Funktionale Genomforschung – neue Ansätze zur Verbesserung der

Züchtungskunde, 78, (6) S. 428 – 439, 2006, ISSN 0044-5401
© Eugen Ulmer KG, Stuttgart
Funktionale Genomforschung – neue Ansätze zur
Verbesserung der Fruchtbarkeit beim Rind
E. Wolf1,2, G. J. Arnold2, St. Bauersachs1,2, H. Blum2, Th. Fröhlich2,
St. Hiendleder3, Katrin Mitko1,2 und H.D. Reichenbach4
Prof. Dr. Dr. h.c. Dr. h.c. Horst Kräußlich zum 80. Geburtstag gewidmet
1 Einleitung
Fruchtbarkeitsprobleme zählen seit Jahren zu den häufigsten Abgangsursachen weiblicher Rinder. In Deutschland wie auch in Österreich ist Unfruchtbarkeit eine führende
Ursache für die Merzung von Milchkühen. Aktuelle Statistiken setzen den aufgrund von
Unfruchtbarkeit gemerzten Anteil der weiblichen Rinder zwischen 22 % und 25 % an
(Arbeitsgemeinschaft Deutscher Rinderzüchter, 2005; ZuchtData, 2006). Eine schlechte Herdenfruchtbarkeit wirkt sich unter anderem durch zusätzliche Kosten für Besamungen und Behandlungen durch den Tierarzt aus. Die erhöhten Zwischenkalbezeiten
führen zu verlängerten Laktationen bei oft reduzierter Milchleistung. Zudem treten
Probleme in der Remontierung der weiblichen Nachzucht auf. Aus diesem Grund ist
eine züchterische Verbesserung der Fruchtbarkeit von herausragender Bedeutung, da
sie durch Kostenreduktion entscheidend zum wirtschaftlichen Erfolg der Rinderzucht
beitragen kann (Übersicht: Gredler, 2006).
Seit 2002 wird die Zuchtwertschätzung Fruchtbarkeit in Deutschland und Österreich
länderübergreifend durchgeführt. Als Merkmal wird die Non-Return-Rate am 90. Tag
nach der ersten Belegung pro Laktation (NRR 90) herangezogen. Allerdings sind die Heritabilitäten für Non-Return-Raten in der Regel sehr niedrig mit Schätzwerten zwischen
0,01 und 0,05 (Übersicht: Gredler, 2006). Neben der NRR 90 werden daher eine Reihe von physiologischen Hilfsmerkmalen diskutiert, für die zum Teil ein geringgradiger
Zusammenhang mit der Fruchtbarkeitsleistung gezeigt wurde. Zu diesen Hilfsmerkmalen zählen unter anderem der Progesterongehalt der Milch, die Bewegungsaktivität und
die Körpertemperatur, welche die Brunstdiagnostik verbessern können (Übersicht:
Gredler, 2006). Auch Messwerte für verschiedene Milchinhaltsstoffe sowie das Merkmal Body Condition Score wurden zur Unterstützung der Zuchtwertschätzung Fruchtbarkeit empfohlen. Allerdings handelt es sich hierbei um Parameter, die nur indirekt mit
der Physiologie und Pathologie der Reproduktion zusammenhängen. Daher ist die Suche nach neuen Merkmalen unverzichtbar, die in engerem Zusammenhang mit dem Reproduktionsgeschehen stehen.
1 Lehrstuhl für Molekulare Tierzucht und Biotechnologie. E-mail: [email protected]
2 Laboratorium für funktionale Genomanalyse (LAFUGA), Genzentrum der Ludwig-MaximiliansUniversität München
3 Animal Genetics, Department of Agricultural and Animal Science, University of Adelaide,
Australia
4 Sachgebiet Biotechniken, Institut für Tierzucht, Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft,
Grub
Funktionale Genomforschung – neue Ansätze
429
Abb. 1. Selektionsstufen in der Reproduktionsbiologie
Biological filters in biology of reproduction.
