Versuchsablauf

Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1
Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1
Eine Arbeit von Helmuth Haslacher
Einleitung
Im Zuge eines Mutationsprojektes fanden
wir eine Hefestamm, welcher nicht in der
Lage war, den nicht vergärbaren Alkohol
Glycerin als Energiequelle zu nutzen. Eine
Sequenzierung des Genoms ergab eine
Punktmutation im ORF YGL084C (GUP1).
Wir machten es uns zur Aufgabe, die Realisierung dieses Gens in der Zelle zu lokalisierung sowie etwaige Interaktionen mit
anderen Proteinen unter der Zuhilfenahme
der Yeast-two-hybrid-Methode zu identifizieren.
Versuchsablauf
Um GUP1 zu lokalisieren, wird das Gen
eines Fusionsproteins mit Green Fluoreszent Protein hergestellt. Dieses wird in
kompetente Hefezellen eingeschleust und
transkribiert. Das Protein wird dort mit Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.
In weiterer Folge sollen Interaktionspartner
von GUP1 ausgemacht werden. Dazu wird
die Yeast-two-hybrid-Methode angewandt.
Hiefür muss GUP1 in ein pBait eingeschrieben und gegen eine cDNA-Bibliothek
(prey) geklont werden. Bei einer erfolgreichen Interaktion wachsen blaue Kolonien
auf Xgal.
Herstellung des pBait
Auswahl der Transformanten
Klonierung gegen
cDNA
Analyse der Kolonien
PCR zur Herstellung
der GUP1/GFP-DNA
Lokalisierung mit GFP
Gelextraktion der
GUP1/GFP-DNA
Einschleusen in
S. c. DAU1
Kultivieren des transgenen Stammes
Fluoreszenmikroskopie zur Lokalisierung
0502975 Helmuth HASLACHER
Um das codierte Protein zu lokalisieren,
soll das Gen an seinem C-Terminus mit
Green Fluorescent Protein (GFP) fusioniert
werden. Dazu wurde ein Plasmid, welches
1. das GFP-Gen und 2. URA3 enthält, mit
bestimmten Primern vervielfältigt. Ein Primer ist homolog zu den letzten 23 Tripletts
des zu untersuchenden Gens und enthält
weitere 24 Bp der Flanke upstream von
GFP auf dem Plasmid. Der andere Primer
ist homolog zu den ersten 23 Tripletts
downstream des zu untersuchenden Gens
und enthält ebenfalls 24 bp upstream des
URA3- Gens auf dem Plasmid. So entsteht
ein Stück DNA, dass GFP und URA3 enthält und am 3’-Ende der zu untersuchenden
S. 1
Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1
chromosomalen DNA homolog rekombinieren kann.
URA3
PCR-Programm:
94 ° C 1 min
55 ° C 1 min
72 ° C 1 min
Für 30 Zylken.
Danach wurde eine letzte Phase auf 72 ° C
für 7 min programmiert (Wolf, 2006).
Abb.1 Herstellung des GFP-Fusionsproteins
(http://clones.invitrogen.com/cloneinfo.php?clone=y
eastgfp)
Materialien:
Steriles Wasser
10X Amplificationspuffer mit 15mM
MgCl2
10 mM dNTP
50 μM Oligonucleotidprimer 1
50 μM Oligonucleotidprimer 2
5 unit/μl Taq Polymerase
Template-DNA (0,1-1 ng plasmid DNA) in
10 μl
Die folgenden Substanzen wurden auf Eis
in einem PCR-tube vermischt:
10X PCR buffer (10 μl)
Primer 1 (1 μl)
5' ATC GCA GTA CAA ATA ATG TTT
GAA ATC AGA GAA GAA GAA AAG
AGG CAC GGA ATT TAC CTA AAA
TGC TGA TCA GCG AGG TAC ACC
GTA GTC ATG 3’
Primer 2 (1µl)
3’ TAC GGT TTA AAT GCT TAT AGT
TAA CAT ATT GTG ACG ATA GTA
CAT ACA TAA AAA TAG ATG ATC
ATG TTT AGC TAT GAG CTA GAT
CCG TAT TGA 5'
dNTP (2 μl)
Template DNA und steriles H2O (85,5 μl)
Taq-Polymerase (0,5 μl)
Zur Kontrolle wurde in einem PCR-tube
eine Reaktion ohne Template-DNA (anstelle dessen werden 10 µl H2O hinzugegeben)
ablaufen gelassen.
