Wahlpraktikum Wirkung von Enzymen aus Schlangengift auf

wahlpraktikum schlangengift - p. bütikofer, j. jelk, m. rauch – 2011
Wahlpraktikum
Wirkung von Enzymen aus Schlangengift auf Zellmembranen
Voraussetzungen für Praktikum
☞ Anmeldung bei der Studienplanung
☞ Absolvierung des 1. Blockes im 1. Semester (Grundlagen über Membranen)
Einleitung
Schlangengifte sind komplexe Gemische von verschiedenen Proteinen und
Oligopeptiden, die teils als Enzyme, teils als Enzyminhibitoren und teils als blockierende
Liganden lebenswichtige Strukturen im Beuteorganismus schädigen. Die wichtigsten
Angriffspunkte von Schlangengiften sind Zellmembranen, Proteine und Polysaccharide
der Gefässwand und des Bindegewebes, sowie Plasmaproteine, die am Hämostase-,
Fibrinolyse- oder Komplementsystem beteiligt sind. Einige isolierte Schlangengiftproteine mit bekannter Wirkungsweise haben als pharmazeutische Wirkstoffe, als
diagnostische Reagenzien oder als präparative Hilfsmittel praktische Anwendungen in
der Medizin (siehe Ref. 1).
Grundsätzlich wird zwischen zwei Typen von Schlangengiften unterschieden:
 neurotoxische Gifte
 hämozytotoxische Gifte
Viele Gifte enthalten mehrere Komponenten, die zudem sowohl neurotoxisch wie auch
hämozytotoxisch wirken können.
Problemstellung
Wir haben ein Enzym isoliert aus dem Gift von Naja mossambica mossambica.
Versuchen Sie mittels einfacher Experimente herauszufinden, um welche Art von Enzym
es sich dabei handelt.
Aufgabe 1
Einige hämozytotoxische Gifte zeigen eine schädigende Wirkung auf die Integrität von
Zellmembranen und führen so zur Zerstörung (Lyse) von Zellen. Sie studieren deshalb
eine mögliche hämozytotoxische Wirkung des isolierten Enzyms an folgendem
Modellsystem: Sie geben eine bestimmte Menge des Enzyms zu isolierten menschlichen
Erythrozyten und bestimmen die Lyse der Zellen in Abhängigkeit der Inkubationszeit.
Die Zelllyse bei Erythrozyten bezeichnet man als Hämolyse. Sie lässt sich einfach
bestimmen, indem man - mittels eines Photometers - den Austritt von Hämoglobin aus
den Erythrozyten in den zellfreien Ueberstand nach Zentrifugation misst.
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Vorgehen 1

Bereiten Sie folgende Suspensionen vor (in Reagensgläser pipettieren):
A
B
C

Erythrozyten
1 ml
1 ml
1 ml
Puffer
9 ml
9 ml
-
Wasser
9 ml
Vergleichen Sie das Aussehen der Suspensionen A, B und C. In den Reagensgläsern
A und B sind die Erythrozyten intakt geblieben, die rote Lösung ist trüb. Im
Reagensglas C ist die Lösung weniger trüb aber dafür deutlicher rot gefärbt: Eine
Vielzahl von Zellen ist geplatzt (lysiert) und dabei ist Hämoglobin ausgetreten.
Frage 1a: Was muss wohl im Puffer enthalten sein, dass die Erythrozyten in den
Reagensgläsern A und B nicht lysieren?

Stellen Sie nun die Reagensgläser A und B in ein Wasserbad bei 37 °C. Nach 5 min
geben Sie 30 units des isolierten Enzyms zu Reagensglas A und lassen die
Suspensionen unter leichtem Schütteln inkubieren.

Nach t = 0, 30, 60, 90 min entnehmen Sie den Reagensgläsern A und B je 1.3 ml (2
x 650 µl) Suspension und pelletieren die Erythrozyten mittels Zentrifugation (5 min,
13‘000 x g). Anschliessend entnehmen Sie 0.8 ml der jeweiligen Überstände und
messen die Absorptionen im Photometer bei 615 nm.

