Dissertation - Optimierung von Verfahren zum In-vitro
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Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für Physiologie, Abteilung für Zelluläre Physiologie, der Ruhr-Universität Bochum Optimierung von Verfahren zum In-vitro-Gentransfer am Meerschweinchenherzen mittels adenoviraler Vektoren INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Andrea Nave aus Unna Hannover 2005 Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. rer. nat. B. Schröder Prof. Dr. rer. nat. L. Pott 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. rer. nat. B. Schröder 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. L. Haas Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2005 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 11 2 LITERATURÜBERSICHT 13 2.1 Signaltransduktion über G-Protein gekoppelte Rezeptoren 13 2.2 Kaliumkanäle 14 2.2.1 G-Protein gekoppelte, einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle 16 2.3 Gentransfer 18 2.4 Vektorsysteme 20 2.4.1 Nichtvirale Vektoren 20 2.4.2 Virale Vektoren 21 2.5 Adenoviraler Gentransfer 22 2.5.1 Adenoviren 22 2.5.2 Adenovirale Vektoren 24 2.5.3 Adenoviraler Gentransfer in Kardiomyozyten 27 3 MATERIAL UND METHODEN 29 3.1 Tiere und Tierhaltung 29 3.2 Molekularbiologische Methoden 29 3.2.1 Gentransfer mithilfe rekombinanter Adenoviren 29 3.2.1.1 Insertion der A1-DNA in den Transfervektor 31 3.2.1.2 Herstellung rekombinanter adenoviraler DNA mittels homologer Rekombination 3.2.1.3 Produktion rekombinanter Adenoviren 3.3 Zellkultur 32 34 35 3.3.1 Isolierung und Primärkultur von Vorhofmyozyten des Meerschweinchenherzens 35 3.3.1.1 Organentnahme 35 3.3.1.2 Perfusion 36 3.3.1.3 Vereinzelung und Kultivierung von Vorhofmyozyten 36 3.3.2 Maßnahmen zur Optimierung der Zellkulturbedingungen 37 INHALTSVERZEICHNIS 3.3.2.1 Zusätze zum Kulturmedium 38 3.3.2.2 Beschichtung der Kulturschälchen 38 3.3.3 Infektion von isolierten Myozyten mit rekombinanten Adenoviren 38 3.3.4 Adenovirale Genübertragung auf das intakte Herz mittels Perfusion 39 3.4 Elektrophysiologische Methoden 40 3.4.1 Elektrophysiologische Messungen mithilfe der Patch-Clamp-Technik 40 3.4.2 Elektrophysiologischer Versuchsaufbau 40 3.4.3 Elektrophysiologische Registrierung des IK(ACh) 41 3.5 Chemikalien und Enzyme 42 3.5.1 Chemikalien für die Molekularbiologie 42 3.5.2 Enzyme für die Molekularbiologie 43 3.5.3 Chemikalien für die Elektrophysiologie und Zellkultur 43 3.5.4 Enzyme für die Zellkultur 44 3.5.5 Plasmide 44 3.5.6 Kits 44 3.5.7 Bakterienstämme 44 3.6 Lösungen und Medien 45 3.6.1 Lösungen und Medien für die Molekularbiologie 45 3.6.2 Lösungen für die Elektrophysiologie 46 3.6.3 Lösungen für die Zellkultur 46 3.6.4 Medien und Beschichtungen für die Zellkultur 48 3.7 Geräte und Verbrauchsmaterialien 48 3.8 Mathematische Auswertung und statistische Verfahren 49 4 ERGEBNISSE 51 4.1 Adenovirale Genübertragung auf das intakte Herz mittels Perfusion 51 4.1.1 Einfluss der Langendorff-Perfusion auf die Myozyten 51 4.1.2 Einfluss von Zusätzen zum Medium auf die Zellkultur 53 4.1.3 Einfluss einer Beschichtung der Kulturschälchen auf die Zellkultur 54 4.1.4 Zeitabhängigkeit der GFP-Expression 54 4.1.5 Einfluss der Virusexpositionsdauer auf die Infektionsrate 56 INHALTSVERZEICHNIS 4.1.6 Einfluss des Virusvolumens auf die Infektionsrate 4.2 Infektion von vereinzelten Myozyten mit rekombinanten Adenoviren 57 58 4.3 Vergleich der Adenovirusinfektion vereinzelter Kardiomyozyten und der Infektion des intakten Herzens mittels Langendorff-Perfusion 59 4.4 Elektrophysiologische Ergebnisse 61 5 DISKUSSION 65 5.1 Langendorff-Perfusionsmodell zur Infektion des intakten Herzens 66 5.2 Optimierung der Zellkulturbedingungen 72 5.3 Schlussbetrachtung 73 6 ZUSAMMENFASSUNG 76 7 SUMMARY 78 8 LITERATURVERZEICHNIS 80 9 DANKSAGUNG 98 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abb. Abbildung ACh Acetylcholin Ad Adenovirus Ado Adenosin ADP Adenosinphosphat AdV Adenovektor ATP Adenosintriphosphat bzw. beziehungsweise ca. circa CAV-1 canines Adenovirus 1 °C Grad Celsius cDNA komplementäre DNA cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat cm Zentimeter cm2 Quadratzentimeter cm3 Kubikzentimeter CTL zytotoxische T-Lymphozyten d day (Tag) DBP DNA-bindendes Protein d.h. das heißt DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglycolbisaminoethylethertetraessigsäure EK Gleichgewichtspotential für Kalium et al. et alii etc. et cetera Fa. Firma ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS FBS fötales Rinderserum g Erdbeschleunigung (9,81 m/sec2) g Gramm G βγ beta/gamma-Untereinheit des G-Proteins GDP Guanosindiphosphat GFP grün fluoreszierendes Protein GFU gene forming units GIRK G-Protein gekoppelter, einwärtsgleichrichtender K+-Kanal GPCR G-Protein gekoppelter Rezeptor GTP Guanosintriphosphat h Stunde(n) HEK-293-Zellen human embryonic kidney cells HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino)-Ethansulfonsäure Hrsg. Herausgeber Hz Hertz I. E. Internationale Einheiten IK(ACh) Strom des ACh-sensitiven Kaliumkanals ITR inverted terminal repeat ITS Insulin-Transferrin-Selenium-Komplex K(ACh) durch Acetylcholin aktivierter GIRK-Kanal kb Kilobasenpaare kHz Kilohertz Kir einwärtsgleichrichtender Kaliumkanal KV spannungsabhängiger Kaliumkanal l Liter LB-Medium Luria Bertani-Medium M molar (mol/l) mg Milligramm min Minuten ml Milliliter mm Millimeter ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS mmol millimol ms Millisekunde(n) mV Millivolt µl Microliter µmol micromol n Anzahl der Versuche ng Nanogramm nm Nanometer NTE Natrium-Tris-EDTA p probability value (Irrtumswahrscheinlichkeit, Signifikanzniveau) pA Picoampere PBE Plaque bildende Einheiten PBS phosphate-buffered-saline pH potentium hydrogenii (negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration) p. i. post infectionem % Prozent ® eingetragenes Warenzeichen RNA Ribonukleinsäure s Sekunde(n) S. E. M. Standardfehler des Mittelwertes TAE Tris-Azetat-EDTA TE Tris-EDTA Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TWIK 2-Poren-Kaliumkanal U Unit, Mengenangabe für Enzyme u. und u.a. und andere U/min Umdrehung(en)/Minute UV Ultraviolett V Volt Vit. Vitamin ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS v/v Volumen pro Volumen w/v Masse pro Volumen z. B. zum Beispiel Die chemischen Elemente werden gemäß dem internationalen Periodensystem abgekürzt. EINLEITUNG 11 1 EINLEITUNG Trotz vieler Erfolge und Weiterentwicklungen klassischer Therapien bleibt die kongestive Herzinsuffizienz eine der häufigsten Todesursachen weltweit (SHAH et al. 2000). Auch andere Erkrankungen des Herzens, beispielsweise die familiäre hypertrophische Herzmuskelerkrankung oder das Long QT-Syndrom, entstehen aufgrund von Störungen der myokardialen Funktion auf zellulärer oder subzellulärer Ebene. Ein Grundverständnis für Abläufe auf diesen Ebenen ist daher hilfreich für die Entstehung therapeutischer Strategien. Bei der Aufklärung zellulärer und molekularer Ursachen von Herzmuskelerkrankungen spielt beispielsweise die Erforschung von inter- und intrazellulären Signalübertragungswegen und ihrer Bedeutung für die Zellfunktion eine wichtige Rolle. Gentechnische Verfahren werden in der Grundlagenforschung angewendet, um die Wirkungsweisen von Genen und deren Produkten kennen zu lernen, sowie die Ursachen von Krankheiten besser zu verstehen. In dem vergangenen Jahrzehnt wurde viel Aufmerksamkeit auf (adeno)viral vermittelten Gentransfer in somatische Zellen gelegt. Dabei stellt das Herz ein wichtiges Zielorgan dar. Gentransfer verspricht nicht nur eine mögliche therapeutische Methode zu sein, sondern auch zur Identifizierung und Validierung molekularer Ziele beizutragen und zelluläre Signalwege aufzuklären. Die Abteilung für Zelluläre Physiologie der Ruhr-Universität Bochum befasst sich mit Fragen der Signaltransduktion über G-Protein gekoppelte Rezeptoren. Die Prüfung der Rezeptoraktivierung erfolgt an atrialen Acetylcholin (ACh)-sensitiven Kaliumkanälen (K(ACh)-Kanälen). Zur Analyse von Signalfunktionen werden Methoden zur Manipulation des Expressionsniveaus von Proteinen in differenzierten Herzmuskelzellen in Primärkultur angewendet (Überexpression, Knock-out, Funktionsmutanten). Dafür wurde ein adenovirales Verfahren etabliert, bei dem der Gentransfer bislang in der Zellkultur durchgeführt wurde. Es gibt jedoch Hinweise, dass eine Virusexposition des intakten Herzens unmittelbar nach der Organentnahme zu besseren Ergebnissen führt (DONAHUE et al. 1998). Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit war es, hierfür ein Verfahren zu etablieren. EINLEITUNG 12 Der Gentransfer sollte sowohl an enzymatisch isolierten adulten Vorhofmyozyten nach 24 Stunden in vitro als auch am intakten perfundierten Herzen vor der Zellvereinzelung und Kultivierung stattfinden. Mithilfe der Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie wurden in den folgenden sechs Tagen sowohl die Vitalität und Anheftungsfähigkeit der vereinzelten Zellen als auch die Expression eines Reportergens (green fluorescent protein – GFP) verglichen. Zudem sollten Maßnahmen durchgeführt werden, um die Zellkulturbedingungen für adulte Herzmuskelzellen zu verbessern. Die Weiterentwicklung von Verfahren zum Gentransfer ist einerseits von großem Grundlageninteresse, zum Beispiel für die Aufklärung von Signalwegen, andererseits besteht darüber hinaus ein Interesse in Bezug auf die Entwicklung und Validierung gentherapeutischer Verfahren. LITERATURÜBERSICHT 13 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Signaltransduktion über G-Protein gekoppelte Rezeptoren G-Protein gekoppelte Rezeptoren (G protein coupled receptors, GPCRs) stellen eine der größten Familien membranständiger Rezeptoren an Zelloberflächen des tierischen Organismus dar. Sie vermitteln die Umsetzung extrazellulärer Signale, z. B. nach Bindung von Neurotransmittern und Hormonen oder nach Eintreffen visueller, olfaktorischer und gustatorischer Reize, in intrazelluläre Signalkaskaden. Dadurch sind sie an der Kontrolle physiologischer Vorgänge oder unseres Verhaltens beteiligt (ERNST 2003). Diese zentrale Bedeutung von GPCRs macht deutlich, dass sie in pathologische Prozesse und zahlreiche Krankheiten, u. a. kardiovaskuläre Störungen, involviert sein können (ROCKMAN et al. 2002). Außerdem entsprechen mehr als drei Prozent der menschlichen Gene GPCR-Genen, weshalb diese Rezeptoren pharmakologisch von sehr großer Bedeutung sind (SAUTEL u. MILLIGAN (2000). Die Stimulation der GPCRs aktiviert an den Rezeptor gekoppelte membranständige intrazelluläre Proteine. Da diese GTP und GDP binden können, werden sie als GProteine bezeichnet (NEER 1995). Dabei handelt es sich um heterotrimere Polypeptide, die aus einer α -Untereinheit, die GTP binden und hydrolysieren kann, einer β und einer γ -Untereinheit bestehen. Im nicht aktiviertem Zustand ist GDP an die α Untereinheit gebunden, die assoziiert mit der β - und der γ -Untereinheit vorliegt. Durch Ligandenbindung an den GPCR kommt es zur Konformationsänderung des Rezeptors, die einen Austausch des GDP gegen GTP an der α -Untereinheit bewirkt. Das so aktivierte G-Protein dissoziiert in zwei Teile, den zytosolischen α Untereinheit/GTP-Komplex und das membrangebundene β γ -Dimer. Beide aktivierte Komponenten beeinflussen Zielproteine, wie z. B. die Adenylatzyklase oder Ionenkanäle (GILMAN 1987, NEER 1995). Durch die GTPase-Aktivität der α -Untereinheit kommt es zur Inaktivierung des α Untereinheit/GTP-Komplexes. Der entstehende α -Untereinheit/GDP-Komplex hat LITERATURÜBERSICHT 14 eine hohe Affinität zum β γ -Dimer. Die folgende Reassoziation zu einem heterotrimeren G-Protein bewirkt die Inaktivierung des G-Proteins (DOHLMANN et al. 1997). Anhand der 20 bisher bekannten α -Untereinheiten und der damit verbundenen Kopplung an bestimmte Signalkaskaden lassen sich mehrere Hauptklassen von GProteinen unterscheiden. So regulieren beispielsweise Untereinheiten der Klasse α i / o Kalium- und Kalziumkanäle. Außerdem inhibieren sie Adenylatzyklasen und aktivieren die cGMP-abhängige Phosphodiesterase. Ein pharmakologisches Merkmal für G-Proteine dieser Klasse ist ihre Sensitivität gegenüber Pertussis-Toxin. Dieses Toxin vermittelt die Übertragung eines ADP-Riboserestes, die zum Verlust der GTPase-Aktivität der α -Untereinheit führt und damit zu einer irreversiblen Inaktivierung der G-Proteine (NEER 1995, BOCKAERT 2001). Nur wenige Ionenkanäle (einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle GIRK, p-Type-NType Ca2+-Kanäle) in Zellen des zentralen Nervensystems und der Peripherie, die an einer Antwort auf Neurotransmitter und Hormone beteiligt sind, werden über GProteine reguliert. Die Regulation der Kanäle kann durch direkte Interaktion des GProteins mit dem Ionenkanal erfolgen oder indirekt durch die Bildung von sekundären Botenstoffen. So erfolgt beispielsweise die Aktivierung der einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanäle GIRK durch direkte Interaktion von β γ -Untereinheiten mit den Ionenkanälen (DASCAL 2001). 