2 Holistische Analysen zur Definition neuer phänotypischer Merkmale
Die Reproduktionsleistung ist durch eine Vielzahl biologischer Selektionsmechanismen
determiniert, die u.a. auf Wechselwirkungen von Gameten, Embryonen und Feten
mit ihrer maternalen Umgebung basieren (Abb. 1). Durch Biotechniken der Fortpflanzung, wie die in vitro Produktion von Embryonen oder die Kerntransfer-Klonierung,
werden diese „biologischen Filter“ teilweise umgangen. Inwieweit bei der Anwendung
von Biotechniken der Fortpflanzung mitunter auftretende Probleme, wie das „Large Offspring Syndrome (LOS)“ bei den Wiederkäuern, damit zusammenhängen, ist bislang unklar.
Eine erfolgversprechende Analyse reproduktionsbiologischer Vorgänge und möglicher Störungen bei der Anwendung von Biotechniken erfordert exakt definiertes biologisches Material, systematische vergleichende Transkriptom- und Proteomanalysen sowie funktionelle Studien (Übersicht: Hiendleder et al., 2005). Untersuchungen der
Wechselwirkung zwischen Gameten bzw. Embryonen und ihrer maternalen Umgebung
sind besonders erfolgversprechend, da Ort und Dauer der Wechselwirkungen relativ genau definiert und Veränderungen von Genexpressionsprofilen einfacher als bei anderen
Merkmalen interpretiert werden können.
Beim Rind entsteht ein großer Anteil der gesamten Verluste an Trächtigkeiten zwischen dem 8. und 18. Tag nach der Befruchtung, also vor der Implantation (Übersicht:
Wolf et al., 2003). Als Ursache für dieses wirtschaftlich wichtige Phänomen des embryonalen Fruchttodes wird u.a. eine gestörte Kommunikation zwischen dem Konzeptus und seiner maternalen Umgebung diskutiert. Limitierende Größen sind das Trächtigkeitserkennungssignaling des Embryos einerseits und die uterine Rezeptivität andererseits. Bei den Wiederkäuern ist das Interferon tau (IFNT) als wichtiges embryonales
Trächtigkeitserkennungssignal bekannt. IFNT wird von den Trophektodermzellen der
Blastozyste produziert und ist das wichtigste antiluteolytische Signal des Embryos. IFNT
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E. Wolf u.a.
Abb. 2. Strategie zur systematischen Analyse embryo-maternaler Wechselwirkungen in der
Präimplantationsperiode (Tag 18)
Strategy for systematic analysis of embryo-maternal interactions in the pre-implantation
period (Day 18)
reduziert auf parakrinem Wege die Expression von Östrogen- und Oxytocinrezeptoren
im Endometrium und verhindert so die zyklische Freisetzung von Prostaglandin F2α
(PGF2α) und damit die Luteolyse (Übersicht: Wolf et al., 2003). Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass neben dem IFNT weitere Mechanismen der embryo-maternalen Kommunikation und Interaktion eine Rolle spielen. Dafür spricht allein die Tatsache, dass
die Sekretion von IFNT in einigen Studien mit der Entwicklungskapazität der Embryonen korrelierte, in anderen Studien jedoch nicht. Für ein umfassendes Verständnis des
embryo-maternalen Dialogs sind systematische vergleichende Transkriptom- und Proteomuntersuchungen zwingende Voraussetzung (Wolf et al., 2006). Diese führen wir
im Rahmen der DFG-Forschergruppe 478 „Mechanismen der embryo-maternalen Kommunikation“ durch (siehe www.ematko.de).