Die zum Teil lysierten Erythrozyten im Reagensglas C verwenden Sie zum
Aufstellen einer Eichkurve, die dann zur Bestimmung einer allfälligen Lyse der
Erythrozyten (Hämolyse) in den Reagensgläsern A und B verwendet wird. Dazu
verdünnen Sie die Lösung C mit Wasser nach folgendem Schema (im Doppel
ausführen; direkt in Küvetten pipettieren):
Hämolyse (%)
10
5
4
3
2
1
0.5

Verdünnte
Lösung C (ml)
1.0
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.05
Wasser (ml)
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0.95
Messen Sie die Absorptionen dieser Lösungen im Photometer bei einer Wellenlänge
von 615 nm gegen Wasser und erstellen Sie eine Eichkurve (% Hämolyse versus
Absorption).
Frage 1b: Was beobachten Sie? Bestimmen Sie das Ausmass der Hämolyse in den beiden
Reagensgläsern.
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Aufgabe 2
Der obige Versuch zeigt Ihnen, dass die Aktivität des isolierten Enzyms zu einer
Schädigung der Zellintegrität von Erythrozyten und damit zur Hämolyse geführt hat. Sie
ziehen nun folgende Enzyme in Betracht, die für diesen Effekt verantwortlich sein
könnten:
 eine Protease
 eine Glycosidase
 eine Phospholipase
Frage 2a: Informieren Sie sich aus der Literatur, welche Reaktionen die oben genannten
Enzyme durchführen.
Frage 2b: Diskutieren Sie, welche Effekte diese Enzyme auf Erythrozyten haben könnten?
Könnten diese Veränderungen ausreichen, um eine Zelllyse zu bewirken?
Sie bestimmen nun experimentell, um welche Art von Enzym es sich beim Präparat
handeln könnte.
Aufgabe 3
Veränderungen in der Proteinzusammensetzung (Grösse und Kohlenhydratdekorationen)
können mittels SDS-Polyacrylamidegel-Elektrophorese (SDS-PAGE) analysiert werden.
Frage 3a: Informieren Sie sich aus der Literatur, auf welchen Prinzipien diese Methode
beruht.
Vorgehen 3

Zur Analyse der Proteinzusammensetzung der Erythrozytenmembran werden zuerst
sogenannte 'Ghosts' präpariert. Dazu werden die Erythrozyten aus den Reagensgläsern A und B nach der 90-minütigen Inkubation in einem hypotonen Puffer bei 4
°C komplett lysiert. Die aufgebrochenen Erythrozyten werden anschliessend
zentrifugiert und solange mit dem hypotonen Puffer gewaschen, bis dass das
ausgetretene Hämoglobin vollständig entfernt und das resultierende
Membranpräparat farblos (oder höchstens noch leicht rosa gefärbt) ist.
Frage 3b: Weshalb werden zur Analyse der Proteine der Erythrozytenmembran zuerst
'Ghosts' hergestellt und nicht gleich ganze Erythrozyten verwendet?

Die Proteinkonzentration in den Ghost-Präparationen wird bestimmt. Anschliessend
werden die einzelnen Proben auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen (pro Bahn
50 µg Protein). Zusätzlich wird eine Ghostpräparation nach Behandlung mit einer
bekannten Protease (Trypsin) aufgetragen.
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
Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgt dann während 16 h bei einer
konstanten Spannung von 70 V. Anschliessend werden die Proteine im Gel mit
einem unspezifischen Farbstoff (Coomassie blue) sichtbar gemacht.

In einem zweiten SDS-Polyacrylamidgel analysieren Sie mögliche Veränderungen in
der Kohlenhydratdekoration der Proteine. Dazu tragen Sie die selben Proben wie
oben auf (pro Bahn wiederum 50 µg). Zusätzlich wird eine Probe nach Behandlung
mit einer bekannten Glycosidase (Endoglycosidase F; Endo F) aufgetragen.

Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proteine (s. oben) werden die
Glycoproteine mit einer Kohlenhydrat-spezifischen Färbemethode sichtbar gemacht.

Resultate: siehe File ‘SDS-PAGE‘.
Frage 3c: Welche Unterschiede zwischen den einzelnen Bahnen erkennen Sie?
Interpretieren Sie den Befund.

