Versuchsablauf
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Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1 Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1 Eine Arbeit von Helmuth Haslacher Einleitung Im Zuge eines Mutationsprojektes fanden wir eine Hefestamm, welcher nicht in der Lage war, den nicht vergärbaren Alkohol Glycerin als Energiequelle zu nutzen. Eine Sequenzierung des Genoms ergab eine Punktmutation im ORF YGL084C (GUP1). Wir machten es uns zur Aufgabe, die Realisierung dieses Gens in der Zelle zu lokalisierung sowie etwaige Interaktionen mit anderen Proteinen unter der Zuhilfenahme der Yeast-two-hybrid-Methode zu identifizieren. Versuchsablauf Um GUP1 zu lokalisieren, wird das Gen eines Fusionsproteins mit Green Fluoreszent Protein hergestellt. Dieses wird in kompetente Hefezellen eingeschleust und transkribiert. Das Protein wird dort mit Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. In weiterer Folge sollen Interaktionspartner von GUP1 ausgemacht werden. Dazu wird die Yeast-two-hybrid-Methode angewandt. Hiefür muss GUP1 in ein pBait eingeschrieben und gegen eine cDNA-Bibliothek (prey) geklont werden. Bei einer erfolgreichen Interaktion wachsen blaue Kolonien auf Xgal. Herstellung des pBait Auswahl der Transformanten Klonierung gegen cDNA Analyse der Kolonien PCR zur Herstellung der GUP1/GFP-DNA Lokalisierung mit GFP Gelextraktion der GUP1/GFP-DNA Einschleusen in S. c. DAU1 Kultivieren des transgenen Stammes Fluoreszenmikroskopie zur Lokalisierung 0502975 Helmuth HASLACHER Um das codierte Protein zu lokalisieren, soll das Gen an seinem C-Terminus mit Green Fluorescent Protein (GFP) fusioniert werden. Dazu wurde ein Plasmid, welches 1. das GFP-Gen und 2. URA3 enthält, mit bestimmten Primern vervielfältigt. Ein Primer ist homolog zu den letzten 23 Tripletts des zu untersuchenden Gens und enthält weitere 24 Bp der Flanke upstream von GFP auf dem Plasmid. Der andere Primer ist homolog zu den ersten 23 Tripletts downstream des zu untersuchenden Gens und enthält ebenfalls 24 bp upstream des URA3- Gens auf dem Plasmid. So entsteht ein Stück DNA, dass GFP und URA3 enthält und am 3’-Ende der zu untersuchenden S. 1 Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1 chromosomalen DNA homolog rekombinieren kann. URA3 PCR-Programm: 94 ° C 1 min 55 ° C 1 min 72 ° C 1 min Für 30 Zylken. Danach wurde eine letzte Phase auf 72 ° C für 7 min programmiert (Wolf, 2006). Abb.1 Herstellung des GFP-Fusionsproteins (http://clones.invitrogen.com/cloneinfo.php?clone=y eastgfp) Materialien: Steriles Wasser 10X Amplificationspuffer mit 15mM MgCl2 10 mM dNTP 50 μM Oligonucleotidprimer 1 50 μM Oligonucleotidprimer 2 5 unit/μl Taq Polymerase Template-DNA (0,1-1 ng plasmid DNA) in 10 μl Die folgenden Substanzen wurden auf Eis in einem PCR-tube vermischt: 10X PCR buffer (10 μl) Primer 1 (1 μl) 5' ATC GCA GTA CAA ATA ATG TTT GAA ATC AGA GAA GAA GAA AAG AGG CAC GGA ATT TAC CTA AAA TGC TGA TCA GCG AGG TAC ACC GTA GTC ATG 3’ Primer 2 (1µl) 3’ TAC GGT TTA AAT GCT TAT AGT TAA CAT ATT GTG ACG ATA GTA CAT ACA TAA AAA TAG ATG ATC ATG TTT AGC TAT GAG CTA GAT CCG TAT TGA 5' dNTP (2 μl) Template DNA und steriles H2O (85,5 μl) Taq-Polymerase (0,5 μl) Zur Kontrolle wurde in einem PCR-tube eine Reaktion ohne Template-DNA (anstelle dessen werden 10 µl H2O hinzugegeben) ablaufen gelassen. Die PCR-tubes wurden in ein auf 94 ° C vorgeheiztes PCR-Gerät gegeben. 