2.2 Kaliumkanäle Die Hauptfunktion von K+-selektiven Ionenkanälen besteht in der Stabilisierung des Ruhemembranpotenzials und einer Beteiligung an der Repolarisation des Aktionspotenzials. Dabei bewirkt ein Öffnen des Kanals einen Kaliumausstrom aus der Zelle, was wiederum zur Hyperpolarisation der Zellmembran führt (HILLE 2001). Entsprechend der Membrantopologie ihrer Poren bildenden Untereinheiten lassen sich die bislang bekannten Kaliumkanäle in drei große Klassen einteilen. Unterschie- LITERATURÜBERSICHT 15 den werden die spannungsabhängigen Kaliumkanäle Kv von den einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen Kir (BRANDTS u. POTT 2000). Einwärtsgleichrichtende K+Kanäle sind wesentlich an der Aufrechterhaltung des Ruhemembranpotenzials der Herzmuskelzelle, eine wichtige Voraussetzung für die Bildung von Aktionspotenzialen und für die Verlangsamung der Depolarisation von Herzmuskelzellen gegenüber Nervenzellen, beteiligt. Unter physiologischen Bedingungen erfolgt nach ihrer Aktivierung ein Kaliumausstrom. Charakteristisch ist, dass sie Ströme in Einwärtsrichtung, also bei zum Nernst-Potenzial für K+ (EK) negativen Membranpotenzialen, besser passieren lassen als in Auswärtsrichtung. Die Einwärtsgleichrichtung, d.h. die Reduktion des Auswärtsstromes erfolgt durch eine Blockierung der Kanalpore durch intrazelluläres Mg2+ und intrazelluläre Polyamine, wodurch die Aktionspotenziale in kardialen Myozyten länger sind im Vergleich zu Neuronen (NICHOLS et al. 1996, BRANDTS u. POTT 2000). Bestimmte Kir-Kanäle, die Rezeptoren für ATP (KATP-Kanäle) oder H+-Ionen (Kir1 oder ROMK) aufweisen, werden durch Erniedrigung dieser Liganden geöffnet bzw. durch ihre Erhöhung verschlossen. Über diese beiden Kaliumkanäle (Kir6 und Kir1) werden im distalen Nierentubulus die Kaliumausscheidung an den pH-Haushalt gekoppelt oder in den B-Zellen des Pankreas die Insulinausschüttung gesteuert (SCHMIDT et al. 2004). Zur zweiten Klasse zählen auch G-Protein gekoppelte, einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle, GIRKs von G-protein activated inwardly rectifying K+channels (ISOMOTO et al. 1997), die an der inhibitorischen Wirkung von Neurotransmittern auf Zellen des Herzens wie auch des Gehirns von Säugetieren beteiligt sind (SAKMANN et al. 1983). Die dritte Klasse bilden die sogenannten 2-Poren-Kanäle (KCa-Kanäle, wie z.B. TWIK von tandem of P domains in a weak inward rectifying K+ channel, BK-, SK 1-4, HCN- oder CNG-Kanäle). HCN- und CNG-Typ Kanäle werden beispielsweise, neben der Membranspannung, durch Bindung zyklischer Nukleotide (cAMP, cGMP) aktiviert bzw. inaktiviert und steuern so die elektrische Antwort der Sinneszellen in der Netzhaut auf einen Lichtreiz (CNG-Kanäle) wie auch die Schrittmacheraktivität LITERATURÜBERSICHT 16 des Sinusknotens am Herzen oder einiger zentraler Neurone (HCN-Kanäle, SCHMIDT et al. 2004). 2.2.1 G-Protein gekoppelte, einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle Die Untereinheiten einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle bestehen aus zwei alphahelikalen Transmembransegmenten (M1 und M2), die untereinander über eine schleifenartige Struktur, der H5-Region, verbunden sind [Abbildung (Abb.) 1]. Der funktionelle Kanal wird durch Assoziation von vier α -Untereinheiten über transmembranale Helices zu Tetrameren gebildet. Die H5-Region bildet Anteile der Pore aus und enthält das für die Kaliumselektivität mitverantwortliche Aminosäuremotiv Glycin-Tyrosin-Glycin (ISOMOTO et al. 1997, JAN u. JAN 1997). Im Falle der GIRKKanäle binden die G-Proteine intrazellulär sowohl an die Carboxytermini als auch an die Aminotermini der Untereinheiten (COREY u. CLAPHAM 1998). Abb. 1: Schematische Darstellung der Membrantopologie einer GIRK-Untereinheit einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle. Die porenbildende Einheit besteht aus zwei transmembranalen Segmenten (M1 und M2), die von einer intermembranalen Schlei- LITERATURÜBERSICHT 17 fe (H5) getrennt sind. Die intrazellulären N- und C-Termini enthalten G-ProteinBindestellen ( G βγ ). Abbildung modifiziert nach Isomoto et al. (1997). In Zellen des Sinus- und Atrioventrikularknotens und in Vorhofzellen dominiert der GProtein-regulierte Kaliumkanal, der auch als K(Ach)-Kanal bezeichnet wird, da er durch vagal freigesetztes Acetylcholin (ACh) über muscarinerge M2-Rezeptoren aktiviert wird (BRANDTS u. POTT 2000). Aber auch andere in Herzmyozyten exprimierte Rezeptoren, die an Pertussis Toxin-sensitive G-Proteine koppeln, können K(Ach)-Kanäle aktivieren, wie z. B. Sphingolipidrezeptoren (BÜNEMANN et al. 1996) oder purinerge A1-Rezeptoren. Der natürliche Agonist von A1-Rezeptoren ist Adenosin, das unter hypoxischen Bedingungen im Herzmuskel als auto- bzw. parakriner Mediator von den Kardiomyozyten selbst freigesetzt wird. Dem A1-Rezeptor werden unter verschiedenen Bedingungen kardioprotektive Effekte zugesprochen, beispielsweise bei Herzinsuffizienz oder bei Ischämie. Die Diskussion wird unterstützt durch die Feststellung, dass eine A1-Überexpression durch Transfektion sowohl im Zellkulturmodell als auch in transgenen Mäusen die myokardiale Resistenz gegenüber Ischämie vergrößert. Das macht den A1-Rezeptor zu einen potenziellen Kandidaten für Gentherapie (WELLNER-KIENITZ et al. 2000). Die Bindung von Adenosin an einen A1Rezeptor der Herzmuskelzelle führt ebenso wie die Acetylcholinbindung an muskarinerge M2-Rezeptoren zur Aktivierung des Pertussis Toxin-sensitiven G-Proteins und über die Bindung des G βγ -Dimers zum Öffnen des Kaliumkanals. Die Öffnung des K(Ach)-Kanals bewirkt schließlich einen Kaliumausstrom aus der Zelle und damit eine Hyperpolarisation in den supraventrikulären Schrittmacherzellen, die elektrische Erregbarkeit der Zellen wird vermindert (Abb. 2) (YAMADA et al. 1998, BRANDTS u. POTT 2000). Damit stellen GIRK-Kanäle die molekulare Basis für die vagal vermittelte Reduktion der Herzfrequenz und für eine Verkürzung der Aktionspotenzialdauer in den Vorhöfen nach Einwirkung von Acetylcholin dar (SAKMANN et al. 1983). Die heterotetrameren K(Ach)-Kanäle werden durch die Untereinheiten Kir3.1 und Kir3.4, die auch als GIRK1 und GIRK4 bezeichnet werden, in einer 2:2-Stöchiometrie LITERATURÜBERSICHT 18 gebildet (BRANDTS u. POTT 2000). GIRK-Kanäle mit ähnlichen Untereinheiten werden in mehreren Gebieten des zentralen Nervensystems exprimiert und haben dort noch weitgehend aufzuklärende Funktionen im Rahmen synaptischer Hemmung (KARSCHIN 1999, DUTAR et al. 2000). Abb. 2: Schematische Darstellung des membrangebundenen Signalweges zur Aktivierung von GIRK-Kanälen am Beispiel des IK(ACh) des Herzens. Nach Aktivierung des Gi-Proteins durch Ligandenbindung an den G-Protein gekoppelten Rezeptor öffnen GIRK-Kanäle nach Binden des G βγ -Dimers. GPCR: G-Protein gekoppelter Rezeptor, Gi: inhibitorisches G-Protein, GIRK: G-Protein aktivierter, einwärtsgleichrichtender Kaliumkanal. 2.3 Gentransfer Der Übertragung von Genen in eukaryotische Zellen wird in der biologischmedizinischen Forschung eine zunehmende Bedeutung zuteil. Die Entwicklung begann mit der Untersuchung von Genfunktionen zur Grundlagenforschung, erst in LITERATURÜBERSICHT 19 Zellkulturen, dann in transgenen Tieren. Daraufhin wurden für biotechnologische Anwendungen vor allem rekombinante Genprodukte in Zellkulturen (Bioreaktoren) oder transgenen Tieren hergestellt (GÜNZBURG 1997). Seit Mitte der 1960er Jahre besteht nun das Interesse an einem Einsatz von Genen zu therapeutischen Zwecken. Zu dieser Zeit waren die ersten Spekulationen über eine mögliche Behandlung von genetischen Störungen durch die virusvermittelte Übertragung funktioneller Gene entstanden (ROMANO et al. 1999). Diese Hypothese wurde 1990 mit dem ersten klinischen Versuch einer Genübertragung zur Behandlung des Adenosindeaminase (ADA)-Mangels Wirklichkeit (BLAESE et al. 1990). Ebenfalls 1990 wurde der erste Versuch einer Gentherapie zur Behandlung eines Melanoms durchgeführt (ROSENBERG et al. 1990). In der folgenden Dekade wurden mehr als 300 Versuchsprotokolle weltweit vor allem zur Behandlung von Krebs (ROTH u. CRISTIANO 1997, PILARO u. SERABIAN 1999) und von angeborenen oder erworbenen monogenetischen Störungen (PILARO u. SERABIAN 1999) genehmigt (ROMANO et al. 2000). Die möglichen Anwendungen der Gentransfertechnologien in der Therapie sind enorm. Erkrankungen, die möglicherweise gentherapeutisch behandelt werden können sind, neben Krebs und Gendefekten, AIDS (PILARO u. SERABIAN 1999) sowie andere Infektionskrankheiten, Kardiopathien (ROMANO et al. 1999, VON DER LEYEN et al. 1999) und neurologische Erkrankungen (IMAOKA et al. 1998, ROSS et al. 1999). Klinische Versuche zur Behandlung von Kardiopathien wurden bereits durchgeführt (LOSORDO et al. 1998, BAUMGARTNER et al. 1998). Außerdem wird die Gentransfertechnologie zur Entwicklung innovativer Impfstoffe benutzt, die auch genetische Immunisierung genannt wird (SEDER u. GURUNATHAN 1999), z. B. für das AIDS-Impfprogramm in den USA (HAYNES 1996, WEBER 1996). Es bestehen weitere Forschungsprogramme zur Entwicklung vorbeugender oder therapeutischer, auf DNA basierender Impfstoffe gegen Malaria (WANG et al. 1998, PARKER et al. 1999), Tuberkulose (TASCON et al. 1996), Hepatitis A-, B- und C-Viren (ANDRE 1995, SALLBERG et al. 1998, FORNS et al. 1999), Influenzavirus (ULMER et al. 1993), Ebolavirus (XU et al. 1998) und La Cross-Virus (SCHUH et al. 1999). Die Grundregel der genetischen Immunisierung kann auch LITERATURÜBERSICHT 20 verwendet werden, um Allergien (ROY et al. 1999) und Autoimmunkrankheiten (LU et al. 1999) zu behandeln oder die Abstoßung transplantierter Gewebe zu verhindern (CHEN et al. 1999, POSTON et al. 1999). Ein junger Vorstoß, Gentherapiestudien zur Behandlung hereditärer Gendefekte in utero durchzuführen, wird kontrovers diskutiert (BILLINGS 1999, BILLINGS et al. 1999, SCHNEIDER u. COUTELLE 1999). 2.4 Vektorsysteme 2.4.1 Nichtvirale Vektoren Fremd-DNA kann mithilfe von viralen und nichtviralen Verfahren in Zellen eingebracht werden. Letztere sind vor allem wegen der bestehenden Sicherheitsbedenken bei der Verwendung von modifizierten Viren als Genübertragungsvehikel interessant, auch wenn sie sich im Allgemeinen als weniger effizient erweisen. Zu den nichtviralen Verfahren gehören physikalische Methoden wie die Elektroporation (ANDREASON u. EVANS 1988, POTTER 1993), die Mikroinjektion (CAPECCHI 1980, BREM et al. 1985), die intramuskuläre Injektion (DAVIS et al. 1993, MONTGOMERY et al. 1993) sowie die Partikelbombardierung (YANG et al. 1990, WILLIAMS et al. 1991, CHENG et al. 1991) und die Druckluftinjektion (Furth et al. 1992). Zu den chemischen Gentransfermethoden zählt die kalziumphosphatvermittelte Transfektion (SCANGOS u. RUDDLE 1981). Daneben werden Liposomen, Virosomen (MANNINO u. GOULD-FOGERITE 1988) und kationische Lipide verwendet (LEDLEY 1995). Außerdem gibt es die Möglichkeit des rezeptorvermittelten Gentransfers (WU u. WU 1987, WAGNER et al. 1990). LITERATURÜBERSICHT 21 2.4.2 Virale Vektoren Die Verwendung von Viren als Vektoren, beruht auf deren Fähigkeit Zellen zu infizieren. Die Vektoren, die bereits in klinischen Versuchen angewendet worden sind, basieren auf Retroviren (GILBOA 1990, MILLER 1990), Adenovirus (LEMARCHAND et al. 1992, ROSENFELD et al. 1992), adenoassoziiertes Virus (PODSAKOFF et al. 1994), Vacciniaviren (MOSS 1996, PAOLETTI 1996), Canarypoxvirus (PAOLETTI 1996) sowie auf Herpessimplexvirus (GLORIOSO et al. 1995). Vorklinische Tests sind durchgeführt worden, um die Gentransfereigenschaften der Vektoren zu kennzeichnen, die auf Foamivirus basieren (RUSSEL u. MILLER 1996), auf Lentiviren [wie humanes Immundefizienzvirus 1 (ZUFFEREY et al. 1997, KIM et al. 1998) und felines Immundefizienzvirus (POESCHLA et al. 1998, JOHNSTON et al. 1999)], humanes Cytomegalovirus (MOCARSKI et al. 1996) und Epstein-Barr-Virus (ROBERTSON et al. 1996). Andere Virenvektoren, die zurzeit in der Entwicklung sind, basieren auf negativsträngigen RNA-Viren (Influenzavirus, PALESE et al. 1996), Alphaviren (FROLOV et al. 1996), Herpesvirus Saimiri (DUBOISE et al. 1996) sowie hybride adenovirale/retrovirale Vektorsysteme (FENG et al. 1997, DUISIT et al. 1999) und hybride alphavirale/retrovirale Vektoren (WAHLFORS u. MORGAN 1999). Jedes Vektorsystem hat seine charakteristischen Eigenschaften, eine Reihe Vorteile und Probleme sowie bevorzugte Anwendungsgebiete in der Therapie. Der schwächste Punkt in der Entwicklung eines Gentransfersystems ist das Vektordesign. Die Probleme hängen im Allgemeinen mit Sicherheitsaspekten, der Verbesserung der Vektorproduktion und Kontrolle der Transgenexpression nach der Zelltransduktion zusammen (ROMANO et al. 1999). Wichtig dabei ist, dass Vektoren für den Patienten keinesfalls pathogen oder toxisch sein dürfen, was durch den Verlust der Replikationsfähigkeit in der Zielzelle weitestgehend sichergestellt werden soll. Deshalb werden beim Vektordesign möglichst nur essenzielle Elemente des Virusgenoms übernommen, wie Verpackungssequenzen, Sequenzen zur Integration und Stabilisierung des Genoms und die dazu gehörenden Regulationseinheiten (RÜGER 1997). LITERATURÜBERSICHT 22 Für die Herstellung eines solchen replikationsdefekten Vektorvirus wird eine komplementierende Helfer- oder Verpackungszelllinie benötigt, die jene Gene enthält, die dem Vektor zur Produktion infektiöser Virionen fehlen (LOUIS et al. 1997, FALLAUX et al. 1996). Bei der Suche nach einem geeigneten Vektorsystem muss die Wahl einer transienten, kurz andauernden Genexpression gegenüber einer langfristigen stabilen Genübertragung abgewogen werden (GÜNZBURG 1997). So kommt es beispielsweise bei retroviralen Vektoren durch Integration ins Wirtsgenom zu einer stabilen Expression (ROBBINS et al. 1998). Aus dieser Integrationsfähigkeit resultiert aber die Gefahr der Insertionsmutagenese in funktionelle Einheiten von Tumorsuppressor- oder Onkogenen (CORNETTA et al. 1990). Bei einigen der sehr effizienten viralen Gentransfersysteme (z. B. solchen, die auf Adenoviren basieren) werden DNA-Moleküle eingeschleust, die nicht in die Wirtszell-DNA integrieren. Diese Information geht nach und nach bei der Zellteilung verloren. Für einige Anwendungen in der Gentherapie hat die zeitlich begrenzte Anwesenheit und Expression von therapeutischen Genen, vor allem in Bezug auf mögliche Sicherheitsrisiken, eindeutige Vorteile, beispielsweise bei bestimmten Formen der Tumortherapie (GÜNZBURG 1997). 