Die PCR-tubes wurden in ein auf 94 ° C
vorgeheiztes PCR-Gerät gegeben.
0502975 Helmuth HASLACHER
Anschließend musste die gewonnene DNA
gereinigt werden. Dazu wurde sie durch ein
Agarosegel laufen gelassen. Unser gesuchtes DNA-Stück (Flanken innerhalb und
außerhalb von GUP1 + GFP + URA3)
misst 1365 bp.
Materialien:
1% Agarosegel (0.5 g ultrapure electrophoretic grade Agarose, 50 ml 1x TBE buffer,
5 μl Ethidiumbromide
0,5g Agarose wurden in einen Erlenmeyerbecher eingewogen. Dann gaben wir 50 ml
des 1x TBE-Puffers hinzu und vermischten
die Ingredenzien. Nun wurde die Agarose
in der Mikrowelle geschmolzen. Zum
Schluss versetzte man das Gel mit 5 µl
Ethidiumbromid-Lösung.
Das Gel ist gegossen geworden. Nach vollendeter Polymerisierung legte man das
Agarosegel in den Elektrophoreseapparat
und übergoss mit 1x TBE-Puffer.
Die aus der PCR gewonnene DNA sowie
die Marker DNA wurden anschließend in 6
x Loading-Puffer auf das Gel aufgetragen.
Die Elektrophorese wurde für 30 min mit
50 V betrieben.
Danach wurde das Gel bei 70 % Intensität
auf dem Transilluminator analysiert. Unser
gesuchtes DNA-Stück (Flanken innerhalb
und außerhalb von GUP1 + GFP + URA3)
misst errechnete 1365 bp. Die Bande, die
dieser Länge entsprach wurde identifiziert
und ausgeschnitten.
Für die Gelextraktion wurde das extrahierte
Gel (0,2 g) mit 600 µl PB-Puffer versetzt
und in einem auf 50 ° C vorgeheizten Wasserbad für 10 min inkubiert.
Anschließend wurde die Probe auf einem
Quiagen-Säulchen in einem EppendorfgeS. 2
Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1
fäß aufgetragen und bei 13000 rpm 1 min
zentrifugiert. Der abgeschiedene gelbe PBPuffer konnte verworfen und der Vorgang
mit Quiagen-Säulchen, 750 µl PE-Puffer
96% Ethanol wiederholt werden. Nach dem
Abscheiden des Überstands wurde erneut
zentrifugiert. Man überführte das QuiagenSäulchen in ein neues Eppendorfgefäß, gab
50 µl EB-Puffer darauf und zentrifugierte
wiederum mit gleicher Einstellung.
Die gereinigte DNA konnte nun für die
Transformation der Hefe eingesetzt werden
(Schweyen/Graschopf, 2006, 34f).
temperatur zentrifugiert. Das Pellet resuspendierte man in 10 ml sterilem H2O. Es
wurde erneut 5 min bei 7000 rpm und
Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend in 1,5 ml des folgenden Lithiumpuffers resuspendiert:
1 vol 10× TE buffer, pH 7.5
1 vol 10× LiAc-Lösung
8 vol steriles H2O.
Die Hefezellen wurden nun für 30 min bei
30 ° C inkubiert.
Dafür mussten die Zellen für die Aufnahme
der DNA kompetent gemacht werden. Wir
verwendeten den Hefestamm DAU1. Dieser
ist ade2 ura3 und daher für die Selektion
nach URA geeignet.
