tribolium-gp1-skript..
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GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher GP-1 Evolution der abdominalen Segmentierung in Tribolium castaneum Gregor Bucher 1 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Inhaltsverzeichnis Einleitung ................................................................................................................................................ 3 Tribolium als entwicklungsgenetisches Modellsystem........................................................................ 3 Lang- und Kurzkeim-Embryogenese................................................................................................... 4 Verschiedene Strategien zur Untersuchung von Genfunktion............................................................. 6 RNAi (doppelstrang-RNA Interferenz) ............................................................................................... 7 Überblick über die Versuche................................................................................................................. 10 Kandidaten-Gen-Ansatz in Tribolium ............................................................................................... 10 Nebenprojekt 1: Morphologie der Segmentierung ............................................................................ 10 Nebenprojekt 2: Fishing PCR ............................................................................................................ 11 Nebenprojekt 3: Konfokale Mikroskopie .......................................................................................... 11 Dokumentation der elektronischen Daten: ........................................................................................ 11 Zeitplan: ................................................................................................................................................ 12 Protokoll zum GP-1:.............................................................................................................................. 13 Protokolle .............................................................................................................................................. 15 V1: in silico Gen-Analyse ................................................................................................................. 15 A. Sequenzen aus dem Netz laden ................................................................................................. 15 B. Blast-Search............................................................................................................................... 16 C. Sequenzen zusammenstückeln und weitere Sequenzen blasten ................................................ 19 D. Multiples Alignment mit „multalin“ ......................................................................................... 20 V2: Fishing PCR mit degenerierten Primern ..................................................................................... 22 A. Design degenerierter Primer...................................................................................................... 22 B. fishing PCR ............................................................................................................................... 23 V3: whole-mount-in-situ Färbung ..................................................................................................... 24 A. Fixierung von Embryonen......................................................................................................... 24 B. in situ Hybridisierung ................................................................................................................ 25 V4: Alkoholische Fuchsin-Färbung Tribolium/Drosophila............................................................... 28 V5: parentale RNAi ........................................................................................................................... 32 A. weibliche Puppen sammeln:...................................................................................................... 32 B. Puppen aufkleben ...................................................................................................................... 32 C. Injektion..................................................................................................................................... 33 V6: Einbetten von Kutikulas.............................................................................................................. 35 2 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Einleitung Tribolium als entwicklungsgenetisches Modellsystem Braucht die Wissenschaft wirklich einen Käfer als Modellsystem? Wer medizinische Fragen angehen will, der untersucht besser Zebrafisch, Hühnchen oder Maus, weil sie der Situation im Menschen wesentlich ähnlicher sind. Wer völlig unbekannte Mechanismen in Protostomiern aufklären will, der sollte den Fadenwurm Chaenorhabditis elegans oder die Diptere Drosophila melanogaster wählen, weil hier ein unvergleichliches Bündel an Techniken und Wissen zur Verfügung steht. Zu was also Tribolium castaneum? Tribolium sollte man als Modellsystem wählen, wenn man ganz spezifische Fragen hat, die mit den anderen Organismen nicht zu klären sind. (1) Für evolutive Fragen: „welche Gene haben sich im Laufe der Evolution wie verändert?“ (Evo-Devo). Dazu braucht man ein gut untersuchtes Referenzsystem (z.B. Drosophila) und einen Vergleichsorganismus. Dieser sollte eine für Insekten typischere Entwicklung aufweisen als Drosophila und möglichst viele Techniken bieten, um Gene und deren Funktion zu untersuche. (2) Für die Untersuchung von Strukturen, die es in Drosophila nicht gibt, z.B. larvale Beine oder (3) für Fragen, die in Drosophila schlecht zu untersuchen sind, wie z.B. drei Kopfentwicklung (in Drosophila ist der larvale Kopf eingestülpt und kommt im Thorax zu liegen. Typische Strukturen wie Antennen, Mandibeln etc. sind nicht mehr zu erkennen). Innerhalb der Arthropoden ist Tribolium der Organismus, der für solche Fragen am Besten geeignet ist. Ein Vorteil ist seine günstige Lage im phylogenetischen System: Coleopteren stehen an der Basis der holometabolen Insekten und gehören damit einer wesentlich ursprünglicheren Gruppe an als die relativ jungen Dipteren. Morphologisch zeigt er im Gegensatz zu Drosophila kaum abgeleitete Aspekte, so dass auch deren genetische Regulation die ursprüngliche Situation widerspiegeln dürfte. Als ursprüngliche Merkmale gelten unter anderem: Ausbildung normaler larvaler Kopf- und ThoraxKörperanhänge mit vermutlich ursprünglicher Funktion („beißende“ im Gegensatz zu „saugenden“ bzw „leckenden“ Mundwerkzeugen), abdominale Segmentierung durch eine Wachstumszone (Kurzkeim-Embryo) und Entwicklung von extraembryonalen Membranen (Tautz et al., 1994). Zweitens sind in Tribolium castaneum Schlüsseltechnologien etabliert, die eine tiefgehende Analyse der Genfunktion erlauben: RNAi induziert Phänokopien, die den entsprechenden Null-Mutanten weitgehend entsprechen. Die Anwendung parentaler RNAi (Injektion von Puppen führt zum RNAi Effekt in den Nachkommen) erlaubt es, große Mengen an knock-down Embryonen zu gewinnen, die nicht durch Injektion verletzt wurden, so dass die Expression anderer Gene im knock-down Hintergrund leicht