2.5 Adenoviraler Gentransfer 2.5.1 Adenoviren Die Familie der Adenoviridae (Ad) wird in zwei Gattungen unterteilt, die Aviadenoviridae, die in verschiedenen Vogelarten endemisch sind, und die Mastadenoviridae, die Säugetiere infizieren können (GÜNZBURG 1997). Diese sind wiederum in zahlreiche Subgenera unterteilt und enthalten neben den humanen Adenoviren auch equine, bovine, ovine, caprine, porcine, canine, murine und Affen-Adenoviren (HINZE 2001). Mehr als 120 Serotypen konnten überwiegend durch immunologische Tests unterschieden werden. Einzelne Serotypen lassen sich anhand ihrer unterschiedlichen LITERATURÜBERSICHT 23 Genome unterscheiden (FLINT 2001). Anhand ihrer genetischen Variabilität sowie dem Glycin- und Cystein- Gehalt ihrer DNA, dem onkogenen Potenzial und der Resistenz gegen neutralisierende Antikörper (WADELL et al. 1980, WADELL et al. 1987) unterscheidet man 49 humane Serotypen (Ad 1 - Ad 49) (HORWITZ 1996). Diese werden 6 Subgruppen (A bis F) zugeteilt, welche sich aufgrund des Hämagglutinationsmusters subklassifizieren lassen (z. B. BI und BIII, DI bis DIII) (MEI u. WADELL 1996, EIZ u. PRING-AKERBLOM 1997). Adenoviren wurden erstmals 1953 in Tonsillengewebe (adenoides Gewebe) nachgewiesen (ROWE et al. 1953) und erhielten daraufhin 1956 ihre Bezeichnung (HAHN et al. 1999). Es handelt sich um unbehüllte Viren mit einem Durchmesser von 70 – 90 nm (NEMEROW u. STEWART 1999) und einer kubischen Kapsidsymmetrie in Form eines Ikosaeders, an dessen Spitzen antennenartige Fibern inserieren. Das Genom besteht aus einer linearen doppelsträngigen DNA von ca. 36 Kilobasenpaaren (kb) Länge. Die Gene sind in fünf funktionellen Gruppen angeordnet, von denen vier (E1 bis E4) zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion aktiviert werden, während L1 bis L5 die Gruppe der spät exprimierten Gene darstellt (SHENK 1996). Adenoviren besitzen ein sehr breites Wirtsspektrum und können teilungsaktive, ruhende wie auch bereits ausdifferenzierte Zellen infizieren (GÜNZBURG 1997). Die Voraussetzung für eine Infektion ist der rezeptorvermittelte Kontakt zwischen Virus und Zielzelle (Attachment). Dabei kommt es bei der Mehrzahl der humanen Adenoviren zur Wechselwirkung der viralen Fiberproteine mit einem integralen Mempranprotein (WICKHAM et al. 1993, MAYR u. FREIMUTH 1997), dem so genannten CAR, einem Rezeptor für Coxsackie- und Adenoviren (BERGELSON et al. 1997, CARSON et al. 1997, TOMKO et al. 1997). In einem zweiten Schritt kommt es durch Wechselwirkung mit zellcodierten α v − Integrinen zur Internalisierung des Virions in Endosomen (WICKHAM et al. 1994, STEVENSON et al. 1995). Nur wenige Adenoviren sind obligat pathogen, im Allgemeinen kommt es zu mild (häufig inapparent) verlaufenden Infektionen bei Mensch und Tier mit Neigung zur Latenz. Vor allem bei Jungtieren (Kalb, Lamm, Fohlen) kann es zu respiratorisch- LITERATURÜBERSICHT 24 enteralen Symptomen kommen (HINZE 2001). Bei einer Infektion mit dem caninen Adenovirus 1 (CAV-1) kann es vor allem bei jungen Welpen auch zu schweren Erkrankungen mit hoher Mortalität kommen (Hepatitis contagiosa canis). Das CAV-1 manifestiert sich bevorzugt in Leber, Gefäßen und z. T. auch im Nervensystem (HERMANNS 1999). Die human pathogenen Adenoviren erzeugen vor allem Erkältungskrankheiten. Auch Gastroenteritiden können die Folge einer Adenovirusinfektion sein, ebenso Infekte der Augen (Konjunktivitis, Keratitis) und des Urogenitaltraktes (HAHN et al. 1999). In sehr seltenen Fällen, wenn Organe und Gewebe, die außerhalb des normalen Wirtsspektrums liegen oder immunsupprimierte Patienten befallen werden, können Adenovirusinfektionen auch zum Tode führen (NIEMANN et al. 1993, OHORI et al. 1995). In den vergangenen Jahren stieg das Interesse an Adenoviren, aufgrund ihrer experimentellen Nutzbarkeit als Vektoren in den Bereichen der Antikrebs- und Gentherapie, an (FLINT 2001). Unter den Gesichtspunkten der breiten Anwendbarkeit, der Fähigkeit hoch differenzierte Zellen zu infizieren, der Möglichkeit das virale Genom zu manipulieren und der Sicherheit solcher genmanipulierter Adenoviren scheinen sie vielversprechende Kandidaten für die Konstruktion von viralen Vektorsystemen zu sein (FLINT 2001, GÜNZBURG 1997). 2.5.2 Adenovirale Vektoren Die Basis für das Konzept eines adenoviralen Vektorsystems bildet die Fähigkeit von Adenoviren, viele verschiedene Zelltypen zu infizieren und ihr Genom in diese Zellen einzubringen. Somit können zusätzlich in das virale Genom eingebaute Fremdgene vergleichbar effizient in die infizierten Zielzellen eingeschleust werden. Da das adenovirale Genom fast den ganzen im Kapsid verfügbaren Raum für sich beansprucht und nur für weitere ungefähr 1,8 kb DNA Platz bleibt (BETT et al. 1993), muss das zu übertragende heterologe Gen anstelle eines viralen Gens in den ade- LITERATURÜBERSICHT 25 noviralen Vektor eingefügt werden. Bei Adenovektoren (AdV) der ersten Generation wird die E1-Region gegen ein heterologes Gen ausgetauscht, somit können Gene mit einer Länge von 4,7 kb eingebaut werden, was der Länge des E1-Gens zusätzlich zu der räumlichen Kapazität von 1,8 kb entspricht (GÜNZBURG 1997). Bei zusätzlicher Deletion der E3-Region, deren Funktion nicht essenziell ist (Modulation der Immunantwort des Wirts, WOLD u. GOODING 1991), entsteht ein zusätzlicher Platz von mehr als 2 kb für ein heterologes Gen (GÜNZBURG 1997). Aufgrund der 105 %igen Verpackungskapazität (BETT et al. 1993) kann somit in E1-/E3- Vektoren maximal ein Bereich von 7,5 kb eingebaut werden (GRAHAM u. PREVEC 1991). Der Vektor wurde in einer menschlichen, embryonalen Nierenzelllinie mit der Bezeichnung 293 (HEK 293) repliziert. Diese Zelllinie trägt und exprimiert Teile des adenoviralen Genoms (GRAHAM et al. 1977), die E1-Genprodukte können E1deletierte Adenoviren komplementieren, sodass rekombinante infektiöse aber replikationsdefiziente Viruspartikel entstehen. Ein Problem bei der Anwendung dieser Vektoren ist zum einen die niedrige Klonierungskapazität, zum anderen die hohe Frequenz der Rekombination der E1Sequenzen mit Vektorsequenzen, wodurch Wildtyp-replikationskompetente Adenoviren entstehen können (LOCHMULLER et al. 1994, HEHIR et al. 1996, GÜNZBURG 1997). Um dieses Sicherheitsrisiko zu umgehen, wurde eine zweite Generation von Vektoren und Verpackungssystemen entwickelt. Den Vektoren der zweiten Generation fehlt nicht nur die E1-Codierungsregion. Zusätzlich hat man die E4-Region, die für essenzielle regulatorische Genprodukte codiert, in den Bereich upstream der E1-Region verschoben. Unter diesen Bedingungen sind viele Rekombinationsereignisse nötig, um ein Wildtypvirus zu erzeugen. Sollte es zu einer Rekombination mit adenoviralen E1-Sequenzen kommen, so fehlt den entstandenen Rekombinanten die E4-Region, wodurch eine weitere Vermehrung nicht möglich ist. Durch eine zusätzliche Infektion mit E4+-Wildtyp-Adenoviren können diese Vektoren allerdings immer noch mobilisiert werden (GÜNZBURG 1997). Ein solches mobilisiertes Virus kann durch eine Attenuierung, z. B. durch eine im Vergleich zum Wildtypvirus niedrigere Verpackungseffizienz, schnell ausverdünnt LITERATURÜBERSICHT 26 werden (GÜNZBURG 1997). Eine Verringerung der Verpackung um den Faktor drei bis zehn ergibt sich aus Sequenzveränderungen der viralen Verpackungssignale, die aus mehreren Alanin-Threonin-reichen Motiven downstream der 5’-inverted terminal repeats (ITRs) bestehen (GRÄBLE u. HEARING 1990, GRÄBLE u. HEARING 1992). Außerdem eliminierte man die niedrige Expression der späten Proteine, die eine Antwort der zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) hervorrufen, indem man eine einzelne Basenmutation in das Gen des DNA-bindenden Proteins (DBP) einführte. Dadurch wurde das für die Expression der späten Gene essenzielle Protein temperatursensitiv (BROUGH et al. 1993). Vektoren werden nun von der Verpackungszelllinie bei der permissiven Temperatur von 32 °C produziert, die normale Körpertemperatur (37 °C) in den Zielzellen ist dagegen nichtpermissiv für das mutierte DBP und die Expression der späten Gene wird verhindert (GÜNZBURG 1997). Wie ENGELHARDT et al. (1994) im Tiermodell nachweisen konnten, kommt es so, aufgrund der abgemilderten CTL-Antwort, zu einer längeranhaltenden Expression der heterologen Gene. Um eine verringerte Wirksamkeit des AdV durch immunologische Prozesse zu vermeiden und die Effizienz des adenoviralen Gentransfers zu verbessern, versuchen andere Untersucher alternative Serotypen (MACK et al. 1997) oder nicht humane Ad (z. B. ovine Ad; LOSER et al. 2000) zu nutzen. Auch wenn das breite Infektionsspektrum adenoviraler Vektoren im Allgemeinen vorteilhaft ist, gibt es Situationen, in denen eine gezielte Infektion oder Expression von heterologen Genen von Vorteil sein könnte. Der Einsatz gerichteter Vektoren zielt vor allem auf eine Veränderung des Zelltropismus und eine Verringerung der Immunogenität und Toxizität (WICKHAM 2000). Dazu können unterschiedliche Methoden genutzt werden, wie die Modifikation des Fiberkopfstücks, z. B. durch den Einbau integrinbindender Arginin-Glycin-Aspartat-Sequenzen (WICKHAM et al. 1996b, WICKHAM et al. 1997, HIDAKA et al. 1999, KASONO et al. 1999) oder Heparinsulfat-bindender Oligolysine (WICKHAM et al. 1996a). Auch bispezifische Fusionsproteine, die zum einen den Rezeptorort des Vektors blockieren und zum anderen einen Liganden in Form eines Antikörpers, eines hochaffinitiven Peptides oder eines Tu- LITERATURÜBERSICHT 27 mormarkers zur Bindung an gewebespezifische Rezeptoren besitzen, wie z. B. EGFR (epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor) (MILLER et al. 1998, DMITRIEV et al. 2000), FAS (CD95) (LEON et al. 1998), FGFR (FibroblastenwachstumsfaktorRezeptor) (WICKHAM 2000), sind eine geeignete Methode. Eine selektive Genexpression bewirkt auch die Verwendung zelltypspezifischer Promotoren (DeMATTEO et al. 1997, LAROCHELLE et al. 1997, EIZEMA et al. 2000). 2.5.3 Adenoviraler Gentransfer in Kardiomyozyten Erst seit wenigen Jahren haben Wissenschaftler im Detail verstanden, wie beispielsweise Herzmuskelzellen arbeiten. Das Wissen über molekularbiologische Grundlagen und Funktionsweisen verschiedener Zelltypen fließt nun auch in die Entwicklung neuer Forschungsstrategien und Therapien ein. Mit den Methoden der Gentechnik sollen Gene in Kardiomyozyten eingeschleust werden, die das Verhalten und den Stoffwechsel der Zelle in der gewünschten Richtung verändern. Um rekombinante Gene in Herzmuskelzellen einzubringen, wird verstärkt adenoviraler Gentransfer genutzt. Verschiedene Versuche führen eine intramuskuläre Injektion des viralen Vektors durch und erzielen eine lokale intensive Transduktexpression, die sich auf eine Region von ein bis zwei Millimeter um den Stichkanal herum beschränkt (GUZMAN et al. 1993, KASS-EISLER et al. 1993). Ein intrakoronarer arterieller Gentransfer führt zu einer diffusen aber weniger effektiven Übertragung, z. B. durch Ex-vivo-Perfusion des Herzens (KYPSON et al. 1998). Diese bietet sich vor einer Herztransplantation am Spenderherzen an, um die Allooder Xenoreaktivität nach der Transplantation zu ändern. Die Expression des übertragenen Gens zeigt sich danach vor allem in der subepikardialen Region des rechten Ventrikels in den Myozyten über den Endothel- und glatten Muskelzellen der Koronargefäße (GOJO et al. 1998, PELLEGRINI et al. 2000). Nach einer perkutanen intrakoronaren Übertragung exprimieren etwa ein Drittel der Zellen in der von der Zielarterie versorgten Region das heterologe Gen. Andere koronare Übertragungs- LITERATURÜBERSICHT 28 methoden, entweder in situ oder ex vivo, produzieren einen kleinen Prozentsatz infizierter Zellen, die sich überall im Herzen finden (DONAHUE et al. 1998). MATERIAL UND METHODEN 29 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Tiere und Tierhaltung Die in den folgenden Versuchen verwendeten Meerschweinchen vom Stamm Dunkin Hartley (Zuchttiere erhalten von Charles River Laboratories) wurden in der Zentralen Versuchstierhaltung der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum zur weiteren Vermehrung und Aufzucht gehalten. Die Tiere wurden in Gruppen bis zu vier Tieren in Meerschweinchenzuchtkäfigen aus Luran (Firma Becker, Größe 70x52x18 cm3) auf staubfreiem Goldspan gehalten. Die durchschnittliche Raumtemperatur lag bei 22 ± 2 °C, die relative Luftfeuchtigkeit bei 55 ± 5 % und der Raum wurde in der Zeit von 8.00 bis 20.00 Uhr beleuchtet. Als Tierfutter wurde standardisiertes, pelletiertes Trockenfutter für Meerschweinchen der Firma Höveler Spezialfutterwerke (Inhaltsstoffe: 19 % Rohprotein, 14 % Rohfaser, 10 % Rohasche, 2 % Rohfett, 1,4 % Ca, 1 % P, 0,3 % Na, 0,95 % Lysin; Zusatzstoffe je kg: 15000 I.E. Vitamin (Vit.) A, 1500 I.E. Vit. D3, 2000 mg Vit. C, 75 mg Vit. E) und Heu verwendet. Trinkwasser wurde den Tieren in Form von Leitungswasser in Tränkflaschen ad libitum angeboten. Insgesamt wurden für diese Arbeit 25 Meerschweinchen beider Geschlechter, in einem Alter von acht bis zehn Wochen und mit einem Gewicht von ungefähr 300 g verwendet. Die Tötung der Tiere zur Organentnahme wurde dem Tierschutzbeauftragten der Ruhr-Universität Bochum angezeigt. 