellen in den ALB1-tg Mäusen verhält. Des Weiteren sollte herausgefunden werden, wie sich die endogenen GP33spezifischen T-Zellen bei Stimulation durch das GP33-Antigen verhalten. Untersuchungen von Blattmann et al. bestimmten die Frequenz von GP33-spezifischen T-Zellen in nicht immunisierten C57BL/6 Mäusen (10) . Welche Rolle die Vorläuferfrequenz induzierbarer tumorspezifischer CTL zur Abstoßung des etablierten 3LL-A9GP33 spielt, sollte in den ALB1tg Mäusen getestet werden. Durch adoptive Transferexperimente mit TCR-tg Zellen sollten die T-Zell vermittelten Mechanismen der Tumorabwehr, wie z.B. die GP33-spezifische Infiltration des Tumorgewebes und die dadurch vermittelbare Abstoßungsreaktion u.a. immunhistochemisch untersucht werden. Qin et al. konnten einen Einfluß von T-Zellen auf die Tumorangiogenese zeigen (80) . So sollten auch in diesem Modell mögliche T-Zell vermittelte Einflüsse auf die Tumorangiogenese untersucht werden. Da TNF und IFN-γ eine Rolle bei der Tumorabwehr in B6 Mäusen zukommt Transferexperimente mit TNF-defizienten und (78) , sollte durch adoptive IFN-γ-defizienten TCR-tg Zellen herausgefunden werden, ob hierdurch Einflüsse auf die Tumoreradikation bestehen. 3.7 Das 3LL-A9GP33 Tumormodell Der 3LL (Lewis Lung) ist ein murines Lungenkarzinom, das erstmals 1951 beschrieben wurde und sich spontan in C57BL/6 Mäusen entwickelt hat (101). Als Tumorzellantigen dienen die H-2Kb Bindungspeptide MUT1 und MUT2, welche aus einem mutierten Gap-Junction Protein , dem Connexin 37, entstanden sind (56). Mäusen können mit synthetischen Peptiden MUT1 und MUT2 geimpft werden und somit vor Metastasen geschützt werden (57) . Es werden verschiedene Subklone der 3LL-Tumorzelle beschrieben, die sich in ihrer Wachstumskinetik hinsichtlich der Metastasenbildung unterscheiden. Hierzu zählt D122, ein stark metastasierender Klon, der eine geringe KbExpression aufweist (76) . Untersuchungen der MHC Expression ergaben ein unterschiedliches Muster der Expression von Kb und Db, welche mit der metastasierenden Eigenschaft der Tumorzelle korrelieren. Parentale 3LL-Zellen und der Klon D122 weisen ein H-2Db Expressionsmuster auf. Sie besitzen eine sehr geringe Expression von H-2Kb. Im Vergleich dazu exprimiert die Zellinie A9 sowohl Kb als auch Db (28). Der 3LL-A9 ist ein immunogener, 3. Einleitung 20 schwach metastasierender Lungentumor. Ein low Kb/ low Db –Phänotyp ist, wie auch ein high Kb/high Db-Phänoptyp nicht metastasierend. Im Gegensatz dazu weist eine low Kb/high Db Expression eine hohes Metastasierungspotential auf und eine medium Kb/high Db Expression ein mittleres Metastasierungspotential. Schwach metastasierende A9 Zellen wachsen in syngenen Mäusen, werden jedoch in allogenen Rezipienten abgestoßen (27) . Der stark metastasierende Klon D122 zeigte in syngenen und allogenen Mäusen ein fortschreitendes Wachstum. Es kommt jedoch nur in syngenen Rezipienten zu Metastasenbildung. Um die T-Zellvermittelte Tumorantwort besser erfassen zu können, wurde der 3LL-A9 mit einem Minigen transfiziert, das für das immundominante GP33-Epitop des Virus der lymphozytären Choriomeningitis (LCMV) kodiert. Bei s.c. Injektion der transfizierten Zelllinie in C57BL/6 Mäuse werden die Tumorzellen vollständig abgestoßen. Des Weiteren viel auf, das die Abstoßung in TNF-/- C57BL/6 Mäusen ausblieb und ein progressives Tumorzellwachstum an der Injektionsstelle statt fand (78). 3.8 ALB1-tg Mäuse ALB1 tg Mäuse exprimieren das CTL Epitop GP33 des LCM-Virus unter Kontrolle des Maus Albumin-Promoters in der Leber und zu einem 100- bis 1000-fach geringerem Anteil im Thymus der Mäuse. Die Expression von GP33 im Thymus von ALB1-tg Mäusen führt zu einer inkompletten zentralen Deletion GP33-spezifischer TCR-tg Zellen im Thymus. Des Weiteren ignorieren periphere GP33-spezifische T-Zellen das GP33 Transgen, welches auf den Leberzellen exprimiert wird. Diese periphere Ignoranz kann in den ALB1-tg Mäusen durch eine Infektion mit LCMV gebrochen werden. Bei adoptivem Transfer von naiven TCR-tg Zellen in ALB1-tg Mäuse findet keine Aktivierung der transferierten Zellen statt. Hingegen infiltrierten in vivo aktivierte, adoptiv transferierte TCR-tg Zellen das Leberparenchym der ALB1-tg Mäuse und induzieren eine akute Hepatitis. Um zu testen, ob transferierte TCR-tg Zellen in vivo mittels einer LCMV-Infektion aktiviert werden und das GP33 Antigen auf den Hepatozyten in der Leber erkennen können, wurde folgendes Experiment durchgeführt: Es wurden naive TCR-tg Zellen in ALB1-tg Mäuse transferiert. Anschließend wurden die Mäuse mit LCMV infiziert. Im Verlaufe der Infektion stiegen die Werte für die Serumtransaminase (sALT) an, die als Indikator für eine Leberzellschädigung dienten. In nicht infizierten transferierten oder nur transferierten und nicht infizierten ALB1-tg Mäusen kam es zu keinem Anstieg der sALTWerte. Hieraus ergab sich, dass naive in vivo aktivierte TCR-tg Zellen in der Lage sind, das exprimierte GP33 Antigen auf den Hepatozyten der Leber zu erkennen (112). 4. Material und Methoden 21 4. Material und Methoden 4.1 Mäuse C57BL/6 (Haplotyp H-2b) wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) oder Harlan Winkelmann (Borchen, Deutschland) bezogen. Verwendete H8-tg Mäuse (Offizielle Nomenklatur: TgN (LCMVGP33)224 Zbz) stammen aus eigener Zucht und exprimieren das immundominante CD8 T-Zellepitop GP33 des lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) unter Kontrolle des H-2Kb Promoters (26) . ALB1-tg Mäuse ebenfalls aus eigener Zucht exprimieren das GP33 des LCMV unter Kontrolle des Albuminpromotors (112) . P14 TCR transgene (TCR-tg) Mäuse der Linie 318 und Linie 327 stammen ebenfalls aus eigener Zucht. Die CD8 T-Zellen der Linie 318 exprimieren zu 40-50%, die der Linie 327 zu 80-90% den TCR des Klones P14, der spezifisch für das GP33/H-2Db ist (74) . TCR-tg TNF-/- Mäuse, aus eigener Zucht, wurden aus der Rückkreuzung zwischen P14 TCRtg 318 x C57BL/6 TNF-/TCR-tg Mäusen generiert (82) . Auch die IFN-γ-/- Mäuse wurden in eigener Zucht aus der Rückkreuzung zwischen P14 TCR-tg 318 x C57BL/6 IFN-γ-/- Mäusen generiert (77). Alle Mäuse wurden in den Tierställen des Instituts für Mikrobiologie und Hygiene und im Neurozentrum des Universitätsklinikums Freiburg gehalten. 4.2 Zelllinien Die verwendete Zelllinie 3LL-A9 (H-2b) ist ein immunogenes, leicht metastasierendes, murines Lungenkarzinom und wurde von Lea Eisenbach (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) zur Verfügung gestellt. Des Weiteren wurde die durch stabile Transfektion der parentalen Zellinie mit dem GP33-Expressionsvektor des LCMV hergestellte 3LL-A9GP33 Tumorzelllinie verwendet (78) . Zur Anwendung kam weiterhin die Mauslymphomzelllinie EL-4 (H-2b). 4.3 Virus LCMV-WE: Das Virus wurde von R. Zinkernagel (Universitäts Hospital Zürich) zur Verfügung gestellt und in L929 Fibroblasten vermehrt. 4. Material und Methoden 22 4.4 Peptide Verwendet wurden die folgenden Peptide: GP33 ein Glykoprotein des LCMV mit den Peptiden33-41 KAVYNFATM. Des weiteren NP396 ein Nucleoprotein des LCMV mit den Peptiden396-404 FQPQNGQFI und das Adenopeptid des Adenovirus aus der 5 early region 1 A mit den Peptiden234-243 SGPSNTPPEI. 4.5 Zellbiologische Methoden 4.5.1 Medien DMEM-Kulturmedium: DMEM-Grundmedium (Biochrom, Berlin) 10% hitzeinaktiviertes FCS (Life Technology, Wiesbaden), 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (ICN Biochemicals), 2 mM L-Gln (Life Technology) IMDM-Kulturmedium: IMDM-Grundmedium (Life Technology) 10% hitzeinaktiviertes FCS (Life Technology) 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (ICN Biochemicals), 2 mM L-Gln (Life Technology) 4.5.2 Kultivierung von Tumorzellen Je nach Wachstum wurden die Zellen alle zwei bis drei Tage mit zweifach konzentriertem Trypsin (2x Trypsin-EDTA-Lösung, Life Technology) vom Boden der Zellkulturflasche abgelöst und ein paar Tropfen der Zelllinie in eine neue Zellkulturflasche mit 15 ml Kulturmedium überführt. Die transfizierte Zelllinie 3LL-A9GP33 wurde zusätzlich mit G418 (Life Technology) (800 µg/ml) kultiviert, um zu verhindern, dass Zellen auswachsen, die GP33 nicht mehr exprimieren. 4.5.3 Subkutane Injektion von Tumorzellen Die Tumorzellen wurden nach dem Ablösen aus der Zellkulturflasche zweimal in PBS gewaschen, anschließend gezählt und auf die zu injizierende Zellzahl /100µl PBS eingestellt. Die hergestellte Zellsuspension wurde subkutan in die rechte oder linke Flanke der Maus injiziert, die zuvor an der Injektionsstelle rasiert wurde. 4. Material und Methoden 4.5.4 23 Bestimmen der Wachstumskinetik von Tumoren anhand der Tumorgröße Die in den Mäusen subkutan injizierten Tumorzellen wurden alle 2-4 Tage auf Tumorwachstum/-grösse kontrolliert. Dazu wurden die Mäuse mit Metofane® (Jansson-Cilag, Deutschland) narkotisiert und der Durchmesser des Tumors mittels Schiebleere (Absolut Digimatic Caliper, Mitutoyo) bestimmt. 4.5.5 Isolierung und Aufarbeitung der subkutan gewachsenen Tumoren Subkutan gewachsene Tumore wurden bei einem Durchmesser bis zu 12 mm aus der Maus isoliert. Dazu wurden die Mäuse mit Metofane® in einem Glas narkotisiert, die Tumorgröße mittels Meßgerät bestimmt und die Tiere durch Zervikaldislokation getötet. Der Tumor wurde mit einer Schere und Pinzette freipräpariert, abgelöst und in ein Falkonröhrchen (Becton Dickinson, USA) mit 5 ml DMEM-Nährmedium überführt. Das Gewebe wurde in einer Petrischale mit einem Spritzenstempel durch ein feines Metallnetz gedrückt, mit weiteren 10 ml Nährmedium aufgenommen und in eine Zellkulturflasche überführt. Nach ca. 2h beginnen die Tumorzellen am Boden der Flasche zu adhärieren. Der Überstand wurde verworfen und die Kultur mit neuem Nährmedium ohne Selektions-Antibiotika aufgefüllt. 4.5.6 Erstellen einer Einzelzellsuspension Die Organe wurden nach der Entnahme in 5 ml IMDM-Kulturmedium überführt und anschließend in einer Petrischale mit einem Spritzenstempel durch ein feines Metallnetz gedrückt. Mit einer Pipette wurde die Zellsuspension unter Zugabe von weiteren 5 ml Medium in ein 15ml Falkonröhrchen überführt und zentrifugiert (1100 rpm, 8 min). Das Sediment wurde in 5 ml Kulturmedium resuspensiert, der Überstand in ein neues Röhrchen übertragen und die Zellzahl/ml mittels Neubauer-Zählkammer mit Trypanblaulösung (Merck, Darmstadt) bestimmt. Anschließend wurden die Zellen auf die erforderliche Zellzahl eingestellt. Die Zellzahl wurde wie folgt bestimmt: gezählte Zellzahl aus 16 Kleinquadraten x Verdünnungsfaktor x 104 (Kammerfaktor) 4.5.7 Virus Injektion und in vivo Stimulation Das –70°C tiefgefrorene LCMV wurde bei RT aufgetaut und 200 pfu (plaque forming unit) in 200 µl intravenös in die seitliche Schwanzvene der Maus injiziert. Zur in vivo Stimulation von 4. Material und Methoden 24 TCR-tg T-Zellen wurden ebenfalls 200 pfu LCMV in 200µl in die seitliche Schwanzvene der Tiere injiziert. An Tag 8 nach Injektion wurde die Milz entfernt und eine Einzelzellsuspension hergestellt. 4.5.8 In vitro Stimulation von TCR-tg T-Zellen 2x106 Milzzellen von TCR-tg Mäusen wurden mit 2x106 Milzzellen von H8-tg Mäusen in 1ml IMDM Kulturmedium in 24-Loch Platten für 3 Tage bei 37°C/5% CO2 im Brutschrank kultiviert. Alternativ wurde 4x106 Milzzellen von TCR-tg Mäusen mit GP33 Peptid (10-7M) in 1 ml IMDM Kulturmedium unter denselben Bedingungen kultiviert. 