untersucht werden kann (Bucher et al., 2002). Zudem wurde gezeigt, dass 3 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher zygotische Injektion von Morpholino-Oligonukleotiden gleichwertige Phänokopien hervorruft. Transgene Techniken sind etabliert (Berghammer et al., 1999) und wurden bereits dazu verwendet, die regulatorische Region von hairy zu analysieren. Aus zwei EMS-Mutagenese screens sind unter anderem Mutanten der antero-posterioren Musterbildung und der Kopfentwicklung isoliert. Drittens wird derzeit ein Insertionsmutagenese-Screen durchgeführt, bei dem unser Labor gemeinsam mit vier weiteren Labors 20.000 Linien mit neuen Insertionen generieren wird. Dieser vom amerikanischen Landwirtschaftsministerium (USDA) finanzierte Screen ist so angelegt, dass er auch embryonal-lethale Phänotypen der Embryonal-Entwicklung identifizieren wird, aber auch EYFPenhancer traps. Viertens steht die genomischen Sequenz von Tribolium castaneum zur Verfügung. Des weiteren werden derzeit von verschiedenen Labors EST Sequenzen generiert. Lang- und Kurzkeim-Embryogenese (Siehe auch (Wimmer, 2003)) Die ersten Schritte der Embryogenese sind in allen Insekten identisch: In der Zygote erfolgen mehrere schnelle Zellteilungen im Inneren des Eis. Die meisten Kerne wandern an die Peripherie („Blastoderm-Stadium“; die Kerne bilden ein Syncytium, deshalb syncytiales Blastoderm). Dann erst bilden sich Zellwände aus (zelluläres Blastoderm). Bei Drosophila werden in diesem Stadium alle Segmente angelegt und fast das gesamte Blastoderm wird zum künftigen Embryo (Langkeim-Entwicklung) (siehe Kopien aus Dettner „Lehrbuch der Entomologie“). In den meisten anderen Insekten (auch in Tribolium) nimmt der künftige Embryo nur einen Teil des posterioren Blastoderms ein und es sind nur die vordersten Segmente und die Wachstumszone angelegt (Kurzkeim-Entwicklung). Alle weiteren Segmente werden von einer posterior gelegenen Wachstumszone gebildet. Diese Art der Entwicklung ist vermutlich ursprünglich. (Siehe Entwicklungsstadien beim Protokoll zum Versuch „Hoechst-Färbung“) Es ist bislang unklar, wie die Segmentierung im wachsenden Keimstreif erfolgt. Die Expression der Segmentpolaritätsgene ist hochkonserviert, auch ihre Funktion ist nach bisherigen Erkenntnissen konserviert. Die Expression der Paarregelgene ist konserviert, allerdings scheint Tc’fushi-tarazu in Tribolium nicht für die Segmentierung benötigt zu werden. Das anteriore Gap-Gen Tc’hunchback scheint sowohl von Expression und Funktion zu einem großen Teil konserviert zu sein. Das terminale Gen Tc’tailless ist zwar an ähnlicher Stelle im Blastoderm exprimiert, aber scheint keinerlei Funktion bei der Segmentierung zu haben. 4 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Es könnte sein, dass in den unterschiedlichen Entwicklungswegen des Abdomens von Drosophila und Tribolium die posterioren Gap-Gene Krüppel, knirps und giant ihre Funktion verändert haben. Das sollen Sie untersuchen! 5 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Verschiedene Strategien zur Untersuchung von Genfunktion A) klassische Screens = vom Phänotyp zum Gen Mit chemischen Mutagenen (z.B. EMS) oder genetischen Elementen (Transposons) werden völlig zufällig Gene ausgeschaltet und die Nachkommen auf den gewünschten Phänotyp „gescreent“. Hat man interessante Mutanten, wird das mutierte Gen identifiziert und weiter untersucht. Vorteil: man sucht ohne Vorannahmen und kann daher alles Mögliche finden. Nachteil: Ein Screen dauert Jahre und ist nur für relativ gut etablierte Modellsysteme möglich. B) Kandidaten-Gen-Ansätze = „reverse“ Ansätze = vom Gen zum Phänotyp Man geht von der Vermutung aus, dass ein bekanntes Gen eine bestimmte Rolle spielen könnte. Mit verschiedenen Methoden lässt sich die Funktion dieses Gens untersuchen: 1) knock-out: durch homologe Rekombination werden Teile des Gens mutiert (eine „echte“ Mutation erzeugt) z.B. Maus. 2) Die Genfunktion wird durch Inhibierung von Transkription oder Translation gestört. z.B. antisense Morpholino-Oligos, die die Translation der mRNA verhindern (z.B. Zebrafisch) oder RNAi (Doppelstrang-RNA Interferenz). Hier wird ein zelleigener Mechanismus ausgenutzt, der dsRNA erkennt und alle ssRNA zerhäckselt, die zu dieser Sequenz homolog sind. Dieser Mechanismus ist hochkonserviert (Einzeller, Hydra, Vertebraten, Protostomier) und ist daher eine Technik, mit der auch Organismen untersucht werden können, für die die klassischen Ansätze nicht durchführbar sind (Meister and Tuschl, 2004). 6 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher RNAi (doppelstrang-RNA Interferenz) Vereinfachte Darstellung des RNAi-Prozesses: (1) Das Enzym „Dicer“ erkennt doppelsträngige RNA (dsRNA), bindet sie und schneidet sie in 21-23 bp lange Stücke. (2) Diese siRNAs (small interfering) werden in einen Enzymkomplex eingbracht: RISC (der Aufbau des Komplexes ist ATP abhängig, vermutlich weil erst die Basen-Paarungen gelöst werden müssen) (3) Die einzelsträngigen siRNAs im RISC-Komplex binden komplementäre RNA Sequenzen, die daraufhin geschnitten werden (RNAi-Weg). Nicht ATP abhängig. Ein Komplex kann mehrere RNAs 7 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher schneiden, benötigt dafür aber ATP (vermutlich um die entstandenen Basen-Paarungen wieder zu lösen) (4) Verstärkung des Effektes durch RNA abhängige RNA-Polymerasen (Vielleicht nicht in allen Organismen). (5) Ausbreitung eines lokalen RNAi-Effekts auf den gesamten Organismus (systemische RNAi). Es ist unklar, wie das Signal weitergeleitet wird: als dsRNA, als siRNA, als RISC-Komplex...) Es wurde jedoch eine Reihe von Genen gefunden, die dafür notwendig sind. Die Ausbreitung funktioniert jedoch nur in manchen Organismen (C.elegans, Tribolium, nicht in Drosophila). Herkunft „natürlicher“ dsRNA und die vermutliche Funktion von RNAi: (1) doppelsträngige RNA durch Hybridisierung in der Zelle. Z.B. wenn zwei Transposons in gegenüber liegende Stellen inserieren und die Transkripte überlappen. RNAi häckselt alle homologen RNAs (=Transposon-RNA) und initiiert Chromatin-Silencing der betreffenden ChromosomenAbschnitte. --> RNAi als Abwehr von Transposons (in vielen RNAi-defekten Stämmen werden Transposons aktiviert) (2) doppelsträngige RNA bestimmter Viren. RNAi häckselt die Transkripte --> RNAi als VirenAbwehr (3) endogene nicht-translatierte Regulations-Gene. Diese sogenannten miRNA-Gene (microRNAs) kodieren für Transkripte, die mit sich selbst komplementär sind und sich daher nach der Transkription auf sich selber falten und dsRNA bilden. Dies wird von DICER erkannt und zu miRNAs geschnitten. Diese miRNAs sind komplementär (haben aber immer auch einige Fehlpaarungen) zu Zielsequenzen im 3´UTR verschiedener Gene. Sie führen zu Repression der Translation (nicht zur Degradation der mRNA!). Sie sind im gesamten Tierreich hochkonserviert und sind vermutlich eine sehr ursprüngliche Strategie der Genregulation, die erst vor kurzem entdeckt wurde. 