Mikroskopische Analyse
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MIKROBIOLOGIE Mikroskopische Analyse Lichtmikroskop optische Linsen Elektronenmikroskop elektrische Linsen Sichtbarmachung von Strukturen, die unterhalb des Auflösungsvermögens des menschlichen Augen liegen. Auge: 70-80 m Lichtmikroskop: 0.5 m + Immersionsöl 0.25 m Elektronenmikroskop 0.3 nm Auflösungsvermögen hängt ab von der Wellenlänge sowie der numerischen Apertur (NA) des Objektivs. NA = n * sin = halber Öffnungswinkel des Objektivs NA ist ein Maß für die Größe des Lichtkegels der vom Objektiv nach dem durchdringen des Objektivs aufgenommen wird. Auflösungsvermögen R = (k*)/NA k = const. 0.61 = Wellenlänge NA = numerische Apertur Das Auflösungsvermögen ist umso größer (besser) je kleiner die Wellenlänge des Lichtes ist und umso größer (besser) je größer die NA. Das sichtbare Licht befindet sich für das menschliche Auge ca. zwischen 400 – 800 nm wobei bei 550 nm (gelblich grünes licht) das menschliche Auge besonders empfindlich ist. Trockenobjekte (Luft zwischen dem Präparat und Objektiv) NAmax 0.85 nLuft 1 sin<1 Ölimmersion NAmax 1.4 nÖl > 1 Nach durchlaufen des Objektivs liegt im Mikroskoptubus ein Zwischenbild vor welches wiederum vergrößert wird. Diese Vergrößerung darf die Qualität jedoch nicht beeinflussen weshalb diese grob das 500-1000fache der NA sein darf. Darüber hinaus wird das Bild unscharf. Die resultierende Gesamtvergrößerung errechnet sich wie folgt: Okularvergrößerung * Objektivvergrößerung Objektivbeschriftung: Vergrößerung, NA, Tubuslänge (in der Regel 160mm), deckglasdicke auf die das Objektiv justiert ist. Als Lichtquelle wird sichtbares Licht zwischen 400-800 nm bzw. UV-Licht 300-400 nm verwendet. Das Licht wird durch den Kondensor gebündelt und in der ebene des Objektivs konzentriert (Köhlern). Ziel: Objekt gleichmäßig und optimal ausleuchten. Apertur des Kondensor kann durch eine Irisblende verkleinert werden. Mit Hilfe der Leuchtfeldblende lässt sich die im Objekt beleuchtete Fläche verkleinern, hat aber keinen Einfluss auf die Apertur des Kondensor. Ziel ist einen guten Kontrast bei gleichbleibender Auflösung zu erreichen. Lichtmikroskopische Verfahren Mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskops lassen sich ungefärbte Zellen (Gewebe) betrachten die in der Regel keine nennenswerte Lichtabsorption besitzen. Lichtwellen die das Objekt durchdringen erfahren eine gewisse zeitliche Verzögerung (durch einen unterschiedlichen Brechungsindex). Die Verzögerung führt zu einer sogenannten Phasendifferenz (für das menschliche Auge nicht erkennbar) die mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskops in hell und dunkel sichtbar gemacht werden. Das Resultat sind deutliche Kontraste. Das Interferenzmikroskop basiert auf dem gleichen Prinzip wie das Phasenkontrastmikroskop wobei die Phasendifferenz gemessen wird wodurch sich die Dichte und daraus die resultierende Masse der untersuchten Zellorganellen bestimmen lässt. Im Dunkelfeldmikroskop werden als Lichtstrahlen bis auf die schräg einfallenden Randstrahlen ausgeblendet. Zum Objektiv gelangen also nur solche Lichtstrahlen die von den untersuchten Objekt gebeugt oder gestreckt werden. Dadurch können Strukturen sichtbar gemacht werden die nur einen sehr geringen Kontrast haben oder sich an der Grenze des auflösbaren befinden. (Einsatz bei autoradiographischen Präparaten) Ein