4.5.9 Zytotoxizitätstest (CTL-Test) Als Zielzellen wurden entweder in vitro kultivierte Zellen (3LL-A9, 3LL-A9GP33 und EL-4) oder Zellen aus ex vivo isolierten Tumorzellen (3LL-A9GP33) verwendet, die mindestens für eine Woche in Kultur gehalten wurden. Die Zellen wurden durch Trypsinbehandlung vom Boden der Kulturflasche abgelöst, mit DMEM-Kulturmedium gewaschen und auf eine Zellzahl von etwa 3x106/ml eingestellt und abzentrifugiert. Die Zielzellen wurden mit 250µl 10-6M Peptid (wahlweise GP33, NP396 des LCMV und EIA 233-243 des Adenovirus) + 550µl IMDM-Kulturmedium + 30-80µl radioaktivmarkiertem 51 Cr (250µCi Na251CrO4 in IMDM 10%FKS) für zwei Stunden bei leichtem Schaukeln im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit IMDM-Kulturmedium dreimal gewaschen und auf eine Zellzahl von 1x105/ml eingestellt. Als Effektorzellen dienten Milzzellen von Mäusen, denen 8 Tage zuvor LCMV (200 pfu) gespritzt worden war oder Milzzellen, die in vitro mit GP33 oder H8-tg Milzzellen für drei Tage stimuliert worden waren. Die Effektorzellen wurden auf eine Zellzahl von 1x107/ml, bzw. 6x106/ml eingestellt. 100 µl der Zellsuspension wurde in einer 96-Loch Mikrotiterplatte über 6 Stufen in einer Verdünnungsreihe 1:3 austitriert. In jedes Loch wurden 100µl Zielzellen hinzugegeben und die Platten bei 1100 rpm für 5 min abzentrifugiert, um die Zellen möglichst in engen Kontakt miteinander zu bringen. Zur Bestimmung der maximalen Lyse und der spontanen Apoptose der Zielzellen wurden in Dreifachansätzen anstatt der Effektoren jeweils 100µl 2M HCl oder 100µl Medium hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 5h im Brutschrank bei 37°C wurden 70µl pro Loch abpipettiert und die Radioaktivität im Überstand mittels Gamma-Zähler (Packard) bestimmt. Sie gibt Aufschluß über das lytische Verhalten der Effektorzellen zu den Zielzellen. Das Ergebnis wird in Prozent angegeben und spiegelt die spezifische Lyse der Zielzellen wider: 4. Material und Methoden spezifische Lyse = 25 (cpmE – cpmS) x100 (cpmT – cpmS) cpmE = Counts pro Minute (cpm) mit Effektorzellen, cpmS = cpm Spontanfreisetzung cpmT = cpm Totalfreisetzung 4.6 Immunfluoreszenz und Durchflußzytometrie 4.6.1 Puffer für Durchflußzytometrie Zell-Puffer: PBS ohne Ca2+ und Mg2+ 0,1% NaN3, 2% FCS Blut-Puffer: wie Zellpuffer, zusätzlich 10 U/ml Liquemin (Roche) Lyse-Puffer: Lysing Buffer, 1:10 verdünnt in ddH2O 4.6.2 (Becton-Dickinson) Verwendete Antikörper Folgende Antikörper kamen für die Analyse in der Durchflußzytometrie zur Verwendung: CD8-FITC, CD8-CyChrome, Vα2-PE, Vβ8-FITC, Thy1.1-PE, CD44-Bio, Ly6C-Bio und CD 25-Bio. Sämtliche Antikörper wurden von Pharmingen, USA bezogen. Der Antikörper CD25Bio wurde von Gibco BRL, Life Technologies USA bezogen. 4.6.3 Färbung von Zellen aus lymphatischen Organen Nach Herstellen einer Einzelzellsuspension wurden 106 Milzzellen in 5ml Zell-Puffer überführt und bei 1100 rpm für 7 min abzentrifugiert. Das Sediment wurde mit den entsprechenden Antikörpern in 100µl für 30 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden einmal mit Zell-Puffer gewaschen, um nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Der Überstand wurde bis auf 400 µl für die Analyse abgesaugt. Bei Verwendung biotinylierter Antikörper wurde zweimal gewaschen, anschließend mit Streptavidin-APC für 30 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubiert und erneut einmal gewaschen. 4. Material und Methoden 4.6.4 26 Analyse von Lymphozyten aus peripherem Blut Zur Untersuchung von PBLs wurde den Tieren mit einer Rasierklinge ein kleiner Schnitt lateral an der Schwanzvene gesetzt und 3-5 Tropfen Blut in 5ml Blutpuffer getropft. Die Blutproben wurden für 7 min bei 1100 rpm abzentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Die Färbung erfolgte wie unter 4.6.3. Nach anschließendem Waschen wurde 1ml Lyse-Puffer hinzugegeben, um Bluterythrozyten zu lysieren. Nach 7 min wurde die Zelllösung mit Blutpuffer aufgefüllt, bei 1100 rpm für 7 min abzentrifugiert und der Überstand bis auf verbleibende 400 µl für die Analyse abgesaugt. 4.6.5 GP33/Db MHC-Klasse I Tetramer-Färbung GP33/Db MHC-Klasse I Tetramere wurden von Tilman Dumrese (Universitätsspital Zürich) zur Verfügung gestellt (4, 65). Die PE markierten GP33/Db Tetramere wurden in 50 µl Zell-Puffer/Probe verdünnt, auf die Zellen gegeben, für 10 min bei 37°C inkubiert und anschließend CD8-FITC (verdünnt in 50µl Zell-Puffer/Probe) hinzugegeben und für 30 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Die nachfolgenden Schritte entsprachen dem Ablauf von 4.6.3 und 4.6.4. 4.6.6 Anfärbung von Zellen mittels intrazellulärem Farbstoff CFSE Mit dem Farbstoff 5/6-Carboxyfluorescein-Diacetate-Succinimidyl-Ester (CFSE, Molecula Probes) kann die Zellmembran angefärbt werden. Bei jeder Zellteilung wird es zur Hälfte an die Tochterzelle weitergegeben. Somit kann man die Zahl der Zellzyklen festgestellt werden. Die Zellen können aufgrund ihrer Fluoreszenz im Durchflußzytometer sichtbar gemacht und analysiert werden. Zur Anfärbung wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt, die einmal mit eiskaltem PBS gewaschen und auf eine Zellzahl von 5x106 Zellen/ml eingestellt wurde. Anschließend wurden die Zellen mit 1 µl CFSE (0,5mM in DMSO) für 10 min bei 37°C inkubiert und dann mit eiskaltem PBS plus 1% FCS gewaschen. Die Suspension wurde auf die entsprechende Zellzahl/700µl eingestellt und in die Mäuse injiziert. 4.6.7 Adoptiver Transfer von Zellen Nach Herstellen einer Einzellzellsuspension wurden die Zellen in IMDM-Grundmedium resuspendiert und auf die gewünschte Zellzahl in 800µl IMDM-Grundmedium eingestellt. Die Suspension wurde langsam in die seitliche Schwanzvene der Maus injiziert. 4. Material und Methoden 27 4.7 Histologie 4.7.1 Kryokonservierung von entnommenen Tumoren Die Mäuse wurden durch Zervikaldislokation getötet, der subkutan gelegene Tumor freipräpariert und im Ganzen bei einer Größe bis zu 10x10 mm auf einen WhatmanFilterpapierstreifen (3MM, Chr) gelegt. Der Tumor wurde mit Tissue-Tek Einbettmedium (Miles Inc.) überdeckt, in flüssigem n-Hexan (Merck, Darmstadt) bei –70°C schockgefroren und anschließend bei –80°C im Gefrierschrank gelagert. 4.7.2 Erstellen histologischer Gewebeschnitte Von den eingefrorenen Geweben wurde am Kryosat (Typ 220, SLEE, Mainz) 7-15 µm dicke Schnitte angefertigt und auf einen Objektträger übertragen. Die angefertigten Schnitte wurden bei RT über Nacht getrocknet und am nächsten Tag in Aceton (Merck, Darmstadt) bei –20°C für 10 Minuten fixiert. Es erfolgte ein erneutes Trocknen bei RT bevor die Schnitte bei –20°C gelagert wurden. 4.7.3 Immunhistologie 4.7.3.1 Verwendete Antikörper Für die immunhistologische Färbung der Präparate wurden Biotin-markierte monoklonale Antikörper eingesetzt: anti-mouse CD4, anti-mouse CD8, anti-mouse CD11b (Mac-1 αM Kette), anti-mouse Ly6G (Gr1), anti-mouse and –rat Thy1.1, anti-mouse ER-MP 12 (CD31). Sämtliche Antikörper wurden von Pharmingen, USA bezogen. Der Antikörper CD31 wurde von BMA Biomedicals AG, Schweiz bezogen. 4.7.3.2 Immunfärbung von Gewebeschnitten Die angefertigten und fixierten Gewebeschnitte wurden über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Zu Beginn des Färbeprozesses wurden sie mit einem Fettstift (Sigma, Deutschland) umrandet. Die Objektträger wurden für 10 min in Tris-Puffer (0,1M Tris-HCl, pH 7,5) gewaschen und 120µl titrierter Antikörper in Tris-Puffer + 5% Mäuseserum (zum Abblocken unspezifischer Bindungen) auf die Schnitte pipettiert. In einer feuchten Kammer wurden die Schnitte für 1h inkubiert und anschließend zwei mal fünf Minuten in Tris-Puffer (pH 7,5) gewaschen. Nach dem Waschgang wurde auf die histologischen Präparate 120µl des 4. Material und Methoden 28 Färbekits Strept AB Complex / AP (Dako, Deutschland) gegeben und für 30 min in der feuchten Kammer inkubiert. Anschließend erfolgte ein erneutes Waschen der Präparate in Tris-Puffer (pH 7,5) für zweimal 5 min. Auf die Schnitte wurden 120µl EnzymSubstratkomplex Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector, Burlingham, USA) gegeben und wieder für 20-30 min in der abgedunkelten feuchten Kammer inkubiert. Die Schnitte wurden unter fließendem Wasser abgespült und für 10 min im Wasserbad gewaschen und anschließend mit Mayers Hämalaun-Lösung (Merck, Darmstadt) für 60-90 sec. gegengefärbt. Nach erneutem Abspülen unter fließendem Wasser wurden die Schnitte mit Kaisers Glycerin-Gelatine (Merck-Darmstadt) eingedeckelt. 5. Ergebnisse 29 5. Ergebnisse 5.1 Charakterisierung der GP33-spezifischen CD8 T-Zellantwort in B6-, ALB1-tg und H8-tg Mäuse ALB1 transgene Mäuse exprimieren das GP33-Peptid in der Leber und zu einem 100- bis 1000-fach geringerem Anteil im Thymus. H8 transgene Mäuse exprimieren das GP33-Peptid ubiquitär auf jeder Zelle. Um die GP33-spezifische CD8 T-Zellantwort in B6-, H8-tg und ALB1-tg Mäusen zu vergleichen, wurden die Mäuse mit LCMV infiziert. An Tag 8 waren die induzierten T-Zellen zu Effektorzellen differenziert. Die Milz wurde entnommen und eine Einzelzellsuspension angefertigt. Die zytotoxischen Eigenschaften der Lymphozyten wurden im CTL-Test untersucht. Im Durchflußzytometer wurde mittels GP33/Db MHC-Klasse I Tetrameren die Anzahl GP33-spezifischer CD8 T-Zellen untersucht. Im CTL-Test wurde die zytotoxische Aktivität der induzierten T-Zellen gegenüber Zielzellen ermittelt, die mit unterschiedlichen Peptiden beladen wurden. Als Ziezellen dienten die Lymphomzelllinie EL-4, die mit dem GP33-Peptid und dem NP396-Peptid des LCMV beladen wurden. Das Peptid NP396 wurde als Positivkontrolle verwandt. Zusätzlich wurde als Negativkontrolle ein Peptid des Adenoviruses, das EIA 233-243 verwandt. Hierbei zeigte sich, dass bei Effektorzellen aus ALB1-tg Mäusen eine ca. 3- bis 5-fach reduzierte zytotoxische Aktivität, bezogen auf das GP33-Peptid, im Vergleich zu den B6 Mäusen vorliegt. Es war kein Unterschied in der Lyse von NP396-beladenen Zielzellen durch ALB1-tg CTL und CTL aus B6 Mäusen zu erkennen. In den H8-tg Mäusen fand sich keine spezifische Lyse GP33-Peptid beladener Zielzellen. Dieses Resultat ist durch eine vollständige zentrale Toleranz gegenüber dem GP33-Peptid zu erklären (26) . Die mit dem NP396-Peptid beladenen Tumorzellen wurden equivalent von Effektoren aus allen Mäusen lysiert. Folglich könnte die reduzierte GP33-spezifische Aktivität auf eine verminderte Anzahl von GP33-spezifischen T-Zellen hinweisen (Abb.1). 