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Gentransfer mithilfe rekombinanter Adenoviren Die Herstellung rekombinanter Adenoviren erfolgte mit dem pAdEasy-System, einem Vektorsystem, das genomische und subgenomische Bestandteile des Ad 5 enthält MATERIAL UND METHODEN 30 (HE et al. 1998). Die damit produzierten rekombinanten Adenoviren sind für Säugetierzellen infektiös, durch Deletion der frühen Gene E1 und E3 aber replikationsdefizient. Die Produktion rekombinanter Adenoviren erfolgte nach dem in Abb. 3 dargestellten Schema (HE et al. 1998). MATERIAL UND METHODEN 31 Abb. 3: Herstellung rekombinanter Adenoviren mithilfe des pAdEasy-Systems. Nach Insertion des Fremdgens in den Transfervektor pAdTrack-CMV durch Ligation erfolgt mittels homologer Rekombination des entstandenen Plasmids mit dem Vektor pAdEasy-1 in E.coli BJ 5183-Zellen die Herstellung rekombinanter adenoviraler DNA (weitere Einzelheiten im Text). Für die anschließende Produktion rekombinanter Adenoviren wurden HEK-293-Zellen verwendet (modifiziert nach HE et al. 1998). 3.2.1.1 Insertion der A1-DNA in den Transfervektor Im ersten Schritt wurde zunächst die komplementäre DNA (cDNA) des purinergen A1-Rezeptors in den Transfervektor pAdTrack-CMV ligiert. Für die vorliegende Arbeit wurde der A1-Rezeptor gewählt, weil dieser unter nativen Bedingungen niedrig exprimiert wird und eine Überexpression funktionell nachweisbar ist. Der Transfervektor enthält die cDNA für ein unter UV-Anregung sichtbares Reporterprotein (green fluorescent protein - GFP). Dadurch wurde in den folgenden Schritten die direkte Beobachtung der Effizienz von Transfektion und Infektion möglich. Die Insertion der Rezeptor-DNA in den Vektor erfolgte durch eine Ligation mithilfe der T4-DNA-Ligase. DNA-Insert und Transfervektor wurden zuvor mit den gleichen Restriktionsendonukleasen, Kpn I und Hind III, behandelt. Ligationsansatz: 400 U T4-DNA-Ligase 100 bis 200 ng pAdTrack-CMV molarer Überschuss von Insert:Vektor = 5:1 ad 10 µl firmeneigener Puffer Die Ligation erfolgte für die Dauer von 10 h bei einer Temperatur von 16 °C. Die Ligase wurde anschließend durch Hitzeinkubation (10 min bei 65 °C) inaktiviert. Von der Plasmid-DNA wurden 2 µl für die Transformation von 40 µl elektrokompetente E. coli XL1-Blue-Zellen durch Elektroporation verwendet. Danach erfolgte die Selektion auf positive Transformanden durch Anzucht auf kanamycinhaltigen (50 µg/ml) LBAgarplatten über Nacht bei 37 °C. MATERIAL UND METHODEN 32 3.2.1.2 Herstellung rekombinanter adenoviraler DNA mittels homologer Rekombination Der zweite Schritt zur Produktion rekombinanter Adenoviren umfasste die homologe Rekombination. Zunächst wurden die Vektoren pAdTrack-CMV, die die cDNA der A1Rezeptoren enthalten, durch eine Restriktion mit dem Enzym Pme I linearisiert und anschließend aufgereinigt. Zur homologen Rekombination wurden die linearisierten Transfer-Vektoren mit dem supercoiled vorliegenden Vektor pAdEasy-1 mittels Elektroporation in elektrokompetente E. coli BJ 5183-Zellen kotransformiert. Transformationsansatz: 500 ng pAdTrack-CMV 100 ng pAdEasy-1 20 µl E. coli (Stamm BJ 5183) Zu dem Transformationsansatz wurden 250 µl LB-Medium gegeben. Anschließend folgte eine 20-minütige Inkubation bei 37 °C. Zur Selektion homolog rekombinierter Vektoren wurden diese auf kanamycinhaltigen (50 µg/ml) LB-Agarplatten angezogen. Die erhaltenen Klone wurden nach einer Miniplasmidpräparation mit einer analytischen Restriktion auf eine erfolgreiche homologe Rekombination hin überprüft (Abb. 4). MATERIAL UND METHODEN 33 Abb. 4: Analyse der homologen Rekombination durch Restriktion mit dem Enzym Pac I. M: Marker Smart Ladder, Eurogentec, DNA-Längenstandard. 1: 33 kb- und 3 kb- Restriktionsfragmente viraler DNA, die nach homologer Rekombination die cDNA des A1-Rezeptors enthält. MATERIAL UND METHODEN 34 3.2.1.3 Produktion rekombinanter Adenoviren Für die Herstellung rekombinanter Adenoviren wurden die aus Punkt 3.2.1.2 gewonnenen adenoviralen Plasmide mit dem Restriktionsenzym Pac I linearisiert. Nach deren Aufreinigung erfolgte die Transfektion mittels Lipofektion von HEK-293-Zellen in 2,5 ml MEM-Medium, die zu 50 bis 75 % konfluent waren (ca. 106 Zellen in einer T25-Zellkulturflasche). Transfektionsansatz: 1x T25-Zellkulturflasche HEK-293-Zellen 4 µg linearisiertes Plasmid 20 µl LipofectamineTM 500 µl MEM-Medium Nach Inkubation in einem Brutschrank für 4 h bei 37 °C und 5 Vol-% CO2 wurden 3 ml MEM-Medium, das zusätzlich 10 % (v/v) FBS und 1 % (w/v) Penicillin/Streptomycin enthielt, dazugegeben. Unter gleichen Bedingungen wurden die Zellen anschließend für die Dauer von sieben Tagen kultiviert. Während der Inkubation konnte der Erfolg von Transfektion und Virusproduktion anhand der Expression des Reportergens GFP mithilfe eines inversen Mikroskops kontrolliert werden. Zu diesem Zweck verfügte das Mikroskop über eine Epifluoreszenzeinrichtung mit einem Filtersatz für GFP (Anregung 470 nm, Emission 515 nm). Zur Isolierung der rekombinanten Adenoviren wurden die HEK-293-Zellen mechanisch von der Wuchsoberfläche der Zellkulturflasche gelöst und durch Zentrifugation pelletiert (10 min bei 500 g). Nach Resuspension der Zellen in 2 ml sterilem PBS-Puffer wurden diese im Trockeneis-Methanol-Gemisch eingefroren. Die gefrorene Zellsuspension wurde daraufhin wieder in 37 °C warmen Wasser aufgetaut, geschüttelt und wieder eingefroren. Nach vier Zyklen wurde der Zelldebris durch Zentrifugation entfernt (10 min bei 500 g), der Überstand enthielt die rekombinanten Adenoviren. Zur Aufkonzentrierung der Virenpartikel wurden HEK-293-Zellen, von oben genannter Zellzahl und Wuchsdichte, mit 1 ml des gewonnenen Überstandes in 3 ml MEM-Medium infiziert und vier bis fünf Tage lang inkubiert. Durch die GFP-Expression konnte die produktive Infektion wiederum leicht beobachtet werden. Die Isolation der Viren erfolgte wie beschrieben. MATERIAL UND METHODEN 35 Die Lagerung des adenoviralen Konstruktes bis zur Verwendung bzw. Transfektion der HEK-Zellen erfolgte gelöst in PBS bei einer Temperatur von –20 °C. Der Titer mit dieser Methode hergestellter Adenoviren wird von HE et al. (1998) mit 106 bis 108 infektiösen Einheiten/ml Überstand angegeben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Virentiter so eingestellt, dass pro Infektion einer 35-mm-Kulturschale isolierter Myozyten (durchschnittlich ca. 5000 Zellen) mit 10 µl Virusüberstand etwa 40 % der Zellen infiziert waren. Daraus läßt sich ein Titer (in gene forming units – GFU) von 2 x 105 GFU/ml errechnen. 3.3 Zellkultur 3.3.1 Isolierung und Primärkultur von Vorhofmyozyten des Meerschweinchenherzens Die Isolierung der Kardiomyozyten des Meerschweinchenherzens erfolgte nach einer Methode von Bechem et al. (1983). 3.3.1.1 Organentnahme Dem Meerschweinchen wurden 30 min vor der Tötung zur Antikoagulation intraperitoneal 5 ml der Heparinlösung (alle Lösungen siehe 3.6.3) und zur Betäubung 2,5 ml der Urethanlösung injiziert. Nach der Tötung durch Ausbluten wurde das Tier in Rückenlage fixiert. Unter sterilen Bedingungen wurden Thorax und Perikard eröffnet, das Herz frei präpariert und die Aortenwurzel dargestellt. Nach intrakardialer Applikation von insgesamt ca. 8 ml der Heparinlösung (steril filtriert) in beide Kammern und Vorhöfe, wurde die Aorta im Bereich der Wurzel inzidiert, sodass eine speziell präparierte Pipettenspitze in die Aorta eingeführt werden konnte. Die Pipettenspitze wurde bis zur Aortenklappe vorgeschoben und mit einem Faden fixiert. Daraufhin wurden in MATERIAL UND METHODEN 36 den linken Ventrikel 2 ml der Heparinlösung injiziert, die bei richtigem Sitz der Pipettenspitze retrograd durch diese nach oben stieg. Danach wurde die Aorta komplett durchtrennt und das Herz entnommen. 3.3.1.2 Perfusion Das isolierte Herz wurde über die in der Aorta fixierte Pipettenspitze an eine sterile modifizierte Langendorff-Perfusion zur retrograden koronaren Perfusion mit konstantem Fluss angebracht. Die Flussrate von 10 bis 15 ml/min wurde kontinuierlich mittels einer peristaltischen Pumpe kontrolliert. Alle verwendeten Lösungen wurden steril filtriert, waren während der Perfusion sauerstoffgesättigt und mithilfe eines Warmwasserbades im doppelwandigen Organbad auf 37 °C angewärmt. Zunächst wurde das Herz zur Gewebereinigung und Entkoppelung der Muskelzellen mit 150 ml der unter 3.6.3 angegebenen kalziumfreien Tyrodelösung für die Dauer von ca. 10 min offen perfundiert. Zur Lockerung des Zellgewebes und Vereinzelung der Myozyten wurde das Herz anschließend im Organbad geschlossen, d. h. das Perfusat rezirkulierte, mit 40 ml der Enzymlösung für etwa 10 min perfundiert, bis sich die Vorhöfe nahezu stumpf von den Ventrikeln ablösen ließen. 3.3.1.3 Isolierung und Primärkultur von Vorhofmyozyten Im Anschluss an die Perfusion wurden die Vorhöfe von den Kammern abgetrennt und der rechte Vorhof getrennt vom linken, wie auch Gewebestücke von beiden Ventrikeln gemeinsam, in jeweils ein 70-mm-Kulturschälchen mit etwa 4 ml der verwendeten Enzymlösung gegeben. Zur Vereinzelung der Zellen wurden die Gewebestücke mit einer Schere zerkleinert und mit einer Pinzette in der Lösung gedippt. Nach kurzer Inkubation wurde die weitere Enzymeinwirkung auf die Herzzellen durch Zugabe einer albuminhaltigen Stopplösung verhindert (3.6.3). MATERIAL UND METHODEN 37 Wie CHAPMAN 1987 berichtete, kommt es während der Exposition von Herzgewebe gegenüber kalziumfreien Lösungen zu einer Überbelastung der Zellen mit Na+. Diese Überbelastung ist die Folge eines anhaltenden Na+-Einstroms über die Kalziumkanäle. Bei Reperfusion mit kalziumenthaltener Lösung tritt das sogenannte „Kalziumparadox“ ein, die Zellen werden dann mit Kalzium überbelastet, wahrscheinlich durch Aktivierung des Natrium-/Kalzium-Austauschers. Diese Kalziumüberbelastung führt zu zytotoxischen Veränderungen des intrazellulären pH und des zellulären Stoffwechsels. Um eine zelluläre Kalziumüberbelastung zu verhindern, wurde durch eine langsame Zugabe geringer Mengen von Lösungen steigender Kalziumkonzentrationen (Lösungen 1 bis 3, 3.6.3) die Kalziumkonzentration an diejenige des Kulturmediums über einen Zeitraum von ungefähr drei Stunden unter ständiger mikroskopischer Kontrolle angepasst. Die Myozyten wurden anschließend auf 35 mm große Kulturschalen bei einer geringen Zelldichte (ca. 5000 Zellen/Kulturschale) ausplattiert und mit jeweils 2 ml Hanks Medium 199 (+ 25 µg/ml Gentamycin und 25 µg/ml Kanamycin) in einem Brutschrank bei einem CO2-Gehalt von 1 % (v/v) und einer Temperatur von 37 °C kultiviert. Das Medium wurde nach jeweils 24 h durch frisches, antibiotikahaltiges Medium 199 ersetzt. Mithilfe des Phasenkontrastmikroskops konnten die Vitalität und der Anheftungsgrad der Primärkultur kontrolliert werden. 3.3.2 Maßnahmen zur Optimierung der Zellkulturbedingungen Um die Adhärenz und Vitalität der isolierten Vorhofmyozyten in vitro zu verbessern, wurden verschiedene Maßnahmen ergriffen. Dabei wurden jeweils 30 - 50 % der vereinzelten Zellen bzw. der Kulturschälchen entsprechend behandelt, um das Ergebnis direkt mit der unbehandelten Kontrollgruppe vergleichen zu können. MATERIAL UND METHODEN 38 3.3.2.1 Zusätze zum Kulturmedium In einigen Versuchen wurde das Kulturmedium, das zu den ausplattierten Myozyten in die Kulturschälchen gegeben wurde, mit Insulin-Transferrin-Selenium-Komplex (ITS) (10 µg/ml Medium) angereichert, um die Vitalität der isolierten Myozyten zu verbessern. Eine andere Maßnahme, zur Verbesserung der Anheftungsfähigkeit der Vorhofzellen, bestand in der Zugabe von 25 µmol/l 2-Mercaptoethanol zum Medium (RAYMOND et al. 1993). Ein weiterer Zusatz, der sowohl zu den Lösungen gegeben wurde, die nach der Isolierung und Vereinzelung der Zellen zur Verwendung kamen (Stopplösung, Lösungen zur Kalziumanpassung, siehe 3.3.1.3), als auch zum Kulturmedium, war Methylcellulose in einer Konzentration von 0,2 g% (STEWART et al. 1995). 3.3.2.2 Beschichtung der Kulturschälchen Eine weitere Möglichkeit, die Zellkulturbedingungen für adulte Herzmyozyten zu verbessern, besteht in der Beschichtung der Kulturschälchen, bevor die isolierten Vorhofmyozyten ausplattiert und mit Hank’s Medium inkubiert werden. Dazu wurde Gelatine 2 %ig auf die Kulturschälchen gegeben, sodass nur der Boden benetzt wurde. Genauso wurde mit Nitrocellulose verfahren, dazu wurde von der NitrocellulosePlatte 1x1 cm2 in 10 ml Methanol gelöst. Zum Trocknen der Beschichtung wurden die so vorbehandelten Schälchen mindestens 30 min lang bei 37 °C inkubiert. 