Für diese Studien nutzen wir u.a. monozygote Zwillinge, die durch „Embryo-Splitting“
erstellt wurden. Für das Experiment werden die Zwillingspaare Zyklus-synchronisiert,
um dann jeweils einem Zwilling Embryonen zu übertragen, während der andere Zwilling als Kontrolle dient (Abb. 2). Dadurch werden störende, bei nicht verwandten Tie-
Funktionale Genomforschung – neue Ansätze
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ren variable genetische Einflüsse auf die Genexpression im Endometrium eliminiert,
was einen enormen Vorteil für die Detektion der spezifisch von Embryonen induzierten
Veränderungen der Genaktivitätsprofile darstellt. Signalwirkungen von Embryonen
werden identifiziert, indem die mRNA- und Protein-Expressionsmuster in standardisiert
gewonnenen Endometriumproben von trächtigen Tieren mit denen ihrer nichtträchtigen Zwillinge verglichen werden. Dabei verfolgen wir einerseits einen KandidatengenAnsatz, andererseits holistische Ansätze, in denen das Transkriptom bzw. das Proteom
der entsprechenden Gewebe auf quantitative Veränderungen des Expressionsprofils untersucht wird.
3 Schlüsselmechanismen der embryo-maternalen Kommunikation und
Implantation
Für die Präimplantationsphase (Tag 18) konnten wir bereits eine Vielzahl von Transkripten im Endometrium identifizieren, deren Abundanz durch die Anwesenheit eines
Embryos zunimmt (Klein et al., 2006). Unter den rund 90 Genen, die wir als differenziell exprimiert identifiziert haben, befinden sich bereits bekannte Interferon-induzierte Gene, aber auch viele bislang in diesem Kontext unbekannte Gene, die u.a. für die
embryo-maternale Immunmodulation oder für strukturelle Umbildungen des Endometriums vor dem Anhaften des Embryos von Bedeutung sein können. Diese Mechanismen
konnten inzwischen in einem zweiten biologischen Modell (trächtige Kalbinnen nach
künstlicher Besamung) bestätigt werden (Bauersachs et al., 2006). In diesem Untersuchungsansatz wurde eine noch größere Zahl differenziell regulierter Gene identifiziert
(ca. 220), woraus das in Abb. 3 dargestellte Modell für die embryo-maternale Interaktion in der Präimplantationsphase abgeleitet werden konnte.
Abb. 3. Embryo-induzierte Transkriptomveränderungen im Rinderendometrium vor der Implantation (Bauersachs et al., 2006)
Embryo-induced transcriptome changes in bovine endometrium before implantation
(Bauersachs et al., 2006)
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E. Wolf u.a.
Abb. 4. Quantitative Veränderung des Endometrium-Proteoms während der Frühgravidität
(Tag 18). A: 2D-DIGE Analyse der Endometrium-Proteine eines Zwillingspaares (Cy2 Scan)
B: 3D-Darstellung abundanzveränderter Proteine bei Anwesenheit eines Embryos (jeweils links nichtträchtig, rechts trächtig, Faktor > 2, p < 0.01). Sechs Tiere (drei Zwillingspaare) wurden analysiert (Berendt et al., 2005)
Quantitative changes of the endometrium proteome during early pregnancy (day 18).
A: 2D-DIGE analysis of endometrium proteins of a twin pair (Cy2 scan) B: 3D-Plot of
proteins which were changed in their abundance by the presence of an embryo (left side:
non-pregnant; right side: pregnant; factor > 2, p < 0.01). Six animals (three twin pairs) were
analyzed (Berendt et al., 2005)
Parallel zu den Transkriptomstudien durchgeführte Proteomuntersuchungen identifizierten eine Reihe von Proteinen, die im Endometrium trächtiger Tiere (Tag 18) in höherer Abundanz als bei nichtträchtigen Vergleichstieren vorkommen (Abb. 4; Berendt
et al., 2005). Zusätzlich werden optimierte Zellkulturen aus Eileiterepithel (Rottmayer et al., 2006) bzw. Endometrium in Kokultur mit synchronen Embryonalstadien verwendet, um die Befunde aus den in vivo-Modellen zu verifizieren und auf ihre funktionelle Relevanz zu prüfen. Darüber hinaus lassen sich mit den in vitro-Kokultursystemen
ergänzend gezielte Versuche in bestimmten, z.B. sehr frühen Entwicklungsabschnitten
von Embryonen durchführen, die mit einem in vivo Modell nicht oder nur ungenügend
genau realisiert werden können. Für die biotechnologische Anwendung in der Rinderzucht sind dabei besonders Auswirkungen der Kokultur bzw. des Kontakts mit Zellen
des weiblichen Genitales auf den Metabolismus und die Entwicklungskompetenz von in
vitro produzierten Embryonen relevant. Diese Effekte werden durch eine detaillierte
morphologische und molekulare Phänotypisierung der produzierten Embryonen sowie
der maternalen Zellen geprüft, die in Kontakt mit den Embryonen waren. Die Funktion
bestimmter Kandidatenproteine kann in serumfreien Systemen für die in vitro-Produktion von Rinderembryonen validiert werden (Boelhauve et al., 2005). Zudem kann die
Expression bestimmter Gene in Embryonen oder Zellen des weiblichen Genitale moduliert werden. Dafür bieten sich beispielsweise lentivirale Vektoren an, mit denen eine
hocheffiziente Transduktion von Eizellen und Zygoten der Tierarten Schwein und Rind
möglich ist (Hofmann et al., 2003; Hofmann et al., 2004).