5. Ergebnisse 30 B.) H8-tg LCMV-infiziert A.) B6 LCMV-infiziert 100 100 80 Spezifische Lyse in % Spezifische Lyse in % EL-4 GP33 EL-4 NP396 60 40 20 Spezifische Lyse in % 0 100 33 11 3,7 1,2 0,4 80 60 40 20 0 100 11 3,7 1,2 0,4 Effektor : Zielzellen Verhältnis Effektor : Zielzellen Verhältnis C.) ALB1-tg LCMV-infiziert (Maus Nr.1) D.) ALB1-tg LCMV-infiziert (Maus Nr.2) 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 100 33 0 33 11 3,7 1,2 0,4 100 33 11 3,7 1,2 Effektoren : Zielzellen Verhältnis Abb. 1: Aktivierung von GP33-spezifischen CD8+ T-Zellen durch eine LCMV-Infektion. Bestimmt wurde die zytolytische Aktivität von Milzzellen aus B6 (A), H8-tg (B) und ALB1-tg Mäusen (C,D), die 8 Tage zuvor mit 200pfu LCMV infiziert wurden. Die Milz wurde entnommen, eine Einzelzellsuspension angefertigt und die lytische Aktivität gegenüber der Tumorzellinie EL-4 beladen mit GP33 (○) oder NP396 (●) im 51CrFreisetzungstest bestimmt. Welche Rolle die Anzahl GP33-spezifischer CD8 T-Zellen aus den ALB1-tg Mäusen in Bezug auf die reduzierte Aktivität der Effektorzellen im CTL-Test spielt, war Ziel des folgenden Experimentes. Hierzu wurden CTL aus der Milz mit MHC-Klasse I (GP33/Db)Tetrameren angefärbt. An Tag 8 nach LCMV-Infektion wurde die Milz aus B6-, H8-tg und ALB1-tg Mäusen entfernt und mit GP33/Db-Tetramer angefärbt (Abb.2). Es zeigte sich, das in den B6-Mäusen an Tag 8 bis zu 14% der CD8+-Zellen mit GP33/Db-Tetramer angefärbt 0,4 5. Ergebnisse 31 werden konnten, während es in den ALB1-tg nur knapp 4% waren. Es fand sich keine Anfärbbarkeit durch GP33/Db-Tetramer von Zellen der H8-tg Mäuse, es waren keine doppelpositiven Zellen darstellbar (Abb.3). Die verminderte Anzahl und lytische Aktivität der induzierten Lymphozyten aus den ALB1-tg Mäusen, weißt auf eine mögliche Generierung GP33-spezifischer Zellen hin. Im Vergleich zu B6 Mäusen ist die GP33-spezifische CTL-Antwort in ALB1-tg Mäusen reduziert. Dennoch konnte keine vollständige Toleranz gegenüber dem GP33-Antigen im Vergleich zu den H8-tg Mäusen nachgewiesen werden. GP33/Db-Tetramer+ B6 LCMV-infiziert H8-tg LCMV-infiziert 5,5% R2 R2 33,8% R3 R3 ALB1-tg LCMV-infiziert 0,3% R2 1,6% 13,1% R3 40,4% CD8+ Abb. 2: Durchflusszytometrische Analyse von Milzzellen aus B6-, H8-tg und ALB1-tg Mäusen an Tag 8 nach LCMV-Infektion. Die Mäuse wurden mit LCMV infiziert und an Tag 8 nach Infektion wurden die Milzzellen isoliert. Untersucht wurde die Population der Lymphozyten auf Expression von CD8 und auf Bindung von GP33/Db-Tetramer. % GP33/Db -Tetramer+ von CD8+ 20 15 10 5 0 B6 H8 ALB Abb. 3: Prozentzahl der GP33/Db-Tetramer+ Zellen von B6-, H8-tg und ALB1-tg Milzzellen an Tag 8 nach LCMV-Infektion in Bezug auf die Gesamtzahl an CD8+ Zellen. 5. Ergebnisse 32 5.2 LCMV-immunisierte ALB1-tg Mäuse können H8-tg Milzzellen abstoßen ALB1-tg Effektorzellen weisen gegenüber dem GP33-Antigen eine reduzierte Aktivität im Vergleich zu den B6-Mäusen auf. Damit stellt sich die Frage, ob LCMV-immunisierte ALB1tg Mäuse die Fähigkeit besitzen, nach der Bildung von antigenspezifischen Lymphozyten im Verlaufe einer LCMV-Infektion, transferierte GP33-exprimierende Zellen (H8-tg Milzzellen) abzustoßen. Das GP33-Peptid wird in der H8-tg Maus unter dem MHC-Klasse I Promoter exprimiert und ist folglich ubiquitär auf allen Zellen der Maus nachweisbar, z.B. exprimieren Milzzellen das GP33-Peptid. Milzzellen aus den H8-tg Mäusen wurden mit dem intrazellulären Farbstoff CFSE markiert, um sie in der Immunfluoreszens mittels Durchflußzytometer sichtbar zu machen. Die Zellen wurden mit einer Zellzahl von 3x107 Zellen/Maus intravenös in B6-, ALB1-tg- und H8-tg LCMV-immunisierte Mäuse injiziert. Nach drei Stunden, Tag 1 und Tag 7 wurde das Blut der Mäuse auf CFSE markierte Zellen mit dem Durchflußzytometer untersucht. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe ohne vorherige Immunisation, waren die B6- und ALB1-tg Mäuse in der Lage, GP33-tragende H8-tg Milzzellen aus ihrem Blut zu eliminieren. Nach zwei Tagen waren im Blut der Mäuse mittels Durchflußzytometer keine CFSE markierten Zellen mehr zu detektieren (Abb.4). 5. Ergebnisse 33 5 B6 % CFSE 4 B6 LCMV-immunisiert 3 // // 2 1 // // 0 // 3h Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 6 Tag 8 5 A L B 1-tg % CFSE 4 A L B 1-tg L C M V -im m unisiert 3 // // 2 1 // // //// // 0 // // 3h T ag1 T ag2 T ag4 T ag7 Z eit nach T ransfer Abb. 4: Adoptiver Transfer von CFSE markierten H8-tg Milzzellen die in LCMV-immunisierte B6- und ALB1tg Mäuse i.v. injiziert wurden. Den Mäusen wurde zu den angegebenen Zeiträumen Blut entnommen und im Durchflußzytometer auf CFSE-markierte Zellen untersucht. 5.3 Wachstum von 3LL-A9 und 3LL-A9GP33 Zellen in B6- und ALB1-tg Mäusen Wie in der Literatur beschrieben, wird der murine Lungentumor 3LL-A9GP33 nach subkutaner Injektion in B6 Mäuse innerhalb eines bestimmten Zeitraumes vollständig abgestoßen (78) . Aus dem vorherigen Experiment ist ersichtlich, das GP33-spezifische Effektorzellen in den ALB1-tg Mäusen in der Lage sind, GP33-exprimierende H8-tg Milzzellen zu beseitigen. (Abb.4). Im Folgenden sollte untersucht werden, in wie fern es in den ALB1-tg Mäusen möglich ist, durch eine GP33-tragende Tumorzelle (3LL-A9GP33) eine GP33-spezifische TZellantwort zu induzieren. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob mögliche induzierte GP33-spezifische CTL in der Lage sind, die Tumorzellen vollständig zu eliminieren. 5. Ergebnisse 34 ALB1-tg, B6- und H8-tg Mäuse bekamen dazu 107 3LL-A9GP33 s.c. in die Flanke injiziert. Alle zwei bis drei Tage wurde das Tumorwachstum in den Mäusen kontrolliert. Hierbei zeigte sich neben der schon oben beschriebenen Abstoßung der Tumorzellen in den B6 Mäusen, das Ausbilden eines soliden Tumors in den H8-tg Mäusen und in den ALB1-tg Mäusen (Abb.5). H8-tg ALB1-tg 100 100 100 80 80 80 60 60 60 40 40 40 20 20 20 2 Tumorgrösse (mm ) B6 0 0 10 30 50 0 10 30 50 10 30 50 Tage nach Tumorzell Injektion Abb. 5:Tumorwachstum von 3LL-A9GP33 in B6-, H8-tg und ALB1-tg Mäusen. Den Mäusen wurden 3LL-A9GP33 Tumorzellen (106) s.c. in die rechte Flanke injiziert. Das Tumorwachstum wurde über 60 Tage kontrolliert. Eine Maus wurde als tumortragend bezeichnet, wenn der Durchmesser > 5mm2 gemessen wurde. Im anschließenden Experiment wurde eine Titrationsreihe mit der Parentalen und der transfizierten Zelle des 3LL-A9 in B6- und ALB1-tg Mäusen durchgeführt, um mögliche Unterschiede in der Wachstumskinetik festzustellen. Parentale 3LL-A9 Tumorzellen sollten sowohl in B6- als auch in ALB1-tg Mäusen einen vollständigen Tumor ausbilden und keine wesentlichen Unterschiede in ihrer Kinetik aufweisen. Diese Zellen besitzen kein genügend starkes Tumorantigen, das zur Induktion einer Abstoßungsreaktion führt. Hierzu wurden 105 – 107 Zellen 3LL-A9/Maus s.c. injiziert. Das Tumorwachstum wurde alle 2 bis 3 Tage kontrolliert. Im Verlauf zeigte sich kein Unterschied bei der Ausbildung eines Tumors zwischen den beiden Mauslinien (Tab.1). 5. Ergebnisse 35 Tab.1: Tumorwachstum von 3LL-A9 in B6- und ALB1-tg Mäusen 3LL-A9 Zellen/Maus B6 ALB1-tg 1x107 7/7 3/3 3x106 6/6 1x106 8/8 2/2 3x105 8/9 1x105 2/3 Tab. 1: Titration von 3LL-A9 Tumorzellen in B6- und ALB1-tg Mäusen. Den Mäusen wurden zwischen 105 und 107 Tumorzellen s.c. in die rechte Flanke injiziert und das Tumorwachstum kontrolliert. Dargestellt ist die Anzahl der Tiere, in denen sich ein vollständiger Tumor ausbildete. Antigen, welches den Zellen des Immunsystems via APC präsentiert werden muß, um eine Immunreaktion auszulösen, kann unter bestimmten Umständen der Erkennung des Immunsystems umgehen (119) . Dies könnte z.B. durch eine geringe Menge an Antigen oder einer schlecht für die Zellen zugänglichen Gewebestruktur liegen. Um diese Hypothese zu testen, wurde in B6 Mäuse zwischen 105 - 107 3LL-A9GP33 Tumorzellen/Maus s.c. injiziert. Das Tumorwachstum wurde kontrolliert. Es zeigten sich jedoch keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Zellkonzentrationen. In allen Mäusen wurde der Tumor gleichmäßig abgestoßen. Ferner sollte überprüft werden, ob eine injizierte Tumorzellzahl von 107 Zellen 3LLA9GP33/Maus in den ALB1-tg zu groß ist eine Immunantwort auszulösen, die den anwachsenden Tumor noch kontrollieren könnte. Dazu wurde das Tumorwachstum in den Mäusen bei Zellzahlen zwischen 106 – 107 3LL-A9GP33 Tumorzellen/Maus verglichen. Es fielen keine Unterschiede im Tumorwachstum bei variierender Zellzahl auf (Tab.2). Tab.2: Tumorwachstum von 3LL-A9GP33 in B6- und ALB1-tg Mäusen A9GP33 B6 ALB1-tg 7 1x10 0/15 18/19 3x106 4/5 1x106 26/30 1x105 0/3 Tab. 2: Titration von 3LL-A9GP33 Tumorzellen in B6- und ALB1-tg Mäusen. Den Mäusen wurden zwischen 105 und 107 Tumorzellen s.c. in die rechte Flanke injiziert und das Tumorwachstum kontrolliert. Dargestellt ist die Anzahl der Tiere in Bezug auf die Gesamtanzahl, in denen sich ein vollständiger Tumor ausbildete. 5. Ergebnisse 36 5.4 Wachstum von 3LL-A9GP33 Zellen in ALB1-tg Mäusen nach LCMVInfektion Durch Generierung einer Immunantwort im Verlaufe einer LCMV-Infektion sind ALB1-tg Mäuse fähig, GP33-tragende H8-tg Milzzellen zu eliminieren. Jedoch können GP33exprimierende 3LL-A9GP33 Tumorzellen nach s.c. Injektion in naive ALB1-tg Mäuse nicht abgestoßen werden. Im nächsten Experiment sollte untersucht werden, ob eine Infektion der B6-, ALB1-tg und H8-tg Mäuse mit dem LCMV vor möglichem Wachstum von 3LL-A9GP33 protegiert. In die mit dem LCMV infizierten Tiere wurden drei Wochen nach Infektion 106 Zellen 3LLA9GP33/Maus injiziert und die Mäuse auf Tumorwachstum kontrolliert. Hierbei zeigte sich, dass ein Tumorwachstum in den zuvor LCMV-immunisierten B6- und ALB1-tg Mäusen ausblieb. Im Gegensatz dazu war in der Kontrollgruppe nach ca. 14 Tagen ein vollständiger Tumor zu erkennen (Abb.6). 2 Tumorgrösse (mm ) B6 LCMV-immunisiert H8-tg LCMV-immunisiert ALB1-tg LCMV-immunisiert 100 100 100 80 80 80 60 60 60 40 40 40 20 20 20 0 0 10 30 50 0 10 30 50 10 30 50 Tage nach Tumorzell Injektion Abb. 6: Tumorwachstum von 3LL-A9GP33 in B6-, H8-tg und ALB1-tg LCMV-immunisierten Mäusen. B6-, H8tg und ALB1-tg Mäuse wurden mit 200 pfu LCMV immunisiert. 4 Wochen nach Infektion wurden den Mäusen 3LL-A9GP33 Tumorzellen (106) s.c. in die rechte Flanke injiziert. Das Tumorwachstum wurde über 60 Tage kontrolliert. 5. Ergebnisse 37 5.5 GP33-spezifische T-Zellen können in 3LL-A9GP33-Tumortragenden ALB1-tg Mäusen nicht nachgewiesen werden Zur Bekämpfung einer Virusinfektion wird eine starke Immunantwort des Wirtes verlangt. Aufgrund der großen Menge an präsentiertem Antigen kommt es zu einer massiven Vermehrung von antigenspezifischen Zellen. Wie in Abbildung 1-4 zu sehen, sind ALB1-tg Mäuse in der Lage, bei einer LCMV-Infektion, spezifische Effektorzellen zu generieren und GP33-tragende Zellen zu eliminieren. Allerdings ist im Zytotoxizitätstest und bei der Anfärbung von Milzzellen mit GP33/Db -Tetramer während und nach einer Virusinfektion, sowohl die Freisetzung von 51 Cr im Chromfreisetzungstest, als auch die Anzahl der GP33/Db-Tetramer+ Zellen im Vergleich zu den B6 Mäusen reduziert. Dennoch ist es möglich, durch eine LCMV-Infektion Effektorzellen gegen das GP33-Peptid zu induzieren. Der 3LL-A9GP33 ist ein immunogener Tumor, der in den B6 Mäusen eine Immunantwort generiert und vollständig abgestoßen wird. In den ALB1-tg Mäusen kommt es zur Ausbildung dieses Tumors (s.o.). Um eine mögliche GP33-spezifische Antwort in den B6 und ALB1-tg sichtbar zu machen, wurden 107 Zellen 3LL-A9GP33 in B6- und ALB1-tg Mäuse subkutan injiziert. An Tag 10 und nach der dritten Woche wurde Blut aus der Schwanzvene der Mäuse entnommen, Lymphozyten des Blutes isoliert und anschließend mit GP33/Db MHC-Klasse I Tetramer angefärbt. Hierbei zeigte sich kein Unterschied zwischen den beiden Mauslinien. Es wurden keine spezifisch für das GP33-Tetramer anfärbbare Zellen in den verschiedenen Maustypen detektiert. (Daten nicht gezeigt). Da der Nachweis von GP33-spezifischen T-Zellen mit MHC-Klasse I Tetrameren nicht genügend sensitiv ist, wurde eine Methode angewandt, die indirekt GP33-spezifische TZellen nachweißt. Sie besitzt eine größere Sensitivität gegenüber evtl. vorhandenen GP33spezifischen T-Zellen. Dazu diente ein adoptives Transferexperiment bei dem H8-tg Milzzellen mit CFSE angefärbt wurden und anschließend intravenös injiziert wurden. Es wurden 3x107 H8-tg CFSE gefärbte Milzzellen in 3LL-A9GP33 tumortragende ALB1-tg Mäuse intravenös injiziert. Nach 3 Stunden, Tag 1 bis Tag 8 wurde das Blut der Mäuse auf CFSE markierte Zellen mittels Durchflußzytometer untersucht. Es zeigte sich kein Unterschied in der Elimination von GP33-tragenden Zellen im Vergleich zu der nicht tumortragenden Kontrollgruppe (Abb.7). Eine mögliche Ursache der fehlenden Aktivierung könnte auf die verminderte Anzahl von GP33-spezifischen T-Zellen in den ALB1-tg Mäusen zurückzuführen sein oder auf eine 5. Ergebnisse 38 verminderte Antigenpräsentation in den Tieren. Die Vorläuferfrequenz von GP33spezifischen T-Zellen in den ALB1-tg Mäusen reicht nicht aus, um durch den 3LL-A9GP33 eine Aktivierung der endogenen T-Zellen zu erreichen. 