3.3.3 Infektion von isolierten Myozyten mit rekombinanten Adenoviren Die Infektion mit rekombinanten Adenoviren wurde 24 h nach Isolierung der Myozyten durchgeführt. Sie erfolgte mit Aliquots der Virusüberstände, die auch zur Infektion des intakten Herzens durch retrograde koronare Perfusion (3.3.4) benutzt wurden, um beide Infektionsmethoden direkt vergleichen zu können. Dabei wurden je 10 µl und 40 µl der aufkonzentrierten Adenoviren aus Punkt 3.2.1.3 (Titer 2 x 105 GFU/ml MATERIAL UND METHODEN 39 Überstand) in 1 ml 199-Medium auf ein 35-mm-Kulturschälchen isolierter Vorhofmyozyten gegeben. Nach einer Infektionsdauer von 3 h wurde ein Mediumwechsel mit sterilem 199-Medium vorgenommen, um restliche Viren aus dem Medium zu entfernen. Fluoreszensmikroskopisch wurde am ersten und zweiten Tag, sowie drei und sechs Tage nach der Infektion der Infektionserfolg über GFP-Fluoreszenz der infizierten Myozyten kontrolliert. Aus dem Verhältnis GFP-positiver Herzmuskelzellen zur Gesamtzahl der in einem Gesichtsfeld bei 100-facher Vergrößerung ausgezählten Myozyten wurde die prozentuale GFP-Expression errechnet, die als ein Indikator für die erreichte Infektion in Prozent galt. 3.3.4 Adenovirale Genübertragung auf das intakte Herz mittels Perfusion Die Infektion des intakten Herzens mittels Langendorff-Perfusion erfolgte in Anlehnung an eine Methode von DONAHUE et al. (1998). Nach der Entnahme des Herzens wie unter 3.3.1.1 beschrieben wurde dieses an die Langendorff-Perfusion angebracht. Für die folgende retrograde Perfusion galten als Basisbedingungen eine koronare Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/min und eine Organbadtemperatur von 37 °C. Alle verwendeten Lösungen (siehe 3.6.3: Perfusionslösungen für die Infektion des intakten Herzens) waren steril filtriert und während der Perfusion sauerstoffgesättigt. Jedes Herz wurde zuerst von 20 ml der Lösung 1 ohne Rezirkulation durchströmt. Nach der ersten Perfusion wurde das Herz für die Infektion vorbehandelt, indem es zunächst mit 450 ml der Lösung 2 über 15 min offen perfundiert wurde und danach über 3 min mit 90 ml der Lösung 3. Nach der Vorbehandlung wurde das Herz mit 40 ml virushaltiger Perfusionslösung (Lösung 4) infiziert. Während der Infektion wurde das Perfusat gesammelt und rezirkulierte. Die einzelnen Versuche unterschieden sich hinsichtlich des eingesetzten Volumens an Virusüberstand aus Punkt 3.2.1.3 und der Infektionsdauer. Es wurden 5 ml (Titer der Perfusionslösung 4: 2,5 x 104 GFU/ml) oder 10 ml Virusüberstand (Titer der Perfusionslösung 4: 5 x 104 GFU/ml) eingesetzt und diese wurden dann jeweils 30 min oder 60 min lang perfundiert. Am Ende des Infektionsintervalls wurde das Herz mit nicht rezirkulierender, virus- und kalziumfreier Tyrodelösung (3.6.3) für 10 min bei einer Flussrate von 10 bis MATERIAL UND METHODEN 40 15 ml/min durchspült. Anschließend folgten die Perfusion mit der Enzymlösung und die Isolierung und Primärkultur der Myozyten, wie unter 3.3.1.2 und 3.3.1.3 beschrieben. Auch bei dieser Methode wurden am ersten, zweiten, dritten und sechsten Tag post infectionem (p.i.) fluoreszenzmikroskopisch der Infektionserfolg anhand der GFP-Expression der Myozyten kontrolliert und die prozentuale GFP-Expression ermittelt. Um den Einfluss des Virus auf die Zellkultur beurteilen zu können, wurden Kontrollversuche durchgeführt. Dafür wurde das Protokoll wie beschrieben eingehalten, lediglich ohne Zugabe des Virusüberstandes zur Perfusionslösung 4. 3.4 Elektrophysiologische Methoden 3.4.1 Elektrophysiologische Messungen mithilfe der Patch-Clamp-Technik Mithilfe der Patch-Clamp (Membranfleck-Klemme) -Methode wurden elektrophysiologische Ableitungen des einwärtsgleichrichtenden Kaliumstromes isolierter und GFPexprimierender Vorhof- und Ventrikelmyozyten des Meerschweinchenherzens in der Ganzzellableitung durchgeführt. Als Weiterentwicklung der Voltage-Clamp-Technik erlaubt dieses von SAKMANN und NEHER (1984) entwickelte Messverfahren unter hoher Auflösung die Erfassung von Strömen an isolierten Zellen (HAMILL et al. 1981). Die elektrophysiologischen Messungen wurden an den Tagen 3 und 4 nach der Infektion durchgeführt. 3.4.2 Elektrophysiologischer Versuchsaufbau Die Messungen erfolgten unter optischer Kontrolle über ein inverses Mikroskop mit Epifluoreszenzeinrichtung zur Identifizierung infizierter Myozyten. Die mithilfe eines MATERIAL UND METHODEN 41 horizontalen Ziehgerätes aus filamentierten Glaskapillaren aus Borosilikat hergestellten Mikropipetten (Spitzendurchmesser ca. 1 µm, Widerstände zwischen 3 und 7 M Ω ) waren über einen Mikromanipulator bewegbar. Die Mikropipetten-halterung wurde über einen Whole-Cell-Patch-Clamp-Verstärker und einen A/D-Wandler mit einem Personalcomputer verbunden. Verstärkerkontrolle, Durchführung der Messprotokolle sowie Registrierung und Auswertung der Daten erfolgten unter Verwendung des Computerprogrammes ISO 2. Abb. 5: Patch-clamp-Technik zur potentiostatischen Messung der Elementarströme, die durch einzelne Ionenkanäle fließen, und zwar in der Ganzzellkonfiguration (whole-cell, nach SAKMANN u. NEHER 1984). 3.4.3 Elektrophysiologische Registrierung des IK(Ach) Die Messungen des einwärtsgleichrichtenden Kaliumstromes in der Ganzzellableitung erfolgten bei einem Haltepotenzial von –90 mV. Unter den gegebenen Ionenbedingungen der intra- und extrazellulären Lösung (3.2.2) liegt das Umkehrpotenzial für Kalium (EK) bei einem Membranpotenzial von –50 mV. Bei dem Haltepotenzial von – 90 mV fließen K+-Ionenströme in Einwärtsrichtung. Zur Ermittlung von Stromspannungsbeziehungen erfolgten im Abstand von 10 s definierte Spannungsrampen (Änderung des Membranpotenzials von –120 mV auf +60 mV innerhalb von 500 ms). Zur Aktivierung muskarinerger M2-Rezeptoren und nachfolgenden Aktivierung von 42 MATERIAL UND METHODEN GIRK 1/4-Kanälen erfolgte die Applikation von Acetylcholin (20 µM). Der IK(ACh) konnte ebenfalls über purinerge A1-Rezeptoren durch Gabe von Adenosin (10 µM) aktiviert werden. Die zu messende Zelle wurde während der Messungen kontinuierlich mit extrazellulärer Lösung perfundiert. Durch einen kontinuierlichen Zulauf wurde die extrazelluläre Badlösung ständig erneuert (ca. 0,5 ml/min). Ein Lösungswechsel in direkter Umgebung der Zelle erfolgte mit einer Halbwertszeit von weniger als 100 ms. Die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur. Mit einem analogen Filter (Frequenz 3 kHz) wurden die registrierten Daten gefiltert und vor der Auswertung durch einen A/D-Wandler bei einer Frequenz von 200 Hz digitalisiert. 3.5 Chemikalien und Enzyme 3.5.1 Chemikalien für die Molekularbiologie Agar Gibco Agarose Biozym Diagnostics Chloroform Sigma EDTA Sigma Ethanol 100 %ig Riedel-de Haen Glycerol Sigma Kanamycin Merck Lipofectamine-PlusTM Invitrogen Natriumacetat J. T. Baker 43 MATERIAL UND METHODEN 3.5.2 Enzyme für die Molekularbiologie Restriktionsendonukleasen Hind III Roche Kpn I New England Biolabs Pac I New England Biolabs Pme I New England Biolabs T4-DNA-Ligase New England Biolabs 3.5.3 Chemikalien für die Elektrophysiologie und Zellkultur Albumin (Rinderserum, fettsäurefrei) Sigma EGTA Sigma FBS Gibco Gentamycin Sigma Heparin Sigma Hepes Sigma ITS Roche Kanamycin Sigma 2-Mercaptoethanol Sigma Methanol Riedel-de Haen Methylcellulose Sigma Penicillin Sigma Serotonin-Oxalat Sigma Streptomycin Sigma Urethan Sigma 44 MATERIAL UND METHODEN 3.5.4 Enzyme für die Zellkultur Collagenase NB8 Serva Deoxyribonuclease I (DNAse) Sigma Elastase Serva Protease Typ XIV Sigma 3.5.5 Plasmide Plasmid Funktion pAdTrack-CMV adenoviraler Transfer-Vektor pAdEasy-1 das adenovirale Genom enthaltener Vektor 3.5.6 Kits Nucleo Spin Extract ®, 2 in 1 Macherey & Nagel Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen 3.5.7 Bakterienstämme Stamm Escherichia coli XL1-Blue Genotyp recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac (F’ pro AB lac p Z ∆ M15 Tn10 (tet r )) Escherichia coli BJ 5183 endA sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (Str r ) 45 MATERIAL UND METHODEN 3.6 Lösungen und Medien 3.6.1 Lösungen und Medien für die Molekularbiologie Agar-Platten 10 % (w/v) Agar in LB-Medium 6x-DNA-Probenpuffer 0,25 % (w/v) Bromphenolblau 0,25 % (w/v) Xylen-Cyanol-FF 15 % (w/v) Ficoll Ethidiumbromid-Lösung, gebrauchsfertig 10 mg/ml, Biorad LB-Medium (pH 7,0) 10 g/l Trypton 5 g/l Hefeextrakt 10 g/l NaCl NTE-Puffer (pH 8,0) 100 mM NaCl 10 mM Tris 1 mM EDTA PBS-Puffer (pH 7,4) 137 mM NaCl 2,7 mM KCl 10 mM NaH2PO4 2 mM KH2PO4 Phenol, gepuffert (Aquaphenol) Appligene, gebrauchsfertig Puffer OPA (One Phor All) Pharmacia TAE-Puffer (pH 8,0) 40 mM Tris 1 mM EDTA 46 MATERIAL UND METHODEN TE-Puffer (pH 8,4) 100 mM Tris 10 mM EDTA 3.6.2 Lösungen für die Elektrophysiologie Intrazelluläre Lösung (Pipettenlösung) 110 mM Kalium-Aspartat 20 mM KCl 5 mM NaCl 1 mM MgCl2 5 mM Na2ATP 2 mM EGTA 0,01 mM GTP 10 mM Hepes/KOH, pH 7,4 Extrazelluläre Lösung (Badlösung) 120 mM NaCl 20 mM KCl 0,5 mM CaCl2 1 mM MgCl2 10 mM Hepes/NaOH, pH 7,4 3.6.3 Lösungen für die Zellkultur H-Tyrode 140 mM NaCl 5,4 mM KCl 1 mM MgCl2 10 mM Hepes/NaOH, pH 7,4 Heparinlösung 1 mg/ml Heparin in H-Tyrode Urethanlösung 150 mg/ml Urethan 47 MATERIAL UND METHODEN Kalziumfreie Tyrode 400 µM EGTA in H-Tyrode Enzymlösung (in H-Tyrode) Albumin 0,5 mg/ml Collagenase 0,5 mg/ml DNAse 0,1 mg/ml Protease 0,14 mg/ml Elastase 10 µl/ml EGTA 0,4 mM MgCl2 5 mM Stopplösung (in H-Tyrode) Albumin 1,0 mg/ml DNAse 0,1 mg/ml MgCl2 5 mM Lösungen für die Kalziumanpassung Lösung 1: Stopplösung, 0,02 mM CaCl2 Lösung 2: Stopplösung, 0,1 mM CaCl2 Lösung 3: Stopplösung, 1 mM CaCl2 Perfusionslösungen für die Infektion des intakten Herzens Lösung 1: H-Tyrode, 1,0 mM Ca2+ Lösung 2: H-Tyrode, 1,0 mM Ca2+, 10 µM Serotonin Lösung 3: H-Tyrode, 50 µM Ca2+, 10 µM Serotonin Lösung 4: H-Tyrode, 50 µM Ca2+, 10 µM Serotonin, 5 ml oder 10 ml der aufkonzentrierten Adenoviren 48 MATERIAL UND METHODEN 3.6.4 Medien und Beschichtungen für die Zellkultur Bikarbonat-gepuffertes M199 PAA Biologics Opti-MEM Gibco Gelatine Sigma Nitrocellulose Gelman Sciences 3.7 Geräte und Verbrauchsmaterialien Autoklav „3850 ELV“ Systec CO2-Inkubator „BB16“ Heraeus Digitalkamera „AxioCam MRc“ Zeiss Digitalwandler MFK Elektroporator „2510“ Eppendorf Epifluoreszenzeinrichtung Zeiss Filtersatz für GFP AHF-Analysetechnik Geldokumentationsanlage Biorad inverses Phasenkontrastmikroskop „Axiovert 100“ Zeiss Laborwaage „CP 324 S“ Sartorius Laborzentrifuge „Biofuge stratos“ Heraeus Langendorff-Perfusion Eigenbau Magnetrührer „M 32“ GLW Mikromanipulator Luigs & Neumann Mikropipettenhalterung Eigenbau Peristaltische Pumpe „Pumpdrive 5201“ Heidolph pH-Meter „inoLab“ wtw Pipettenpuller „DMZ-Universal-Puller“ Zeitz Instrument Powersupply „PPS 200-1D“ MWG-Biotech Präzisionspipetten Eppendorf 49 MATERIAL UND METHODEN Softwareprogramm Excel, MS-Office 2000 Microsoft Inc. Softwareprogramm ISO 2 MFK Sterilwerkbank „Class II Type A/B 3“ Nuaire Thermomixer „5436“ Eppendorf Tischzentrifuge „5415 R“ Eppendorf Verstärker „EPC 7“ List Vortex „L 46“ GLW Warmluftschüttelinkubator „G 24“ New Brunswick Scientific Warmwasserbad „thermomix 1441“ Braun Warmwasserbad „MA 6“ Lauda Borosilikatglaskapillaren „GCL50F-10“ Havard Apparatus LTD Eimalspritzen 1 ml Dahlhausen Einmalspritzen 10 ml, 20 ml Braun Elektroporationsküvette 400 µl Eppendorf Filter 0,2 µm Schleicher & Schuell Injektionskanülen HLZ Logistik GmbH Pipettenspitzen Eppendorf Röhrchen, konisch Falcon Serologische Pipette 1 ml, 10 ml Falcon Transferpipetten 3 ml Falcon Zellkulturflasche T-25 Falcon Zellkulturschälchen 35 mm, 60 mm Falcon Zellsieb 70 µm Falcon 3.8 Auswertung und statistische Verfahren Die statistische Auswertung der Messdaten bzw. -ergebnisse erfolgte mit Microsoft Excel Algorithmen. Von den durchgeführten Versuchen wurden jeweils drei bzw. MATERIAL UND METHODEN 50 sechs Versuchsreihen unter gleichen Bedingungen ausgewertet. Aus den Versuchsergebnissen wurden das arithmetische Mittel und der zugehörige Standardfehler des Mittelwertes (S.E.M.) errechnet. Die Unterschiede zwischen den Mittelwerten zweier Stichproben wurden mithilfe des ungepaarten Student’s t-Test auf ihre Signifikanz getestet. Unterschiede wurden als signifikant bewertet, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner als 5% war (p<0,05). Signifikanzniveaus wurden ausgedrückt als p<0,05 und p<0,01. ERGEBNISSE 51 4 ERGEBNISSE 4.1 Adenovirale Genübertragung auf das intakte Herz mittels Perfusion 4.1.1 Einfluss der Langendorff-Perfusion auf die Myozyten Im Anschluss an die Perfusion des Meerschweinchenherzens erfolgten die Isolierung und Kalziumanpassung der Herzmuskelzellen unter ständiger mikroskopischer Kontrolle. Unmittelbar nach ihrer Vereinzelung zeigten die rechteckigen Myozyten kantige Ecken und Verzweigungen (Abb. 6). Abb. 6: Foto von Vorhofmyozyten des Meerschweinchenherzens unmittelbar nach der enzymatischen Isolierung (Durchlichtaufnahme, 320-fache Vergrößerung). Die Zellvereinzelung des linken Atriums ergab eine ca. 20 % größere Anzahl Myozyten im Vergleich zum rechten Vorhof und einen größeren Anteil abgestorbener Zellen. Zudem reagierten die Herzmuskelzellen des linken Vorhofs empfindlicher auf die Kalziumanpassung mit Kontraktion. Die Myozyten der Ventrikel waren zu ca. 60 - 70 ERGEBNISSE 52 % unmittelbar nach der Isolierung abgestorben (Abb. 7). Etwa eine halbe Stunde später waren die Ventrikelmyozyten nahezu komplett verdaut. Sterbende Zellen zeigten zunächst Blasen in ihrer rauh erscheinenden Membran. Das Zytoplasma wurde inhomogen, bis nur noch Zellreste übrigblieben. Abb. 7: Foto von Ventrikelmyozyten des Meerschweinchenherzens unmittelbar nach der enzymatischen Isolierung (Durchlichtaufnahme, 320-fache Vergrößerung). Einzelne Ventrikelzellen, die die Vorhofzellkultur kontaminierten, starben jedoch nicht ab. Sie zeigten die gleichen morphologischen Veränderungen wie die atrialen Herzmuskelzellen und konnten bei Durchführung der elektrophysiologischen Messungen als Ventrikelzellen identifiziert werden. Während der ungefähr dreistündigen Kalziumanpassung rundeten sich die Enden der Kardiomyozyten ab, sodass eine länglich ovale Form vorherrschte, die in Primärkultur in eine abgerundete Form überging (Abb. 8). Nach wenigen Minuten in serumfreiem Medium 199 bei 37 °C und einem CO2-Gehalt von 1 % (v/v) begannen sich die Zellen am Boden des Kulturschälchens anzulagern und hafteten zum Teil nach 30 Minuten fest daran. ERGEBNISSE 53 Abb. 8: Fotos von Vorhofmyozyten des Meerschweinchenherzens nach 24 Stunden in vitro (Durchlichtaufnahme, 320-fache Vergrößerung). Bei nahezu 50 % der durchgeführten Versuche war die Adhärenz der kultivierten Vorhofmyozyten nur mäßig. Die Vitalität der Myozyten des linken Vorhofs war in der Regel etwas schlechter als die des rechten. Hier war der Anteil abgestorbener Zellen sowie von Zellen mit rauh erscheinender Membran oder vakuoligem Plasma größer. Die gleichen Ergebnisse zeigten die virusfreien Kontrollversuche, die unter ansonsten gleichen Bedingungen durchgeführt wurden. Der Anteil GFP-positiver Kardiomyozyten war bei Zellen des rechten Atriums um durchschnittlich 10 bis 15 % höher als bei den Myozyten des linken Vorhofs. 