Materialien:
WA-ura Medium
S. cerevisiae DAU1 (ade2, ura3)
YPAD-Medium: YPD medium mit 30
mg/liter Adeninhemisulfat versetzt
Steriles H2O
10× TE buffer, pH 7.5 steril
10× LiAc-Lösung: 1 M LiAc, pH 7.5
DNA: Heringssperma und zu transformierende DNA
50% (w/v) PEG
30°C Inkubator mit Schüttler
Zentrifuge
42°C Wasserbad
Eine einzelne DAU1-Kolonie wurde in 5ml
YPD-Medium inokuliert und übernacht bei
30 ° C inkubiert. Am nächsten Tag wurde
eine sterile 1l-Flasche (Inhalt: 300 ml YPAD) mit einem Teil der Ü/N Kultur inokuliert. Die Kultur musste wiederum bei 30 °
C über nacht auf rund 107 (OD600 =0,30,5) Zellen anwachsen gelassen werden.
Nun verdünnte man auf 2 x 106 Zellen in
frischem QPAD-Medium inkubierte und für
weitere 4 Stunden. Das im Medium enthaltene Adenin sorgte für eine höhere Transformationsrate als üblich. Die Zellen wurden nun 5 min bei 5000 rpm und Raum0502975 Helmuth HASLACHER
200 µg Carrier-DNA wurden mit 5 µg zu
transformierender DNA in einem Eppendorfgefäß gemischt. Das Gesamtvolumen
sollte 20 µl betragen. Man mengte 200 µl
Hefezellen beigemengt. Danach gab man
1,2 ml PEG-Puffer hinzu:
8 vol 50% PEG
1 vol 10× TE Puffer, pH 7.5
1 vol 10× LiAc-Lösung.
Es wurde für 30 min bei 30 ° C geschüttelt.
Danach folgte ein exakt 15 minütiger Hitzeschock bei 42 ° C und ein anschließendes
Zentrifugieren für 5 s bei Raumtemperatur,
bevor in 500 µl 1x TE-Puffer resuspendiert
werden konnte. Davon wurden 200 µl auf
WA-ura ausplattiert. Als Kontrollplatte
diente eine Verdünnung der ursprünglichen
DAU1-Kultur auf WA-ura. Nun konnte bei
30 ° C inkubiert warden (Introduction of
DNA into Yeast Cells).
Zwei Tage darauf wurden die Platten aus
dem Inkubator entfernt und untersucht.
Auf der Kontrollplatte sind erwartungsgemäß nur drei revertierte Kolonien gewachsen. Auf der transformierten WA-trp Platte
sind hingegen 63 Kolonien entstanden. Sieben von diesen 63 Kolonien wurden für die
Fluoreszenzmikroskopie verwendet.
S. 3
Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1
Materialien:
S. cerevisiae DAU1-GFP-Chimerae
1 M Tris.Cl pH 7,5
PBS pH 7,4 2 % (m/v) Glucose
Inkubator
Con A-beschichtete Deckgläser
FITC-Filter
Zuerst wurden die Deckgläser beschichtet.
Dafür bereitete man eine 2 mg/ml Lösung
von Canvavalin A in Wasser vor. Davon
wurden jeweils 5 µl auf jedes der Deckgläser pibettiert. Diese trockneten anschließend bei Raumtemperatur und konnten so
am nächsten Versuchstag verwendet werden.
Die sieben Hefekolonien wurden einzeln in
flüssigem Selektivmedium übernacht bei
30 ° C auf eine OD600 von 0,7 anwachsen
gelassen.
Am nächsten Tag wurde jeweils 1 M
Tris.Cl-Lösung bis zu einer Konzentration
von 10 mM hinzugegeben. Nach einer erneuten Inkubation bei 30 ° C unter Schütteln zentrifugierte man 1 ml der Zellen 5
min bei 700 rpm und Raumtemperatur.
Nachdem der Überstand verworfen worden
ist, konnten die Zellen in 200 µl PBS/2 %
Glucose resuspendiert werden. Nun wurden
sie auf den con A-beschichteten Deckgläsern unter Zuhilfenahme der Fluoreszenzmikroskopie unter einem FITC-Filter analysiert 8 (Bagett et. al., 2003).
Ergebnisse:
Abb. 2 Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt GFPAktivität im Bereich des Endoplasmatischen
Reticulums und der Plasmamebran.
(http://wwwoas.kfunigraz.ac.at:8010/pls/al12/ypl.
htm?cgene=YGL084C, 10.01.2007).