5 ALB1-tg ALB1-tg + 3LL-A9GP33 % CFSE 4 3 //// // // 2 //////// 1 0 // 3h // Tag1 Tag2 Tag3 Tag8 Zeit nach Transfer Abb. 7: In ALB1-tg Mäuse wurde 3 Wochen nachdem sie einen vollständigen 3LL-A9GP33 Tumor generiert hatten H8-tg CFSE markierte Milzzellen (3x107) adoptiv transferiert (●). Als Kontrolle dienten nicht tumortragende ALB1-tg Mäuse (○) die ebenfalls H8-tg CFSE markierte Milzzellen i.v. injiziert bekamen. PBL wurden 3h, an Tag 1,2,3 und 8 aus dem Blut der Mäuse isoliert und im Durchflusszytometer auf die Anzahl CFSE positiver Zellen untersucht. 5.6 Wirkung einer akuten LCMV-Infektion auf das Wachstum von 3LLA9GP33 Tumorzellen Die bisherigen Resultate zeigen, dass die Antigenpräsentation nach Tumorzellinjektion in einer naiven ALB1-tg nicht ausreicht, um eine GP33-spezifische Antwort auszulösen. Eine Vielzahl von etablierten Möglichkeiten stehen zur Verfügung GP33-spezifische Zellen zu aktivieren und damit den 3LL-A9GP33 Tumor zur Abstoßung zu bringen. Eine akute LCMVInfektion wäre eine Möglichkeit, das Immunsystem zu aktivieren und die GP33-spezifischen Zellen zu induzieren. Ob diese Antwort ausreicht, einen etablierten Tumor abzustoßen, wurde im folgenden Experiment getestet. In ALB1-tg Mäuse wurden 106 Zellen 3LL-A9GP33 subkutan injiziert. Nach 14 – 21 Tagen hatte sich ein vollständiger Tumor generiert und es wurde LCMV in die laterale Schwanzvene injiziert. 5. Ergebnisse 39 Die mit Virus behandelten Tiere zeigten in den darauffolgenden Tagen einen deutlichen Rückgang der Tumormasse, bis zum vollständigen Verschwinden eines sichtbaren Tumors (Abb.8). Bei einigen Mäusen generierte sich erneut ein Tumor. Dieser wurde im Zytotoxizitätstest untersucht, um zu testen, ob es sich dabei um Tumorzellen handelt, die das GP33-Tumorantigen verloren haben. Dieses bestätigte sich im durchgeführten Experiment (Daten nicht gezeigt). 100 GP33 LCMV 2 Tumorgrösse (mm ) 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Tage nach Tumorzell Injektion Abb. 8: Tumorwachstum von 3LL-A9GP33 in ALB1-tg Mäusen nach Injektion von LCMV. ALB1-tg Mäuse wurden nach Generierung eines Tumors bei einem Mindestdurchmesser von 15 mm2 mit 200 pfu LCMV i.v. infiziert (↓). Das Tumorwachstum wurde über 60 Tage kontrolliert und erneut gewachsene Tumore im 51CrFreisetzungstest auf Expression des GP33-Antigens getestet. Alle erneut gewachsene Tumore wurden als GP33Variante getestet. 5.7 Adoptiver Transfer von aktivierten TCR-tg Zellen in ALB1-tg Mäuse GP33-spezifische TCR-tg Zellen müssen durch Antigen Präsentierende Zellen (APC) aktiviert werden, die ihnen das entsprechende Peptid präsentieren. Dies kann einerseits in vivo durch eine Infektion mit dem LCMV geschehen, als auch in vitro durch Stimulation mit reinem GP33-Peptid. 5. Ergebnisse 5.7.1 40 Adoptiver Transfer von in vivo aktivierten TCR-tg Zellen In ALB1-tg Mäuse wurden 106 Zellen 3LL-A9GP33/Maus injiziert. Nach Ausbildung eines tastbaren Tumors wurden 1.5x107 in vivo aktivierte TCR-tg CD8+-Zellen in die seitliche Schwanzvene der tumortragenden ALB1-tg Mäuse injiziert. Das Tumorwachstum wurde kontrolliert. Hierbei zeigte sich, dass die ALB1-tg Mäuse in der Lage waren, den Tumor im Verlaufe einer Woche vollständig abzustoßen (Abb.9). Bei denen sich nach einiger Zeit erneut entwickelnden Tumoren handelte es sich um Tumorvarianten, die das GP33-Antigen nicht mehr exprimierten. Dies wurde im Zytotoxozitätstest ermittelt. 140 120 2 Tumorgrösse (mm ) 100 P33 G PG33 T C R -tg Zellen 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Tage nach Tum orzell Injektion Abb. 9: Tumorwachstum von 3LL-A9GP33 in ALB1-tg Mäusen nach adoptivem Transfer von in vivo aktivierten TCR-tg CD8+ T-Zellen. Die Tumorzellen wurden s.c. in die rechte Flanke der Mäuse injiziert. Nach Ausbildung eines vollständigen Tumors wurden die TCR-tg Zellen i.v. injiziert. Das Tumorwachstum wurde über 60 Tage kontrolliert und erneut gewachsene Tumore im 51Cr-Freisetzungstest als GP33- Varianten gemessen. 5.7.2 Adoptiver Transfer von in vitro aktivierten TCR-tg Zellen Durch einen Transfer von in vivo aktivierten TCR-tg Zellen kann nicht ausgeschlossen werden, dass infektiöses Virus mittransferiert wird, welches GP33-spezifische T-Zellen vom Wirt aktiviert und so zu einer Elimination des Tumors führt. Deshalb sollte im nächsten Versuch untersucht werden, ob auch in vitro aktivierte TCR-tg Zellen in der Lage sind, den 3LL-A9GP33 Tumor zur Abstoßung zu bringen. 5. Ergebnisse 41 Hierzu wurden TCR-tg Zellen mit dem GP33-Peptid für drei Tage in vitro stimuliert. Diese wurden anschließend, an Tag 15 nach Tumorzellinjektion, mit einer Zellzahl von 1,5x107 TCR-tg Zellen/Maus in die tumortragenden ALB1-tg Mäuse i.v. injiziert. Daraufhin bildete sich der Tumor in den Mäusen zurück und zwei von vier Mäusen waren in der Lage, den Tumor vollständig zu eliminieren (Abb.10). In den anderen Beiden wuchs der Tumor erneut aus, testete sich im Zytotoxizitäts-Assay als GP33- Variante (nicht gezeigt). 200 180 Tumorgrösse (mm2) 160 TCR-tg Zellen 140 120 GP33- 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 Tage nach Tumorzell Injektion Abb. 10: Tumorwachstum von 3LL-A9GP33 Tumoren in ALB1-tg Mäusen nach adoptivem Transfer von in vitro stimulierten TCR-tg CD8+ T-Zellen (107). Die Tumorzellen (107) wurden s.c. in die rechte Flanke der Mäuse injiziert. Nach Ausbildung eines vollständigen Tumors wurden TCR-tg Zellen i.v. in die seitliche Schwanzvene der Mäuse injiziert. Das Tumorwachstum wurde über 50 Tage kontrolliert und erneut gewachsene Tumore im 51 Cr-Freisetzungstest als GP33- Variante gemessen. 5.8 Adoptiver Transfer von naiven TCR-tg Zellen Die bisher gezeigten Resultate deuten darauf hin, dass 3LL-A9GP33 Tumorzellen in ALB1-tg Mäusen wachsen, weil diese Tiere eine verringerte Anzahl von GP33-spezifischen T-Zellen besitzen. Folglich stellte sich die Frage, ob adoptiv transferierte naive GP33-spezifische TCRtg Zellen eine Tumorabstoßung in ALB1-tg Mäusen vermitteln können. Um diese Frage zu prüfen, wurden an Tag 0 intravenös 107 naive TCR-tg Zellen und anschließend subkutan 107 3LL-A9GP33 Tumorzellen in ALB1-tg Mäuse injiziert. Für den adoptiven Transfer stellte sich heraus das TCR-tg Zellen P14 der Linie 327 am besten geeignet zu sein schienen. 5. Ergebnisse 42 Nach kurzem sichtbar werden eines subkutan wachsendem Tumors wurde dieser in den Mäusen nach 10 – 14 Tagen vollständig abgestoßen (Abb.11). Welche Rolle die GP33-spezifische Vorläuferfrequenz spielt, d.h. wie viele GP33-spezifische Zellen der Host benötigt, damit eine Antwort auf das Antigen stattfinden kann, wurde im nächsten Experiment untersucht. Hierzu wurde die Zellzahl der transgenen Zellen von 107 Zellen/Maus auf 104 Zellen/Maus in dreierschritten austitriert, i.v. injiziert und anschließend subkutan 107 Zellen 3LL-A9GP33 injiziert. Bis zu einer Zellzahl von 104 transferierten Zellen, waren alle Mäuse in der Lage den Tumor vollständig abzustoßen (Abb.11). Bei einer Zellzahl von 3x106 injizierten TCR-tg Zellen (2/6) wuchsen nach 50 Tagen erneut Tumoren aus, die als GP33-- Variante getestet wurden. (Nicht gezeigt). 5. Ergebnisse 43 140 120 100 10 7 TCR-tg Zellen 80 60 40 n=3 20 0 0 10 20 30 40 50 60 20 30 40 50 60 20 30 40 50 60 20 30 40 50 60 140 120 100 10 6 TCR-tg Zellen 80 n=6 40 2 Tumorgrösse (mm ) 60 20 0 0 10 140 120 100 10 5 TCR-tg Zellen 80 60 n=3 40 20 0 0 10 140 120 100 80 10 4 TC R -tg Zellen 60 40 n=3 20 0 0 10 Tage nach Tum orzell Injektion Abb. 11: Tumorwachstum von 3LL-A9GP33 Tumorzellen in ALB1-tg Mäusen nach adoptivem Transfer von 104 – 107 naiven TCR-tg CD8+ T-Zellen. TCR-tg Zellen wurden in titrierter Zellzahl i.v. in die seitliche Schwanzvene der Maus injiziert. Tumorzellen (107) wurden am gleichen Tag s.c. in die rechte Flanke der Maus injiziert. Das Tumorwachstum wurde über 60 Tage kontrolliert. 5. Ergebnisse 44 5.9 Immunhistologie der Tumoren 5.9.1 Infiltration von hämatopoietischen Zellen in 3LL-A9 und 3LL-A9GP33 Tumore Parentale und GP33-transfizierte 3LL-A9 Zellen wachsen in den ALB1-tg Mäusen zu soliden Tumoren aus. Daher ist anzunehmen, das keine Unterschiede in der Infiltration von hämatopoietischen Zellen besteht. Um dieses zu prüfen, wurden die Tumore histologisch auf Infiltration der Immunzellen untersucht. Gefrierschnitte der Tumore wurden mittels Immunhistochemie auf Infiltration von CD4, CD8, CD11b, Gr1 und CD31 angefärbt. In beiden Tumoren zeigte sich im Vergleich eine equivalente Infiltration von CD4+ (Abb.12 A,F) und CD8+ Zellen (Abb.12 B,G). Auch in der Infiltration von CD11b+ und Gr1+ Zellen, durch welche die Population der Granulozyten und Makrophagen angefärbt werden kann, waren histologisch keine Unterschiede darzustellen (Abb.12 C,D,H,I). Die Vaskularisierung der Tumoren, histologisch dargestellt durch den Endothelmarker CD31, zeigte auch hier keine bedeutsamen Unterschiede zwischen den beiden Tumoren (Abb.12 E,J). 5.9.2 Infiltration von transferierten TCR-tg Zellen in 3LL-A9GP33 Tumore Verglichen wurden die oben genannten Tumore mit Gefrierschnitten aus ALB1-tg Mäusen, die einen adoptiven Transfer von naiven TCR-tg Zellen erhielten, mit gleichzeitiger Injektion von 3LL-A9 und 3LL-A9GP33 Tumorzellen. Durch die Beobachtung, dass der transfizierte Tumor nach adoptivem Transfer von TCR-tg T-Zellen in den ALB1-tg Mäusen abgestoßen wird, sollte nachgewiesen werden, ob die Abstoßung durch eine veränderte Infiltration von Immunzellen zu erklären ist. Eine Infiltration von transferierten Zellen in Tumore konnte bisher in anderen Tumormodellen nachgewiesen werden (51, 64). Beide Tumore wurden an Tag 8, 10 und 15 (Tag 15 nur 3LL-A9) aus den Mäusen entfernt und die Gefrierschnitte mit den Ak CD4, CD8, CD11b, Gr1, Thy 1.1 und CD31 angefärbt. Die in den ALB1-tg auswachsende Parentalzellinie zeigte in ihrer Infiltration keine Unterschiede zu den zuvor gefärbten Tumoren ohne Transfer. Auch eine mögliche unspezifische Infiltration von Thy1.1+ Zellen, welche die adoptiv transferierten Zellen darstellen, ließ sich nicht erkennen (Gezeigt nur für Tag 10). Des Weiteren gab es keine Unterschiede in der Vaskularisierung des Tumors (Abb.13+14 A-C) im Vergleich zu den Tumoren ohne adoptiven Transfer. Histologisch ließen sich jedoch bei den transfizierten Tumoren Unterschiede in der Infiltration von Immunzellen darstellen. In einigen Bereichen fiel eine Mehranreicherung von CD4+ Zellen auf (Abb.13 D,G), die bei dem parenteralen Tumor nicht zu finden war (Abb.13 A). 