0502975 Helmuth HASLACHER Anschließend musste die gewonnene DNA gereinigt werden. Dazu wurde sie durch ein Agarosegel laufen gelassen. Unser gesuchtes DNA-Stück (Flanken innerhalb und außerhalb von GUP1 + GFP + URA3) misst 1365 bp. Materialien: 1% Agarosegel (0.5 g ultrapure electrophoretic grade Agarose, 50 ml 1x TBE buffer, 5 μl Ethidiumbromide 0,5g Agarose wurden in einen Erlenmeyerbecher eingewogen. Dann gaben wir 50 ml des 1x TBE-Puffers hinzu und vermischten die Ingredenzien. Nun wurde die Agarose in der Mikrowelle geschmolzen. Zum Schluss versetzte man das Gel mit 5 µl Ethidiumbromid-Lösung. Das Gel ist gegossen geworden. Nach vollendeter Polymerisierung legte man das Agarosegel in den Elektrophoreseapparat und übergoss mit 1x TBE-Puffer. Die aus der PCR gewonnene DNA sowie die Marker DNA wurden anschließend in 6 x Loading-Puffer auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde für 30 min mit 50 V betrieben. Danach wurde das Gel bei 70 % Intensität auf dem Transilluminator analysiert. Unser gesuchtes DNA-Stück (Flanken innerhalb und außerhalb von GUP1 + GFP + URA3) misst errechnete 1365 bp. Die Bande, die dieser Länge entsprach wurde identifiziert und ausgeschnitten. Für die Gelextraktion wurde das extrahierte Gel (0,2 g) mit 600 µl PB-Puffer versetzt und in einem auf 50 ° C vorgeheizten Wasserbad für 10 min inkubiert. Anschließend wurde die Probe auf einem Quiagen-Säulchen in einem EppendorfgeS. 2 Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1 fäß aufgetragen und bei 13000 rpm 1 min zentrifugiert. Der abgeschiedene gelbe PBPuffer konnte verworfen und der Vorgang mit Quiagen-Säulchen, 750 µl PE-Puffer 96% Ethanol wiederholt werden. Nach dem Abscheiden des Überstands wurde erneut zentrifugiert. Man überführte das QuiagenSäulchen in ein neues Eppendorfgefäß, gab 50 µl EB-Puffer darauf und zentrifugierte wiederum mit gleicher Einstellung. Die gereinigte DNA konnte nun für die Transformation der Hefe eingesetzt werden (Schweyen/Graschopf, 2006, 34f). temperatur zentrifugiert. Das Pellet resuspendierte man in 10 ml sterilem H2O. Es wurde erneut 5 min bei 7000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend in 1,5 ml des folgenden Lithiumpuffers resuspendiert: 1 vol 10× TE buffer, pH 7.5 1 vol 10× LiAc-Lösung 8 vol steriles H2O. Die Hefezellen wurden nun für 30 min bei 30 ° C inkubiert. Dafür mussten die Zellen für die Aufnahme der DNA kompetent gemacht werden. Wir verwendeten den Hefestamm DAU1. Dieser ist ade2 ura3 und daher für die Selektion nach URA geeignet. Materialien: WA-ura Medium S. cerevisiae DAU1 (ade2, ura3) YPAD-Medium: YPD medium mit 30 mg/liter Adeninhemisulfat versetzt Steriles H2O 10× TE buffer, pH 7.5 steril 10× LiAc-Lösung: 1 M LiAc, pH 7.5 DNA: Heringssperma und zu transformierende DNA 50% (w/v) PEG 30°C Inkubator mit Schüttler Zentrifuge 42°C Wasserbad Eine einzelne DAU1-Kolonie wurde in 5ml YPD-Medium inokuliert und übernacht bei 30 ° C inkubiert. Am nächsten Tag wurde eine sterile 1l-Flasche (Inhalt: 300 ml YPAD) mit einem Teil der Ü/N Kultur