8 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Experimentelle RNAi RNAi ist ein Durchbruch für vergleichende Arbeiten, weil damit auch Nicht-Modell-Organismen funktionell untersucht werden können. Für evolutionäre Fragestellungen ist dies von großem Wert. Trotzdem konnte die Technik bisher nicht in allen Tieren etabliert werden. Eine Reihe von Techniken steht zur Verfügung: (1) embryonale Injektion von dsRNA (2) parentale RNAi: Injektion von adulten/Puppen, der Effekt wird auf die Nachkommen übertragen. Vorteil: Embryonen sind nicht durch Injektion verletzt, können in großen Mengen gewonnen werden und mit Standardmethoden weiter untersucht werden. (3) Biolistik: dsRNA wird an winzige Goldkügelchen gebunden und in den Organismus „geschossen“ (4) Transfektion von siRNAs in Zellkultur. Die siRNAs werden in vitro hergestellt und durch Transfektionsreagenzien in die Zellen eingeführt. Säugerzellen reagieren auf lange dsRNAs mit unspezifischen toxischen Reaktionen, deshalb muss man siRNAs verwenden) (5) transgen: selbst-komplementäre Konstrukte werden transgen eingeführt. Nach der Transkription entsteht durch Rückfaltung dsRNA (ähnlich dem endogenen miRNA-Mechanismus) 9 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Überblick über die Versuche Kandidaten-Gen-Ansatz in Tribolium Vorgeschichte: Sie interessieren sich für die Evolution der abdominalen Segmentierung, weil sich hier die Entwicklung von Drosophila stark von der für Insekten typischen Entwicklung unterscheidet. Sie haben sich für Tribolium als Modellorgansimus entschieden - eine gute Wahl ;-). Sie wissen, dass auf der Ebene der Segmentpolaritäts-Gene in Tribolium keine Veränderungen nachweisbar waren. Zudem haben Kollegen herausgefunden, dass die Expression der Paarregelgene äußerst konserviert ist. Sie beschließen daher, die Tribolium-Orthologe der abdominalen Gap-Gene zu untersuchen. Ihr Projekt: Sie bilden Gruppen, die jeweils ein Gen bearbeiten: giant, Krüppel, hunchback und knirps. Dazu isolieren Sie (1) „Ihr“ Gen aus der genomischen Sequenz von Tribolium und machen (2) eine erste phylogenetische Analyse der Sequenz. Sie untersuchen (3) seine Expression durch in-situHybridisierung und analysieren (4) die Phänokopie (=RNAi-Phänotyp), indem Sie die Genfunktion mit parentaler RNAi ausschalten. Frage: In wie weit ist die Funktion dieser Gene zwischen Tribolium und Drosophila konserviert? Daten, die Sie dokumentieren sollten: - Genanalyse: alignment des Tribolium-Genes mit dem Drosophila-Gen (kopieren/einfügen aus der Blast-Analyse in Word), Phylogenetischer Baum der Sequenz mit unterschiedlichen Spezies - In-situ-Hybridisierung: Beschreibung der Genexpression anhand von 4-5 Bildern unterschiedlicher Stadien - RNAi: Beschreibung des Kutikula-Phänotyps anhand von Aufzeichnungen und eines Konfokalen Bildes - RNAi: Beschreibung des engrailed Musters in RNAi Embryonen anhand von 3-4 Bildern Nebenprojekt 1: Morphologie der Segmentierung Kernfärbung von Drosophila, Tribolium: Beschreibung von Lang (Droso)- und Kurzkeim (Tribo)Embryogenese. Gryllus: ist Gryllus ein Lang- oder Kurzkeimer? Frage: Welcher Entwicklungsweg ist vermutlich ursprünglich, welcher abgeleitet? (Dazu müssen Sie die phylogenetische Stellung dieser Gruppen zueinander kennen. 10 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Daten: Beschreibung der drei Entwicklungswege durch Skizzen. Jede Gruppe fotografiert die Stadien eines der Fuchsin-gefärbten Organismen und stellt diese Bilder zur Verfügung. Nebenprojekt 2: Fishing PCR Design von degenerierten primern, mit denen homologe Gene aus Spezies isoliert werden können, deren genomische Sequenz nicht vorliegt – das sind die meisten.... Daten: alignment auf Proteinebene, darunter der degenerierte code, Sequenz der primer in 5`-3`Orientierung Nebenprojekt 3: Konfokale Mikroskopie (Beate Preitz) Einführung in die konfokale Mikroskopie, Scannen von Kutikulas (evtl auch Hoechst-Präparate) Dokumentation der elektronischen Daten: Einloggen mit: ewbpra01/ Passwort: ??? / Domäne: GWDG Daten werden am Ende des Praktikums gelöscht! 11 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Zeitplan: Leider lässt sich das Projekt nicht ganz in der oben beschriebenen logischen Abfolge organisieren, da manche Schritte zu lang dauern würden. 1.Tag (Freitag) Theorie RNAi, KandidatenGen-Ansatz Puppen sammeln, aufkleben parallel: Spitzen ziehen Mo Di Mi Do RNAi Käfer absieben (für Kutikula Präps), nachreifen lassen (Vorlesung) (Vorlesung) Färbung, 1. Tag Färbung 2. Tag Theorie: - Evo-Devo - Segmentierung PCR-Gel gießen fishing PCR mit degenerierten Primern parallel: Analyse FuchsinFärbung, Fotos Fr RNAi Kutikulas einbetten Färbungen präparieren, fotografieren parallel: Einführung in Bildverarbeit ung Mo Di Theorie: konfokale Mikroskopie (Vorlesung) während des ganzen Tages: eine Kutikula pro Gen scannen Diskussion der Daten: Färbung RNAi KutikulaPhänotypen parallel: RNAi Kutikulas auswerten parallel: Komposits mit den Bildern erstellen TestInjektion RNAi- und wt-Käfer auf Weißmehl für Fixierung Mittag Mittag Injektion Einführung: SequenzAnalyse ParaOrthologe, Sequenzevol ution, phylog. Baum SequenzAnalyse Diskussion der SequenzDaten Theorie degenerierte Primer design degenerierter Primer Fuchsin Färbung von Drosophila, Tribolium und Gryllus Mittag RNAi + wtEmbryonen fixieren PCRauftragen Analyse der PCR parallel: Präparation von Gryllus Embryonen Mittag Mittag Mittag Einbetten und Analyse der FuchsinFärbung Diskussion der Daten: Fuchsinfärbu ng parallel: Komposits mit den Bildern erstellen parallel: Einführung Bildverarbeit ung Theorie: Langkeim, Kurzkeim Mittag Mittag Theorie: EnhancerTrap-Screen Demo: fluoreszente Augenmarker Diskussion der Daten: Färbung wt Wie Protokoll schreiben? PraktikumsKritik, Lob, Anregungen Projekte im Labor Wimmer Projekte im Labor Bucher parallel: parallel: parallel: parallel: parallel: Sequenzanaly Sequenzanaly Sequenzanaly Sequenzanaly Sequenzanaly se des GensX se des GensX se des GensX se des GensX se des GensX 12 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Protokoll zum GP-1: Aufbau wie eine Veröffentlichung, wahlweise jeder ein eigenes oder 2er Gruppen, die ein Gen bearbeitet haben. In der Kürze liegt die Würze! 1) Zusammenfassung 2) Einleitung: Die Einleitung soll dem Leser auf den Stand des Wissens bringen und ihm alle Informationen geben, die er braucht, um die Versuche zu verstehen (aber auch nicht mehr!). Bei einer wissenschaftlichen Arbeit (Diplomarbeit, Veröffentlichung) müssen alle wichtigen Aussagen mit den passenden Zitaten belegt werden. (Das muss für dieses Protokoll nicht sein). Struktur: Zuerst der allgemeine Hintergrund und die „weiter weg“ liegenden Fakten, dann Dinge, die der Hintergrund für dieses Projekt sind und schließlich ganz spezifisch die nötigen Fakten und die Fragestellung für dieses Projekt. Wenn die Einleitung richtig strukturiert ist, wären die ersten Sätze für viele Projekte als Einführung geeignet, die mittleren nur für die Projekte z.B. dieses Kurses und die letzten nur für dieses eine Gap-Gen-Ortholog (Kann man sich wie einen Trichter vorstellen, an dessen unterster engster Stelle dieses Projekt steht). ein Vorschlag (das ist aber nicht die einzig sinnvolle Reihenfolge!): Inhalte Struktur Der Abschnitt könnte auch in der Einleitung von Projekten stehen, die ... Drosophila Segmentierung mit Schwerpunkt auf abdominalen Gap-Genen (nur kurz – siehe Veröffentlichung im Skript) es gibt unterschiedliche Entwicklungswege in verschiedenen Insekten - die könnten auf unterschiedlichen genetischen Mechanismen beruhen - Kurz-Langkeim-Entwicklung - Hintergrund der bekannten Drosophila Daten, mit denen unsere Daten verglichen werden - die große wissenschaftliche Frage: die