5. Ergebnisse 45 3LL-A9GP33 3LL-A9 A F B G C H D I E J CD4 CD8 CD11b Gr1 CD31 Abb. 12: Immunhistochemische Darstellung von infiltrierenden Zellen in 3LL-A9 und 3LL-A9GP33 Tumoren. Untersucht wurden die histologischen Schnitte mittels mAb auf Infiltration von CD4+ (A;F), CD8+(B,G), CD11b+(C,H) und Gr1+(D,I) Zellen. Zusätzlich wurde in den Tumoren die Ausbildung von Endothel mittles mAb gegen CD31 dargestellt (E,J). 5. Ergebnisse 46 3LL-A9 + TCR-tg 3LL-A9GP33 + TCR-tg Tag 10 Tag 8 Tag 10 A D G B E H C F I CD4 CD8 Thy1.1 Abb. 13: Immunhistochemische Darstellung von 3LL-A9 und 3LL-A9GP33 Tumoren in ALB1-tg Mäusen, denen 8-10 Tage zuvor einen adoptiven Transfer von Thy1.1+ TCR-tg Zellen erhalten haben mit gleichzeitiger s.c. Injektion der Tumorzellen. Die Tumore wurden auf Infiltration von Immunzellen mittels mAb gegen CD4 (A,D,G), CD8 (B,E,H) und Thy1.1 (C,F,I) untersucht. 5. Ergebnisse 47 3LL-A9 + TCR-tg 3LL-A9GP33 + TCR-tg Tag 10 Tag 8 Tag 10 A D G B E H C F I Gr1 CD11b CD31 Abb. 14: Immunhistochemische Darstellung von 3LL-A9 und 3LL-A9GP33 Tumoren in ALB1-tg Mäusen, denen 8-10 Tage zuvor einen adoptiven Transfer von Thy1.1+ TCR-tg Zellen erhalten haben mit gleichzeitiger Injektion von Tumorzellen. Die Tumore wurden auf Infiltration von Immunzellen mittels mAb gegen Gr1 (A,D,G), CD11b (B,E,H) untersucht. Zusätzlich wurde in den Tumoren die Ausbildung von Endothel mittels mAb gegen CD31 untersucht (C,F,I). 5. Ergebnisse 48 Auch eine massive Anreicherung von Gr1+ Zellen und CD11b+ Zellen war vor allem im Randbereich des Tumorgewebes deutlich verstärkt, welches auf eine verstärkte Anreicherung und Infiltration von Granulozyten (Gr1+) und Makrophagen (CD11b+) in das transfizierte Tumorgewebe hindeutet (Abb.14 A,B,D,E,G,H). CD8+ Zellen infiltrierten das Tumorgewebe gleichmäßig und fanden sich im Gegensatz zu den parenteralen Tumoren vermehrt im ganzen Tumorgewebe (Abb.13 B,E,H). Hierbei zeigte sich, dass auch Thy1.1+ Zellen histologisch nachgewiesen werden konnten, die das transfizierte Tumorgewebe infiltrieren. (Abb.13 F,I). Die Anfärbung der Gefrierschnitte mittels CD31 zeigte eine deutlich verringerte Vaskularisierung, vor allem in den zentralen Bereichen des transfizierten Tumors (Abb.14 C,F,I). 5.10 Analyse der TCR-tg Zellen in tumortragenden ALB1-tg Mäusen Naive TCR-tg Zellen können 3LL-A9GP33 Tumorzellen eliminieren. Die transferierten TCR-tg Zellen müssen durch Tumorzellen, z.B. via APC, aktiviert werden. Bei Aktivierung von Zellen des Immunsystems kommt es zur Änderung von oberflächenspezifischen Molekülen. Doch können aktivierte TCR-tg Zellen im Verlaufe der Immunantwort auf 3LL-A9GP33 Tumorzellen nachgewiesen werden? Im nächsten Experiment wurde untersucht, ob es in den tumortragenden Mäusen zu einer Änderung der Zelloberflächenmoleküle kommt. Hierzu wurden den Tieren an Tag 4, 8, 15 und 22 Blut aus der Schwanzvene entnommen und mit Antikörpern angefärbt. CD8 – Thy1.1 doppeltpositive Zellen stellen die, in die ALB1-tg Mäuse, transferierten TCR-tg Zellen dar. Diese Population wurde auf Proliferation und die Änderung der Expression von CD25, CD44 und Ly6c untersucht. Jedoch zeigte sich keiner der untersuchten Populationen während der Generierung der Immunantwort auf den injizierten Tumor eine Änderung der untersuchten Oberflächenmoleküle. Weder die Anzahl der transferierten CD8+-Zellen, noch die Expression von CD25, CD44, oder Ly6c änderte sich im Verlauf der Antwort. Gezeigt werden die Ergebnisse nur für Tag 4 und Tag 8 nach Transfer (Abb.15+16). 5. Ergebnisse 49 Tag 4 nach Transfer Mit Tumor Ohne Tumor Tag 8 nach Transfer Ohne Tumor Mit Tumor CD25 CD44 Ly6c Thy1.1 Thy1.1 Abb. 15: Durchflusszytometrische Analyse Thy1.1+ CD8+ TCR-tg T-Zellen mittels mAb auf die Expression von Oberflächenmolekülen CD25, CD44 und Ly6c. An Tag 4 und 8 nach adoptivem Transfer wurden PBL aus dem Blut von tumortragenden ALB1-tg Mäusen und nicht tumortragenden ALB1-tg Mäusen isoliert. 2 Tumorgrösse (mm ) + % TCR-tg von CD8 in PBL 5. Ergebnisse 50 15 ALB1-tg + TCR-tg Zellen + 3LL-A9GP33 ALB1-tg + TCR-tg Zellen 10 5 0 TCR-tg Zellen + 3LL-A9GP33 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 Tage nach Transfer Abb. 16: Darstellung der Prozentzahl adoptiv transferierter TCR-tg CD8+ T-Zellen in Bezug auf die Gesamtzzahl CD8+ T-Zellen aus tumortragenden ALB1-tg Mäusen. Dies ist in Vergleich gesetzt zur Tumorgröße in den tumortragenden ALB1-tg Tieren. Als Kontrolle dienten nichttumortragende ALB1-tg Mäuse denen zuvor ebenfalls TCR-tg Zellen adoptiv transferiert wurden. 5. Ergebnisse 51 5.11 TNF als Effektormolekül TNF spielt bei der Abstoßung von 3LL-A9GP33 Tumoren in B6 eine entscheidende Rolle. TNF-defiziente B6 Mäuse sind nicht in der Lage 3LL-A9GP33 Tumorzellen zu eliminieren (78). TNF als Effektormolekül kann von verschiedenen Zellen des Immunsystems im Verlaufe einer Immunantwort generiert und sezerniert werden. Da nicht bekannt ist, welche Zellen des Immunsystems, CD8+, Makrophagen, Granulozyten oder NK-Zellen das für die Abstoßung des 3LL-A9GP33 Tumors benötigte TNF sezernieren, wurde in einem Transferexperiment 3x106 naive TNF defiziente TCR-tg Zellen in ALB1-tg Mäuse transferiert und zum gleichen Zeitpunkt in die Mäuse 1x107 Zellen A9GP33/Maus subkutan injiziert. Die Mäuse wurden auf Wachstum eines Tumors kontrolliert. Der sich beginnend nach 8 Tagen sichtbar werdende Tumor wird, wie auch im Experiment mit nicht für TNF defizienten transferierten TCR-tg Zellen, vollständig abgestoßen und ist nach ca. 14 Tagen nicht mehr sichtbar (Abb.17). Hieraus scheint sich zu ergeben, dass TNF als Effektormolekül der transferierten naiven TCR-tg Zellen keine entscheidende Bedeutung in der Elimination eines etablierten Tumors 3LL-A9GP33 besitzt. 140 2 Tumorgrösse (mm ) 120 100 80 TCR-tg TNF-/- 60 40 n=3 20 0 0 10 20 30 40 50 Tage nach Tumorzell Injektion Abb. 17: Tumorwachstum von 3LL-A9GP33 Tumorzellen in ALB1-tg Mäusen nach adoptivem Transfer von naiven TCR-tg TNF-/- CD8+ T-Zellen (3x106). Die TCR-tg Zellen wurden i.v. in die seitliche Schwanzvene der Mäuse injiziert. Tumorzellen (107) wurden am gleichen Tag s.c. in die rechte Flanke der Mäuse injiziert. Das Tumorwachstum wurde über 50 Tage kontolliert. 5. Ergebnisse 52 5.12 IFN-γ als Effektormolekül Wie in der Vergangenheit gezeigt generieren B6 IFN-γ defiziente Mäuse nach Injektion von 3LL-A9GP33 einen vollständigen Tumor, der jedoch als GP33- Variante getestet wird (78) . Welche Rolle IFN-γ bei der Abwehr von 3LL-A9GP33 spielt, sprich welche Zellen IFN-γ sezernieren, sollte im folgenden Transferexperiment untersucht werden. 3x106 naive TCR-tg IFN-γ-/- Zellen wurden ALB1-tg Mäuse transferiert, die zum gleichen Zeitpunkt subkutan 107 3LL-A9GP33 Zellen/Maus injiziert bekamen. Das Tumorwachstum wurde über die folgenden Wochen überprüft. Eine von Vier Mäusen war in der Lage den Tumor vollständig abzustoßen, in drei weiteren Tieren entwickelte sich nach einiger Zeit ein neuer Tumor, der im Zytotoxizitätstest als GP33- Variante getestet wurde (nicht gezeigt) (Abb.18). Wie im vorherigen Experiment mit TNF defizienten TCR-tg Zellen scheint auch IFN-γ der TCR-tg Zellen keine Bedeutung in der Elimination eines etablierten Tumors 3LL-A9GP33 zu besitzen. 140 2 Tumorgrösse (mm ) 120 GP33 - 100 80 TCR-tg IFN-g-/- 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Tage nach Tumorzell Injektion Abb. 18: Tumorwachstum von 3LL-A9GP33 Tumorzellen in ALB1-tg Mäusen nach adoptivem Transfer von naiven TCR-tg IFN-γ -/- CD8+ T-Zellen (3x106). Die TCR-tg Zellen wurden i.v. in die seitliche Schwanzvene der Mäuse injiziert. Tumorzellen (107) wurden am gleichen Tag s.c. in die rechte Flanke der Mäuse injiziert. Das Tumorwachstum wurde über 60 Tage kontrolliert. 6. Diskussion 53 6. Diskussion Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Wachstum des 3LL-A9GP33 Tumors in ALB1-tg Mäusen zu untersuchen. Es galt zu klären, welche Voraussetzungen in dem ALB1 Mausmodell erfüllt sein müssen, damit ein Wachstum von transformierten 3LL-A9GP33 Tumorzellen verhindert werden kann. Die besonderen Ausgangsbedingungen durch bestehende Toleranzmechanismen gegenüber dem GP33-Antigen, die in den ALB1-tg Mäusen vorherrschen, wurden erstmals von Voehringer et al. beschrieben (112). Versuche von Prévost-Blondel et al. zeigen die CD8+ T-Zell vermittelte Tumorabwehr des 3LL-A9GP33 in B6 Mäusen. Es wurde gezeigt, dass die Abstoßung abhängig von TNF und in einem geringeren Maße auch von IFN-γ ist (78). 6.1 Induktion von GP33-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten Während einer akuten Infektion von B6 Mäusen (H-2b) mit dem LCMV kommt es zur Induktion von LCMV spezifischen CTL (35). Dabei spielen besonders die H-2Db-restringierten Peptide GP 33-41 und NP 396-404 eine bedeutende Rolle. Die Elimination von virusinfizierten Zellen wird durch spezifische CD8+ T-Zellen vermittelt. Im Vergleich dazu führt eine LCMV Infektion in H8-tg Mäusen nicht zur Ausbildung von GP33-spezifischen CTL. Hier wird die Viruselimination überwiegend durch NP396 spezifische T-Zellen vermittelt, da in H8-tg Mäusen Zentrale Toleranzmechanismen vorliegen und es nicht zur Induktion von GP33-spezifischen T-Lymphozyten kommt (26) . Voehringer et al. konnten zeigen, dass in ALB1-tg Mäusen eine partielle Toleranz gegenüber dem GP33-Antigen besteht, welches auf den Hepatozyten und im Thymus exprimiert wird. Die partielle Toleranz wird durch inkomplette zentrale Deletion GP33-spezifischer T-Zellen vermittelt, die aus der verminderten thymischen Expression des GP33 Antigens resultiert starkes CD8-spezifisches Epitop des LCMV (112) . Das GP33 ist ein (75) . Wie sich die Effektorfunktion von GP33- spezifischen T-Lymphozyten aus den ALB1-tg Mäusen darstellt, wurde im Zytotoxizitätstest ermittelt. Dabei zeigte sich, dass die spezifische Lyse GP33-exprimierender Tumorzellen durch CTL aus ALB1-tg Mäusen 8 Tage nach LCMV-Infektion im Vergleich zu Effektorzellen aus B6 Mäusen reduziert ist (Abb.1). Die Ergebnisse zeigen, dass in ALB1-tg Mäusen eine spezifische Immunantwort gegenüber dem GP33 induziert werden kann. Diese ist jedoch reduziert, kann aber bei ausreichender Stimulation mit dem GP33-Peptid generiert werden. Auch in anderen Toleranzmodellen konnten ähnliche Ergebnisse beobachtet werden, 6. Diskussion 54 bei denen diese durch eine Virusinfektion gebrochen werden kann, bzw. spezifische CTL induziert wurden (24, 69). Es gibt mehrere Möglichkeiten warum es hier zu einer verminderten Lyse der Zielzellen kommt. Die verminderte Lyse GP33-tragender Zielzellen