Funktionale Genomforschung – neue Ansätze
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4 Zyklusabhängige Steuerung zellulärer Funktionen im weiblichen Genitale
Neben den Untersuchungen an trächtigen Tieren beschäftigen wir uns mit molekularen
und funktionellen Veränderungen im Eileiter und in der Gebärmutter während des Zyklus. Das Epithel des Eileiters als Umgebung entscheidender Reproduktionsprozesse unterliegt hinsichtlich seiner Morphologie wie auch hinsichtlich funktionaler Parameter
erheblichen zyklusabhängigen Veränderungen. Um die molekularen Grundlagen dieser
Veränderungen zu analysieren, haben wir vergleichende Transkriptomuntersuchungen
von Eileiterepithelzellen im Östrus (Zyklustag 0) und im Diöstrus (Zyklustag 12) durchgeführt. Unter den insgesamt 77 differentiell exprimierten Genen wiesen im Östrus viele für die Proteinfaltung und -sekretion relevante Gene eine höhere Aktivität auf, während im Diöstrus vor allem Gene, die für Transkriptionsfaktoren kodieren, ein höheres
Expressionsniveau zeigten (Bauersachs et al., 2004). Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass 3 Tage nach der Ovulation das Genaktivitätsmuster im Epithel des ipsilateralen Eileiters sich von dem des kontralateralen Eileiterepithels unterscheidet. Es wurden
über 30 Gene identifiziert, die reproduzierbar im ipsilateralen Eileiter in ihrer Aktivität
hoch- oder herunterreguliert waren. Es handelt sich um Gene, die für das Immunsystem
relevant sind, Gene, die das Zytoskelett regulieren, wie auch um Gene, die für Zell-ZellInteraktion von Bedeutung sind (Bauersachs et al., 2003). Diese Ergebnisse zeigen,
dass innerhalb eines Tieres lokale Unterschiede in der Hormonkonzentration oder der
ovulierte Kumulus-Oozyten-Komplex entsprechende Veränderungen der Genaktivität
im Eileiter induzieren können. Transkriptomstudien von Endometriumproben, die im
Östrus oder im Diöstrus gewonnen wurden, ergaben eine noch größere Zahl von differentiell abundanten Transkripten, die ebenfalls eine Zyklusstadien-spezifische vermehrte Expression bestimmter Funktionsklassen von Genen erkennen ließen (Bauersachs et
al., 2005).