Evolution neuer Baupläne ... irgendwie mit Segmentierung und Musterbildung zu tun haben (tausende von Projekten) ... sich auf den evolutionären Vergleich von Entwicklung konzentrieren (Beine, Segmentierung, Augen...) (hunderte von Projekten) - Warum sollte man die posterioren Gap-Gene untersuchen? - Tribolium als Modellsystem - Ziel der Arbeit ... sich mit der Evolution von Segmentierung beschäftigen (dutzende von Projekten in verschiedenen Organismen) ... die Funktion von Gap- noch konkreter: nicht maternal, nicht Segmentpol, Genen vergleichen (derzeit 4-5 Labore) sondern Gap-Gene ... die Funktion von Gap - untersuchter Genen im Käfer untersuchen Modellorganismus (derzeit 2) - die Frage dieses Projektes ... genau dieses Gen in Tribolium untersuchen (Du und Dein Konkurrent!) - eingeschränkte Fragestellung: Evolution von Segmentierung, 13 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher 3) Material und Methoden Keine Romane, bitte! Verweis auf das Praktikums-Skript, (ausführen nur, wenn vom Skript abgewichen wurde) 4) Ergebnisse: Im Ergebnisteil werden (fast) ohne Interpretation nur die Daten dargestellt. Alle Fakten/Details stehen im Text, die wichtigsten Dinge sind in Abbildungen/Bildunterschriften gezeigt (wenn jemand nur von Bild zu Bild springt, sollte er das Wichtigste erfahren haben). Die Daten werden hier nicht ausführlich diskutiert! Ein Aufbau, der sich bewährt hat (auch in Vorträgen): 1) Was ist die Frage? 2) Was ist das Experiment dazu? (eventuell: was sind die erwarteten alternativen Ergebnisse?) 3) Was war das Ergebnis meines Experiments? 4) Was ist also die ganz kurze Antwort auf die obige Frage (hier schrammen wir knapp an der Diskussion vorbei) und welche Frage ergibt sich daraus (das wäre dann 1) des nächsten Abschnitts) - Vergleich der Entwicklungswege von Gryllus, Tribolium und Drosophila (Zeichnungen oder Fotos). - Was ist vemutlich ursprünglich? - Sequenz des Tribolium Orthologs (Ausschnitt des Proteins), Alignment mit Genen aus anderen Organismen, Baum. In wie weit spiegelt der Baum die phylogenetischen Verhältnisse korrekt wider? - Degenerierte Primer: Protein-Sequenz, degenerierte DNA Sequenz, Primer in 5´-3´ Richtung aufschreiben (das ist die Konvention) - PCR, Gelbild, Welche Bande sollte man ausschneiden, wenn man das spezifischste Produkt haben will? In welcher Bande könnten am ehesten weitere ähnliche Gene enthalten sein? Bzw was müsste man an den Reaktionsbedingungen ändern, wenn die Reaktion nicht geklappt hat? - Expression des Gens. 3-4 Bilder, Ist es in den gleichen Segmenten exprimiert wie in Drosophila? - RNAi Konzentration der dsRNA, - Kutikula-Phänotyp 1 Konfokal-Bild, Beschreibung Phänotyp auf engrailed-Ebene. In wie weit entspricht der dem Kutikula-Phänotyp? 5) Diskussion: Die Diskussion analysiert die Daten im Licht der Fragestellung und setzt sie in Beziehung zu dem bereits Bekannten (das in der Einleitung vorgestellt wurde). Je nach Projekt kann das recht unterschiedlich aufgebaut sein. Im Prinzip funktioniert die Diskussion umgekehrt wie die Einleitung: zuerst die ganz nach am Projekt liegenden Fragen (wie z.B. technische Probleme, unklare Ergebnisse, weitere nötige Experimente, um diese Unklarheiten zu beseitigen), dann die Antwort auf die konkrete Fragestellung dieses Projektes (was tut dieses Gen? ist es nun wie Droso oder ein bisschen oder ganz anders?), für die etwas weiter gefasste Frage (z.B. Segmentierung im Kurzkeim Embryo) und schließlich was das für die große wissenschaftliche Frage bedeutet. Zum Schluss kann ein Ausblick kommen: was muss jetzt getan werden, um die große Frage weiter zu untersuchen. - Wie könnte man den RNAi Phänotyp interpretieren? Welche Funktion könnte das Gen haben? - Hat es eine ähnliche/identische Funktion in der abdominalen Segmentierung von Tribolium/Drosophila? - Funktioniert es wie ein typisches Drosophila Gap-Gen? - Ist also die Drosophila Kaskade in Tribolium konserviert? Was bedeutet das für die Evolution von verschiedenen Entwicklungswegen allgemein? - Mit welchen Experimenten könnte man die (vielen) offenen Fragen aufklären? 14 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Protokolle V1: in silico Gen-Analyse Booten der Rechner: Einschalten und mit Pfeiltasten „Windows“ wählen – wer nicht schnell genug klickt, der muss mit Linux arbeiten oder herunterfahren und neu starten. STOP STOP STOP STOP STOP STOP STOP STOP zu viele gleichzeitige An/Abmeldungen überfordern das System – daher in der Reihenfolge der Gruppennummern einloggen - login: Domäne: GWDG Benutzer: ewbpra02 Login: erhalten Sie mündlich - Daten im Netzlaufwerk „ewbpra01...“ speichern (Gruppen-Nummer + Gen) Daten werde am Ende des Praktikums gelöscht!! - word oder wordpad öffnen: Start/all programs/accessories/wordpad - Internet Explorer A. Die bekannten Drosophila Sequenzen aus dem Netz laden Um bekannte Protein-Sequenzen aus dem Netz zu laden, gehen Sie in das Sequence Retrieval System (SRS) (http://srs.ebi.ac.uk/) QuickSearch. Wählen Sie „Protein Sequences“ und geben Sie in das Suchfeld ein: „Genname & Drosophila“ (mögliche Operatoren: & (=AND), ! (=BUTNOT), | (=OR)). Sie erhalten mehrere Treffer: Klicken Sie auf den gewünschten Treffer unter der Spalte „UniProt“ . Sie erhalten nun eine Seite mit allen möglichen Informationen über das Gen, seine Protein-Domänen und links zu verschiedenen Datenbanken, in denen das Gen oder typische Motive davon zu finden sind. Ganz unten finden Sie die Proteinsequenz. Um die Sequenz ohne Zahlen und Formatierungen zu erhalten, klicken Sie ganz oben 15 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher unter „general information“ auf „accession number“. Sie erhalten eine Text-Seite, bei der Sie die Sequenz ganz unten finden. Kopieren Sie diese Sequenz in ein Word-Dokument im sog. FastA-Format (Genname nach „>“, in der nächsten Zeilen fängt die Sequenz an. Leerzeichen werden automatisch entfernt, es dürfen aber keine tabstops o.ä. enthalten sein): >Genname, Informationen etc MSISMLQDAQ TRTLAAALAG IKQEDVHLDR SMSLSPPMSA ... Speichern Sie das Dokument im „Nur Text Format“ ab, denn der unsichtbare „Kopf“ und unsichtbare Steuerelemente bei Word-Dokumenten können später stören. (Sollten Sie eine Nukleotidsequenz herunterladen wollen, dann gehen Sie genau so vor, nur wählen Sie auf der Quick-Search Seite „nucleotide sequences“ statt „protein sequences“.) B. Blast-Search (“ist im Käfer-Genom ein homologes Gen enthalten? Wie ist die Asr-Sequenz?) BLAST: „Basic Local Alignment Tool“ Der Algorithmus sucht nach kurzen gleich langen SequenzAbschnitten, die identisch sind. Davon ausgehend erweitert er das alignment nach beiden Seiten. Dabei kann er auch Lücken einführen. Gehen Sie in der „Beetle-Base“ (http://www.bioinformatics.ksu.edu/BeetleBase/) auf „TriboliumBlast“. Wählen Sie das Programm „tblastn“. 