könnte einerseits durch eine reduzierte Anzahl GP33-spezifischer T-Lymphozyten in den ALB1-tg Mäusen zustande kommen. Somit wäre die Anzahl von CTL nach spezifischer Stimulation geringer ausgeprägt, als in B6 Mäusen. Aber auch eine reduzierte Aktivität der CTL könnte für eine verminderte Lyse im Zytotoxizitätstest verantwortlich sein. Diese könnte durch eine geringere Affinität des TCR zum MHC-Klasse I Komplex der Zielzelle erklärt werden. Um dies zu klären, wurden CD8+ T-Lymphozyten mittels GP33/Db-Tetramer angefärbt. Hierbei zeigte sich eine bis zu 3-5fach verminderte Anzahl GP33 spezifischer CTL in den ALB1-tg Mäusen (Abb.2 und 3). Dennoch konnte keine verminderte Affinität der CTL aus B6- und ALB1-tg Mäusen gegenüber den GP33/Db Tetrameren festgestellt werden. Sie weisen gleiche mittlere Fluoreszenzraten in der FACS Analyse auf (Daten nicht gezeigt). Die reduzierte Anzahl spezifischer CTL konnte demnach als Folge einer partiellen zentralen Deletion der T-Zellen angesehen werden. Wichtig für die Generation einer Immunantwort ist die absolute Anzahl von T-Lymphozyten in einer Maus, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind. Sie spielt eine entscheidende Rolle bei der Erkennung und Elimination von den für sie spezifischen Antigenen. Sie wird als Vorläuferfrequenz bezeichnet. Blattmann et al. konnten zeigen, dass eine naive B6 Maus ca. 100-200 naive GP33-spezifische CD8+ T-Lymphozyten besitzt. Die Anzahl steigt im Rahmen einer akuten Infektion mit dem LCMV innerhalb von einer Woche auf eine Anzahl von ungefähr 107 GP33-spezifischer CTL/Maus an. Im Anschluss an die Infektion fällt die Anzahl auf ungefähr 5x105 GP33-spezifischer CTL/Maus ab, die Gedächtnis-Zellen in verbleiben (10). Wie in Abb.4 gezeigt kommt es bei ALB1-tg Mäusen nach einer akuten Infektion mit dem LCMV zur Ausbildung von Gedächtniszellen. Diese sind in der Lage adoptiv transferierte GP33-exprimierende Milzzellen aus H8-tg Mäusen abzustoßen. ALB1-tg Mäuse sind also wie B6 Mäuse in der Lage, GP33-spezifische CTL im Verlaufe einer LCMV-Infektion auszubilden, die schließlich zu Gedächtniszellen differenzieren. Die Anzahl ist in ALB1-tg Mäusen im Vergleich zu B6 Mäusen reduziert. Dies steht im Gegensatz zu den H8-tg Mäusen, bei denen eine vollständige Toleranz gegenüber dem GP33 ausgebildet ist (26) . Diese Eigenschaften sind bei den ALB1-tg Mäusen interessant für die Untersuchung der Immunabwehr des 3LL-A9GP33 Tumors. Die Injektion von GP33-tragenden Tumorzellen in ALB1-tg Mäuse, die eine partielle Toleranz gegenüber dem GP33 aufweisen, 6. Diskussion 55 liefert Untersuchungsbedingungen, wie sie häufig in der Pathogenese der Tumorentwicklung vorkommt. Häufig entstehen Tumoren aus einem entarteten Gewebe, welches Selbstantigene exprimiert und somit der eigenen Immunabwehr aufgrund von Toleranzmechanismen entgeht. 6.2 Wachstum von 3LL-A9GP33 Tumoren Prévost-Blondel et al. konnten zeigen das der 3LL-A9GP33 nach s.c. Injektion in B6 Mäusen nach ca. 14 Tagen vollständig abgestoßen wird. Diese Abstoßung wird durch CD8+ T-Zellen vermittelt. Nach Injektion von 3LL-A9GP33 Tumorzellen in H8-tg Mäuse kommt es in Folge von vollständiger GP33 Toleranz zum Auswachsen eines soliden Tumors (78). Wie das Wachstumsverhalten des 3LL-A9GP33 Tumors in ALB1-tg Mäusen bei vorhandener partieller Toleranz der GP33-spezifischen T-Lymphozyten ist wurde durch subkutan injizierte Tumorzellen des 3LL-A9GP33 in naiven ALB1-tg Mäusen getestet. Es zeigte sich, dass sie wie in den H8-tg Mäusen ebenfalls zu soliden Tumoren auswachsen (Abb.5). Im Vergleich dazu kommt es bei zuvor LCMV-immunisierten ALB1-tg Mäusen nicht zum Auswachsen eines soliden Tumors (Abb.6). Die endogene Vorläuferfrequenz GP33-spezifischer T-Lymphozyten ist in naiven ALB1-tg Mäusen reduziert. Durch eine LCMV-Infektion mit anschließender Ausbildung von Gedächtniszellen wird die Vorläuferfrequenz GP33-spezifischer TLymphozyten erhöht (10). Dies könnte erklären, warum es in den LCMV-immunisierten Tieren zu einer vermittelten Tumorabwehr kommt. Ähnliche Ergebnisse wurden von unserer Arbeitsgruppe mit einem anderen Tumormodell, dem MCA102GP33 Fibrosarkom, gezeigt (11) . Warum die Injektion von Tumorzellen in naive ALB1-tg Mäuse im Gegensatz zu B6 Mäusen nicht ausreicht die Tumorabstoßung auszulösen ist unklar. Möglichkeiten des Tumors die Immunabwehr zu umgehen, sind vielfach beschrieben worden. Hierbei kann u.a. die Wachstumskinetik der Tumorzelle eine Rolle spielen, d.h. das Wachstum der Tumorzelle ist stärker und schneller als die Induktion der CTLs und die vermittelte Abstoßung (19, 47) . Um dies in unserem Modell auszuschließen, wurden Titrationsreihen der zu injizierenden Tumorzellanzahl von 105 bis 107 Tumorzellen/Maus angefertigt. Hierbei zeigten sich keine Unterschiede im Wachstum oder der Elimination von Tumorzellen in den ALB1-tg Mäusen in Bezug auf die injizierte Tumorzellzahl (Tab.1 und 2). Somit sind Unterschiede zwischen der Wachstumskinetik und der T-Zell vermittelten Tumorabwehr auszuschließen. Als weitere Ursache fortschreitenden Tumorwachstums könnte die fehlende Generierung einer T-Zell Antwort ursächlich sein. Bei Anfärbung von PBL aus tumortragenden Mäusen mittels GP33/Db-Tetramer waren keine spezifischen CTL zu detektieren (Daten nicht gezeigt). Auch beim adoptiven Transfer von CFSE gefärbten GP33-exprimierenden H8-tg Milzzellen wurden 6. Diskussion 56 diese nicht abgestoßen (Abb.7). Somit bleibt eine Aktivierung endogener GP33-spezifischer CTL in tumortragenden ALB1-tg Mäusen aus und liefert damit die Erklärung für das Auswachsen eines soliden Tumors. Es ist beschrieben, dass tumorzellumgebendes Stroma die effektive Aktivierung von tumorspezifischen T-Lymphozyten verhindern kann. Die Immunzellen sind nicht in der Lage das Tumorgewebe zu infiltrieren und umgehen somit einer lokalen Aktivierung Mechanismen wie Toleranz-Induktion, MHC-Klasse I Herabregulierung (11) (94) . Andere oder im Tumor entstandene lösliche Moleküle wie z.B. TGF-β, werden beschrieben, die Entstehung einer Immunantwort zu verhindern (38, 42, 100) . Wick et al. machten die Beobachtung das selbst in TCR-tg Mäusen, die spezifisch für ein MHC-Klasse I restringiertes Peptid Ld sind, es zum Auswachsen eines Ld exprimierenden Fibrosarkoms kommt. Die hierbei generierte Immunantwort ist nicht in der Lage den Tumor zu eliminieren. Transplantiert man jedoch LdPeptid präsentierende Haut in die tumortragenden Tiere, infiltrieren die durch den Tumor induzierten CTL die Haut und es kommt zur Abstoßung der Hauttransplantate. Das Tumorgewebe bleibt hierbei völlig unbetroffen (115). Die Schwierigkeiten bestehen also darin, selbst wenn es zur Induktion von tumorspezifischen CTL kommt, diese auch an den Ort des etablierten Tumors zu bringen und sie gegebenenfalls im Tumorgewebe zu aktivieren. 6.3 Möglichkeiten den etablierten 3LL-A9GP33 Tumor zu eliminieren 6.3.1 Virusinfektion tumortragender ALB1-tg Mäusen reduziert Tumorwachstum Da die meisten Tumore nicht vom Immunsystem als fremd erkannt werden, muss versucht werden immunmodulatorisch Einfluss auf das Wachstum zu nehmen. Mit Hilfe einer Virusinfektion können endogene Ag spezifische CTL induziert werden, die nach Aktivierung zur Tumorzellelimination führen (59) . Aktivierte endogene GP33-spezifische T-Zellen sind nach s.c. Injektion von Tumorzellen des 3LL-A9GP33 im peripheren Blut nicht nachweisbar und es kommt zum Auswachsen eines soliden Tumors (s.o.). Es wurden 2-3 Wochen nach Anwachsen von subkutan injizierten 3LL-A9GP33 Tumorzellen in ALB1-tg Mäusen die Tiere mit LCMV i.v. infiziert. Dabei zeigte sich anfangs, dass es im Verlaufe der Infektion zur Reduktion der Tumormasse kam. Im weiteren Verlauf kam es zum Auswachsen von GP33negativen Tumorvarianten (Abb.8). Möglicherweise entstehen durch das schon fortgeschrittene Tumorzellwachstum, bei einer hohen Anzahl von Zellteilungen der Tumorzellen, Ag-Verlust Varianten (GP33 negativ) des Tumors. Sie könnten dann nicht mehr von GP33-spezifischen CTL erkannt werden, entgehen dem Immunsystem und es resultiert 6. Diskussion 57 die Ausbildung eines GP33-negativen Tumors. Die Ergebnisse zeigen, dass GP33-spezifische CTL durch die LCMV Infektion induziert werden. Sie sind sogar in der Lage bei einem schon bestehenden und organisiertem Tumor, GP33-exprimierende Tumorzellen zu eliminieren. Blohm et al. konnten erst kürzlich in einem Modell mit einem GP33-transfizierten MCA102 Fibrosarkom (MCA102GP33) ähnliche Ergebnisse nachweisen. Es besteht die Möglichkeit, dass hierbei zusätzliche Faktoren, die durch die Virusinfektion ausgelöst werden, zur Hilfe kommen. Induzierte CD4+ T-Zellen oder aktivierte APC könnten hilfreich bei der Tumorzellelimination sein (11). 6.3.2 Adoptiver Transfer von aktivierten TCR-tg Zellen in tumortragende ALB1-tg Mäuse reduziert Tumorwachstum Durch adoptiven Transfer können Ag spezifische T-Lymphozyten verabreicht werden, die zur erfolgreichen Elimination oder Reduktion von Tumoren führen. Dies konnte bereits mehrfach gezeigt werden (19, 47, 61, 85) . Eine Möglichkeit den etablierten 3LL-A9GP33 Tumor zu eliminieren, könnte also durch die Verabreichung von GP33-spezifischen T-Zellen erreicht werden. Wie in einem anderen Tumormodell mit B16GP33 Melanomzellen, die ebenfalls das GP33-Antigen exprimieren, wurde von unserer Arbeitsgruppe nachgewiesen, dass es durch adoptiv transferierte TCR-tg T-Zellen zur Reduktion der Tumormasse kommt (77) . Durch den adoptiven Transfer von in vivo oder in vitro stimulierten TCR-tg Zellen würden bereits aktivierte GP33-spezifische CTL in die tumortragenden Mäuse transferiert, die anschließend das Tumorgewebe infiltrieren könnten und zur Reduktion der Tumormasse führen könnten. Diese Annahme bestätigte sich sowohl für in vivo als auch für in vitro aktivierte T-Zellen (Abb.9 und 10). Auch hierbei zeigte sich, wie auch nach Virusexposition tumortragender ALB1-tg Mäuse, nach anfänglicher Reduktion der Tumormasse in einigen Tieren das Auswachsen einer GP33-negativen Tumorvariante. Es machte keinen Unterschied, ob es sich um in vivo oder in vitro aktivierte TCR-tg Zellen handelte. Offensichtlich ist bei beiden Stimulationsmöglichkeiten die Aktivierung stark genug, um eine erfolgreiche Tumorzellabwehr zu vermitteln. 