Polarisationsmikroskop arbeitet mit polarisiertem Licht (Licht das nur in eine Richtung schwingt) und ermöglicht das erkennen von Strukturen die doppelbrechend sind. Eine anisotope (doppelbrechend) Struktur spaltet polarisiertes Licht in 2 Faktoren auf die gegeneinander phasenverschoben sind. Dadurch werden Mikrostrukturen der Zelle sichtbar. Bei Fluoreszenzmikroskope sind drei Begriffe wichtig. Die Lumineszenz bezeichnet eine Aussendung langwelligen (energieschwachen) Lichts nach Bestrahlung mit kurzwelligem (somit energiereichem) Licht (UV). Von Fluoreszenz spricht man wenn die Aussendung des langwelligen Lichts genauso lange wie die Bestrahlung mit dem energiereichen licht anhält, die Phosphoreszenz beschreibt ein weiterstrahlen über diesen Zeitpunkt hinaus. Da UV Licht für das Menschliche Auge schädlich ist müssen verschiedene Filter verwendet werden welche nur die entstehenden langwelligen Strahlen passieren lassen. Der Anregungsfilter befindet sich zwischen Lichtquelle und Objekt und filtert langwelliges Licht heraus. Der Sperrfilter zwischen Objektiv und Okular filtert das nicht benötigte UV-Licht heraus sodass nur das Fluoreszenzlicht das Auge erreicht. Mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops werden Präparate untersucht die entweder zur Eigenfluoreszenz neigen oder Präparate welche mit bestimmten fluoreszierenden Farbstoffen gefärbt sind. Das UV-Mikroskop wird verwendet um Präparate welche chemische charakteristische UV-Absorptionsspektren aufzeigen (wie DNA, RNA, Zellkerne,...) ohne färben mit Hilfe eines Bildumwandlers oder UV-Fernseheinrichtungen sichtbar zu machen. Das konfokale Laser-Scanningmikroskop verbindet das klassische Lichtmikroskop mit dem Elektronenmikroskop und liefert so Informationen über die 3D Struktur eines mikroskopischen Präparates. Das Mikroskop legt „optische Schnitte“ durch das Präparat die zusammengesetzt ein dreidimensionales Bild ergeben. Fermentation Wachstum von Mikroorganismen Lebenswichtig für das Wachstum von Mikroorganismen ist Wasser! Pilze wachsen auf Substrat mit einem Wassergehalt >12%, Bakterien dagegen benötigen >20%. Weiterhin werden folgende Nährstoffe benötigt: Makroelemente (werden in größeren Mengen benötigt) C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe Mikroelemente (werden in geringeren mengen benötigt) Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, V, B, Cl, Na, Si Zusätzliche Bedingungen für das Wachstum sind ein optimaler pH-Wert, das Verhältnis der Ionen untereinander, Redoxverhältnisse, Temperatur und weitere. Anspruchsvolle Mikroorganismen sowie Defekt-Mutanten benötigen Substanzen die normalerweise zum Grundbestand der Zelle gehören, die aber nicht mehr von ihnen synthetisiert werden können Wachstumsfaktoren Beispiele hierfür sind Aminosäuren, Vitamine, Purine, öä Auxotrophe Organismen sind auf Wachstumsfaktoren angewiesen. Prototrophe Organismen bzw. Wildstämme sind nicht auf diese Wachstumsfaktoren angewiesen. Prototropher Organismus Mutation Auxotropher Organismus Kohlenstoffdioxid (CO2) ist für viele Mikroorganismen unbedingt erforderlich. CO2 ist Hauptkohlenstoffquelle für phototrophe und C-autotrophe Lebewesen. Phototroph = verwenden Licht als Energiequelle Autotroph = Fixierung von CO2 beim Aufbau der Zellkohlenstoffmasse Heterotroph = Zellkohlenstoffmasse wird aus organischen Verbindungen aufgebaut. Bei diesen Organismen hat