4.1.2 Einfluss von Zusätzen zum Medium auf die Zellkultur Der Zusatz von 2-Mercaptoethanol zum Kulturmedium (3.3.2.1) zeigte keine erkennbare Beeinflussung von Vitalität und Anheftungsgrad der kultivierten Kardiomyozyten im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Auch der Zusatz von Methylcellulose sowohl zur Stopplösung als auch zum Kulturmedium hatte keine Veränderung der Primärkultur zur Folge. Nach Zugabe von ITS zum Medium waren die so behandelten Vorhofmyozyten vitaler als die Kontrollzellen. 54 ERGEBNISSE 4.1.3 Einfluss einer Beschichtung der Kulturschälchen auf die Zellkultur Während die Beschichtung der Kulturschälchen mit Gelatine (3.3.2.2) nach 24 Stunden und längerer Inkubation im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe keine Unterschiede erkennen ließ, führte die Beschichtung der Schälchen mit Nitrocellulose zu einer besseren Adhärenz der Vorhofmyozyten in vitro. 4.1.4 Zeitabhängigkeit der GFP-Expression Die Infektion des intakten Herzens erfolgte durch retrograde koronare Perfusion des frisch entnommenen Organs mit rekombinanten Adenoviren (3.3.4). Abb. 9 zeigt den Fluoreszenznachweis von atrialen Myozyten, die drei Tage nach der viralen Infektion GFP-positiv waren. a b Abb. 9: Fluoreszenznachweis durch GFP-positive Vorhofmyozyten drei Tage nach der adenoviralen Genübertragung mittels Langendorff-Perfusion des intakten Meerschweinchenherzens. a: 50-fache Vergrößerung (unter UV-Anregung); b: Durchlichtaufnahme, 200-fache Vergrößerung (unter UV-Anregung). 55 ERGEBNISSE 24 Stunden nach der Infektion konnten einzelne GFP-positive nicht-myokardiale Zellen (Endothelzellen, interstitielle Fibroblasten) in der Primärkultur beobachtet werden. Abb. 10 zeigt das fluoreszenzmikroskopische Bild eines GFP-exprimierenden Fibroblasten. a b Abb. 10: Fluoreszenzmikroskopische Darstellung eines GFP-positiven Fibroblasten 24 Stunden nach adenoviraler Infektion mittels Perfusion eines Meerschweinchenherzens. a: 320-fache Vergrößerung (unter UV-Anregung), b: Durchlichtaufnahme, 320-fache Vergrößerung (unter UV-Anregung). GFP-positive Vorhofmyozyten waren frühestens nach ca. 48 Stunden p.i. sichtbar. Zu diesem Zeitpunkt wurde beispielsweise nach der 60-minütigen Perfusion von 5 ml Virusüberstand eine mittlere GFP-Expression von 3,18 ± 1,15 % erreicht (n=3; p<0,01) bzw. nach 60-minütiger Perfusion von 10 ml Virusüberstand 5,79 ± 1,92 % (n=3; p<0,05). Unter gleichen Bedingungen betrug der prozentuale Anteil GFP-positiver Kardiomyozyten am dritten Tag nach der Infektion 10,54 ± 1,99 % bzw. 18,78 ± 2,67 %. Wie in Abb. 11 dargestellt, stieg die mittlere GFP-Expression bis zum sechsten Tag nach der Infektion auf 21,13 ± 2,53 % bzw. 30,38 ± 1,86 %. Der höchste prozentuale Anteil GFP-exprimierender Vorhofzellen (an Tag 6 p.i.) diente als Maßstab für die ERGEBNISSE 56 erreichte mittlere Infektion unter definierten Versuchsbedingungen und wurde in den folgenden Ergebnissen mit dieser gleichgesetzt. Abb. 11: Zeitabhängigkeit der mittleren GFP-Expression nach 60-minütiger Perfusion von a: 5 ml Virusüberstand (Titer der Perfusionslösung: 2,5 x 104 GFU/ml) bzw. b: 10 ml Virusüberstand (Titer der Perfusionslösung: 5 x 104 GFU/ml); Abszisse: Tage p.i., Ordinate: GFP-Expression (GFP-Expr.) in Prozent; n=3; p<0,01 (a) bzw. p<0,05 (b). 4.1.5 Einfluss der Virusexpositionsdauer auf die Infektionsrate Wie in Abb. 12 dargestellt (Vergleich der mittleren Infektion nach einer Virusexpositionsdauer von 30 und 60 Minuten), besteht eine Abhängigkeit zwischen der Dauer der geschlossenen Langendorff-Perfusion mit der virushaltigen Tyrodelösung und der daraus resultierenden mittleren Infektion der Vorhofmyozyten (= GFP-Expression an Tag 6 p.i.). Während die 30-minütige Exposition von 5 ml Virusüberstand nach 6 Tagen eine mittlere Infektion von 3,07 ± 0,53 % ergab, stieg der prozentuale Anteil ERGEBNISSE 57 GFP-positiver Myozyten am 6. Tag nach einem 60-minütigen Infektionsintervall von 5 ml Virusüberstand auf 21,13 ± 2,53 % an (n=3; p<0,01). Abb. 12: Vergleich der mittleren Infektion nach einer Virusexpositionsdauer von 30 (p<0,01) und 60 Minuten (p<0,01), dargestellt an Tag 6 p. i. nach der Perfusion von 5 ml Virusüberstand (Titer der Perfusionslösung: 2,5 x 104 GFU/ml); Abszisse: Expositionsdauer (Expos.) in min, Ordinate: mittlere Infektion in Prozent; n=3. 4.1.6 Einfluss des Virusvolumens auf die Infektionsrate Das bei der Virusperfusion eingesetzte Volumen Virusüberstand beeinflusst die resultierende prozentuale mittlere Infektion, wie Abb. 13 deutlich macht. Die 60minütige Perfusion von 5 ml Virusüberstand ergab sechs Tage später eine mittlere Infektion von 21,13 ± 2,53 % (p<0,05), während die Perfusion von 10 ml Virusüberstand unter gleichen Bedingungen eine 30,38 ± 1,86 %ige Infektion zur Folge hatte (p<0,05); (n=3). ERGEBNISSE 58 Abb. 13: Vergleich der mittleren Infektion am sechsten Tag nach der 60-minütigen Perfusion von 5 ml (Titer der Perfusionslösung: 2,5 x 104 GFU/ml, p<0,05) und 10 ml Virusüberstand (Titer der Perfusionslösung: 5 x 104 GFU/ml, p<0,05); Abszisse: Volumen der aufkonzentrierten Viren (Virus) in ml, Ordinate: mittlere Infektion in Prozent; n=3. 4.2 Infektion von vereinzelten Myozyten mit rekombinanten Adenoviren Der In-vitro-Gentransfer erfolgte durch Infektion der vereinzelten atrialen Myozyten, 24 Stunden nach ihrer Isolierung, mit rekombinanten Adenoviren (3.3.3). Frühestens nach etwa zwei Tagen p.i. waren GFP-positive Vorhofmyozyten sichtbar. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine mittlere GFP-Expression von 3,48 ± 1,10 % für 10 µl und 6,40 ± 1,69 % für 40 µl erreicht. Am dritten Tag nach der Infektion mit 10 µl Virusüberstand betrug die mittlere GFP-Expression 19,95 ± 4,26 %. Die Infektion mit 40 µl der aufkonzentrierten Adenoviren ergab am gleichen Tag eine 30,58 ± 8,35 %ige GFP-Expression. Bis zum sechsten Tag p.i. stieg die mittlere GFP-Expression, als Maßstab für die Infektion, für 10 µl auf 39,74 ± 7,77 % und für 40 µl auf 54,09 ± 11,54 % an (n=6; für alle angegebenen Expressionsraten gilt p<0,005). ERGEBNISSE 59 Abb. 14: Zeitabhängigkeit der mittleren GFP-Expression nach der In-vitro-Infektion von vereinzelten atrialen Myozyten mit a: 40 µl bzw. b: 10 µl aufkonzentrierter Adenoviren (Titer 2 x 105 GFU/ml Überstand); Abszisse: Tage p.i., Ordinate: mittlere GFP-Exression (GFP-Expr.) in Prozent; n=6; p<0,005 (für a und b). 4.3 Vergleich der Adenovirusinfektion vereinzelter Kardiomyozyten und der Infektion des intakten Herzens mittels LangendorffPerfusion Abb. 15 stellt den direkten Vergleich der Ergebnisse beider Methoden zur Infektion von Kardiomyozyten (4.1 und 4.2) mit Bezug zum Alter der Primärkulturen in Tagen dar. Während die Entwicklung der GFP-Expression tendenziell übereinstimmte, wurden die höheren mittleren Werte nach der In-vitro-Infektion der vereinzelten Vorhofzellen erreicht. Da diese erst einen Tag nach ihrer Isolierung infiziert wurden, zeigt die graphische Darstellung der mittleren GFP-Expression vor allem in den ersten Tagen eine Verzögerung von 24 Stunden im Vergleich zur prozentualen GFPExpression nach Infektion des intakten Herzens. ERGEBNISSE 60 Von der Methode unabhängig unterschieden sich Morphologie und Vitalität der vereinzelten Zellen nicht. Lediglich die Anheftungsfähigkeit der Myozyten war nach Infektion des intakten Herzens geringgradig schlechter. Abb. 15: Vergleich der Entwicklung der mittleren GFP-Expression zwischen der Adenovirusinfektion vereinzelter Vorhofmyozyten und der des intakten Herzens, mit Bezug zum Alter der Primärkulturen, a: Infektion in der Zellkultur mit 10 µl Virusüberstand/Kulturschälchen (Titer 2 x 105 GFU/ml Überstand); b: Infektion des intakten Herzens mit 10 ml Virusüberstand (Titer der Perfusionslösung: 5 x 104 GFU/ml, 60 min Perfusion); Abszisse: Alter der Primärkulturen in Tagen (Tage), Ordinate: mittlere GFP-Expression (GFP-Expr.) in Prozent. ERGEBNISSE 61 4.4 Elektrophysiologische Ergebnisse Der Erfolg der adenoviralen Infektion durch Langendorff-Perfusion lässt sich außer durch die Expression des Reportergens auch funktionell anhand der besonderen elektrophysiologischen Eigenschaften kontrollieren, die eine Überexpression des A1Rezeptors zur Folge hat. Bei der nicht infizierten atrialen Kontrollgruppe zeigten die Ganzzellströme, die durch sättigende Adenosinkonzentrationen hervorgerufen wurden, nach schneller Agonistenapplikation eine langsame Aktivierungskinetik. Zudem waren diese Ströme kleiner als jene, die durch sättigende Acetylcholinkonzentrationen induziert wurden. Die Infektion von Vorhofzellen mit einem Vektor, der die cDNA für den A1-Rezeptor enthielt, führte zur Erhöhung der Expression des A1-Rezeptors, welche nach der extrazellulären Applikation von Adenosin (10 µM) in einer beschleunigten Aktivierung des Kaliumstromes resultierte. Außerdem zeigte sich, im Vergleich zur nicht infizierten Kontrollgruppe, eine deutlich größere Amplitude des IK(ACh),(Ado), die sogar die Amplitude des durch Acetylcholin induzierten Stromes überstieg (Abb. 16). a ERGEBNISSE 62 b Abb. 16: Patch-Clamp-Registrierung eines atrialen IK(ACh)-Kanals (typische Beispiele). Die extrazelluläre Applikation von Acetylcholin (20 µM), sowie von Adenosin (10 µM) aktiviert einen Kaliumeinwärtsstrom (Haltepotenzial –90 mV, EK –50 mV). a: Kontrollzelle; b: infizierte, GFP-positive Vorhofzelle. Die Stromspannungsbeziehung (I/V-Beziehung) der registrierten Stromantwort, ermittelt aus einer Spannungsrampe bei Kanalaktivierung nach Subtraktion des Hintergrundstroms (a-b bzw. c-b), zeigte die für diesen Kanal charakteristische Einwärtsgleichrichtung. Das Umkehrpotential von –50 mV identifizierte den registrierten Strom als einen Kaliumstrom. Abb. 17 zeigt deutlich die bei einer infizierten, GFPpositiven Vorhofzelle größere Stromamplitude I nach der Gabe von Adenosin (a-b) im Vergleich zur Stromamplitude nach Acetylcholinapplikation (c-b). ERGEBNISSE 63 Abb. 17: I/V-Beziehung der registrierten Stromantworten einer GFP-positiven Vorhofzelle (Spannungsrampe von –120 bis +60 mV). Die I/V-Beziehung zeigt die für GIRK-Kanäle charakteristische Einwärtsgleichrichtung, das Umkehrpotential der registrierten Ströme beträgt –50 mV. a-b: Adenosin induzierter Strom nach Subtraktion des Hintergrundstroms; c-b: Azetylcholin induzierter Strom nach Subtraktion des Hintergrundstroms. Analog dazu konnten auch bei den adenoviral infizierten Ventrikelzellen, die unter physiologischen Bedingungen kleine Acetylcholin-induzierte Ströme und minimale Adenosin-induzierte Ströme zeigten, nach der extrazellulären Adenosinapplikation eine schnellere Aktivierungskinetik sowie eine deutlich größere Amplitude des IK(ACh),(Ado) gemessen werden (Abb. 18). ERGEBNISSE 64 Abb. 18: Patch-Clamp-Registrierung eines IK(ACh),(Ado) einer infizierten, GFP-positiven Ventrikelzelle. Die extrazelluläre Applikation von Acetylcholin (20 µM), sowie von Adenosin (10 µM), aktiviert einen Kaliumeinwärtsstrom (Haltepotenzial –90 mV, EK – 50 mV). Die Gabe von Barium (2 mM) blockiert den Hintergrundstrom. DISKUSSION 65 5 DISKUSSION Die physiologische Grundlagenforschung, z. B. an Signalwegen über G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) oder Ionenkanälen als „Kommunikationsproteine“, steht in enger Beziehung zu vielen Gebieten der klinischen Medizin. Ein Grundverständnis für diese Abläufe ist hilfreich für die Entwicklung therapeutischer Strategien bei Mensch und Tier. Dabei bieten gentechnische Methoden neue Möglichkeiten. Durch die Übertragung fremder genetischer Informationen können z. B. Genfunktionen untersucht werden. Um rekombinante Gene in Kardiomyozyten zu übertragen, wird vor allem der adenovirale Gentransfer eingesetzt. Gentransfer ist somit nicht nur eine neue Möglichkeit der Therapie bestimmter angeborener und erworbener Erkrankungen, sondern auch ein nützliches Werkzeug für die Grundlagenforschung. Für die Erforschung der Signaltransduktion über GPCRs wendet die Abteilung für Zelluläre Physiologie der Ruhr-Universität Bochum auch ein adenovirales Verfahren an. Durch Manipulation des Expressionsniveaus von Proteinen in differenzierten Herzmuskelzellen (Überexpression, Knock-out, Funktionsmutanten) werden Signalfunktionen analysiert. Bislang findet der Gentransfer in der Zellkultur statt. Mithilfe der vorliegenden Arbeit sollte ein Verfahren etabliert werden, mit dem das intakte Herz unmittelbar nach der Organentnahme adenoviral infiziert wird. Ziel dieses Verfahrens sollte eine Vergrößerung des Zeitfensters sein, das zur Verfügung steht, um die Auswirkungen der Manipulation untersuchen zu können. Im Hinblick auf den turnover eines Proteins ist die Zeit, die zu dessen Untersuchung zur Verfügung steht, limitiert. Durch die im Bezug zum Alter der kultivierten Zellen früher nachweisbare Expression des heterologen Gens wird der Zeitraum, indem z. B. elektrophysiologische Messungen durchgeführt werden können, größer. Die Virusinfektion des intakten Herzens wurde mit dem Gentransfer an isolierten adulten Vorhofmyozyten in Primärkultur verglichen. Außerdem sollten Maßnahmen geprüft werden, die zu einer Verbesserung der Zellkulturbedingungen der Kardiomyozyten beitragen. DISKUSSION 5.1 66 Langendorff-Perfusionsmodell zur Infektion des intakten Herzens Die Infektion des intakten Herzens durch koronare Perfusion erfolgte in Anlehnung an eine Methode von DONAHUE et al. (1998). Um einen effektiven und homogenen Gentransfer auf das intakte Herz eines Kaninchens mit einer möglichst kurzen Virusexpositionszeit zu erreichen, setzten die Autoren die mikrovaskuläre Permeabilität steigernde Mittel (Serotonin, geringe extrazelluläre Kalziumkonzentration) und hohe Viruskonzentrationen ein. In der vorliegenden Arbeit erfolgte der adenovirale Gentransfer auf das intakte Herz eines Meerschweinchens, das vor allem für kardiovaskuläre Untersuchungen ein viel verwendetes Versuchstier