5 Dynamische Transkriptom- und Proteomstudien
Die verschiedenen bislang punktuell durchgeführten Untersuchungen haben bereits eine Vielzahl von Genen identifiziert, die in verschiedenen Zyklusstadien bzw. während
der Frühgravidität in ihrer Expression verändert sind. Die gewonnenen Transkriptomund Proteomprofile stellen aber nur eine Momentaufnahme dar und erlauben keine
Rückschlüsse hinsichtlich der dynamischen molekularen Veränderungen in Reproduktionsgeweben während des Zyklus bzw. in der Frühgravidität. Daher werden in dem vom
Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten FUGATO-Forschungsverbund FERTILINK (siehe www.fugato-forschung.de) die Daten durch systematische
Untersuchung weiterer Zeitpunkte komplettiert. Dadurch soll ein detailliertes Bild der
molekularen Physiologie von embryo-maternalen Interaktionen vor und während der
Implantation entstehen, um klären zu können, ob und welche Störungen dieser Mechanismen bei Unfruchtbarkeit eine Rolle spielen.
5.1 Entwicklung eines bovinen Ovidukt-Endometrium (BOE)-Arrays
Aufbauend auf den o.g. Untersuchungen haben wir ein bovines Ovidukt- und Endometrium (BOE) cDNA-Array entwickelt, das etwa 900 verschiedene Transkripte enthält,
welche durch 1344 cDNA-Fragmente repräsentiert werden (Abb. 5). Bei den ursprünglichen Studien wurden jeweils subtraktive cDNA-Bibliotheken angelegt und diese durch
cDNA-Array-Hybridisierung analysiert, um cDNAs differentiell exprimierter Gene zu
identifizieren. Alle diese cDNAs wurden auf dem BOE-Array zusammengefasst, um ein
Set an Genen zu erhalten, welche für das Reproduktionsgeschehen in den betreffenden
Geweben von Bedeutung sind. So enthält das BOE-Array cDNAs von Genen, die im Eileiterepithel an Tag 3,5 des Zyklus mRNA-Konzentrationsunterschiede zwischen dem
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Abb. 5. Herstellung eines bovinen Ovidukt- und Endometrium (BOE)-cDNA-Arrays. Ausgehend
von verschiedenen Transkriptomstudien im bovinen Oviduktepithel und im Endometrium wurde mit Hilfe einer Liquid-Handling-Station ein Set von 1344 cDNA-Fragmenten
zusammengestellt, die ca. 900 verschiedene mRNAs repräsentieren. Diese cDNA-Fragmente wurden mit einem Microarray-Spotter auf Nylon-Membranen (2 x 5 cm) aufgetragen. Das Bild des Arrays stellt ein Hybridisierungsergebnis mit einer Endometriumprobe vom Tag 18 des Sexualzyklus dar
Generation of a bovine oviduct and endometrium (BOE) cDNA array. Based on different
transcriptome studies of bovine oviduct epithelium and endometrium a set of 1344 cDNA
fragments representing about 900 different mRNAs was arranged using a liquid handling
station. These cDNA fragments were spotted onto Nylon membranes (2 x 5 cm) using a
microarray spotter. The figure shows the hybridization signal with a probe from endometrium at day 18 of the estrous cycle
ipsi- und dem kontralateralen Eileiter aufwiesen (Bauersachs et al., 2003), bzw. an
verschiedenen Zyklustagen unterschiedlich reguliert waren (Bauersachs et al., 2004
und nicht publizierte Daten). Die Mehrzahl der cDNAs stammt allerdings aus Expressionsvergleichen von Endometriumproben aus unterschiedlichen Zyklusstadien (Bauersachs et al. 2005 und nicht publizierte Daten) und Vergleichen zwischen Trächtigkeit
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vs. Kontrolle am Tag 18 (Klein et al. 2006, Bauersachs et al. 2006) und Tag 15 (nicht
publizierte Daten). Eine zusätzliche Erweiterung des BOE-Arrays erfolgt mit langen synthetischen Oligonukleotiden von Genen, die mit Hilfe boviner Affymetrix GeneChips®
identifiziert worden sind. Zur Zeit wird das BOE-Array zur Untersuchung von mRNA-Expressionsprofilen während des Zyklus angewendet, wofür fünf verschiedene Zykluszeitpunkte ausgewählt wurden, um einen genaueren Einblick in den Verlauf der Änderungen der mRNA-Spiegel zu erhalten. Damit werden die Grundlagen für spätere diagnostische Anwendungen des BOE-Arrays gelegt.