16 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher tblastn: Proteinsequenz wird in Nukleotid-Datenbanken gesucht, die in alle 6 Leseraster übersetzt wurden (d.h. tatsächlich wird also ein Protein gegen hypothetische Proteine gesucht. Diese Suche ermöglicht es, in einer genomischen „Rohsequenz“ sein Protein zu finden). blastp: Protein wird in Protein-Datenbanken gesucht. blastx: Nukleotidsequenz wird in alle Leseraster übersetzt und in Proteindatenbanken gesucht (wichtig, wenn Sie eine Nukleotidsequenz ohne weitere Informationen haben und gerne wüssten, ob es sich um codierende Sequenzen handelt und welches Protein es sein könnte) tblastx: Nukleotidsequenz wird in alle Leseraster übersetzt und in Nukleotiddatenbanken gesucht, die auch in alle Leseraster übersetzt sind. (Sehr rechenaufwändig und oft aus Kapazitätsgründen nicht möglich) blastn: Nukleotidsequenz wird in Nukleotid-Datenbanken gesucht (wegen des redundanten genetischen codes für Proteinsuchen nicht geeignet) Kopieren Sie Ihre Sequenz in das Fenster (Leerzeichen werden ignoriert, es macht also nichts aus, wenn die Sequenz „unordentlich“ aussieht (siehe Abb unten). (Die restlichen Parameter bleiben unverändert, low complexity filter ist an) Nach einigen Minuten, erhalten Sie ihre Ergebnisse. Der schwarze Balken mit Zahlen zeigt Ihre eingegebene Sequenz an, die farbigen Linien darunter zeigen an, für welche Stelle Ihres Proteins ähnliche Proteine gefunden wurden. Die Farbe der Linien zeigt den Grad der Ähnlichkeit an: 17 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Darunter sind die einzelnen „hits“ aufgelisten. „gi“ ist der „gene bank identifier“. Mit dem linken link könnten Sie die entsprechende Nukleotid-Sequenz erhalten. „Score“ ist ein Maß für die Ähnlichkeit (jedes Aminosäure-Paar im alignement erhält je nach Grad der Ähnlichkeit einen bestimmten „score“. Identische Asr-Paare bekommen unterschiedlich hohe Werte, je nachdem, wie häufig die Asr generell sind. All diese Werte werden aufsummiert und bestimmte Werte für jede Lücke und die Länge einer Lücke abgezogen (gap open/extension penalty). Die Summe daraus ergibt den „bits Score“ - je höher, desto besser. E (Expectation value) gibt an, wie groß die Erwartung ist, dass ein alignment mit genau so gutem oder besserem Score zufällig in dieser Datenbank auftritt. Die Größe der verwendeten Datenbank spiegelt sich also wider! Gute E-Werte sind kleiner als „e-15“. Manchmal wird auch noch der „p-value“ angegeben. Das ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine beliebige Sequenz gleicher Länge in dieser Datenbank einen gleich guten oder besseren score hat. Klick auf den Score-Wert bringt Sie zum alignment, das zu diesem Score geführt hat (alternativ können Sie auch einfach nach unten scrollen). Weiter unten finden Sie die alignments, die der Blast-Algorithmus gefunden hat: „Query“ ist das eingegebene Protein, „Sbjct“ das gefundene. In der Mitte sind die identischen Aminosäuren aufgeführt, + bedeutet, dass die Aminosäuren ähnlich, aber nicht identisch sind. Beachten Sie die XXXXXXXX in der Query: diese Aminosäuren sind repetetiv, so dass das Programm sie nicht verwendet hat (low complexity filter ist standardmäßig an). 18 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher C. Sequenzen zusammenstückeln und weitere Sequenzen blasten (= backblast). Für unsere Zwecke reicht es, die entsprechende Sequenz (subject) direkt aus dem alignment zu kopieren und in Word zusammen zu stückeln (d.h. löschen Sie Zahlen und evtl. Bindestriche). Bitte alle Sequenzen im FastA Format speichern und die Art-Namen dazu: >Tribo-Kr MSISMLQDAQ TRTLAAALAG IKQEDVHLDR SMSLSPPMSA ... Gibt es Paraloge in Drosophila und Tribolium? Nehmen Sie nicht nur den besten Tribolium-Hit sondern auch den zweit- und drittbesten (nicht der Evalue gilt, sondern ob die Proteinsequenz mit dem besten hit identisch ist oder etwas abweicht). Es können mehrere hits der gleichen Sequenz vorhanden sein (zB aus EST screens und aus automatischer Annotation des Genoms ...) Blasten Sie die Drosophila-Sequenz in Drosophila und identifizieren Sie den zweit- und drittbesten Hit im Genom (die besten hits sind naturgemäß identisch mit der query) Welche der bisher in allen möglichen Organismen bekannten Sequenzen sind zu diesem gefundenen Tribolium-Protein ähnlich? Gehen Sie nun auf die Blast-Seite des NCBI (national center for biotechnology information) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ und „blasten“ Sie sich weitere Sequenzen anderer Organismen. 19 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Nehmen Sie dabei das Tribolium-Protein und suchen Sie gegen Protein-Datenbasen (blastp, „nonredundant“ nr ). Dazu kopieren Sie die Tribolium Protein-Sequenz in das Fenster, klicken auf „Blast“ und auf der folgenden Seite auf „format“. Aus den Resultaten bringen Sie etwa 5 weitere Homologe Gene ins FastA Format (die obersten hits sind wieder Tribolium – bitte andere Spezies wählen). Wenn hier die besten Treffer nicht das gesuchte Gen sind, dann haben Sie das falsche Protein isoliert – das ist der „back-Blast“ Test. Nehmen Sie dabei von den besten hits ausgehend unterschiedliche Organismen; mindestens ein Vertebrat sollte dabei sein (CG, Dm, Drome = Drosophila melanogaster, Ce, Celeg = Caenorhabditis elegans (Nematoda), Ag = Anopheles gambiae ....). Bitte eindeutig benennen mit Organismus-Abkürzung und Gen-Name: Das FastA Format sieht dann etwa so aus: > Dm- X MNGFEGHProteinSequenz... > Tc- X – best hit MNEGFEGGGHProteinSequenz... > Tc-X – second hit MNGFEGHProteinSequenz... > Maus-X MNGFEGHProteinSequenz... ... D. Multiples Alignment mit „multalin“ Bringen Sie nun alle Sequenzen in ein Text-Dokument im FastA Format. Gehen Sie auf die Seite http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html und kopieren Sie die Sequenzen in das Feld (Standard-Settings). Multalin sucht konservierte Blöcke in den Sequenzen und fügt Lücken in die Sequenzen ein, so dass diese hochkonservierten Teile der Gene übereinander zu liegen kommen. Um das alignment auszudrucken, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das alignment (Bild-File!) speichern (Namen mit Gennamen und Gruppennummer!) und ausdrucken (wir brauchen den Ausdruck, um degenerierte Primer zu machen!!). Um es als Text-File zu erhalten, klicken Sie auf „results as a text page“ und kopieren Sie sich das alignment in Word. (evtl müssen Sie Querformat einstellen, auf jeden Fall aber die Schriftart Courier beibehalten!). Um einen Baum darzustellen, gehen Sie auf die Option „alignment and tree description“ geben Sie unter „minimal distance between sequences“ 0 ein. (Das bedeutet, dass alle Sequenzen ihren eigenen 20 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Ast bekommen. Höhtere Werte für diese Option sind dann sinnvoll, wenn Sie sehr viele Sequenzen haben und der Baum zu unübersichtlich wird – dann werden mehrere Sequenzen, die sich „nur“ in X Aminosäuren unterscheiden als ein cluster mit einem Ast dargestellt). Es gibt zwei Darstellungsformen: Phenogramm: die Länge senkrechter Linien bedeutet nichts, die Länge waagrechter Linien gibt die Unterschiedlichkeit der Sequenzen wider. Dies entspricht in etwa der phylogenetischen Distanz. Radial Tree: Die Länge aler Linien bedeutet Unterschiedlichkeit der Sequenzen und damit in etwa der phylogenetischen Distanz. In beiden Bäumen bedeutet das offene Dreieck die „root“, d.h. wo das Ausgangs-Gen herkommt, d.h. wo die Linie des letzten gemeinsamen Vorfahren abzweigen würde. PAM-distance: 1 PAM ist die Zeit, die benötigt wird, um 1% nicht-lethale Mutationen entstanden. 