DNA / GENOM
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GENTECHNIK PRÜFUNGEN Welche Funktion / Aufgabe hat ein Gen? Gene codieren für Proteine Wie ist ein prokaryontisches Gen aufgebaut? Nur aus reinen Informationen keine Itrons, Gen ist nicht gestückelt (Seite 7) Wie ist ein eukaryontisches Gen aufgebaut? Es besteht aus Exon´s und Itron´s. Itrons werden beim Spleissen rausgeschnitten. Aus wie vielen Basenpaaren besteht ungefähr das haploide humane Genom? 3.4 * 10 9 Basenpaare Wie viele Gene enthält das menschliche Genom ungefähr? ca. 40000 Gene Wie lang in cm ist das diploide menschliche Genom in einer Zelle? 200 cm Wie viel Prozent des menschlichen Genoms codieren für Proteine? 2% Wie heißt die klassische Methode um Proteine von DNA/RNA abzutrennen? Reinigung von NS durch organische Lösungsmittel: Phenol/Chloroform Extraktion oder Chloroform / i-AmylOH Extraktion In welcher Phase befinden sich Proteine und in welcher Phase DNA/RNA? Wo befinden sich die Phasen im Röhrchen? - oben wässrige Phase enthält DNA und RNA - Grenzschicht in der Mitte enthält zusammengeballte Proteine - unter Schicht enthält das Phenol (Seite 16) Nennen Sie vier wesentliche Schritte zur Isolierung von DNA mit Spin Columns? ?????? Wie heißen die RNA Typen mit vollen Namen? rRNA ribosomale-RNA tRNA Transfer-RNA mRNA Messenger-RNA snRNA small nuclear RNA Welche biologische Funktion hat jeder RNA Typ? rRNA: Aufbau von Ribosomen tRNA: Transport von Aminosäuren mRNA: Informationsüberträger snRNA: Bestandteil von Spleissosom Welchen entscheidende Merkmal haben fast alle mRNA? An welchem Ende sitzt dieses Merkmal? Poly(A)-Schwanz am 3´ Ende besteht aus etwa 100 bis 200 Adeninen Wie heißen die 5 wesentlichen Komponenten (Enzyme , Reagenzien) die zum Umschreiben von mRNA in doppelsträngige cDNA benötigt werden? ????????? Was bedeutet die Abkürzung cDNA? copy / complement DNA Wie heißt die spiegelbildliche Erkennungssequenz von Restriktionsenzymen? RE erkennen Palindrome / palindromische Sequenzen Formulieren Sie ein Beispiel! GAATTC CTTAAG Wandern bei der Gelelekrophorese die kleinen DNA-Stücke schneller oder langsamer als größere? Begründung! Kleiner Moleküle wandern schneller als die größeren, da das Gel aus einem komplexen Netzwerk aus Poren besteht können die kleineren MO schneller durchfließen als größere MO Nennen Sie zwei Methoden, um DNA im Anschluss an eine Gelelektrophorese sichtbar zu machen! Silberfärbung (Gel in Sillbernitratlsg. legen – gelbliche Banden direkt im Gel sichtbar) Autoradiographie (radioaktive Markierung der DNA vor der Elektrophorese – Nachweis über Schwärzung eines photographischen Films) Jede PCR besteht aus drei hauptsächlichen Schritten. Wie heißen sie? 1. Denaturierung 2. Primer Annealing 3. Primer Extension Was geschieht bei jedem der drei Schritte? ?????? Bei welchen ungefähren Temperaturen läuft jeder Schritt ab? Denaturierung 95°, Annealing 50° - 65° , Extension 72° Wie lange dauert ungefähr jeder Schritt? Denaturierung 1 min, Annealing 30 sek , Extension 45 sek – 3 min Was versteht man unter Bakterien kompetent zu machen? Kompetent – Aufnahmebereitschaft von DNA erhöhen Nennen Sie die gebräuchlichste Methode dafür! CaCl2 Methode Nennen sie drei wichtige Steuerelemente/ Steuersignale und deren Funktion bei einem E-coli Expressionsvektor! ???????? Erklären sie kurz den Aufbau und die Arbeitsweise von DNA-Chips! ?????????? Wie heißen die drei Blot-Typen? Western-Blot, Southern-Blot, Northern-Blot Welches Biomolekül soll mit jedem Typ nachgewiesen werden? W-Blot: Proteine S-Blot: DNA N-Blot: RNA Mit welcher Reagenz wird das Biomolekül bei jedem Blot nachgewiesen? W-Blot: Antikörpern S-Blot: DNA Sonden N-Blot: DNA Sonden Aus welchen 5 unterschiedlichen Komponenten besteht ein funktioneller Sequenzieransatz bei der SANGER-Methode (Puffer und Mg zählen nicht)? Starter Primer