Mit Hilfe des BOE-Arrays können zukünftig auch Gewebeproben, die durch Biopsie
aus dem Endometrium von Rindern gewonnen werden, in größerer Zahl untersucht
werden. Die Endometriumbiopsie wird beispielsweise in Finnland bereits zu Routineuntersuchungen durchgeführt. Letztlich soll geklärt werden, ob bestimmte differentielle
Genexpressionsmuster im Endometrium für Fruchtbarkeits- oder Stoffwechselstörungen
charakteristisch sind. In diesem Fall könnte das BOE-Array der Ausgangspunkt für ein
neues Werkzeug für die Differentialdiagnostik von Fruchtbarkeitsstörungen werden.
Langfristig könnte es auch möglich sein, endometriale Genexpressionsprofile in bestimmten Zyklusstadien als Merkmale für die Zuchtwertschätzung auf Fruchtbarkeit zu
verwenden.
5.2 Proteinarrays als nächste Stufe
Die modernen Methoden der Proteomanalyse wie zweidimensionale Gelelektrophorese
und Tandem-Massenspektrometrie (Fröhlich und Arnold, 2006) ermöglichen die Entdeckung von Biomarkern auf Proteinebene, diese Methoden sind jedoch aufgrund ihres
hohen experimentellen Aufwandes für die diagnostische Anwendung in aller Regel nicht
geeignet. Für eine Routineanwendung in der Diagnostik stehen die schon seit langem bewährten Verfahren der Antikörper-basierten RIA- und ELISA-Techniken sowie der Immunhistochemie nach wie vor im Vordergrund, und es spricht vieles dafür, auch für neu
entdeckte Protein-Biomarker zunächst auf diese Techniken zurückzugreifen. Gleichwohl
beschäftigen sich seit der überaus erfolgreichen Markteinführung der DNA/RNA-Mikroarrays auch eine Reihe von Forschungs- und Entwicklungslabors mit der Etablierung
sogenannter Proteinchips oder Antikörper-Arrays. Eine entscheidende Voraussetzung für
Proteinarrays sind stets Antikörper sehr hoher Spezifität; diese stehen jedoch in der erforderlichen Qualität gegenwärtig nur für eine sehr begrenzte Anzahl von Proteinen (insgesamt einige hundert, für die Spezies Rind bedeutend weniger) zur Verfügung. Wir haben
ein Verfahren zur Erzeugung monoepitopspezifischer Antikörper entwickelt (iSEPIA-Technologie) und generieren im Rahmen der Untersuchungen zur embryo-maternalen Kommunikation entsprechende Sonden für Proteine, deren Relevanz sich in den holistischen
Untersuchungen auf Transkriptom- oder Proteomebene herausstellte.
Eine besondere Schwierigkeit stellt der extrem hohe dynamische Konzentrationsbereich dar, in welchem unterschiedliche Proteine in Geweben und insbesondere in Körperflüssigkeiten auftreten (Serum: 1012, d.h. ein „seltenes“ Protein muss neben einem
1012-fachen Überschuss eines hochabundanten Proteins detektiert werden). Mit den
heute bekannten Verfahren ist die gleichzeitige Detektion eines hochabundanten und
eines seltenen Proteins nicht machbar, da die Bindungskonstanten von Antikörpern hinreichender Spezifität nur um wenige Größenordnungen variieren. Gleichwohl aber lassen sich auf einem Antikörper-Array Proteine einer gemeinsamen Abundanzklasse
parallel detektieren. In den letzten Jahren sind zudem insbesondere bei den Spot-Technologien und den Detektionsverfahren ganz erhebliche Fortschritte gemacht worden
(z.B. Zeptosens-Technologie), die die Menge an benötigtem Analyt erheblich reduzieren
(je ca. 1000 Proteinmoleküle). Die wesentlichen Vorteile von Protein-Arrays liegen in
der parallelen Detektion und Quantifizierung mehrerer Proteine sowie in der Miniaturisierung der Assays und der damit verbundenen Kostenersparnis.