20 PAM ist die 20-fache Zeit (aber nicht die 20-fache Menge an Mutationen, weil zunehmend auch Rück- bzw Weitermutationen auftreten können). PAM ist aber höchstens als erste grobe Schätzung der Abstände anzusehen, denn in einzelnen Spezies kann die Mutationsrate größer sein, d.h. 1PAM kleiner. Speichern Sie den Baum als .gif Datei. Alle Daten in einem Ordner gespeichert und ausgedruckt? Folgendes brauchen Sie: - FastA Dokument mit allen Sequenzen (nur text format) - alignment mit allen Sequenzen als Grafik oder Textformat – Ausdruck!! - Baum als gif Ordner benannt (Jahr-Gruppennummer-Gen) 21 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher V2: Fishing PCR mit degenerierten Primern A. Design degenerierter Primer Von Organismen, die nicht sequenziert sind, müssen Orthologe durch „fishing PCR“ mit degenerierten primern isoliert werden. Nehmen Sie dazu das alignment und identifizieren Sie hochkonservierte Blöcke (d.h. auch in Vertebraten weitgehend konserviert). Suchen Sie zwei Blöcke, die möglichst weit voneinander entfernt liegen, um den oberen bzw unteren Primer zu legen. Notieren Sie die konservierte Proteinsequenz (Abstand zwischen den Aminosäuren: etwa 2 Zeichen) und darunter den degenerierten genetischen code für die entsprechenden Aminosäuren. Diskutieren Sie in Ihrer Gruppe und entscheiden Sie sich dann für die Lage des oberen bzw unteren primers. Die Kriterien sind: Insgesamt möglichst wenig Degeneration, insbesondere in den letzten 6-8 Basen, die 3´ Basen unbedingt in absolut konservierten Bereichen, wenn möglich kein T als letzte Base (T paart nicht nur mit A, sondern auch anderen Basen). 22 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher B. fishing PCR Das Bestellen der Primer dauert etwa 4 Tage. Daher verwenden wir für die fishing PCR schon früher hergestellte primer. Diese sollten eine 170-180 bp lange konservierte Region des „hunchback“ Gens amplifizieren. Da in keiner bisher untersuchten Spezies ein Intron zwischen diesen Primern liegt, verwenden wir genomische DNA (ansonsten müssten wir mRNA isolieren, sie in cDNA umschreiben und dies als Matrize für die PCR verwenden). Die optimale Temperatur für degenerierte Primer ist nur empirisch bestimmbar. Deshalb werden Sie verschiedene annealing Temperaturen ausprobieren. In der Gradienten-PCR-Maschine ist dies in einem Versuch möglich. Jeder pipettiert eine Reaktion, diese werden dann entlang des Temperaturgradienten eingeordnet. Position 1 Temperatur 40 2 40,2 3 41,3 4 43,1 5 45,4 6 48 7 50,7 8 53,5 9 56 10 58,1 11 59,8 12 60,6 Tragen Sie auf jeden Fall Handschuhe - die degenerierten Primer könnten sonst Ihr ganz persönliches hunchback-Gen amplifizieren! Das Enzym bitte immer auf Eis aufbewahren. Alle anderen Reagenzien werden aufgetaut, gut gemischt (schütteln oder vortexen) und kurz herunterzentrifugiert, dann auf Eis gestellt. Auch die PCR-Reaktion bleibt auf Eis (vermindert die Entstehung von Artefakten). Pipettieren Ihre Reaktion nach folgendem Schema: genomische DNA (50 ng/ul) 2ul H2O 22,8 dNTP-Mix (2,5 mM jedes Ncltd) 4 MgCl (25 mM) 2,4 10X Puffer 4 hbup1 / hbup2 (20 uM) 2 hblow1 2 (20 uM) (hier Pipette nur bis zum ersten Anschlag ausdrücken) ------------------------------------------------mischen (4X langsam pipettieren mit 15 ul Volumen) Taq-Polymerase 0,8 ------------------------------------------------ mischen (4X langsam pipettieren mit 15 ul Volumen) Endvolumen 40 PCR-Programm: 3´ 30´´ 30´´ 30´´ 3´ 95° 95° | 40-60° |30X 72° | 72° 8° (DNA vollständig denaturiert) (PCR-Produkte denaturiert) (annealing Temperatur entlang eines Gradienten) (Elongation, mind 1 Min je 1000 Basen Produkt) (alle partiellen Produkte werden fertig amplifiziert) (Lagerung) Auftrennung erfolgt in einem 1,5% Agarose-Gel. 23 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher V3: whole-mount-in-situ Färbung A. Fixierung von Embryonen 1) Embryonen aus der Über-Nacht-Ablage absieben (Siebe: 800 µm – hält Käfer zurück, 300 µm – hält Eier zurück, Weißmehl fällt durch), möglichst viel Mehl durch leichtes Klopfen auf die Unterlage absieben. (Bei 33° haben die Embryonen die Segmentierung nach etwa 30 h abgeschlossen. Die ältesten Embryonen im Gelege befinden sich also im elongierten Keimstreif-Stadium) 2) Eier in Waschsiebe (150 um Netz) überführen 3) mit Leitungswasser (Spritzflasche) kräftig spülen, 4) 2x 4 min. in 50% Klorix dechorionieren. (!Kittel verwenden, denn Klorix ist ein starkes Bleichmittel). Dabei das Netzchen auf und ab bewegen, bzw mit Klorix-Lösung spülen. Wenn die Eier beim auf und ab bewegen an der Oberfläche bleiben, dann sind sie dechorioniert. Fallen sie nach unten, muss weiter inkubiert werden. Mit Leitungswasser stark(!) spülen, um Mehlreste wegzuwaschen. 5) Eier mit Pinsel in Fixiergläschen überführen (Scintillationsröhrchen) Fixierlösung: 2 ml PEMS 300 µl Formaldehyd 6 ml Heptan 30 min. auf Schüttler fixieren (je länger, desto schlechter devitellinisieren die Eier) (Heptan soll die Vitellinhülle für das Fixans durchlässig machen) 6) Devitellinisieren Wässrige Phase unten absaugen, dabei alle Mehlreste auf dem Boden entfernen (diese stören spätere Färbungen), 8ml MeOH schnell dazugeben, Röhrchen rasch verschließen und gleich kräftig schütteln oder/und vortexen. Devitellinisierte Embryonen fallen herunter (v.a. junge Stadien), die anderen bleiben in der Interphase. Abgesunkene Embryonen abnehmen und restliche Embryonen in der Interphase durch Auf- und Abziehen durch die Kanüle einer Spritze devitellinisieren (0,8 um Durchmesser) (1X durchjagen, abgesunkene absammeln, dann 2X und fester durchjagen etc. (2X bei StandardAnwendung zB Wildtyp, 3-4X, wenn es wertvolle Embryonen sind, z.B. pRNAi). Embryonen im Eppi drei Mal mit 1 ml frischem MeOH spülen und bei -20° aufbewahren. 24 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Puffer Klorix-Lösung: Haushaltsreiniger: (Natriumhypochlorid-Lösung, NaOCl), 1:1 mit Wasser verdünnt. Fixierungspuffer (PEMS): 0.1 M Pipes, 2mM MgSO4, 1mM EDTA, pH 6.9. Heptan (100%) Formaldehyd (37%) Methanol (100%) B. in situ Hybridisierung ul = microliter Alle Inkubationen finden in 1,5 ml Eppendorfgefäßen statt. Verwenden Sie für jeden Ansatz so viele Embryonen, dass sie ein Volumen von ca. 20-40 ul einnehmen. Embryonen waschen: Überstand abnehmen, 1ml der jeweiligen Lösung zugeben, auf dem Drehrad rollieren, damit gut durchmischt wird. Nach jedem Wasch-Schritt die Embronen erst 5 Sekunden absinken lassen, dann Eppi schräg rollen, damit Embryonen aus dem Deckel gewaschen werden, dann 3 Minuten absetzen lassen Wichtig: Bei Anfängern gehen 90% der Embryonen verloren, weil sie mit dem Überstand abgenommen wurden!! Keimstreifen sinken langsamer ab und man sieht sie fast nicht (nur Blastodermstadien sieht man gut) Æ Eppi vor dem Abnehmen gegen das Licht halten und schauen, ob noch etwas schwebt und den abgenommenen Überstand in Blockschälchen pipettieren und kontrollieren, dass keine Embryonen drin sind!! 1. Nehmen Sie so viel MeOH ab, so dass in etwa 500 ul im Eppi bleiben; geben Sie 500 ul PBT zu und mischen sie für 1 min (Rehydrierung in 50% wässriger Lsg.). 2. nehmen Sie den Überstand (50% MEOH) ab und geben Sie 1 ml PBT zu. 1X waschen mit PBT. 3. Geben Sie 1ml ProteinaseK-Lösung zu (enthält 5 ul PK (1,5 mg/ml)) und mischen Sie für genau 3 min durch Drehen in der Hand. Daraufhin 3 min absinken lassen und dann sofort abstoppen durch 2x waschen mit je 1 ml PBT. (Proteinase K macht die Zellen für Sonden durchlässig, bei zu langer Inkubation zerstört sie jedoch die Embryonen) 4. Überstand abnehmen und 1 ml Postfix (die Lösung enthält 140 ul 37% Formaldehyd auf 1ml PBT) zugeben, und für 15 min auf Drehrad fixieren lassen 5. Waschen Sie 4x mit je 1 ml PBT für je 3 min; Überstand abnehmen 6. Nehmen Sie 500 ul PBT ab, geben Sie zu den verbleibenden 500 ul PBT 500 ml Hyb-B zu (nicht Schütteln, nicht auf Drehrad!). 