Sechs der sieben analysierten Kolonien
zeigen eine GFP-Aktivität an. Allein eine
Kolonie bleibt
Aus den Bildern ist deutlich zu ersehen,
dass GUP1 entlang des Endoplasmatischen
Reticulums lokalisiert ist. Das N-terminale
Ende ist im periplasmatischen Raum angesiedelt, wohingegen sich der C-Terminus
im Cytoplasma befindet (Bleve et. al.,
2006).
Bestimmung von Protein-Protein
Interaktionen
Um mögliche Interaktionspartner von
GUP1 zu finden, unterzogen wir das kodierende Gen der Yeast-two-hybrid-Methode.
Dazu musste zuerst ein LexA-GUP1 Fusionsprotein (pBait) hergestellt und charakterisiert werden.
Materialien:
S. cerevisae EGY48 lexAop-LEU2
pMW101 (für pBait)
pMW112
pSH17-4
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S. 4
Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1
pRFHM1
pJK101
Modifizierte GUP1-DNA (ohne Zielsequenz und ohne Transmembrandomänen)
Monoclonaler Antikörper für LexA
CM-Selektivmedium
Yeast Selektiv-X-gal-Medium
Die modifizierte GUP1-DNA wurde in die
Polylinkersequenz von pMW101 in-frame
mit LexA integriert. Nach der LiAcMethode nach Gietz (siehe S.) trasfomierten wir sechs verschiedene Transformationen des Stammes EGY48 lexAop-LEU2 mit
pBait und den lexAop-lacZ –
Reporterplasmiden:
1) pBait + pMW112 (Test für die Aktivierung)
2) pSH17-4 + pMW112 (positive Kontrolle
für Aktivierung)
3) pRFHM1 + pMW112 (negative Kontrolle für Aktivierung)
4) pBait + pJK101 (Test für Repression/DNA-Bindung)
5) pRFHM1 + pJK101 (Positive Kontrolle
für Repression)
6) pJK101 (negative Kontrolle für Repression)
Die ersten fünf Transformanten wurden auf
CM(Glu)-Ura-His, der sechste auf
CM(Glu)-Ura ausplattiert. Die Platten wurden bei 30 ° C inkubiert und nach drei Tagen weiterverwendet.
Nun musste bewiesen werden, dass das
Fusionsprotein brauchbar war und für die
Tests verwendet werden konnte. Dazu wurden von jeweils acht Kolonien einen cm
lange Einzelausstriche auf CM(Glu)-UraHis (1-5) bzw. CM(Glu)-Ura (6) gemacht
und übernacht bei 30 ° C inkubiert. Zwei
Tage darauf überstrichen wir von den Masterplatten auf die folgenden Medien:
Transformanten 1-6 auf CM(Glu, X-gal)Ura und auf CM(Gal, X-gal)-Ura
Transformanten 1-4 auf CM(Glu)-Ura-HisLeu und auf CM(Gal)-Ura-His-Leu.
0502975 Helmuth HASLACHER
Die Inkubationszeit dauerte bis zu 4 Tage
bei 30 ° C. Die Ergebnisse der geglückten
Transformanten sind in Tab. 1 zu sehen.
Die auf Grund der AktivierungsRepressions-Assays gewählten Kolonien
konnten nun für die Transformation mit
einer prey-Library verwendet werden
(Sambrook/Russel (2001), 18.17ff).
Materialen:
S. cerevisiae S. cerevisae EGY48 lexAopLEU2 + pBait + lexAop-lacZ-Reporter
DMSO
Sterile Glycerinlösung (65 % Glycerin, 0,1
M MgSO4, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)
TE (ph 7,5) steril
TE (ph 7,5) mit 0,1 M LiAc
TE (ph 7,5) mit 40 % PEG 4000 und 0,1 M
LiAc steril
Carrier DNA
Interaction-trap-library von CLONTECH
CM Selektivmedium
Yeast Selektiv-X-gal-Medium
Eine Hefekolonie wurde in 20 ml CM(Glu)Ura-His Flüssigmedium bei 30 ° C übernacht im Schüttler anwachsen gleassen.
Tags darauf verdünnten wir diese in 300 ml
CM(Glu)-Ura-His auf OD600= 0,13. Nun
wurde die Kultur im Schüttler bei 30 ° C
auf OD=0,5 anwachsen gelassen.