CO2 viele „Funktionen“ (Synthese verschiedener Zellbestandteile) CO2 Bedürfnis für Wachstum wird oft nicht erkannt. Einfache Nährlösungen für anspruchslose Organismen des Bodens/Wassers (bsp. Pseudomonas, E.coli) gewährleisten gutes Wachstum K2PO4 NH4CL MgSO4 FeSO4 CaCl2 C6H12O6 0.5 g 1.0 g 0.2 g 0.01 g 0.01 g 10 g Spurenelemente 1mL 1000mL Wasser Bei vielen Mikroorganismen müssen die Nähr- und Vitaminlösungen den Bedürfnissen angepasst werden. Derartige aus chemischen Verbindungen definierter Zusammensetzung hergestellte Lösungen nennt man synthetische Nährlösungen. Ein Nährmedium das gerade ein normales Wachstum der Mikroorganismen gewährleistet nennt man Minimal-Medium. Liegen keine Kenntnisse über die genauen Nähstoffbedürfnisse vor verwendet man komplexe Nährmedien die nicht exakt definiert sind und deren Zusammensetzung oft unbekannt ist. Beispiel Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Würze (Brauereimalzextrakt) Heu-Extrakt, Pflaumensaft, Möhrensaft.... Feste Nährmedien Agar ist ein mit 2% Algenextrakt versehender gelartiger Nährboden. Er schmilzt bei 100°C und bleibt beim abkühlen bis 45°C flüssig. Dieser wird von Mikroorganismen fast nicht angegriffen. Gelatine dagegen schmilzt schon bei 26-37°C und wird oft von Mikroorganismen angegriffen weshalb diese eher selten verwendet wird. Bedingungen des Wachstums für Mikroorganismen pH-Wert Es gibt unterschiedlichste Mikroorganismen deren pH Optimum sehr unterschiedlich sein kann (viele Bakterien bevorzugen einen neutralen pHBereich um7). Nitrifizierer, Rhizobien, Actinomyceten, Harnstoff-Zersetzer benötigen einen leicht basischen pH-Wert pH größer 7 bis pH 8. Säuretolerantere wie Lactobacillen, Acetobacter, Sercina ventriculi vertragen weit höhere werte wogegen acidophile wie Thiobacillus, Acetobacter ocidophilus einen pH kleiner 7 bevorzugen. Versuch: Bodenprobe auf Komplexmedium (pH 5) Bodenprobe auf Komplexmedium (pH 8) Ergebnis: Bei pH 5 hauptsächlich Pilze bei pH 8 hauptsächlich Bakt. Allgemein: Pilze bevorzugen eher niedrige pH-Werte Bakterien bevorzugen eher höhere pH-Werte Erhaltung des opt. pH-Wertes Phänomen: Selbstabtötung durch Säure Mikroorganismen in der Nährlösung produzieren eine Säure die sie abtötet. In der Kultur muss während des Wachstums sicher gestellt werden, dass der pH-Wert den opt. Bereich nicht verlässt. Möglichkeit: - Nährmedium mit Puffersubstanzen abpuffern, d.h. z.B. mit Zugaben von Phosphaten (puffern im Bereich pH 7,2), Natriumtricarbonat Zugabe von nicht vergärbaren Substanzen um Säurebildung zu verhindern Zugabe von Bicarbonat-Ionen (HC03)- da Beziehung zwischen pH Wert (also Bicarbonat-Ionen) und CO2-Partialdruck der Atmosphäre Kleinere pH-Schwankungen (pH 6-9) werden in der Regel toleriert da die Organismen innerhalb von ca. 30min das ursprüngliche interne Milieu wiederherstellen können. Schäden bei ungünstigen pH-Werten treten auf, weil unter diesen Bedingungen viele Substanzen nicht ionisch vorliegen sondern undisoziiert und undisoziierte Säuren leichter in Zellen eindringen. Temperatur Hinsichtlich der Temperatur haben die Mikroorganismen unterschiedliche Bedürfnisse. Man unterscheidet vier Gruppen: - mesophile Organismen 20-45°C Boden- und Wasserbakterien - termophile Organismen >45°C viele Sporenbildner - psychrophile Organismen <20°C marine Organismen, Leuchtorganismen - thermotolerante Organismen Das Temperaturoptimum, nicht