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E. Wolf u.a.
Abb. 6. Schematischer Aufbau von Proteinarrays. A: Chip-gebundener Analyt, direkte Detektion
mittels markierter Primär-Antikörper. B: Chip-gebundener Analyt, indirekte Detektion
mittels markierter Sekundär-Antikörper. C: „Dual Antibody Sandwich Assay“: Chip-gebundene Primär-Antikörper, Detektion des gebundenen markierten analytspezifischen Sekundär-Antikörpers. D: „Labeled Protein Capture Assay“: Chip-gebundene Primär-Antikörper, direkte Detektion des gebundenen markierten Analyts
Schematic representation of protein arrays. A: Chip-bound analyte, direct detection using
labelled primary antibodies. B: Chip-bound analyte, indirect detection using labelled
secondary antibodies. C: „Dual Antibody Sandwich Assay“: Chip-bound primary antibodies, detection using labelled analyte-specific secondary antibodies. D: „Labeled Protein
Capture Assay“: Chip-bound primary antibodies, direct detection of bound labelled analyte
Prinzipiell kann zwischen Arrays unterschieden werden, bei denen entweder das Antigen oder die Antikörper im Nano- bis Picoliter-Maßstab auf die Chip-Oberfläche aufgebracht werden (siehe Abb. 6). Beim ersten Arraytyp, geeignet für das Screening einer
Vielzahl von Proben (Körperflüssigkeiten, Gewebelysate) auf einige wenige Proteine,
werden die Proteinproben an die Chipoberfläche gebunden, und die Detektion und
Quantifizierung erfolgten entweder direkt mit markierten primären Antikörpern (z.B.
Fluoreszenz-markiert bzw. Enzym-gekoppelt) oder indirekt mit sekundären Antikörpern, die gegen die Primär-Antikörper gerichtet sind (Abb. 6 A, B).
Beim zweiten Arraytyp, geeignet für die parallele Detektion mehrer Proteine, wird ein
Set von Antikörpern entsprechender Spezifitäten an die Chipoberfläche gebunden und
der gesamte Chip mit jeweils einer biologischen Probe inkubiert. Zur Detektion der gebundenen Proteine wird entweder die biologische Probe direkt markiert („Direct Labelling Single-Antibody Assay“), oder man inkubiert mit einem Gemisch markierter Antikörper gegen jeweils andere Epitope der einzelnen Proteine („Dual Antibody Sandwich Assay“), wodurch die Spezifität nochmals erhöht wird (Abb. 6 C, D).
Aufgrund der umfangreichen weltweiten Forschungsaktivitäten werden in Zukunft
eine Vielzahl neuer Biomarker bzw. Biomarkersets zur Verfügung stehen, wodurch die
Entwicklung und Anwendung von Proteinarrays auch in der tiermedizinischen und tierzüchterischen Diagnostik einen erheblichen Aufschwung nehmen wird.
6 Nutzen für die Tierzuchtpraxis
Die biotechnologische Anwendung der gewonnenen Erkenntnisse kann sich einerseits
auf eine Verstärkung der Signale im embryo-maternalen Dialog konzentrieren, um die
Trächtigkeitsrate nach Embryotransfer zu erhöhen und dem embryonalen Frühtod ent-
Funktionale Genomforschung – neue Ansätze
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gegenzuwirken. Ein denkbares Szenario ist beispielsweise die rekombinante Expression
neuer embryonaler Trächtigkeitserkennungsproteine, um sie lokal mit dem Embryo zu
transferieren oder auch systemisch zu applizieren. Die generelle Machbarkeit dieser
Strategie wurde am Beispiel von rekombinantem IFNT bereits demonstriert. Andererseits ist auch die Entwicklung Array-basierter Verfahren für die Differentialdiagnostik
von Fruchtbarkeitsstörungen ein Ziel der holistischen Analyse embryo-maternaler Interaktionen und anderer Regulationsmechanismen in der Reproduktionsbiologie. Als Zukunftsperspektive zeichnen sich systembiologische Ansätze in der Tierzucht ab, die auf
der Basis holistischer Analyseverfahren, rasch wachsender biologischer Erkenntnisse
und neuer mathematischer Modelle eine Verbesserung funktionaler Merkmale, wie Gesundheit und Fruchtbarkeit, ermöglichen sollten.