darstellt. Eine Konsequenz bei der Weiterentwicklung des Verfahrens bestünde in der Etablierung des Langendorff-Models für Herzen von Ratten und Mäusen, da für diese Tierarten der größte Pool an bereits bekannten cDNAs für Genprodukte existiert (z. B. transgene Tiere oder Knock-out-Tiere). Mithilfe des unter UV-Anregung nachweisbaren Reporterproteins GFP wurde an den Tagen 1 bis 6 nach der adenoviralen Genübertragung der Infektionserfolg kontrolliert. Nicht-myokardiale Zellen zeigten bereits nach 24 Stunden in vitro GFP-Expression. Die ermittelte prozentuale GFP-Expression der Vorhofmyozyten stieg von Tag 2 bis Tag 6 p. i. an. Diese zeitlich unterschiedliche bzw. verzögerte Expression ist zum einen abhängig vom infizierten Zelltyp (Endothelzelle, Fibroblast, Ventrikelzelle, Vorhofzelle), zum anderen abhängig von der differierenden Beeinflussung der Zellen durch die Präparation. Während DONAHUE et al. (1998) nach der 10-minütigen Perfusion einer Viruslösung mit einer Konzentration von 6,0 x 108 Plaque bildenden Einheiten (PBE)/ml eine Infektion von 91,5 % bzw. bereits nach 2 Minuten Perfusion mit 1,6 x 109 PBE/ml eine Infektion von 92,3 % erreichten, führte die 60-minütige Perfusion von 10 ml Virusüberstand in 40 ml Tyrodelösung (Titer der Perfusionslösung: 5 x 104 GFU/ml) in der vorliegenden Arbeit zu einer mittleren Anzahl GFP-positiver Zellen von 30,38 %. Der DISKUSSION 67 Hauptgrund für die deutlich geringer ausfallende Infektionsrate, trotz der längeren Virusexpositionsdauer, liegt sehr wahrscheinlich in der geringeren Konzentration der verwendeten Viruslösung. Es können verschiedene Methoden angewendet werden, um den Titer einer Viruslösung zu bestimmen. Der Virustiter bei DONAHUE et al. (1998) wurde mithilfe eines sogenannte Plaque-Assays bestimmt. Der in dieser Arbeit verwendete selbst produzierte Virusüberstand wurde mithilfe der In-vitro-Infektion isolierter Vorhofmyozyten genauer definiert. So ergab die Infektion eines 35-mm-Kulturschälchens isolierter Vorhofzellen (ca. 5000 Zellen) mit 10 µl Virusüberstand in 1 ml Medium eine Infektionsrate von etwa 40 %. Daraus lässt sich rechnerisch ein Titer von 2 x 105 GFU/ml abschätzen. Die angegebenen Virustiter sind somit nicht vergleichbar. Selbst der Titer derselben Viruslösung kann, abhängig von der benutzten Methode, mehr als 100fach abweichen (QUANTUM BIOTECHNOLOGIES 2000). Die Versuche zur adenoviralen Infektion des intakten Meerschweinchenherzens wurden mit verschieden langen Infektionsintervallen von 30 min und 60 min durchgeführt. Dabei zeigte sich eine Abhängigkeit zwischen der Dauer der Virusexposition und der daraus resultierenden prozentualen Infektion der Vorhofmyozyten. Mit steigender Virusexpositionsdauer ergab sich auch eine steigende Anzahl GFP-positiver Zellen. Dieses Ergebnis stimmt überein mit den Erfahrungen von DONAHUE et al. (1997). Im Vergleich zur extrem schnellen Infektion isolierter Kardiomyozyten ist die Virusinfektion des intakten Herzens deutlich langsamer, was zeigt, dass viel von der Verzögerung im intakten Herzen Diffusionsbarrieren (Kapillarendothel, Basalmembran, extrazelluläre Matrix) zuzuschreiben ist. Die direkte Abhängigkeit zwischen Expositionsdauer und resultierender Infektion zeigt deutlich, dass ausreichend Zeit wichtig ist, damit das Virus die Diffusionsbarrieren überwinden kann. Am Ende des Infektionsintervalls erfolgte eine Spülung durch koronare Perfusion des Herzens mit virusfreier Tyrode und die enzymatische Vereinzelung der Vorhofzellen. Zum Infektionserfolg tragen somit nur die Viren bei, die bis zum Beginn der Spülung die genannten Diffusionsbarrieren überwinden und die Herzmuskelzellen infizieren können. Eine längere Virusexpositionsdauer bei gleicher Flussrate führt zudem zu einer grö- DISKUSSION 68 ßeren Anzahl von Passagen der Viren durch das Herz, und dadurch zu einer entsprechend größeren Anzahl von Viren, die während der Perfusion aus dem Gefäßraum treten und die Myozyten infizieren können. Das Infektionsintervall ist jedoch nicht beliebig verlängerbar, da auch Vitalität und Adhärenz der Vorhofmuskelzellen in Primärkultur von der Dauer der Gesamtperfusion beeinflusst werden. So hat eine länger andauernde Langendorff-Perfusion vor allem schlechter haftende Zellen zur Folge, die damit für weitere Untersuchungen mittels Patch-Clamp-Messungen nicht mehr zur Verfügung stehen. Auch im Hinblick auf eine Adaptation dieser Technik für die Gentherapie ist die Virusexpositionsdauer limitiert, denn hierbei besteht das Ziel in einem Gentransfer, der sich in einem für Invivo-Übertragung praktikablen Zeitraum vollzieht. Zudem haben DONAHUE et al. (1997) die Erfahrung gemacht, dass nach der 60-minütigen Virusperfusion die maximale Infektionsrate erreicht wird und sich diese auch durch längere Virusexposition nicht vergrößert. Der Einfluss der Diffusionsbarrieren auf die Verteilung der Transgenexpression im Herzen wird deutlich durch das Ergebnis einer histologischen Untersuchung, die GOJO et al. (1998) nach der koronaren Perfusion eines adenoviralen Vektors durchführten. Dabei zeigte sich die Expression des übertragenen Gens vor allem in den Myozyten über den Endothel- und glatten Muskelzellen der Koronargefäße. Bei einer anderen histologischen Untersuchung nach Langendorff-Perfusion eines adenoviralen Vektors zeigte sich ebenfalls, dass die Transgenexpression nicht gleichmäßig im Herzen verteilt war (PELLEGRINI et al. 2000). Eine effiziente Transgenexpression fand sich in den perivaskulären Bereichen und in der subepikardialen Region, während in Richtung subendokardiale Region des Herzens die Expression deutlich nachließ. Auch eine Erhöhung der Flussrate und des Perfusionsdrucks erbrachte keine Veränderung der Verteilung der Transgenexpression. In den verschiedenen Versuchen der Langendorff-Perfusion zur Infektion des intakten Herzens wurden 5 ml und 10 ml der aufkonzentrierten Adenoviren in Zelltyrode eingesetzt. Dabei zeigte sich eine direkte Abhängigkeit zwischen dem eingesetzten Volumen Virusüberstand und der resultierenden Infektionsrate. DISKUSSION 69 Da es sich um das gleiche Verfahren zur Produktion rekombinanter Adenoviren handelte, hatten die gewonnenen Virusüberstände den gleichen Titer (höchstens unbedeutende, sehr geringe Abweichungen). Insgesamt wurden 40 ml der unter 3.6.3 beschriebenen Lösung 4 (Perfusionslösung für die Infektion des intakten Herzens) zur geschlossenen Perfusion eingesetzt. Die Virentiter der verwendeten Perfusionslösungen unterschieden sich entsprechend des Volumens an Virusüberstand, das zur Infektion des Herzens eingesetzt wurde (2,5 x 104 GFU/ml und 5 x 104 GFU/ml). Die direkte Abhängigkeit zwischen der eingesetzten Viruskonzentration und der resultierenden Infektion haben auch DONAHUE et al. (1997, 1998) beschrieben. Ausschlaggebend ist also ein hohes Virus-Zell-Verhältnis. Um mit dem beschriebenen Verfahren eine Perfusionslösung mit einem größeren Virustiter und eine größere Anzahl GFP-positiver Myozyten erhalten zu können, müssen Virusüberstände mit höheren Titern oder größere Volumina der aufkonzentrierten Adenoviren eingesetzt werden. Mit dem unter Punkt 3.2.1 beschriebenen Verfahren zur Herstellung rekombinanter Adenoviren läßt sich unter den gegebenen Laborbedingungen der Titer recht zeitaufwendig nur geringgradig erhöhen. Die Aufkonzentrierung erfolgt wie unter 3.2.1.3 beschrieben durch Infektion von HEK-293-Zellen mit 1 ml des gewonnenen Virusüberstandes. Bis zur Lyse der Zellen vergehen durchschnittlich vier bis fünf Tage, erst dann kann der Virusüberstand mit höherem Titer geerntet werden. Um den Titer der Viruslösung deutlich zu erhöhen, würden mehrere dieser Verfahren zur Aufkonzentrierung benötigt. Da es sich bei der Virusperfusion um eine geschlossene Perfusion mit Rezirkulation handelt und das Fassungsvermögen von Organbad und Perfusionsschlauch im vorliegenden Fall maximal 40 ml entspricht, ist das einzusetzende Volumen Virusüberstand nur begrenzt vergrößerbar. Wie beschrieben machten die Herzmuskelzellen nach ihrer Vereinzelung eine morphologische Veränderung durch als sichtbares Zeichen der beginnenden Dedifferenzierung während der Kultivierung. Zunächst zeigten sie eine der im Zellverband des intakten Herzmuskels entsprechende Form mit Ecken und Verzweigungen, durch die DISKUSSION 70 die Verbindung mit Nachbarzellen gewährleistet wurde, dann erfolgte eine Abrundung der Zellen. Im Gegensatz zu den Vorhofzellen waren mehr als die Hälfte der Ventrikelmyozyten unmittelbar nach der Isolierung bereits abgestorben. Etwa eine halbe Stunde später waren die Zellen nahezu komplett verdaut, die vereinzelten vital erscheinenden Ventrikelzellen hafteten jedoch nicht an und gingen nach ein bis zwei Tagen in vitro zugrunde. Vor allem die zehnminütige Perfusion der Enzymlösung zur Vereinzelung der Herzmuskelzellen scheint dafür verantwortlich zu sein. Zur Isolierung von Ventrikelzellen genügt bereits eine etwa fünf- bis siebenminütige Enzymeinwirkung dieser Konzentration. Zusätzlich wirkt sich die ungefähr 100 Minuten dauernde gesamte Perfusion negativ auf die Vitalität der Ventrikelzellen aus. Einzelne vitale und adhärente Ventrikelzellen, die die Kultur der Vorhofmyozyten kontaminierten, konnten elektrophysiologisch identifiziert werden. Aufgrund der besseren Kulturbedingungen konnten sie anheften und gingen nicht zugrunde, während sich in der Ventrikelzellkultur die große Menge an verdauten Zellresten negativ auf die Zellen auswirkte. Da der linke Vorhof eine dickere Wand besitzt als der rechte Vorhof, ergab die Zellvereinzelung eine ca. 10 % größere Anzahl Myozyten des linken Atriums im Vergleich zum rechten. Die Ursache für die Beobachtung, dass die kultivierten Vorhofmyozyten des rechten Atriums in der Regel vitaler waren und ein besseres Anheftungvermögen zeigten, bleibt unklar. Beim klassischen Langendorff-Verfahren beginnt die retrograde koronare Perfusion wie beschrieben mit der Zuführung der Perfusionslösung durch eine präparierte Pipettenspitze, die in der Aorta fixiert ist. Im Bereich der Aortenklappen entspringen in den Sinus aortae die Herzkranzarterien (Arteriae coronariae sinistra und dextra), die subepikardial verlaufen und in die Muskulatur eindringende Myokardäste abgeben. Diese gehen in ein außerordentlich dichtes, dreidimensionales Kapillarnetz über, das jeweils ein bestimmtes Muskelareal versorgt. Der Abfluss der Perfusionslösung aus der Muskulatur erfolgt über die Venae cordis in den rechten Vorhof, und aus diesen durch die vordere Hohlvene (Vena cava cranialis) oder über die rechte Kammer durch den Truncus pulmonalis. Um ihren DISKUSSION 71 richtigen Sitz zu kontrollieren könnte die Pipette bei der Platzierung in der Aorta möglicherweise zu weit in Richtung linker Ventrikel vorgeschoben und dabei die Aortenklappe beschädigt worden sein. Vor der Fixierung der Pipette mithilfe eines Fadens wurde diese wieder zurückgezogen, so dass sie vor den Sinus aortae platziert war. Nur so ist eine koronare Perfusion überhaupt möglich, und nur dann können vitale Zellen isoliert werden. Aufgrund einer eventuellen Schädigung der Aortenklappe wäre es möglich, dass ein Teil der Perfusionslösung von der Aorta direkt in die linke Herzkammer und von dort aufgrund des Perfusionsdrucks retrograd in den linken Vorhof gelangt und durch die Lungenvenen (Venae pulmonales) aus dem Herzen tritt. Möglicherweise erfahren dabei die Zellen der linken Herzhälfte eine mechanische Alteration durch den Druck der Perfusionslösung, aufgrund deren sie nach der Vereinzelung empfindlicher auf die Kalziumanpassung reagieren und in der Primärkultur eine schlechtere Adhärenz und Vitalität zeigen, was auf eine Schädigung der Zellmembran hindeutet. Außerdem fiel auf, dass die Herzmuskelzellen des rechten Vorhofs eine um 10 bis 15 % höhere GFP-Expression zeigten im Vergleich mit den Myozyten des linken Vorhofs. Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen PELLEGRINI et al. (2000) bei der Perfusion eines adenoviralen Vektors unter hypothermen Bedingungen. Die anschließende histologische Untersuchung zeigte bei 75 % der untersuchten Herzen eine betonte Transgenexpression im rechten Ventrikel im Vergleich zum linken Ventrikel (die Vorhöfe wurden nicht untersucht). Möglicherweise steht dieses Ergebnis im Zusammenhang mit der bereits erwähnten Hypothese der durch den Perfusionsdruck bedingten mechanischen Schädigung von Myozyten des linken Herzens. So kann eine Schädigung der Zellmembran und ihrer Strukturen die rezeptorvermittelte virale Infektion der Zielzelle beeinträchtigen. Das würde die geringere GFP-Expression der Myozyten des linken Vorhofs erklären. In der vorliegenden Arbeit wurde der Expressionsgrad des A1-Rezeptors in adulten Herzmuskelzellen des Meerschweinchens durch Infektion manipuliert. Die daraus resultierende Überexpression führte zu einer erhöhten A1-Rezeptordichte, aufgrund derer die infizierten Kardiomyozyten eine im Vergleich zur nicht manipulierten Kon- DISKUSSION 72 trolle schnellere Aktivierungskinetik und eine größere Amplitude des Kaliumstromes nach Adenosingabe zeigten. Die Amplitude des IK(ACh),(Ado) überstieg sogar die Amplitude des durch Acetylcholin induzierten Stromes. Zum gleichen Ergebnis kamen auch WELLNER-KIENITZ et al. (2000) nach der Transfektion von Kardiomyozyten der Ratte mit dem A1-Rezeptor. Normalerweise ist die Ansprechbarkeit des IK(ACh) über den A1-Rezeptor geringer als über M2-Rezeptoren (BÜNEMANN u. POTT 1995). Die Transfektion mit einem A1-tragenden Vektor resultierte in einer Zunahme des maximalen IK(ACh),(Ado)-Stroms. Außerdem kam es bei 70 % der positiven Zellen zu einer erheblichen Abnahme der ACh-induzierten Ströme. Diese Reduktion des über M2-Rezeptoren ausgelösten Stromes könnte die Folge einer Konkurrenz von A1und M2- Rezeptoren (und möglicherweise anderer Rezeptoren) um einen gemeinsamen Pool von G-Proteinen sein. Möglich wäre auch, dass die Überexpression des A1-Rezeptors negative Auswirkungen auf die Expression des M2-Rezeptors hat (WELLNER-KIENITZ et al. 2000). Die Applikation von Barium bei den Ventrikelzellen erfolgte, um den Bariumsensitiven Hintergrundstrom IK1 zu blockieren. So konnte gezeigt werden, dass die untersuchte Zelle intakt war und keine Leckströme auftraten. 