aber das Temperaturmaximum liegt im mesophilen Bereich Zum beuispeil Methylococcus copulates Optimum : 37°C Maximum : 50°C Osmotischer Druck Die meisten Bakterien sind gegenüber dem osmotischen Druck recht tolerant da die Zellwand sehr stabil ist und in der Regel einen Salzgehalt von 0,1-10% toleriert. Ausnahme: marine Bakterien (3,5-4% Salz) benötigen einen bestimmten Salzgehalt im Medium und wachsen unter 1% Salzgehalt nicht mehr. Halophyle Organismen wachsen auch in Pökellauge oder auf Salzhering. Sauerstoffgehalt Obligat aerobe Bakterien Benötigen auf jeden Fall 02 als Elektronenakzeptor. Der Sauerstoff muss in gelöster Form vorliegen 1 Liter Wasser löst bei 20°C 6,3 ml Sauerstoff (0,28 mmol) wodurch 8,3 mg Glukose (0,046 mmol) oxidiert werden (ca. 1 zu 1000 Glukosekonzentration in Medium). Während des Wachstums muss kontinuierlich belüftet werden. Die Belüftung erfolgt über eine große Oberfläche zwischen Gas Flüssigkeitsphase, und unter Anwendung eines erhöhten Sauerstoffpartialdrucks in der Gasphase. Wirkung: Sauerstoff löst sich mit erhöhter Geschwindigkeit im Medium. Belüftungsgemische: Sauerstoff, Stickstoff, Kohlendioxid Belüftung von aeroben Mikroorganismen-Kulturen - Kultur mit flacher Schicht - Schütteln des Mediums od. Rotation von liegenden Flaschen - durchströmen der Nährlösung mit Luft unter Druck durch Gasverteiler - Perkolation - mechanisches Rühren + Belüftung Kulturgefäße für MO Reagenzglas, Petrischale, Erlenmeyerkolben mit und ohne Kerben, Fennbachkolben, p-Kolben, Koller-schale, Kluyverkolben, Fermenter, Perkolation Streng anaerobe Bakterien Erforderlich für das Wachstum ist der Ausschluss von Luftsauerstoff! Anaerobentechnik entlüftete, ausgekochte Nährlösungen, Luftblasenfrei verschlossene Flaschen, Sauerstofffreie Gesamtatmosphäre Zugabe zum Medium: Reduktionsmittel (Ascorbinsäure (Vitamin C) und Thioglykalat-Cystein), Vakuumexsiccatoren, Sauerstoffabsorptionsmittel (alkalisches Dyrogallol, Dithionit, Kupfer I Chlorid) Stoffaufnahme in die Zelle Stoffe, die in die Zelle eindringen, müssen die Zellgrenzschichten passieren. Kleine Moleküle passieren die Zellwand ohne weiteres, Makromoleküle werden zurückgehalten. Selektiver Transport erfolgt an der Cytoplasmamembran. Der aktive Transport sorgt unter Energieverbruch dafür das viele Stoffe im Zellinneren in erheblich höheren Konzentration als im Nährmedium vorliegen. Modellvorstellungen Träger (für zu transportierende Stoffe) wechselt zwischen der äußeren und inneren Grenzschicht der Zellmembran. Aktiver Transport stellt eine spezifische Stoffaufnahme dar, d.h. Stoffe werden aufgenommen, wenn ein Transportmechanismus dafür vorhanden ist. Dieser Transportapparat hat oft Enzymcharakter - induzierbar - substratspezifisch - wird durch Proteinsynthese gebildet. - Beispiel Permeasen (Lactose-Permeasen bei E.coli) Beim der passiven Stoffaufnahme werden Stoffe aus der Umgebung bis zum Konzentrationsausgleich aufgenommen. Kein Energieaufwand! Einfache Diffusion Unspezifisches Eindringen Bedingung: Molekülgröße, lipophil Eigenschaften: geringe Transportgeschwindigkeit abhängig von der Höhe des Konzentrationsgradienten Ernährungstypen von Mikroorganismen - phototrophe Organismen - Licht als Energiequelle photosynthetisch chemotrophe Organismen - Energie aus Redox-Reaktionen (chemosynthetisch) lithotrophe Organismen - Nutzung von anorg. H-Donatoren (H2, NH3, H2S, Fe++, C02) organotrophe