inokuliert. Die Kultur musste wiederum bei 30 ° C über nacht auf rund 107 (OD600 =0,30,5) Zellen anwachsen gelassen werden. Nun verdünnte man auf 2 x 106 Zellen in frischem QPAD-Medium inkubierte und für weitere 4 Stunden. Das im Medium enthaltene Adenin sorgte für eine höhere Transformationsrate als üblich. Die Zellen wurden nun 5 min bei 5000 rpm und Raum0502975 Helmuth HASLACHER 200 µg Carrier-DNA wurden mit 5 µg zu transformierender DNA in einem Eppendorfgefäß gemischt. Das Gesamtvolumen sollte 20 µl betragen. Man mengte 200 µl Hefezellen beigemengt. Danach gab man 1,2 ml PEG-Puffer hinzu: 8 vol 50% PEG 1 vol 10× TE Puffer, pH 7.5 1 vol 10× LiAc-Lösung. Es wurde für 30 min bei 30 ° C geschüttelt. Danach folgte ein exakt 15 minütiger Hitzeschock bei 42 ° C und ein anschließendes Zentrifugieren für 5 s bei Raumtemperatur, bevor in 500 µl 1x TE-Puffer resuspendiert werden konnte. Davon wurden 200 µl auf WA-ura ausplattiert. Als Kontrollplatte diente eine Verdünnung der ursprünglichen DAU1-Kultur auf WA-ura. Nun konnte bei 30 ° C inkubiert warden (Introduction of DNA into Yeast Cells). Zwei Tage darauf wurden die Platten aus dem Inkubator entfernt und untersucht. Auf der Kontrollplatte sind erwartungsgemäß nur drei revertierte Kolonien gewachsen. Auf der transformierten WA-trp Platte sind hingegen 63 Kolonien entstanden. Sieben von diesen 63 Kolonien wurden für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet. S. 3 Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1 Materialien: S. cerevisiae DAU1-GFP-Chimerae 1 M Tris.Cl pH 7,5 PBS pH 7,4 2 % (m/v) Glucose Inkubator Con A-beschichtete Deckgläser FITC-Filter Zuerst wurden die Deckgläser beschichtet. Dafür bereitete man eine 2 mg/ml Lösung von Canvavalin A in Wasser vor. Davon wurden jeweils 5 µl auf jedes der Deckgläser pibettiert. Diese trockneten anschließend bei Raumtemperatur und konnten so am nächsten Versuchstag verwendet werden. Die sieben Hefekolonien wurden einzeln in flüssigem Selektivmedium übernacht bei 30 ° C auf eine OD600 von 0,7 anwachsen gelassen. Am nächsten Tag wurde jeweils 1 M Tris.Cl-Lösung bis zu einer Konzentration von 10 mM hinzugegeben. Nach einer erneuten Inkubation bei 30 ° C unter Schütteln zentrifugierte man 1 ml der Zellen 5 min bei 700 rpm und Raumtemperatur. Nachdem der Überstand verworfen worden ist, konnten die Zellen in 200 µl PBS/2 % Glucose resuspendiert werden. Nun wurden sie auf den con A-beschichteten Deckgläsern unter Zuhilfenahme der Fluoreszenzmikroskopie unter einem FITC-Filter analysiert 8 (Bagett et. al., 2003). Ergebnisse: Abb. 2 Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt GFPAktivität im Bereich des Endoplasmatischen Reticulums und der Plasmamebran. (http://wwwoas.kfunigraz.ac.at:8010/pls/al12/ypl. htm?cgene=YGL084C, 10.01.2007). Sechs der sieben analysierten Kolonien zeigen eine GFP-Aktivität an. Allein eine Kolonie bleibt Aus den Bildern ist deutlich zu ersehen, dass GUP1 entlang des Endoplasmatischen Reticulums lokalisiert ist. Das N-terminale Ende ist im periplasmatischen Raum angesiedelt, wohingegen sich der C-Terminus im Cytoplasma befindet (Bleve et. al., 2006). Bestimmung von Protein-Protein Interaktionen Um mögliche Interaktionspartner von GUP1 zu