Die Kultur wurde in ein steriles, 250 mlZentrifugiergefäß überführt und 5 min bei
Raumtemperatur und 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen.
Nach Zugabe von 30 ml sterilem H2O und
einer Resuspension darin wurde das Gemisch in eine 30 ml Falcon-Tube übergeleitet. Nach einer abermaligen Zentrifugation
bei 3000 rpm für 5 min wurden die Zellen
nach verwerfen des Überstandes in 1,5 mlo
TE mit 0,1 M LiAc resuspendiert. Jeweils 1
µg Library-DNA und 50 µg frisch denaturierte Carrier-DNA wurden in sterile 1,5
ml-Eppendorfgefäße pibettiert. Gleich darauf gaben wir jeweils 50 µl der Zellsuspension und 300 µl TE mit 40 % PEG 4000
und 0,1 M LiAc hinzu. Nach sanftem Hinund Herkippen wurden die Gefäße für 1 h
bei 30 ° C inkubiert. Danach gaben wir
jeweils 40 µl DMSO hinzu und führten
S. 5
Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1
einen Hitzeschock bei 42 ° C durch. Die
Zellkulturen wurden im Anschluss wie folgt
ausplattiert:
2) CM(Gal/Raff/Xgal)-Ura-His-Trp
3) CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu
4) CM/(Gal/Raff)-Ura-His-Trp-Leu
28 Gefäße wurden auf 24 x 24 cm
CM(Glu)-Ura-His-Trp Dropout-Platten
ausplattiert und für zwei Tage bei 30 ° C
inkubiert.
und für 3 Tage bei 30 ° C inkubiert
(Sambrook/Russel (2001), 18.30ff).
Ergebnisse:
Jeweils 350 µl der verbleibenden zwei Gefäßen plattierten wir ebenfalls auf 24 x 24
cm CM(Glu)-Ura-His-Trp Dropout-Platten
aus. Je 40 µl wurden 10-1, 10-2, 10-3 in sterilem H2O verdünnt und auf 100 mm
CM(Glu)-Ura-His-Trp Dropout-Platten
ausplattiert und bei 30 ° C inkubiert.
Nach zwei Tagen wurden die Zellen abgeerntet und in konischen 50 ml-Röhren in 40
ml TE (pH 7,5) suspendiert. Die Zellen
wurden nun 5 min bei 2500 rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser
Waschvorgang musste wiederholt werden.
Die Zellen konnten nun in 1 vol steriler
Glycerinlösung resuspendiert in in 1 mlPortionen aliquotiert werden.
Ein Aliquot muss 1:10 mit CM(Gal-Raff)Ura-His-Trp Dropout-Medium verdünnt
und unter Schütteln 4 h bei 30 ° C inkubiert
werden. In dieser Zeit wird die Transkription des GAL1 Promotors der Library iduziert. 106Zellen wurden auf 100mm
CM(Gal/Raff)-Ura-His-Trp DropoutMedien ausplattiert und für 5 Tage bei 30 °
C inkubiert. Die Platten werden periodisch
überwacht und die 6 erscheinenden Kolonien zum Zeitpunkt ihres Erscheinens dokumentiert. Diese wurden am 5 Tag auf
CM(Glu)-Ura-His-Trp nach ihrem Erscheindungsdatum geordnet und bei 30 ° C
inkubiert.
Nun konnte ein Transkiptionsaktivierungsassay durchgeführt werden.
Nun wurden die 6 Kolonien mit einem
Zahnstocher (mit dem zuvor in etwas Medium der Masterplate gekratzt wurde) jeweils auf die folgenden Platten ausgestrichen:
1) CM(Glu/XGal)-Ura-His-Trp
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Die 6 Kolonien wiesen bei einer nachfolgenden Analyse β-Galaktosidase-Aktivität
auf. Dies bedeutet, dass das Bait, welches
GUP1 beinhaltet, Interaktionen mit den 6
Proteinen aus der cDNA-Library eingehen
kann, welche als Prey in die Zellen eingebracht worden sind.