Organismen - Nutzung von org. H-Donatoren o Fixierung von C02 - Autotrophe o Fixierung organischen C - Heterotroph Angaben: Energiegewinnen und Angabe des H-Donators - photolithotroph - grüne Pflanzen, Blaualgen, Schwefelpurpurbakt. - chemolitotroph - nitrifizierende Bakt. - chemoorganotroph - Tiere, Mehrzahl der Mikroorganismen - chemolithoheterotroph - Desulfouibrio desulfuricans, oxidiert Wasserstoff, assimiliert dabei organische Substanzen Anreicherungskulturen Wichtig ist das nur die minimalen Bedürfnisse des betreffenden Stoffwechseltyps erfüllt sein dürfen. Selektion nach Resistenz. Toleranz gegen Säure, Alkali, Hitze, Strahlen etc. Nährboden + NaN3 Milchsäurebakterien (alle anderen Aerobier werden unterdrückt) Azid, CN, H2S Selektion gegen Aerobier die Cytochrome (=wichtigste Enzyme der Atmungskette) an Atmungsprozess beteiligen Impfmaterial mit verschiedenen Mikroorganismen eines Stoffwechseltyps - alle wachsen, der beste setzt sich durch - Möglichkeit ähnlich wachsender Mikroorganismen zu erfassen - Direktes Plattenverfahren - Mikroorganismen auf Selektivnährböden o Vereinzelung der Zellen sind die Zellen weit voneinander entfernt kann jeder stamm wachsen Isolierung einer Reinkultur durch Koch’sches Plattengussverfahren oder Ausstreichen auf Agar (3ÖA). Bei Anaerobiern erfolgt eine Inkubation in geschmolzenem Agar (45°C) und eine Bebrütung unter Luftabschluss. Physiologie des Wachstums Zunahme der Zellzahl und Zellmasse. Pro Volumen-Einheit Verdopplung Zeiteinheit Zeitintervall der Verdopplung Bakterienzahl Bakterienkonzentration Zellzahl/mL Teilungsrate [std-1] Generationszeit Bakterienmasse Bakteriendichte Trockengewicht/mL Wachstumsrate [std]-1 Verdopplungszeit Erfassung der Bakterienzahl - Gesamtzahl (lebende und tote) o Zellkammerverfahren 0.05 mm Kantenlänge 0.02 mm Dicke Volumen 5 * 10-8 mL gezählte Mikroorganismen * d * 107 = Bakterienzahl/mL o Elektrisches Zählgerät Hierbei beruht das Messprinzip auf einer Abnahme der Leitfähigkeit o Membranfiltermethode Hierbei muss die Zahl der Mikroorganismen kleiner 106/mL betragen. Es folgt eine Filtration, Trocknung, Färbung und anschließende Auszählung - Lebende zahl o Koch’sches Plattengussverfahren Verdünnungsreihe (Zehner Schritte) In flüssigem Agar suspendieren Mit Spatel auf Agar ausspateln Bebrüten und anschließende Kolonienzählung o Filtern und Filter auf Agar übertragen Bebrüten Kolonien auszählen - Erfassung der Bakterienmasse (direkte Methode) o Bestimmung des Frisch-/Nassgewichtes (fehlerhaft) Zentrifugieren Waschen wiegen o Bestimmung des Gesamtkohlenstoffs und Gesamtstickstoffs o Bestimmung des Bakterienproteins (Biuret-Methode) - Erfassung der Bakterienmasse (indirekte Methode) o Tubidimetrische Bestimmung (= Trübungsmessung) Routinebetrieb – Bestimmung der optischen Dichte (E-Messung) Linear nur im bereich niedriger Bakterienzahl Zusammenhang zwischen N- C-Gehalt und optischen Messwerten muss bekannt sein! o Bestimmung von Stoffwechselgrößen die direkt mit dem Wachstum zusammenhängen O2-Aufnahme CO2-Abgabe Säure-Abgabe Usw. Wachstum der Bakterien Vermehrung durch Zellteilung 20 21 22 24 26 Ausgangspunkt: N0-Zellen Nach n-Teilungen: N = N0 * 2n Teilungsrate: v = n/t = [(logN – logN0) / (log2(t))] Generationszeit: g = t/n Graphische Darstellung: Aus exponentiellem Wachstum folgt eine exponentielle Kurve deren Steilheit der Teilungsrate entspricht.