Eine schematische Darstellung einer SDS-PAGE von Erythrozytenmembranproteinen sowie des Aufbaus der Erythrozytenmembran finden Sie im File ‘Figuren
Ery‘.
Aufgabe 4
Veränderungen in der Lipidzusammensetzung können mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) analysiert werden.
Frage 4a: Informieren Sie sich aus der Literatur, auf welchen Prinzipien diese Methode
beruht.
Vorgehen 4

Um die Lipidzusammensetzung der Erythrozytenmembran zu studieren, extrahiert
man die gesamten Lipide von Erythrozyten mit organischen Lösungsmitteln und
trennt die einzelnen Komponenten (Phospholipide, Fettsäuren, Cholesterin,
Glycolipide) anschliessend mittels TLC in speziell zusammengesetzten
Lösungsmittelgemischen. Da wir in unserem Enzympräparat eine Phospholipase
vermuten, wird ein System gewählt, dass sich für die Analyse der verschiedenen
Phospholipidklassen eignet.
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
Lipid-Extraktion
2 x 630 µl ml Erythrozytensuspension A und B
in Reagenzgläser pipettieren
Zentrifugation (7 min; 2‘000 rpm);
Überstände möglichst quantitativ abnehmen und verwerfen
Zugabe von 125 µl H2O dest zu Pellets A und B;
gut mischen (Vortex); 15 min bei RT stehen lassen
Unter ständigem mischen langsame Zugabe
von 2 x 700 µl kaltem Isopropanol (2-Propanol)
Für 60 min auf Eis stehen lassen;
ca. alle 10 min gut mischen
Unter ständigem mischen langsame Zugabe
von 2 x 450 µl Chloroform (CHCl3)
Für 60 min bei RT stehen lassen;
ca. alle 10 min gut mischen
Zentrifugation (15 min; 2‘000 rpm);
Überstände (ca. 2 ml extrahierte Lipide) vorsichtig
abpipettieren und unter Stickstoff eindampfen
Lipidextrakt in 50 µl CHCl3:Methanol (2:1)
aufnehmen; bei -20 °C aufbewahren

Die extrahierten Lipide werden nun mittels TLC in die verschiedenen Phospholipidklassen und eine Neutrallipid-Fraktion aufgetrennt. Dazu tragen Sie die Extrakte
nach einem vorgegebenen Schema mit einer feinen Glaspipette auf eine 20 cm x 20
cm Silica Gel TLC Platte. Daneben werden reine Phospholipide als Standards
aufgetragen (je 50 nmol).
PC: Phosphatidylcholin
PE: Phosphatidyläthanolamin
PS: Phosphatidylserin
Sph: Sphingomyelin
LPC: Lysophosphatidylcholin
LPE: Lysophosphatidyläthanolamin
Chol: Cholesterin
PC PE
PS Sph A
B
LPC LPE Chol
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
Präparation des Laufmittels zum Entwickeln des Chromatogramms:
CHCl3
Methanol
Essigsäure
0.9% NaCl
50 ml
25 ml
8 ml
2.5 ml

Geben Sie dann das Laufmittel in einen Glastank, der mit Filterpapier ausgekleidet
ist, und lassen Sie das System für 15 min äquilibrieren. Anschliessend stellen Sie die
TLC Platte in den Tank und lassen das Chromatogramm entwickeln, bis die
Lösungsmittelfront ca. 1 cm vom oberen Rand der Platte entfernt ist (Dauer ca. 100
min).

Entfernen Sie die Platte aus dem Tank und stellen Sie sie in eine Kapelle zum
Abdampfen der Lösungsmittel (ev. mit kaltem Luftstrom nachhelfen; Föhn).

Die aufgetrennten Lipidklassen werden nun mittels Jodfärbung sichtbar gemacht:
Stellen Sie die Platte in eine mit Joddampf gesättigte Glaskammer (Handschuhe
tragen!) und warten Sie, bis die Lipide sichtbar werden. Nehmen Sie die Platte
heraus und markieren Sie die Flecken mit einem stumpfen Bleistift; belassen Sie
dabei die Platte im Abzug (Joddämpfe sind giftig!).
Frage 4b: Informieren Sie sich aus der Literatur, auf welchem Prinzip die Färbemethode
beruht.
Frage 4c: Ordnen Sie die Flecken den entsprechenden Lipidklassen (Standards) zu.
Vergleichen Sie die Lipidzusammensetzung der Extrakte aus Reagensgläsern A und B.
Interpretieren Sie das Resultat.
Aufgabe 5
Versuchen Sie nun aufgrund der gemachten Beobachtungen eine möglichst präzise
Angabe über das isolierte Enzym aus Schlangengift zu machen. Welche Reaktion(en)
katalysiert es? Gibt es verwandte Enzyme, die auf ähnliche Substrate wirken? Wo
kommt das Enzym natürlicherweise sonst noch vor? Wie kann es biologische Membranen
zerstören?
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