3 min Embryonen absinken lassen und Überstand abnehmen 7. Geben Sie 250 ul Hyb-B zu für 10 min; nehmen Sie den Überstand ab 25 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher 8. Geben Sie 250 ul Hyb-A zu, und prä-hybridisieren Sie für ca. 1 Std. bei 65° 9. Nehmen Sie so viel Überstand ab wie möglich und geben Sie 50 ul Hyb-A mit 3 ul RNA-Probe zu (!im Heizblock arbeiten, damit die Temperatur nicht abfällt; die Probe vor Zugabe auf 65° vorwärmen) 10. -------------------- Hybridisieren Sie über Nacht im 65° Heizblock --------------- 11. Geben Sie 500 ul Hyb-B (vorgewärmt auf 65°) zu, und lassen Sie die Embryonen 5 min bei 65° sich absetzen (nicht mischen!); Überstand abnehmen 12. Nochmals 500 ul Hyb-B (vorgewärmt) zugeben (nicht mischen!), und 15 min bei 65° inkubieren; Überstand nicht abnehmen. Ab jetzt alle Schritte bei Raumtemperatur. 13. Geben Sie 500 ul PBT zu, mischen Sie für 2 min; Überstand entf. 14. Waschen Sie 2x für 5 min mit je 1 ml PBT am Drehrad bei Raumtemperatur; Überstand abnehmen 15. Waschen Sie 1X 15, 1x für 20 min mit 1 ml PBT, Blocking mit 2X 20´ BBT 16. Geben Sie 500ul der anti-DIG-Antikörperverdünnung (1:2000 in BBT) zu und inkubieren Sie für 1 Stunde am Drehrad; Überstand abnehmen -------- Mittagspause----------17. Waschen Sie am Drehrad 2x für 5 min und 3x für 15 min mit je 1 ml PBT; Überstand abnehmen 18. Waschen Sie 2x mit je 1 ml Färbe-Puffer für je 2 min; Überstand abnehmen 19. Die Substrate der Farbreaktion sind potentiell giftig. Handschuhe anziehen! Geben Sie 1 ml Detektionspuffer (gelblich) zu. 20. Nehmen Sie die Embryonen (im Puffer suspendiert) mit einer abgeschnittenen blauen Spitze heraus und transferieren Sie sie in ein Blockschälchen (Blockschälchen vorher mit Leitungswasser ausspülen und trocknen – falscher pH inhibiert die Färbereaktion) 21. die Färbung sollte sich innerhalb von 15-60 min entwickeln; gelegentlich unter dem Binokular kontrollieren! 22. Um die Reaktion zu stoppen (bitte vorher fragen!), transferieren Sie die Embryonen mit der abgeschnittenen blauen Spitze zurück in das Eppendorf-Röhrchen, und waschen Sie 3x für je 5 min mit 1 ml PBT (nach Waschen Handschuhe nicht mehr nötig). Um Nachfärbung zu vermeiden: 3X 10´ waschen 23. Einbetten: Blastoderm-Stadien: Transferieren Sie Blastoderm-Stadien mit einer abgeschnittenen gelben Spitze auf einen Objektträger und saugen Sie das PBT ab. Geben Sie 100% Glycerin dazu und mischen Sie die Embryonen vorsichtig darin. Legen Sie ein Deckglas mit Plastillin-Füßchen auf. Keimstreifen: Transferieren Sie Embryonen auf einen Objektträger und saugen Sie das PBT ab. Geben Sie 100% Glycerin zu und mischen Sie vorsichtig. Mit feinen Spritzen mit inserierten Insektennadeln lässt sich der Dotter abpräparieren. Embryonen mit wenig Rest-Dotter transferieren Sie auf einen neuen Objektträger mit einem winzigen Tropfen 50% Glycerin. Strecken Sie den 26 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Keimstreif am Rand des Tropfens auf den Rücken aus. Saugen den Tropfen Glycerin ab und legen Sie ein kleines Deckgläschen auf. Dann lassen Sie vom Rand her wieder 50% Glycerin unter das Deckgläschen einziehen. Analysieren Sie die Färbung am Mikroskop PBT: PBS plus 0.02% Tween 20; zur Inaktivierung von RNAse mit 0.5 ml DEPC/l für 15min gerührt und dann autoklaviert Färbepuffer (jeweils frisch ansetzen): 1 ml 1M MgCl2 zu 20 ml 0.1M Tris pH 9.5 zugeben, mischen; dann 400 ul 5M NaCl zugeben und mischen, und schliesslich 100 ul 20% Tween20 Detektions-Puffer (frisch herstellen): je Ansatz 1 ml Färbepuffer + 4,5 ul NBT-Lösung + 3,5 ul X-Phosphat-Lösung, einen Ansatz für alle zusammen ansetzen! Hybe-A: 25 ml deionisiertes Formamide + 12.5 ml 20x SSC (Maniatis; pH 5.5); mit dH2O auf 50 ml auffüllen, und folgendes zugeben: 1 ml boiled sonicated salmon testis DNA (10mg/ml) + 250 ul tRNA (20mg/ml) + 25 ul heparin stock (100mg/ml). Bei -20°C aufbewahren Hybe-B: 50% Formamid, 5xSSC, dH2O NBT-Lösung: 4-nitro blue tetrazolium chloride, 75mg/ml in 70% dimethylformamide (-20oC) X-phosphate-Lösung: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, toluidinium salt, 50mg/ml in 100% dimethylformamide (DMF); Bei -20°C aufbewahren 27 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher V4: Alkoholische Fuchsin-Färbung Tribolium/Drosophila/Gryllus Sie erhalten fixierte Embryonen in MeOH. Alle Schritte in Eppendorf Röhrchen, je 1 ml. 1. Wasserbad/Alublöcke im Ofen auf 65°C vorwärmen! Embryonen 30 min in Lösung A nachfixieren (auf Drehrad) 2. 4 x 10 min in 70%igem EtOH waschen 3. 10 min im Heizblock bei 65°C in 2N HCl (nicht länger, nicht kürzer!!) 4. 1 x mit H2O waschen 5. 2 x mit 70%igem EtOH waschen 6. 30 min (nicht länger!) färben mit 1ml alkoholischer Fuchsinlsg (Achtung: sehr rot! Mantel! Handschuhe!). 7. Waschen Sie mit je 1 ml 100% EtOH mehrfach ohne Drehrad, bis die Färbung im Überstand nachlässt. Dann waschen mit 2X5 min, dann 2X 10 Minuten auf dem Drehrad (bis auch hier keine rote Färbung mehr im Überstand zu sehen ist). Geduld, es kann dauern... 8. in PBT bringen (25% Vol mit PBT ersetzen, mischen, 50% ersetzen, mischen, 100% ersetzen, mischen) In 2 Blockschälchen transferieren, Im Binokular betrachten (jeder Student bekommt ein Bino!) 9. Einbetten: Drosphila und Tribolium wie Blastdodermstadien der in situ Färbung einbetten (siehe V3 Schritt 23, vorherige Seite), Auswertung/Fotos unter dem Mikroskop Gryllus: werden im Blockschälchen in PBT unter dem Bino ausgewertet Lösungen: - Lsg.A: 12,0 ml 95%igen EtOH 1,5 ml 100%ige Essigsre 0,6 ml 37%igen Formaldehyd - alkoholische Fuchsinlösung: 100 mg Pararosanilin (Sigma P-7632) + 16 ml EtOH + 4 ml H2O dest. + 0,2 ml conc. HCl, bei -20°C einfrieren - PEMS-Puffer: 12,08 g Pipes + 800 ul 1 M MgSO4 + 800 ul 0,5 M EDTA, mit NaOH auf pH 6.9 einstellen, mit Millipore-H2O auf 400 ml auffüllen Auswertung: Versuchen Sie, die unten beschriebenen Stadien wiederzufinden, und die morphologische Entwicklung zu verstehen. Ist Gryllus ein Kurz- oder Langkeimembryo? Welcher Embryo zeigt das? 28 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Fuchsin-Färbung Tribolium Gryllus Sie erhalten fixierte Eier in MeOH, ein Gemisch aus jungen und mittleren Stadien. Devitellinisieren: Die jungen Stadien (klein, dunkle braun-graue Farbe) sind durchlässig für Fuchsin – sie müsen nicht präpariert werden. Die älteren (größer, blendend-weißer Inhalt) müssen per Hand aus der Vitellinhülle präpariert werden. Bringen Sie die Eier mit einer abgebrochenen blauen Spitze in ein Blockschälchen. Zwicken Sie mit einer feinen Pinzette das vordere Ende der Vitellinhülle auf (durch den Innendruck entweicht dabei Flüssigkeit/Dotter) Nun entfernen Sie die Vitellinhülle, indem Sie sie mit zwei Pinzetten auseinander ziehen. Alternative: pressen Sie den Ei-Inhalt durch das Loch heraus, indem Sie von hinten nach vorne vorsichtig drücken (Zahnpasta-Technik). Achtung: der Embryo (leicht transparent-weißes Gewebe) liegt im Dotter eingebettet (blenden weiß) und ist kaum zu sehen. Er liegt im posterioren Teil des Eies. 29 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Bitte beachten Sie: schon im Blastoderm-Stadium sind alle Segmente genetisch angelegt! Daher tragen beinahe alle Zellen im Blastoderm zum Embryo bei. Diese Art der Entwicklung nennt man „Langkeim-Entwicklung“ (long germ embryogenesis) 30 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Im Keim-Rudiment Stadium erkennen Sie, dass nur die ventro-posterioren Teile des Blastoderms zum Embryo werden. Der Rest wird extraembryonales Gewebe. In diesem Stadium sind nur Kopf- und ThoraxSegmente angelegt. Alle anderen Segmente entstehen während eines Wachstumsprozesses der posterior gelegenen Wachstumszone. Deshalb und weil der künftige Embryo nur einen Teil des Blastoderms einnimmt, nennt man diese Form der Entwicklung „Kurz-Keim-Entwicklung“ (short germ embryogenesis). Gryllus Entwicklung Hat Gryllus eine Lang- oder Kurz-Keim-Embryogenese? Zeichnen Sie einen phylogenetischen Baum mit Drosophila (Diptera), Tribolium (Coleoptera) und Gryllus (Saltatoria) und tragen Sie den Entwicklungstyp auf. Welcher Entwicklungstyp ist nach dieser (zugegebenermaßen etwas mageren...) Merkmalsverteilung als ursprünglich anzunehmen? 