finden, unterzogen wir das kodierende Gen der Yeast-two-hybrid-Methode. Dazu musste zuerst ein LexA-GUP1 Fusionsprotein (pBait) hergestellt und charakterisiert werden. Materialien: S. cerevisae EGY48 lexAop-LEU2 pMW101 (für pBait) pMW112 pSH17-4 0502975 Helmuth HASLACHER S. 4 Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1 pRFHM1 pJK101 Modifizierte GUP1-DNA (ohne Zielsequenz und ohne Transmembrandomänen) Monoclonaler Antikörper für LexA CM-Selektivmedium Yeast Selektiv-X-gal-Medium Die modifizierte GUP1-DNA wurde in die Polylinkersequenz von pMW101 in-frame mit LexA integriert. Nach der LiAcMethode nach Gietz (siehe S.) trasfomierten wir sechs verschiedene Transformationen des Stammes EGY48 lexAop-LEU2 mit pBait und den lexAop-lacZ – Reporterplasmiden: 1) pBait + pMW112 (Test für die Aktivierung) 2) pSH17-4 + pMW112 (positive Kontrolle für Aktivierung) 3) pRFHM1 + pMW112 (negative Kontrolle für Aktivierung) 4) pBait + pJK101 (Test für Repression/DNA-Bindung) 5) pRFHM1 + pJK101 (Positive Kontrolle für Repression) 6) pJK101 (negative Kontrolle für Repression) Die ersten fünf Transformanten wurden auf CM(Glu)-Ura-His, der sechste auf CM(Glu)-Ura ausplattiert. Die Platten wurden bei 30 ° C inkubiert und nach drei Tagen weiterverwendet. Nun musste bewiesen werden, dass das Fusionsprotein brauchbar war und für die Tests verwendet werden konnte. Dazu wurden von jeweils acht Kolonien einen cm lange Einzelausstriche auf CM(Glu)-UraHis (1-5) bzw. CM(Glu)-Ura (6) gemacht und übernacht bei 30 ° C inkubiert. Zwei Tage darauf überstrichen wir von den Masterplatten auf die folgenden Medien: Transformanten 1-6 auf CM(Glu, X-gal)Ura und auf CM(Gal, X-gal)-Ura Transformanten 1-4 auf CM(Glu)-Ura-HisLeu und auf CM(Gal)-Ura-His-Leu. 0502975 Helmuth HASLACHER Die Inkubationszeit dauerte bis zu 4 Tage bei 30 ° C. Die Ergebnisse der geglückten Transformanten sind in Tab. 1 zu sehen. Die auf Grund der AktivierungsRepressions-Assays gewählten Kolonien konnten nun für die Transformation mit einer prey-Library verwendet werden (Sambrook/Russel (2001), 18.17ff). Materialen: S. cerevisiae S. cerevisae EGY48 lexAopLEU2 + pBait + lexAop-lacZ-Reporter DMSO Sterile Glycerinlösung (65 % Glycerin, 0,1 M MgSO4, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) TE (ph 7,5) steril TE (ph 7,5) mit 0,1 M LiAc TE (ph 7,5) mit 40 % PEG 4000 und 0,1 M LiAc steril Carrier DNA Interaction-trap-library von CLONTECH CM Selektivmedium Yeast Selektiv-X-gal-Medium Eine Hefekolonie wurde in 20 ml CM(Glu)Ura-His Flüssigmedium bei 30 ° C übernacht im Schüttler anwachsen gleassen. Tags darauf verdünnten wir diese in 300 ml CM(Glu)-Ura-His auf OD600= 0,13. Nun wurde die Kultur im Schüttler bei 30 ° C auf OD=0,5 anwachsen gelassen. Die Kultur wurde in ein steriles, 250 mlZentrifugiergefäß überführt und 5 min bei Raumtemperatur und 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Nach Zugabe von 30 ml sterilem H2O und einer Resuspension darin wurde das Gemisch in eine 30 ml Falcon-Tube übergeleitet. Nach einer abermaligen Zentrifugation bei 3000 rpm für 5 min wurden die Zellen nach verwerfen des Überstandes in 1,5 mlo TE mit 0,1 M LiAc resuspendiert. Jeweils 1 µg Library-DNA und 50 µg frisch denaturierte Carrier-DNA wurden