Die Proteine wurden mittels Western-Blot
identifiziert:
JSN1
Mitglied der Puf-Familie (RNA-bindende
Proteine). Diese zeigen Wechselwirkungen
mit mRNAs, die für Membran-assoziierte
Proteine kodieren
(http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YJR091C).
CDA2
Die Chitin-Deacetylase Cda2 ist mit Cda10
in der Chitosanbiosynthese vorkommend
und damit für die Starrheit der Askosporenwand verantwortlich
(http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YLR308W).
YNL058C
Die Realisierung des Gens YNL058C ist
ein Protein, dessen Funktion noch unbekannt ist. GFP-Fusionsexperimente zeigten,
dass dieses nicht essentielle Gen an der
Vakuole lokalisiert ist
(http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YNL058C).
S. 6
Lokalisierung und Protein-Protein Interaktionen von GUP1
FET3
Die Ferro-O2-Oxidoreduktase ist für Hochaffinitäts-Eisenaufnahme notwendig und ist
außerdem in eine Kupferresistenz involviert. Das Protein zählt zu den in die
Membran integrierten Multikupferosidasen
(http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YMR058W).
mit GUP1 in Wechselwirkung treten und
damit einen Komplex bilden könnten. Dieser Komplex könnte im Anschluss durch
Kristallisation sichtbar gemacht werden.
VTC4
Das vakuoläre Membranprotein ist für die
Polyphosphatakkumulation der Vakuole
verantwortlich. Das Protein reguliert die
vakuoläre H+-ATPase-Aktivität sowie
Transporterchaperone
(http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YJL012C).
Literatur:
YHL042W
Die Funktion des Proteins ist nicht bekannt.
Es ist ein Mitglied der DUP380 Subfamilie
von konservierten, oft subtelomerisch kodierten Proteinen
(http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YHL042W).
Diskussion der Ergebnisse:
Unser gesuchtes Protein ist GUP1 (Glycerol-Uptake 1, YGL084C) und zählt damit
zu den Transmembranproteinen, die in den
Glycerintransport involviert sind. Bei einer
Mutation in GUP1 ist der Organismus nicht
in der Lage, den nicht vergärbaren Stoff
Glycerin als Energiequelle zu verwerten.
Die Ergebnisse haben gezeigt, dass dieses
Proteinen in die Plasmamembran integriert
ist und außerdem am Endoplasmatischen
Reticulum lokalisiert werden kann.
Unter Verwendung der Two-HybridMethode konnten Interaktionen mit sechs
Proteinen festgestellt werden, von denen
zwei eine noch unbekannte Funktion aufweisen.
In weiterer Folge könnten mittels eines
SPLIT-Ubiquitin-Assays weitere Transmembranproteine ausgemacht werden, die
0502975 Helmuth HASLACHER
Bagett, J.J/Shaw, J.D./Sciambi. C.J.(2003) Fluorescent Labeling of Yeast. Unter:
http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/97804
71143031/cp/cpcb/article/cb0431/current/html#cb04
13-rec-0002 Stand: 10.01.2006
Bleve, Gianluca et. al. (2005): Subcellular localization and functional expression of the glycerol uptake
protein 1 (GUP1) of Saccharomyces cerevisiae
tagged with green fluorescent protein. Unter:
http://www.biochemj.org/bj/390/bj3900145.htm
Stand: 10.01.2006
Sambrook, Joseph/Russel, David W. (2001): Molecular Clong: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York.
Schweyen, Rudolph/Graschopf, Anton (2006): Allgemeine Biologie. Übungen I – Mikroorganismen.
Unter:
https://www.univie.ac.at/gem/skripten/Daten/Grasch
opf/AB1/AB%20I%20Mikroorganismen_200607.pdf Stand: 15.01.2007
Wolf, Julie B. (2006): PCRAmplification of DNA.
Unter:
http://www.research.umbc.edu/~jwolf/m2.htm#pcr
Stand: 15.01.2007
http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YJR091C Stand: 15.01.2006
http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YLR308W Stand: 15.01.2006
http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YNL058C Stand: 15.01.2006
http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YMR058W Stand: 15.01.2006
http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YJL012C Stand: 15.01.2006
http://db.yeastgenome.org/cgibin/locus.pl?locus=YHL042W Stand: 15.01.2006
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