31 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher V5: parentale RNAi A. weibliche Puppen sammeln: Sie erhalten eine Mischung aus männlichen und weiblichen Puppen. Unter dem Binokular legen Sie die Puppen so auf den Rücken, dass die Abdomen-Spitze auf die Lichtquelle weist. An der Abdomenspitze befinden sich die Urogomphi, die in beiden Geschlechtern gleich groß sind. Etwas anterior davon, auf der Ventralseite, liegen die kleineren Genital-Papillen, die in Weibchen aber deutlich grösser ausgebildet sind als in Männchen (bei Weibchen sind zwei Spitzen zu erkennen, siehe Pfeil, bei Männchen sieht es wie eine zweigeteilte Platte aus). weibliche & männliche Puppe alte, mittelalte, junge Puppen Trennen Sie Weibchen von Männchen. Jeder braucht 15 Weibchen (für die Injektion) und etwa 5 Männchen (zur späteren Befruchtung). Für das eigentliche Experiment suchen Sie möglichst alte Puppen heraus (Augen voll pigmentiert und Flügel grau schimmernd). B. Puppen aufkleben Schneiden Sie einen schmalen Streifen doppelseitiges Klebeband ab (Breite ca. 3mm, Länge ca 5cm) und Puppen so aufkleben, dass die Ventralseite nach oben zeigt, wobei nur die äußerste (!) Abdomenspitze (evtl nur die Urogomphi) Kontakt mit dem Klebstoff haben dürfen (!in dieser Hinsicht können Sie nicht vorsichtig genug sein – wenn die Käfer zu weit anterior angeklebt sind, können sie nicht schlüpfen!). Üben Sie erst mit unsortierten Puppen unbekannten Geschlechts. Dem Betreuer zeigen! Behalten Sie die aufgeklebten Übungspuppen für Injektionsversuche. 32 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher aufgeklebte Puppe Nehmen Sie einen neuen Objektträger und kleben Sie die weiblichen Puppen auf. Beschriften Sie mit Namen und Gen. Bevor Sie selbst injizieren, demonstrieren wir den Vorgang an einem Bino mit Kamera! C. Injektion Injektions-Apparatur: Mikromanipulator so einstellen, dass der Nadelhalter im Winkel von etwa 60 Grad auf die Arbeitsplatte zielt. Injektionskapillaren vorbereiten (zum Ausprobieren zunächst nur mit Wasser-Phenolrot-Mix injizieren - das ist die rote Lösung): Spitz ausgezogene Kapillaren sind bereits vorbereitet. Unter dem Stereomikroskop brechen Sie die Spitze der Kapillare ab (mit Rasierklinge schräg quetschen). Die Öffnung sollte in etwa so groß sein wie der sklerotisierte Teil der Urogomphi. Dicke der Spitze: etwa so groß wie der sklerotisierte Teil der Urogomphi Befüllen der Kapillare: Kapillare wird vom Betreuer in die Anlage eingespannt. Zur Übung befüllen Sie zuerst mit WasserPhenolrot-Mix: 3ul auf einen Eppi-Deckel pipettieren, unter dem Bino die Spitze in den Tropfen führen und ganz sachten (!) Unterdruck anlegen. Bevor die Spitze Luft ansaugen kann, den Unterdruck auf Null reduzieren. 33 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher Test-Injektion: Kapillarenspitze ventro-lateral zwischen zwei abdominale Segmente einführen (dort injizieren, wo die Flügelspitze hinzeigt; nicht in der Mitte injizieren, um das Nervensystem nicht zu schädigen). Steigern sie langsam und vorsichtig(!) den Druck, bis sich die Puppe durch den erhöhten Turgor sichtbar streckt. Zuerst (!) Druck reduzieren, dann die Kanüle wieder aus der Puppe ziehen (sonst fließt die dsRNA aus der Kanüle). Ort der Injektion: lateral, zwischen zwei Gut injizierte Puppen sind durch den Sterniten, in etwa dort, wo die Flügelspitzen Innendruck gestreckt (rechts) hindeuten dsRNA Injektion: Befüllen und Injizieren wie beim Test. Sollten größere Tropfen an dsRNA auf der Puppe zurückbleiben, kann man diese wieder einsaugen (!nur geringer Unterdruck, sonst landet die dsRNA im Kapillarenhalter). Beim Injizieren wird der Objektträger mit den aufgeklebten Puppen mit einer Hand geführt, und die Injektionskapillare wird mit dem Mikromanipulator auf die Puppe zu (und wieder zurück) geführt. 3 ul sollten für etwa 15 Puppen reichen. Nachbehandlung: Objektträger mit injizierten Puppen nach unten auf Vollkorn-Mehl legen, männliche Puppen zugeben (ca 5) und bei 33° Grad inkubieren. Am 7-ten Tag nach der Injektion Käfer in Röhrchen mit weissem Mehl transferieren, nach weiteren 3 Tagen Eier aussieben. Diese Eier werden auf 280 um-Siebchen bei 32 Grad inkubiert. Schlüpfende Larven krabbeln dann durch das Sieb weg, die Embryonen mit RNAiPhänotyp bleiben oben liegen und werden nach 4 Tagen in Hoyers-Milchsäure eingebettet. 34 GP-1: Evolution der abdominalen Segmentierung Gregor Bucher V6: Einbetten von Kutikulas Eiablage: die Käfer werden aus dem Vollkornmehl ausgesiebt (800um Netz) und auf feines weisses Mehl (mit 5% feinem Hefepulver) gesetzt. Nach 3 Tagen werden erst die Käfer (800 um), dann die Eier herausgesiebt (300 um) und auf 300 um Entwicklungs-Siebchen transferiert. Die Siebchen werden für 4 Tage so bei 33 Grad inkubiert, dass Heterozygote und Wildtypen schlüpfen und durch die Maschen nach unten wegkrabbeln können. Die zurückbleibenden Eier (mit lethalen Mutanten) werden eingebettet. Dechorionisieren/Mehl entfernen: Eier in 150 um Netzchen transferieren. Netzchen in Petrischalen mit 50% Klorix stellen, ab und zu auf- und abbewegen, ab und zu mit Spritzflasche kräftig(!) spülen. Verschwinden des Mehls unter dem Binokular beobachten. Dann mit Wasser (kräfitg!) waschen, Einbetten: Einen Tropfen Hoyers-Milchsäure auf einen Objektträger bringen. Mit dem Pinsel die dechorionierten Embryonen mit möglichst wenig Flüssigkeit in den Tropfen übertragen und gleichmäßig verteilen. Deckglas auflegen (ohne Luftblasen!) und vorsichtig quetschen (unter dem Bino verfolgen!). Die Vitellinhülle soll platzen und der Embryo sich ausstrecken. Zu starkes quetschen vermeiden! Literatur: Berghammer, A. J., Klingler, M., and Wimmer, E. A. (1999). A universal marker for transgenic insects. Nature 402, 370-1. Bucher, G., Scholten, J., and Klingler, M. (2002). Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol 12, R856. Meister, G., and Tuschl, T. (2004). Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 431, 343-9. Tautz, D., Friedrich, M., and Schröder, R. (1994). Insect embryogenesis - what is ancestral and what is derived? Development Supplement, 193-199. Wimmer, E. A. (2003). Genetik der embryonalen Musterbildung. In "Lehrbuch der Entomologie" (P. Dettner, Ed.), pp. 420-436. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg. 35