dNTP32; ddATP; ddGTP; ddTTP; ddCTP; ????? Nennen sie 3 Krankheiten die heutzutage routinemäßig mit gentechnischen Medikamenten behandelt werden! ?????? Nennen sie die 6 wesentlichen Schritte, die durchgeführt werden müssen, um von einem Gen, das in einer Zelle vorliegt, zu einem rekombinanten Protein zu kommen! Isolierung des Gens; Konstruktion und/oder Bereitstellung eines Vektors (Plasmid); Einbau des Gens (Insert) in den Vektor → Konstrukt; Einschleusen des Konstruktes in Wirtszellen (Bakterien, Hefen, Säugerzellen…); Selektion und Isolierung eines Zellklons; Kultivierung / Vermehrung der Wirtszelle mit gleichzeitiger Vermehrung der DNA; Ernte der Zellen; Isolierung / Reinigung des Proteins aus dem Kulturmedium oder aus den Zellen Nennen sie die zwei prinzipiell unterschiedlichen Möglichkeiten zur Expression von Proteinen! Transformation von Bakterienzellen, Transfektion von Säugetierzellen Was sind Inclusion Bodies (IB´s Einschlusskörperchen)? Wo werden IB`s gebildet? Welches Hauptproblem besteht bei der Isolierung eines Proteins aus IB´s? IB`s sind denaturierte und inaktive Proteinaggregate IB`s werden in Bakterien gebildet Proteine sind nicht korrekt gefaltet, müssen sehr aufwendig aufgeschlossen werden Nennen sie die drei wesentlichen Möglichkeiten, wie die Gentechnologie für die Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden kann! ????????? Nennen sie die drei wesentliche strukturellen Unterschiede zwischen der DNA und der mRNA beim Menschen! DNA: doppelsträngig; Basen:AGTC, Zucker: Desoxiribose mRNA: einzelsträngig, Basen: AGCU, Zucker: Ribose (DNA besitzt Exons und Itrons, reife mRNA nur Exons) Wie lautet die Basenpaarungsregel der doppelsträngigen DNA? A-T; G-C Welche zwei chemischen Kräfte halten die doppelsträngige DNA zusammen? Wie heißt die schwächere Kraft? Wasserstoffbrückenbindung (schwächer) und Ester Aus welchen 2 Komponenten besteht das Rückrad der DNA? Phosphat und Desoxyribose Wie heißt der Grundbaustein der DNA und auch RNA? Aus welchen drei Komponenten ist dieser Baustein zusammengesetzt? Grundbaustein: Nucleotid Zusammensetzung: Phosphat+Zucker+Basen Definieren sie kurz die Begriffe Transcription, Translation und reverse Transcription! Transcription: Aus der DNA wird die einzelsträngige mRNA (Prokaryonten) prä-mRNA (Eukaryonten) gebildet Translation: Die mRNA (reife mRNA) codiert / wird übersetzt in ein Protein reverse Transcription: Enzyme schreiben RNA in DNA zurück Was versteht man unter einem Triplett? 3 Basen codieren für eine Aminosäure Der genetische Code ist degeneriert. Was versteht man darunter? Warum ist diese Degeneration biologisch sinnvoll? Mehrere Tripletts codieren für die gleiche Aminosäure. Trotz eventueller Fehler im genetischen Code können die Aminosäuren gebildet werden. Wie ist ein prokaryontisches Gen aufgebaut? Wie ist ein eukaryontisches Gen aufgebaut? Geben sie eine kurze Definition der beiden wichtigen Begriffe, die hierbei genannt werden müssen. Was hat das für Konsequenzen bei der Isolierung von prokaryontischen und von eukaryontischen Genen? Prok. Gen: Gene der Bakterien, welche nur aus Exon bestehen Euk. Gen: Gene welche aus Itrons und Exons bestehen Exon: Teile des Gens welche in die mRNA bei Prokaryonten und reife mRNA bei Eukaryonten trancripert werden. Enthalten die zu vererbende Information Itrons: kommen nur bei eukaryontischen Genen vor. Sie werden durch das Spleissen aus der prä-mRNA entfernt. Sie codieren für ???? Prokaryontische Gene lassen sie daher viel leichter isolieren, bei eukaryontische Genen müssen erst die Itrons entfernt werden (sehr aufwendig) Wie heißt die Methode, mit der Proteine von der DNA/RNA abgetrennt werden können? In welcher Phase befindet sich das Protein und in welcher Phase DNA/RNA? Wo befinden sich diese Phasen im Röhrchen? Name: Phenol-Chloroform Extraktion von DNA Protein: befindet sich in der Grenzschicht (zusammengeballte Proteine) DNA und RNA befinden sich in der wässrigen Phase Grenzschicht befindet sich in der Mitte des Röhrchen zwischen wässriger Phase (oben) und Phenol (unten) Mit welcher Reagenz entfernt man die RNA im Anschluss an die genannte Methode? Welche besondere Qualität muss diese Reagenz haben? RNA wird durch RNasen (Enzyme) entfernt. Diese müssen DNase frei sein. Wie heißt die Methode, mit der man noch geringere DNA-Mengen ausfällen kann? Welche 3 Parameter müssen für eine quantitative Fällung beachtet werden? ??? Ethanol-Präzpitation von DNA Parameter: Konzentrationen an einwertigen Kationen Temperatur (0°C bis 70°C) Zeit (30 min bis 12 h) Welches ist das für die mRNA- Isolierungen wichtige, gemeinsame Merkmal von fast allen mRNA´s? An welchem Ende der mRNA befindet sich dieses Merkmal? Merkmal: der Poly A-Schwanz am 3´ Ende besteht aus etwa aus 100 -200 Adeninen Welche 2 wesentlichen Merkmale zeigen alle Restriktionsenzyme (RE´s)? Nennen sie die beiden prinzipiell unterschiedlichen Schnittenden die RE´s erzeugen können! Merkmale: 1. erkennen spezifische DNA Sequenzen 2. schneiden spezifisch die doppelsträngige DNA Schnittenden: 1. Stumpfe / glatte Enden /blunt ends 2. Überhängende / klebrige / kohäsive Enden / sticky ends Die Erkennungssequenz von Typ2 RE´s zeigt ein spiegelbildliches Muster. Wie nennt man dieses Muster? Formulieren sie selber ein Beispiel für eine derartige Sequenz! Das Muster nennt man Palindrome / palindromische Sequenz Bsp.: GAATTC CTTAAG Beschreiben sie die vier wesentlichen Schritte zur Isolierung von DNA mit Spin Columns, wo bleibt dabei die DNA? ????????? Nennen sie 4 Zelltypen, in denen Proteine zur Expression gebracht werden können! in kultivierbaren Zellen. - Bakterien - Säugetierzellen - Pflanzenzellen - Hefen - Insektenzellen Nennen sie 2 Methoden für den DNA-Transfer in eukaryontische Zellen! Wie heißt der DNA-Transfer in eukaryontischen Zellen? Wie heißt der DNA-Transfer in tierische Zellen? 2 Methoden:???????? Transiente Transformation (-fektion)?? Stabile Transformation (-fektion)?? der DNA Transfer in prok. Zellen ist die Transformation der DNA Transfer in tier. Zellen ist die Transfektion Nennen sie 2 Vorteile und 2 Nachteile der Proteinexpression in Säugetierzellen! Vorteile: lösliches Protein; korrekte Faltung; korrekte Glycosierung Nachteile: lange Generationszeiten (18-24h); aufwendige und teure Massenkultivierung; geringe Ausbeuten Nennen sie 4 Veränderungen, die am E-Coli Wildtyp durchgeführt wurden, um ihn in den Sicherheitsstamm K12 zu überführen! ????? Nennen sie 8 wichtige Enzyme / Proteine die an der DNA-Replikation beteiligt sind! Helicase, Ligase, DNA-Polymerase; einzelstrangbildende Proteine (Okazaki-Fragm.), Primase Was versteht man unter einem „rare cutter“ bei Restriktionsenzymen? Nennen sie ein „rare cutter“! Für welchen Anwendungszweck sind „rare cutter „ besonders gut geeignet? Rare Cutter sind üerschaubare Sequenzen welche durch die RE´s geschnitten werden Beispiel dafür: EcoRI Sequenz: GAATTC Rare Cutter werden für die Gen-Neukombination benutzt. Nennen sie 4 Methoden, um DNA nach der Gelelektrophorese sichtbar zu machen Silberfärbung; Autoradiographie; Southern-Blot; Ethidiumbromid; Tiazin-Farbstoffe (bioSafe, BioRad) Nennen sie 2 Vorteile und 2 Nachteile bei der Expression von Proteinen aus Bakterien! Vorteile: kurze Generationszeit (20 min); billige Massenkultivierung; hohe Ausbeute (bis 90% des bakt. Proteins) Nachteile: Inclusion-Bodies ; keine korrekte Proteinfaltung; keine Glycosylserung Wie heißen die zwei prinzipiell unterschiedlichen Möglichkeiten, DNA direkt im Gel sichtbar zu machen? Direkte Visualisierung der DNA im Gel; Indirekte Visualisierung der DNA Welches ist der prinzipielle Unterschied in der DNA-Sequenzierung nach MAXAMGILBERT und nach SANGER? MG: chemische Methode S: Enzymatische Methode