in sterile 1,5 ml-Eppendorfgefäße pibettiert. Gleich darauf gaben wir jeweils 50 µl der Zellsuspension und 300 µl TE mit 40 % PEG 4000 und 0,1 M LiAc hinzu. Nach sanftem Hinund Herkippen wurden die Gefäße für 1 h bei 30 ° C inkubiert. Danach gaben wir jeweils 40 µl DMSO hinzu und führten S. 5 Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1 einen Hitzeschock bei 42 ° C durch. Die Zellkulturen wurden im Anschluss wie folgt ausplattiert: 2) CM(Gal/Raff/Xgal)-Ura-His-Trp 3) CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu 4) CM/(Gal/Raff)-Ura-His-Trp-Leu 28 Gefäße wurden auf 24 x 24 cm CM(Glu)-Ura-His-Trp Dropout-Platten ausplattiert und für zwei Tage bei 30 ° C inkubiert. und für 3 Tage bei 30 ° C inkubiert (Sambrook/Russel (2001), 18.30ff). Ergebnisse: Jeweils 350 µl der verbleibenden zwei Gefäßen plattierten wir ebenfalls auf 24 x 24 cm CM(Glu)-Ura-His-Trp Dropout-Platten aus. Je 40 µl wurden 10-1, 10-2, 10-3 in sterilem H2O verdünnt und auf 100 mm CM(Glu)-Ura-His-Trp Dropout-Platten ausplattiert und bei 30 ° C inkubiert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen abgeerntet und in konischen 50 ml-Röhren in 40 ml TE (pH 7,5) suspendiert. Die Zellen wurden nun 5 min bei 2500 rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser Waschvorgang musste wiederholt werden. Die Zellen konnten nun in 1 vol steriler Glycerinlösung resuspendiert in in 1 mlPortionen aliquotiert werden. Ein Aliquot muss 1:10 mit CM(Gal-Raff)Ura-His-Trp Dropout-Medium verdünnt und unter Schütteln 4 h bei 30 ° C inkubiert werden. In dieser Zeit wird die Transkription des GAL1 Promotors der Library iduziert. 106Zellen wurden auf 100mm CM(Gal/Raff)-Ura-His-Trp DropoutMedien ausplattiert und für 5 Tage bei 30 ° C inkubiert. Die Platten werden periodisch überwacht und die 6 erscheinenden Kolonien zum Zeitpunkt ihres Erscheinens dokumentiert. Diese wurden am 5 Tag auf CM(Glu)-Ura-His-Trp nach ihrem Erscheindungsdatum geordnet und bei 30 ° C inkubiert. Nun konnte ein Transkiptionsaktivierungsassay durchgeführt werden. Nun wurden die 6 Kolonien mit einem Zahnstocher (mit dem zuvor in etwas Medium der Masterplate gekratzt wurde) jeweils auf die folgenden Platten ausgestrichen: 1) CM(Glu/XGal)-Ura-His-Trp 0502975 Helmuth HASLACHER Die 6 Kolonien wiesen bei einer nachfolgenden Analyse β-Galaktosidase-Aktivität auf. Dies bedeutet, dass das Bait, welches GUP1 beinhaltet, Interaktionen mit den 6 Proteinen aus der cDNA-Library eingehen kann, welche als Prey in die Zellen eingebracht worden sind. Die Proteine wurden mittels Western-Blot identifiziert: JSN1 Mitglied der Puf-Familie (RNA-bindende Proteine). Diese zeigen Wechselwirkungen mit mRNAs, die für Membran-assoziierte Proteine kodieren (http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YJR091C). CDA2 Die Chitin-Deacetylase Cda2 ist mit Cda10 in der Chitosanbiosynthese vorkommend und damit für die Starrheit der Askosporenwand verantwortlich (http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YLR308W). YNL058C Die Realisierung des Gens YNL058C ist ein Protein, dessen Funktion noch unbekannt ist. GFP-Fusionsexperimente zeigten, dass dieses nicht essentielle Gen an der Vakuole lokalisiert ist (http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YNL058C). S. 