6.3.3 Adoptiver Transfer von naiven TCR-tg Zellen in ALB1-tg Mäuse schützt vor Tumorzellwachstum Die Eradikation des bestehenden Tumors durch Induktion einer ausreichend starken Immunantwort mittels Virusinfektion konnte gezeigt werden (Abb. 8). Auch die Eradikation des bestehenden Tumors durch adoptiven Transfer von aktivierten TCR-tg T-Zellen war 6. Diskussion 58 erfolgreich (Abb.9 und 10). Bei der Tumorelimination durch adoptiven Transfer von in vivo aktivierten TCR-tg T-Zellen kann der Verdacht geäußert werden, dass durch die in vivo Aktivierung der T-Zellen und den anschließenden adoptiven Transfer unvermeidbar Viruspartikel in die tumortragenden Tiere mittransferiert wird, die zur weiteren Aktivierung der spezifischen T-Zellen führen könnten. Um dieses Argument zu entkräften, wurden in vitro aktivierte TCR-tg T-Zellen adoptiv transferiert. Doch bei i.v. Injektion dieser Zellen kann auch hier der Verdacht geäußert werden, dass ungewollt Ag mittransferiert wird, welches das Immunsystem weiter stimuliert und dies zur spezifischen Tumorabwehr durch die endogenen CD8+ T-Zellen führt. Um die genannten Argumente gänzlich auszuschließen, wurden naive TCR-tg T-Zellen gleichzeitig mit s.c. Injektion von 3LL-A9GP33 Tumorzellen transferiert. Hierdurch wurde der Transfer von stimulierendem Ag vermieden. Es kam nicht zur Ausbildung eines soliden Tumors. Folglich reichen adoptiv transferierte naive TCR-tg TZellen aus, um das Tumorwachstum des 3LL-A9GP33 zu verhindern (Abb.11). Ob es allerdings ausreichen würde naive TCR-tg T-Zellen in Tiere mit bereits bestehendem Tumor zu injizieren und damit das Tumorwachstum zu reduzieren, müsste in weiteren Versuchen untersucht werden. Untersuchungen von Singh et al. zeigen, dass Tumoren, die bereits organisiert sind und in Stücken verpflanzt werden deutlich schlechter abgestoßen werden als injizierte Zellsuspensionen von Tumorzellen, in denen noch keine Organisation stattgefunden hat (94). Hanson et al. konnten zeigen, dass die Tumorabwehr davon abhängig ist, wie hoch die Anzahl an adoptiv transferierten TCR-tg T-Zellen ist, die in die tumortragenden Tiere injiziert werden. Für die Abstoßung ist des Weiteren entscheidend wie weit das Tumorwachstum in den Tieren schon fortgeschritten ist (47) . Dies steht in Kontrast zu Untersuchungen von Cordaro et al., die zeigten, dass die Abstoßungsreaktion gegen einen Tumor wesentlich von dem bereits stattgefundenen Tumorwachstum und der Tumormasse abhängt. In ihren Experimenten wurden bereits etablierte Tumore besser abgestoßen, im Gegensatz zu kleinen noch nicht formierten Tumoren (19) . Diese Unterschiede könnten allerdings in einer geringer ausgeprägten Antigenpräsentation der Tumorzelle liegen und daraus eine verspätete Aktivierung der TCR-tg T-Zellen resultieren. 6.4 Erhöhung der Vorläuferfrequenz tumorspezifischer T-Zellen führt zur Tumorzellelimination Wenn die vermittelte Tumorabwehr abhängig ist von der Vorläuferfrequenz der Agspezifischen T-Zellen, könnte durch adoptiven Transfer von naiven TCR-tg T-Zellen die Anzahl der Ag-spezifischen T-Zellen der Maus erhöht werden. Diese Annahme würde auch 6. Diskussion 59 zu der Beobachtung von Hanson et al. passen, dass die vermittelte Tumorabwehr von der Anzahl der injizierten TCR-tg T-Zellen abhängig ist (47) . Es wurde gezeigt, dass sich die endogenen T-Zellen in ihrer Eigenschaft nicht von den TCR-tg-Zellen aus TCR-tg Mäusen unterscheiden (10). Wie oben beschrieben, ist die Anzahl der GP33-spezifischen Effektorzellen nach LCMV-Infektion in den ALB1-tg Mäusen im Vergleich zu B6 Mäusen auf ein Drittel reduziert, welches in der Anfärbung der CD8+ T-Zellen mittels GP33/Db-Tetramer gezeigt wurde (Abb.2 und 3). Dies könnte darauf hinweisen, dass die Vorläuferfrequenz von GP33spezifischen T-Zellen in den ALB1-tg Mäusen auch um ein Drittel vermindert ist. Ausgehend von der Annahme, dass eine B6 Maus 100-200 GP33-spezifische T-Zellen besitzt, könnte folglich die Anzahl der GP33-spezifischen T-Zellen der ALB1-tg Mäuse bei einem Drittel im Vergleich zu B6 Mäusen liegen. Somit besäßen ALB1-tg Mäuse nur ca. 30-60 GP33spezifische T-Zellen. Die Anzahl der adoptiv transferierten T-Zellen wurde von 107 Zellen/Maus immer weiter reduziert, bis zu einer Zellzahl von 104 CD8+ TCR-tg Zellen. In allen Fällen wurden die 3LLA9GP33 Tumorzellen nach kurzem Anwachsen eines sichtbaren und palpablen Tumors erfolgreich eliminiert (Abb.11). Hierdurch wurde die Anzahl von GP33-spezifischen T-Zellen um mindestens das 100-fache im Vergleich zu einer naiven ALB1-tg Maus erhöht. Somit führt eine Erhöhung der Vorläuferfrequenz in den ALB1-tg Mäusen zur erfolgreichen Elimination des 3LL-A9GP33 Tumors. Um weitere Rückschlüsse auf die Mindestanzahl der benötigten endogenen TCR-tg T-Zellen zu schließen, müsste die Anzahl der adoptiv transferierten T-Zellen noch weiter verringert werden. Wenn ihre Eigenschaft den B6 Mäusen entsprechen würde, deren Vorläuferfrequenz bei 100-200 GP33-spezifischen T-Zellen liegt, müsste eine Anzahl von 102 adoptiv transferierten T-Zellen ausreichen, den 3LL-A9GP33 vollständig zu eliminieren. Dies bleibt in weiteren Experimenten zu untersuchen. 6.5 Mechanismen der T-Zell vermittelten Tumorabwehr 6.5.1 Infiltration von TCR-tg T-Zellen führt zur Tumorzellelimination Sowohl der Parentale 3LL-A9 Tumor als auch der transfizierte 3LL-A9GP33 weisen in der Histologie ein ähnliches Infiltrationsmuster hämatopoietischer Zellen des unspezifischen Immunsystems auf. Es findet sich eine mäßige Infiltration von CD11b+ und Gr1+ Zellen (Abb.12 C,D,H,I). Das Ag Gr1 ist charakteristisch für Granulozyten (31), das Ag CD11b zählt zu den Integrinen und wird überwiegend auf Leukozyten der myeloiden Linie exprimiert. Es dient der Charakterisierung von Makrophagen (97) . Des weiteren findet sich eine nur geringe 6. Diskussion 60 Infiltration von CD4+ und CD8+ T-Zellen in den Tumoren (Abb.12 A,B,F,G). Die Infiltration von CD4+ und CD8+ T-Zellen scheint unspezifisch zu sein, da im Blut der tumortragenden Tiere keine aktivierten PBL nachweisbar sind (Daten nicht gezeigt) und es auch nicht zur Abstoßung von GP33-exprimierenden H8tg Milzzellen kommt (Abb.7). Diese Beobachtung würde mit dem progredienten Tumorwachstum beider Zelllinien in den ALB1-tg Mäusen übereinstimmen und die Erkenntnis unterstreichen, dass der 3LL-A9GP33 Tumor nicht in der Lage ist, eine protektive Immunantwort in naiven ALB1-tg Mäusen zu induzieren. Die Infiltration liefe folglich im Rahmen einer unspezifischen Entzündungsreaktion ab (87). Eine zweite Möglichkeit das Infiltrationsmuster zu erklären, bestünde in einer spezifischen Infiltration von T-Lymphozyten (Tumor infiltrierende Lymphozyten = TIL), die jedoch nur im Tumor selber einen aktivierten Phänotyp aufweisen würden und als aktivierte CTL im Tumor verbleiben und nur dort wirken (51, 64) . Diese Hypothese könnte ebenfalls durch den fehlenden Nachweis von aktivierten T-Zellen in den PBL und die fehlende Abstoßung GP33exprimierender H8-tg Milzzellen zu erklären sein. Um die Hypothese zu bekräftigen müssten hierzu allerdings TIL aus den tumortragenden Tieren isoliert werden und mittels FACSAnalyse untersucht werden. Warum es in diesem Falle nicht zur Elimination des Tumors kommen würde, ließe sich durch Unterschiede in der Kinetik zwischen Tumorwachstum und T-Zell Aktivierung erklären (67). Im Gegensatz zu den histologischen Untersuchungen der tumortragenden ALB1-tg Mäuse stehen die Beobachtungen für die Tiere, denen zusätzlich zur Tumorzellinjektion TCR-tg Zellen adoptiv transferiert wurden. Es unterschieden sich die Infiltrationsmuster zwischen den Tieren mit Parentalzelltumor und den Tieren, denen der transfizierte 3LL-A9GP33 injiziert wurde. Bei Letzteren war eine deutlich verstärkte Infiltration von Granulozyten (Gr1+) und Makrophagen (CD11b+) zu erkennen (Abb.14 D,E,G,H). Des weiteren fand sich eine verstärkte Infiltration von CD4+ und CD8+ Zellen(Abb.13 D,E,G,H). Gleichzeitig fand sich eine Infiltration von Thy1.1+ TCR-tg Zellen (Abb.13 F,I). Sie bilden einen Saum um nekrotisches Tumorgewebe herum und infiltrierten vermehrt in den Bereichen mit noch existentem vitalem Tumorgewebe. In den Mäusen mit Parentalzelltumor konnte weder eine so ausgeprägte Infiltration von Granulozyten und Makrophagen (Abb.14 A,B), noch eine verstärkte Infiltration von CD4+ und CD8+ T-Zellen beobachtet werden (Abb.13 A,B). Eine Infiltration von Thy1.1+ TCR-tg Zellen ließ sich nicht beobachten (Abb.13 C). Dies spricht für eine spezifische Infiltration der adoptiv transferierten TCR-tg Zellen in den 3LL-A9GP33 Tumor. Die starke Infiltration von Makrophagen in die Tumormasse könnte auf die spezifische Infiltration von TCR-tg T-Zellen zurückzuführen sein, da sie nur in den 3LL- 6. Diskussion 61 A9GP33 tragenden Tieren beobachtet wurde. Die T-Zellen könnten in Folge der spezifischen Aktivierung vermehrt chemotaktisch wirkende Zytokine sezernieren und hierdurch verstärkt Makrophagen in das entartete Gewebe locken. Zu diesen Chemokinen zählen z.B. MIP-1α und -1β (macrophage inflammatory protein-1α und -1β) sowie MCP-1 (macrophage chemoattractant protein-1 (18, 87). Die Bedeutung der Makrophagen in der Tumorabwehr wurde mehrfach beschrieben. Eine Möglichkeit besteht in der direkten Effektorfunktion, die durch die Makrophagen vermittelt werden könnte (58) . Sie könnten ihre Effektorfunktion über sezerniertes NO (Stickstoffmonoxid) oder sezerniertens TNF direkt ausführen (55) . Des Weiteren könnten sie Zell zu Zell Kontakte mit CD8+ T-Zellen eingehen. Sie sezernieren IL12 und stimulieren somit die Synthese von IFN-γ durch T-Zellen oder NK-Zellen, welches direkte Effekte auf das Tumorwachstum besitzen könnte (63, 70, 93, 95). 6.5.2 Einfluss von IFN-γ und TNF der TCR-tg Zellen auf das Tumorzellwachstum Die Bedeutung von IFN-γ auf das Tumorzellwachstum ist vielseitig. Es inhibiert das Tumorzellwachstum durch direkte zytotoxische Wirkung zusammen mit TNF (33, 116) . Es steigert die MHC-Expression und erhöht dadurch die Ag-Präsentation von TAA mit folgender vermehrter Tumorzellerkennung und –elimination (25) . Des Weiteren besitzt es eine wesentliche Bedeutung in der Angiogeneseinhibition durch direkten und indirekten Einfluß auf hematopoietische- und nichthematopoietische Zellen im Tumorgewebe (6, 20, 80). Es konnte gezeigt werden, dass IFN-γ hauptsächlich von CD4+- und CD8+ T-Zellen, sowie von NKZellen sezerniert wird (5, 12) . Prévost-Blondel et al. konnten zeigen, dass IFN-γ bei der Eliminierung von 3LL-A9GP33 Tumoren in B6 Mäusen keinen Hauptmechanismus in der Tumorzelllyse darstellt (78) . Die Bedeutung von IFN-γ der TCR-tg Zellen im adoptiven Transferexperiment zeigte, dass auch in den ALB1-tg Mäusen eine Reduktion des Tumorzellwachstums resultierte (Abb.18). Hieraus könnte gefolgert werden, dass dem IFN-γ der TCR-tg Zellen in diesem Falle keine wesentliche Bedeutung zukommt. Die anschließend auswachsenden Tumoren in den Tieren wurden als GP33-negative Tumorvarianten getestet (Daten nicht gezeigt). Es bleibt jedoch die Frage offen, ob es Unterschiede in der Vaskularisation zwischen den histologischen Schnitten von 3LL-A9GP33 Tumoren in ALB1-tg Mäusen mit adoptivem Transfer von IFN-γ defizienten und IFN-γ kompetenten TCR-tg Zellen gäbe. Dieses wäre zu erwarten, wenn sezerniertes IFN-γ aus CD8+ T-Zellen, wie von Qin et al. beobachtet, auch hier einen inhibierenden Einfluß auf die Angiogenese hätte (Qin Z et al., Tumor rejection by CD8+ T cells involves IFNγ-mediated anti-angiogenesis, 2002, eingereicht). Dies bleibt in nachfolgenden Experimenten zu untersuchen. 