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Zusammenfassung
Fruchtbarkeitsprobleme bei weiblichen Rindern stellen ein zunehmendes Problem dar,
das hohe Kosten verursacht und den genetischen Fortschritt beeinträchtigt. Gegenwärtig verfolgte Ansätze zur Verbesserung der Fruchtbarkeit sind aufgrund der niedrigen
Heritabilität des verwendeten Merkmals (Non-Return-Rate am 90. Tag nach der ersten
Besamung; NRR 90) ineffizient. Daher werden dringend neue phänotypische Merkmale mit einer höheren Aussagekraft hinsichtlich der genetischen Komponente der Fruchtbarkeit benötigt. Da sich beim Rind ein großer Teil der Verluste an Trächtigkeiten vor
der Implantation ereignet, stellt die Interaktion zwischen frühen Embryonalstadien und
ihrer maternalen Umgebung ein attraktives Ziel für systematische Untersuchungen dar,
die zur Aufklärung der Ursachen des embryonalen Fruchttodes beitragen. Auf der Basis
von holistischen Transkriptom- und Proteomstudien versuchen wir die embryo-maternale Kommunikation und die Regulation der uterinen Rezeptivität zu verstehen. Ein
kurzfristiges Ziel ist die Etablierung Array-basierter Verfahren für die Differentialdiagnostik von Fruchtbarkeitsstörungen und die Aufklärung von Zusammenhängen zwischen Stoffwechselproblemen und Unfruchtbarkeit. Längerfristig sollen Quantitative
Trait Loci identifiziert werden, die fruchtbarkeitsrelevante Genexpressionsprofile in
weiblichen Reproduktionsgeweben wie dem Endometrium beeinflussen.
Danksagung: Die vorgestellten Projekte zur funktionalen Genomforschung werden von
der Deutschen Forschungsgemeinschaft (FOR 478) sowie vom Bundesministerium für
Bildung und Forschung (FUGATO-Fertilink) gefördert. Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Horst
Kräußlich gebührt unser besonderer Dank für sein anhaltendes Interesse an diesen Projekten und für viele wertvolle Anregungen und Diskussionsbeiträge.
Schlüsselwörter: Fruchtbarkeit; funktionale Genomik; Proteomik; embryo-maternale
Kommunikation; diagnostische Arrays
Funktionale Genomforschung – neue Ansätze
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Functional genome research – new strategies to improve fertility in cattle
by E. Wolf, G.J. Arnold, St. Bauersachs, H. Blum, Th. Fröhlich, St. Hiendleder, Katrin
Mitko and H.D. Reichenbach
Female infertility is an increasingly important problem in cattle, causing enormous
costs and retarding genetic progress. Current attempts to improve fertility by genetic
selection are inefficient due to the low heritability of the respective trait, i.e. the nonreturn-rate 90 days after first service (NRR 90). Thus novel phenotypic traits more
closely related to fertility are urgently needed. Since a large proportion of pregnancy
losses occurs in the preimplantation period, the interaction between early embryos
and their maternal environment is an attractive target for systematic investigations,
which may uncover mechanisms underlying early embryonic death. Based on holistic
transcriptome and proteome studies we attempt to understand the quantitative biology of embryo-maternal communication and the regulation of endometrial receptivity. A short-term goal is the development of array-based systems for the differential
diagnosis of fertility problems and for evaluating the connection between metabolic
disturbances and reproductive functions. A long-term goal is the identification of
quantitative trait loci affecting the fertility-related gene expression profiles in female
reproductive tissues such as endometrium.
Keywords: Fertility, functional genomics, proteomics, embryo-maternal communication,
diagnostic arrays