6 Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1 FET3 Die Ferro-O2-Oxidoreduktase ist für Hochaffinitäts-Eisenaufnahme notwendig und ist außerdem in eine Kupferresistenz involviert. Das Protein zählt zu den in die Membran integrierten Multikupferosidasen (http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YMR058W). mit GUP1 in Wechselwirkung treten und damit einen Komplex bilden könnten. Dieser Komplex könnte im Anschluss durch Kristallisation sichtbar gemacht werden. VTC4 Das vakuoläre Membranprotein ist für die Polyphosphatakkumulation der Vakuole verantwortlich. Das Protein reguliert die vakuoläre H+-ATPase-Aktivität sowie Transporterchaperone (http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YJL012C). Literatur: YHL042W Die Funktion des Proteins ist nicht bekannt. Es ist ein Mitglied der DUP380 Subfamilie von konservierten, oft subtelomerisch kodierten Proteinen (http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YHL042W). Diskussion der Ergebnisse: Unser gesuchtes Protein ist GUP1 (Glycerol-Uptake 1, YGL084C) und zählt damit zu den Transmembranproteinen, die in den Glycerintransport involviert sind. Bei einer Mutation in GUP1 ist der Organismus nicht in der Lage, den nicht vergärbaren Stoff Glycerin als Energiequelle zu verwerten. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass dieses Proteinen in die Plasmamembran integriert ist und außerdem am Endoplasmatischen Reticulum lokalisiert werden kann. Unter Verwendung der Two-HybridMethode konnten Interaktionen mit sechs Proteinen festgestellt werden, von denen zwei eine noch unbekannte Funktion aufweisen. In weiterer Folge könnten mittels eines SPLIT-Ubiquitin-Assays weitere Transmembranproteine ausgemacht werden, die 0502975 Helmuth HASLACHER Bagett, J.J/Shaw, J.D./Sciambi. C.J.(2003) Fluorescent Labeling of Yeast. Unter: http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/97804 71143031/cp/cpcb/article/cb0431/current/html#cb04 13-rec-0002 Stand: 10.01.2006 Bleve, Gianluca et. al. (2005): Subcellular localization and functional expression of the glycerol uptake protein 1 (GUP1) of Saccharomyces cerevisiae tagged with green fluorescent protein. Unter: http://www.biochemj.org/bj/390/bj3900145.htm Stand: 10.01.2006 Sambrook, Joseph/Russel, David W. (2001): Molecular Clong: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York. Schweyen, Rudolph/Graschopf, Anton (2006): Allgemeine Biologie. Übungen I – Mikroorganismen. Unter: https://www.univie.ac.at/gem/skripten/Daten/Grasch opf/AB1/AB%20I%20Mikroorganismen_200607.pdf Stand: 15.01.2007 Wolf, Julie B. (2006): PCRAmplification of DNA. Unter: http://www.research.umbc.edu/~jwolf/m2.htm#pcr Stand: 15.01.2007 http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YJR091C Stand: 15.01.2006 http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YLR308W Stand: 15.01.2006 http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YNL058C Stand: 15.01.2006 http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YMR058W Stand: 15.01.2006 http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YJL012C Stand: 15.01.2006 http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YHL042W Stand: 15.01.2006 S. 7