6. Diskussion 62 Prévost-Blondel et al. konnten weiterhin zeigen, dass die Tumorzellelimination von 3LLA9GP33 Tumoren in B6 Mäusen abhängig ist von sezerniertem oder membrangebundenen TNF (78) . Um zu klären, ob das benötigte TNF von GP33-spezifischen CD8+ T-Zellen sezerniert würde, wurden die Transferexperimente mit TNF defizienten TCR-tg Zellen durchgeführt. Die hierbei gemachte Beobachtung, dass alle Tiere erfolgreich die Abstoßung der 3LL-A9GP33 Tumorzellen vermitteln können (Abb.17), weist darauf hin, dass dem TNF aus den adoptiv transferierten Zellen und somit auch aus den GP33-spezifischen CD8+ Zellen keine wesentliche Bedeutung zukommt. TNF wird überwiegend von aktivierten T-Zellen, Makrophagen und NK-Zellen sezerniert (55) . Es vermittelt seine biologischen Effekte über zwei verschiedene Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2. Hierüber nimmt es Einfluss auf das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung, es wirkt immunregulierend, vermittelt direkt entzündliche Reaktionen und Apoptose (107, 109, 113). Die Sekretion des Zytokines TNF-α durch CD8+ T-Zellen, scheint einen antitumorösen Effekt zu besitzen (81) . Untersuchungen von Hallermalm et al. zeigen, dass TNF eine ähnliche Funktion wie IFN-γ zu vermitteln scheint und die MHC-Klasse I Expression zu erhöhen scheint (46) . Es bestünde also die Möglichkeit, dass TNF aus aktivierten endogenen Zellen, wie z.B. Makrophagen oder NK-Zellen sezerniert würde. Die hierdurch vermittelten antitumorösen Effekte könnten direkt über Apoptose der Tumorzellen oder indirekt über vermehrte MHC-Klasse I Expression und damit einer verstärkten Präsentation von TAA an GP33-spezifische CD8+ T-Zellen stattfinden. „CrissCross“ Untersuchungen in ALB1-tg Mäusen, die sowohl TNF-defizient als auch TNFkompetent wären, mit adoptivem Transfer von TNF-defizienten TCRtg Zellen oder TNFkompetenten TCR-tg Zellen könnten hierbei weiterhelfen. Die Untersuchung der MHCKlasse I Expression der Tumorzellen im Einfluss von TNF wäre interessant, ebenso wie die Untersuchung in Makrophagen oder NK-Zellen depletierten Mäusen. 6.5.3 Hemmung der Tumor-Angiogenese durch TCR-tg T-Zellen Die Ausbildung von Blutgefäßen in vitalem Tumorgewebe ist eine wichtige Voraussetzung für fortschreitendes Wachstum von Tumoren. Auch Tumorgewebe muss wie gesundes Gewebe mit Nährstoffen versorgt werden. Es wurde beobachtet, dass es innerhalb von Tumoren, deren Gefäßsystem nicht ausreichend ausgebildet war, zu Nekrosen kam. Eine Möglichkeit warum das Gefäßsystem in den Tumoren nicht ausreichend ausgebildet wurde, könnte dem angiostatischen Effekt von IFN-γ zugesprochen werden, welches im Verlaufe einer Immunantwort von CD4+ T-Zellen oder NK-Zellen sezerniert wird (6, 80) . Des Weiteren besitzen Zytokine wie IL-12 und IL-18 einen angiostatischen Effekt und haben somit Einfluss 6. Diskussion auf die Vaskularisation von Tumorgewebe 63 (20, 21, 118) . Zusätzlich zeigten Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe einen IFN-γ abhängigen angiostatischen Effekt transferierter TCR-tg CD8+ TZellen in Lungenmetastasen eines B16GP33 Melanoms. (Qin Z et al., Tumor rejection by CD8+ T cells involves IFNγ-mediated anti-angiogenesis, 2002, eingereicht). Dabei stellte sich die Frage ob auch in 3LL-A9GP33 tumortragenden ALB1-tg Mäusen, denen naive TCR-tg Zellen transferiert wurden, Veränderungen in der Vaskularisation zu beobachten seien. Ausgehend von den gewonnenen Erkenntnissen durch das B16GP33 Melanom wurden die histologischen Schnitte der A9 Tumore mit einem CD31-spezifischen Ak angefärbt. CD31 ist ein Oberflächenmolekül welches u.a. auf Endothelzellen exprimiert wird (29, 80) . Es zeigte sich, das sowohl der parentale 3LL-A9 Tumor mit oder ohne adoptiven Transfer TCR-tg Zellen und auch der transfizierte 3LL-A9GP33 Tumor ohne adoptiven Transfer eine ähnliche Vaskularisation aufwiesen (Abb.12 E,J + Abb.14 C). Diese Tumoren wiesen alle ein progressives Wachstum in den Tieren auf und unterliegen keiner Abstoßung. Hingegen konnte in den 3LL-A9GP33 tumortragenden ALB1-tg Mäusen, die einen adoptiven Transfer TCR-tg Zellen erhalten haben eine deutlich geringere Vaskularisation beobachtet werden, vor allem in den Bereichen, in denen eine ausgeprägte Nekrose sichtbar war (Abb.14 F,I). Diese Beobachtung würde mit den oben beschriebenen Erkenntnissen von Qin et al. übereinstimmen, dass es CD8+ T-Zell vermittelt zu einem angiostatischen Effekt im Tumorgewebe kommt. Ob dieser Effekt direkt dem IFN-γ zugesprochen werden kann ist unklar. Möglicherweise könnten auch andere Faktoren eine Rolle spielen, die durch IFN-γ induziert werden. Hierzu könnten Faktoren wie IP-10 (Interferon-inducible protein-10) oder MIG (Monokine induced by interferon-gamma) zählen die angiostatische denen angiostatische Effekte zugeschrieben werden (90, 91). Dies müssten weitere Versuche klären. 6.6 Aktivitätsparameter TCR-tg T-Zellen In Kontrast zu anderen Untersuchungen, bei denen aktivierte T-Zellen funktionslos sind und ein progredientes Tumorwachstum resultiert, steht die Beobachtung, dass es durch den adoptiven Transfer von naiven TCR-tg Zellen zur Tumorzellelimination in ALB1-tg Mäusen kommt (Abb.11). Dabei stellt sich die Frage, was mit den adoptiv transferierten TCR-tg Zellen passiert. Man könnte davon ausgehen, dass im Blut der tumortragenden Tiere aktivierte PBL nachzuweisen sind, da im Vergleich zu den tumortragenden Tieren ohne adoptiven Transfer eine erfolgreiche Tumorzellelimination stattfindet. Dazu wurden Thy1.1+ CD8+ PBL, die in diesem Falle die Population der adoptiv transferierten TCR-tg T-Zellen darstellen, auf die Expression von CD25, CD44 und Ly6c untersucht. Im Falle einer 6. Diskussion 64 Aktivierung müssten die Zellen im Vergleich zu naiven CD8+ T-Zellen CD25, CD44 und Ly6c vermehrt exprimieren. Doch war zu Beobachten, dass die Tumorzellabstoßung in den Tieren stattfindet, ohne das der Nachweis von aktivierten Ag-spezifischen T-Zellen im Blut gelang (Abb.15). Auch war keine Änderung der Gesamtanzahl der Thy1.1+ CD8+ T-Zellen im Verlauf der Tumorabstoßung zu erkennen (Abb.16), so dass keine übermäßige Proliferation dieser Zellpopulation stattfindet. Diese Ergebnisse können die durch die Histologie gezeigten Beobachtungen nicht erklären. So ist im Vergleich zu dem Parentaltumor und den Tieren ohne adoptiven Transfer von TCR-tg Zellen eindeutig eine spezifische Infiltration von Thy1.1+ CD8+ Zellen im Tumorgewebe nachweisbar (Abb.13 C,F,I). Hierbei handelt es sich um die Population der adoptiv transferierten TCRtg T-Zellen. Wie und/oder ob es also zur Aktivierung der TCR-tg T-Zellen kommt bleibt unklar. Eine Möglichkeit bestünde in der selektiven Aktivierung der TILs durch infiltrierende CD11b+ Makrophagen, die durch lösliche Faktoren von Tumorzellen, spezifische Zell-Zell Interaktionen und/oder durch Tumorzellnekrose in dem Tumor angelockt werden könnten. Sie nehmen möglicherweise Zelltrümmer oder Hitzeschockprotein assoziierte Peptide auf (102) und könnten sie innerhalb des Tumors an CD8+ T-Zellen „cross-präsentieren“ (11). Sie verbleiben im Tumorgewebe und könnten somit auch nicht im Blut nachgewiesen werden. Doch wird der Mechanismus der CD8+ T-Zell Aktivierung durch Tumore kontrovers diskutiert. Der direkten Ag Präsentation im Tumorgewebe steht die Beobachtung von Ochsenbein et al. gegenüber, dass „CrossPriming“ für die Initiierung einer tumorspezifischen Antwort ineffektiv sei und die Induktion der CTL ausschließlich in den sekundären lymphatischen Geweben durch professionelle APC stattfinde (68) . Die Aktivierung von CD8+ T-Zellen innerhalb der sekundär lymphatischen Organe kann in diesem Modell nicht ausgeschlossen werden, doch konnte in Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe keine Tumorzell zugehörige DNA mittels PCR in den sekundären lymphatischen Organen von 3LL-A9GP33 tumortragenden B6 Mäusen nachgewiesen werden (78) , so dass dieses auch für die tumortragenden ALB1-tg Mäuse anzunehmen sein könnte. Des Weiteren müsste es sonst möglich sein aktivierte TCR-tg T-Zellen im Blut nachzuweisen. Um zu untersuchen, ob sich im Tumorgewebe aktivierte TILs befinden, müssten diese aus dem Tumor isoliert werden und könnten anschließend mittels FACS-Analyse auf die Expression von Aktivierungsmarkern untersucht werden. Des Weiteren wäre interessant zu untersuchen ob sich in der Milz der tumortragenden Tiere aktivierte TCR-tg Zellen befinden. Welche Rolle die Zellen des unspezifischen Immunsystems, wie Makrophagen oder NKZellen bei der Tumorabwehr spielen, oder ob CD4+ T-Helferzellen eine wichtige Funktion spielen bleibt ungeklärt und müsste in nachfolgenden Experimenten untersucht werden. 6. Diskussion 65 Die vorliegende Arbeit beschreibt ein neues Tumormodell in ALB1-tg Mäusen mit definierten TAA. Durch inkomplette zentrale Deletion von GP33-spezifischen T-Zellen ist die Vorläuferfrequenz GP33-spezifischer T-Zellen in den ALB1-tg Mäusen reduziert. Durch adoptiven Transfer TCR-tg Zellen kann die Anzahl tumorspezifischer T-Zellen in den ALB1tg Mäusen erhöht werden. Hierdurch konnten direkt tumorspezifische T-Zellen im Tumorgewebe nachgewiesen werden, die für die Abstoßung des Tumors in den ALB1-tg Mäusen verantwortlich sind. Somit ist die Erhöhung der Vorläuferfrequenz tumorspezifischer T-Zellen entscheidend für eine stattfindende Abstoßungsreaktion von 3LL-A9GP33 Tumorzellen in ALB1-tg Mäusen. 7. 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Juni 1994 Abitur Zivildienst: 08/94 – 10/95 Deutsches Rotes Kreuz, Göttingen Ausbildung zum Rettungssanitäter Universitärer Werdegang: Studium der Humanmedizin: 10/95 – 09/97 Medizinische Fakultät der Universität Rostock 09/97 Physikum 10/97 – 09/98 Medizinische Fakultät der Freien Universität Berlin 09/98 1. Staatsexamen 10/98 – 03/99 Medizinische Fakultät der Universität Freiburg 03/99 – 10/99 Auslandsaufenthalt USA, Madison, Wisconsin 10/99 – 11/02 Medizinische Fakultät der Universität Freiburg 08/01 2. Staatsexamen 11/02 3. Staatsexamen Wissenschaftliche Tätigkeit: 03/99 – 07/99 Research Intern/Honorary Fellow Universität von Wisconsin, Medical School, Madison, USA Pathologie und Laboratoriumsmedizin, Abt. Neuroimmunologie, Prof. Z. Fabry, PhD 9. Danksagung 78 9. Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich ganz herzlich bei allen bedanken, die mich im Laufe meiner Arbeit unterstützt haben. Dabei gilt mein ganz besonderer Dank Hanspeter Pircher, der es immer wieder geschafft hat, mich für die Immunologie zu begeistern. Durch ihn habe ich viele Einblicke in die immunologische Forschungsarbeit bekommen. Schon vor meiner Arbeit in seinem Labor hat er mich während eines Forschungsaufenthaltes mit fachlichen Ratschlägen immer wieder sehr gut unterstützt. Mir hat es sehr viel Spass bereitet in seinem Labor arbeiten zu können und meine Versuche unter seiner Leitung durchzuführen. Mein Dank gilt auch Privat-Dozent Dr. Stefan Benz, der sich als Zweitgutachter bereit erklärt hat, meine Arbeit zu beurteilen. Ohne die Mitarbeiter der Abteilung wäre es nicht möglich gewesen, diese Arbeit zu erstellen und die Experimente durchzuführen. Dafür danke ich ganz herzlich: Peter Aichele, Evelyn Roth, Ulrike Blohm, David Vöhringer, Heike Unsöld, Marlies Rawiel, Tobias Ostler, Holger Oemus, Johannes Schwartzkopff, Christine Zimmermann, Eva Häfner und Stephen Batsford. Ich habe gerne mir Euch zusammengearbeitet. Erwähnen möchte ich auch die Tierpfleger des Institutes, die sich mit Liebe um die Versuchstiere gekümmert haben. Und dann möchte ich mich noch bei meiner Familie und meinen Freunden bedanken, die immer wieder ein offenes Ohr für mich hatten und mir mit Rat und Tat zur Seite standen.