5.2 Optimierung der Zellkulturbedingungen RAYMOND et al. (1993) beschrieben die Wirkung von 2-Mercaptoethanol in sehr geringer Konzentration als Überlebensfaktor für verschiedene Neurone, wahrscheinlich indem es hilft das neuronale Antioxidationssystem zu verstärken, vielleicht durch Förderung der Cyst(e)inaufnahme. Diese Wirkung zeigte es jedoch nicht bei Herzmuskelzellen in vitro, die Zugabe von 2-Mercaptoethanol zum Kulturmedium erzielte keine Verbesserung der Vitalität und Adhärenz der isolierten Myozyten. Durch Zugabe von Methylcellulose (STEWART et al. 1995) zeigten Suspensionen von verschiedenen anheftungsabhängigen Zellen, nach der Abtragung von den Kulturplatten mittels Trypsin oder EDTA und dem erneuten Ausplattieren und Inkubieren, die deut- DISKUSSION 73 lichste Erhaltung der Anheftungsfähigkeit. Die Zugabe von Methylcellulose zu den Lösungen, die zu den vereinzelten Vorhofmyozyten gegeben wurden, zeigte jedoch nicht die erhoffte Verbesserung der Anheftungsfähigkeit. Lediglich die Zugabe von ITS erbrachte eine deutliche Verbesserung der Vitalität und Adhärenz der kultivierten Vorhofzellen im Vergleich zu den unbehandelten Primärkulturen. ITS ist ein nährendes und wachstumsförderndes Supplement zum Kulturmedium. Dabei wirkt das anabole Pankreashormon Insulin als ein Wachstumsfaktor. Selen ist ein essenzielles Spurenelement, das zu den Antioxidantien zählt und Bestandteil der Glutathionperoxidase ist. Transferrin ist ein Plasmaprotein, das freies, dreiwertiges Eisen im Serum bindet und transportiert. Die Gelatinierung der Kulturschälchen erbrachte keine verbesserte Anheftungsfähigkeit. Gelatine wird als dreidimensionales Biopolymer vielfach als Adhäsionsvermittler in Zellkulturen eingesetzt. Eine deutlich bessere Adhärenz zeigten die Vorhofzellen, die auf mit Nitrocellulose beschichteten Kulturschälchen ausplattiert wurden. Dabei handelt es sich um ein Polysaccharid, das ebenfalls eine dreidimensionale Matrix in den Kulturschälchen bildet, wodurch die Zellen eine größere Oberfläche zum Anheften finden. 5.3 Schlussbetrachtung Beim direkten Vergleich des Perfusionsmodells zur Infektion des intakten Herzens mit dem adenoviralen Gentransfer in Primärkultur, zeigten sich die Zellen des infizierten intakten Herzens morphologisch unverändert und unbeeinflusst. Allerdings fiel bei etwa der Hälfte der Perfusionsversuche die schlechtere Anheftungsfähigkeit der Vorhofmyozyten auf. Diese zeigte sich auch bei den Kontrollversuchen des Perfusionsmodells, bei denen das gleiche Protokoll eingehalten wurde, nur ohne Zugabe des adenoviralen Vektors. So scheint die schlechtere Adhärenz nicht die Folge der Viruseinwirkung zu sein, sondern hängt, wie bereits erwähnt, mit der möglichen me- DISKUSSION 74 chanischen Schädigung der Zellen durch die länger andauernde Perfusion im Vergleich zur In-vitro-Infektion zusammen. Der zeitliche Verlauf der GFP-Expression war bei beiden Methoden ähnlich, bei der Infektion von isolierten, kultivierten Vorhofmyozyten konnte letztendlich aber eine höhere mittlere Infektion erzielt werden. In den ersten zwei bis drei Tagen nach der Zellvereinzelung kommt jedoch der 24-stündige „Vorsprung“ zum Tragen, den das Langendorff-Perfusionsmodell gegenüber der Infektion vereinzelter Zellen nach 24 Stunden in vitro hat. Das bedeutet, dass man 24 Stunden länger Zeit hat, den Expressionserfolg auszuwerten. Das ist von Bedeutung, wenn man beispielsweise mit einer K.o.-Mutanten die Funktion eines bestimmten Proteins ausschalten will. Wie bereits erwähnt ist die Zeit, die zur Verfügung steht, um die Auswirkungen der gentechnischen Manipulation zu untersuchen, gerade im Hinblick auf den turnover eines Proteins, limitiert. Zudem sind die Bedingungen für eine elektrophysiologische Untersuchungen der Zellen günstiger, denn je jünger die Zellkultur ist, desto nativer sind die zu messenden Ströme. Primäre Zellen enthalten die nahezu komplette, ursprüngliche biologische Information und lassen somit besonders aussagekräftige Rückschlüsse auf die Stoffwechselsituation im Körper zu, da die Gene in einer ihrer nativen Umgebung ähnlichen Situation untersucht werden können. Durch längere Kultivierung kommt es allerdings zu Anpassungsvorgängen, die schon früh in den morphologischen Veränderungen sichtbar und schließlich auch elektrophysiologisch auszumachen sind. Beispielsweise beschrieben VELDKAMP et al. (1999), dass die Abnahme des einwärtsgleichrichtenden Stromes in Ventrikelzellen des Kaninchens, wie sie bereits am dritten Tag der Primärkultivierung beobachtet werden konnte, das Resultat einer Verringerung der Anzahl aktiver Kanäle war. Abschließend betrachtet kann zum einen ein Verfahren etabliert werden, mit dem das intakte Herz eines Meerschweinchens unmittelbar nach der Organentnahme adenoviral infiziert wird. Im Hinblick auf das Alter der Primärkultur, die das Reportergen in einer für die elektrophysiologische Untersuchung ausreichenden Menge exprimiert, bietet das genannte Verfahren Vorteile gegenüber der In-vitro-Infektion, weil Patch-Clamp-Messungen der Kardiomyozyten ein bis zwei Tage früher durchge- 75 DISKUSSION führt werden können. Somit wirkt sich das Ergebnis dieser Arbeit positiv auf die Möglichkeit zur Grundlagenforschung, in diesem Falle über G-Protein gekoppelte Signaltransduktion, aus. Zum anderen läßt der erfolgreiche adenovirale Gentransfer über die Blutbahn auf das intakte Herz Rückschlüsse zu für entsprechende gentherapeutische Verfahren, z. B. an einem Spenderherzen vor der Transplantation. Es ist allerdings noch ein weiter Weg, bis Forschungsergebnisse bei Patienten angewendet werden können. Problematisch ist nicht nur die Frage, ob experimentelle Ergebnisse auf den Patienten übertragen werden können. Generell drohen bei solchen Therapien auch schwerwiegende Komplikationen, wie z. B. entzündliche oder onkogene Wirkungen, die Expression in Nicht-Zielzellen und die Induktion von autoimmunen Prozessen. Auch muss geklärt werden, wie die Langzeitwirkungen der Therapie aussehen. Sogar mit einer wirkungsvollen Technik der Genübertragung sind parallele Bemühungen notwendig, geeignete therapeutische Genkonstrukte zu entwerfen. ZUSAMMENFASSUNG 76 6 ZUSAMMENFASSUNG Andrea Nave Optimierung von Verfahren zum In-vitro-Gentransfer am Meerschweinchenherzen mittels adenoviraler Vektoren Das Ziel dieser Studie war es, ein Verfahren zu etablieren, mit dem das intakte Herz eines Meerschweinchens unmittelbar nach der Organentnahme adenoviral infiziert werden kann. Dazu wurde das frisch entnommene Organ mittels einer LangendorffPerfusion mit einer Lösung, die rekombinante Adenoviren enthielt, 30 min oder 60 min lang retrograd durchspült. Danach erfolgte die enzymatische Isolierung und Kultivierung der Herzmuskelzellen. In den folgenden sechs Tagen wurden (fluoreszenz-) mikroskopisch die Vitalität und Anheftungsfähigkeit der Kardiomyozyten in vitro sowie die Expression des Reportergens GFP kontrolliert. Durch die Zugabe von ITS zum Kulturmedium sowie die Beschichtung der Kulturschälchen mit Nitrocellulose konnten die Zellkulturbedingungen optimiert und die gewünschte Verbesserung der Anheftungsfähigkeit und Vitalität der Vorhofzellen erreicht werden. In den verschiedenen Versuchen wurde deutlich, dass die Virusexpositionsdauer sowie der Titer der adenovirushaltigen Perfusionslösung die resultierende Infektion beeinflussten. Je länger die Dauer der Virusperfusion und je größer das Virus-ZellVerhältnis ist, desto größer ist die Zahl der Viren, die die Diffusionsbarrieren überwinden und die Herzmuskelzellen infizieren können. Mithilfe des adenoviralen Gentransfers wurde der purinerge A1-Rezeptor in den Kardiomyozyten überexprimiert und die Auswirkungen auf den Strom IK(ACh) (GIRK) mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Die infizierten Myozyten zeigten nach der Applikation von Adenosin eine im Vergleich zur nativen Kontrollgruppe schnellere Aktivierungskinetik und größere Amplitude des Kaliumstromes, die sogar die Amplitude des durch Acetylcholin induzierten Stromes überstieg (die parasympathische ZUSAMMENFASSUNG 77 Stimulierung hat einen negativ chronotropen Effekt; der physiologische Signalweg führt zur Aktivierung von muskarinergen M2-Rezeptoren, zur Aktivierung von Gi GProteinen und nach Bindung der βγ -Untereinheit an die GIRK-Untereinheit zum Öffnen der K+-Kanäle). Dies könnte das Resultat einer Konkurrenz von A1- und M2Rezeptoren um einen gemeinsamen Pool von G-Proteinen oder negativer Auswirkungen der Überexpression des A1-Rezeptors auf die Expression des M2-Rezeptors sein. Letztendlich konnte ein Verfahren etabliert werden, mit dem ein intaktes Meerschweinchenherz unmittelbar nach der Organentnahme adenoviral infiziert werden kann. Darüber hinaus bietet das beschriebene Verfahren gegenüber der Infektion in der Zellkultur den Vorteil, dass das Reportergen, im Hinblick auf die Dauer der Primärkultivierung, etwa ein bis zwei Tage früher in einer für weiterführende Untersuchungen ausreichenden Menge exprimiert wird. SUMMARY 78 7 SUMMARY Andrea Nave Methods for optimizing the in vitro gene transfer in guinea pig hearts via adenoviral vectors. The objective of this study was to establish a method in which the intact heart of a guinea pig could be adenovirally infected immediately after organ-extraction. To infect cardiomyocytes, the recombinant adenoviruses were added to the solution that perfused the isolated heart mounted in a Langendorff-perfusion system. Following a 30 min or 60 min retrograd heart perfusion, atrial myocytes were isolated enzymatically and cultured for a period of 6 days. During the cultivation time, the adhesion of the cardiomyocytes and their vitality were controlled optically. The expression of the reporter gene was investigated by counting GFP-positive cells. Adding ITS to the culture medium and coating the cell culture dishes with nitrocellulose improved adhesion and vitality of the atrial myocytes. It is shown that the cell infection rate depend on the duration of virus exposure and the titer of the adenovirus. The number of infected cells increased with an increasing virus perfusion time. In addition, increasing the ratio virus titer /atrial cells improved cardiac myocyte infection. The purinergic A1-receptor was overexpressed in rat atrial cardiomyocytes via adenoviral gene transfer. Since activation of the A1-receptors results in the activation of an inward rectifying K+ current (GIRK current), a successful cell infection can be investigated by measuring activation kinetics and amplitude of the adenosine-induced GIRK current. Upon adenoviral-induced A1-receptor overexpression, GIRK current exhibited faster activation kinetics and an increase in the current amplitude compared to control cells. The amplitude of the adenosine-induced GIRK current even exceeded the amplitude of the acetylcholine-induced current (the physiological pathway of the negative SUMMARY 79 chronotropic effect upon parasympathetic stimulation involves activation of muscarinic M2-receptors, activation of Gi G proteins and opening of the K+ channel after binding of βγ subunits to the GIRK subunits). The negative interference of M2- and A1-receptors might involve competition about a common pool of G proteins or an A1induced negative effect on the M2-receptor expression level. Finally, a method was established to infect an intact guinea pig heart immediately after extraction with adenoviruses. Furthermore, compared to the time course of GFP expression in cultured cardiomyocytes, the method, described in the present study, offers the advantage of an immediate GFP expression after plating the cells. This allows electrophysiological or biochemical experiments within 2 days after cell isolation compared to 4-5 days with a conventional infection method. LITERATURVERZEICHNIS 80 8 LITERATURVERZEICHNIS ANDRE, F. E. (1995): Approaches to a vaccine against hepatitis A: development and manufacture of an inactivated vaccine. J. Infect. Dis. 171, 33-39 ANDREASON, G. L. u. G. A. EVANS (1988): Introduction and expression of DNA molecules in eukaryotic cells by electroporation. Biotechniques 6, 650-660 BAUMGARTNER, I., A. PIECZEK, O. MANOR, R. BLAIR, M. KEARNEY, K. WALSH u. J. M. ISNER (1998): Constitutive expression of phVEGF165 following intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation 97, 1114-1123 BECHEM, M., L. 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Bei Herrn Prof. Dr. Schröder bedanke ich mich ebenfalls für die bereitwillige Übernahme meiner Dissertation und die hilfreiche Unterstützung bei der Anfertigung der Arbeit. Bedanken möchte ich mich bei Frau Dr. Bender und Frau Dr. Wellner-Kienitz, die mir jederzeit bei fachlichen Fragen sowie bei der Korrektur der Arbeit hilfreich zur Seite gestanden haben. Weiterhin möchte ich mich bei Frau Galhoff, Herrn Rinne und Frau Lui für ihre unermüdliche Hilfe und fachliche Unterstützung im Labor bedanken. Auch meinen Mitdoktoranden ein Dankeschön für die hervorragende Arbeitsatmosphäre. Ganz herzlich bedanke ich mich bei Christoph und meiner Familie, die mir wie immer tatkräftig zur Seite standen und mich, wo es nur ging, unterstützt haben.
