Untersuchung von Wischproben auf ihren Gehalt an adenoviraler DNA
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Untersuchung von Wischproben auf ihren Gehalt an adenoviraler DNA Staatliches Umweltamt Köln: Dr. Andreas Friemann Staatliches Veterinäruntersuchungsamt Krefeld: Heike Naumann UNTERSUCHUNG VON WISCHPROBEN AUF IHREN GEHALT AN ADENOVIRALER DNA ............. 1 I. Untersuchungsmethode ................................................................................................................................... 1 II. Ergebnisse ........................................................................................................................................................ 3 III. Schlussfolgerungen für den Vollzug des Gentechnikrechts .................................................................... 8 III.1 Maßnahmen zur Verbesserung der mikrobiologischen Arbeitsweise ............................................... 8 III.2 Maßnahmen zur Vermeidung der Aerosolbildung in Zentrifugen ................................................... 10 VI. Fazit ................................................................................................................................................................ 11 Untersuchung von Wischproben auf ihren Gehalt an adenoviraler DNA Im Rahmen der Überwachung gentechnischer Anlagen von drei Universitätskliniken wurden in Genlaboratorien, in denen mit rekombinanten Adenoviren gearbeitet wird, Wischproben genommen und auf ihren Gehalt an adenoviraler DNA untersucht. Ziel dieser experimentellen Überwachung war die Frage, ob während der Durchführung mikrobiologischer Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen die im Gentechnikrecht vorgeschriebenen Einschließungs- und Hygienemaßnahmen eingehalten werden. I. Untersuchungsmethode Die Analyse der Proben erfolgte durch das Staatliche Veterinäruntersuchungsamt Krefeld entsprechend einer im Unterausschuss Methodenentwicklung des LAG im Rahmen eines Ringversuchs validierten Vorgehensweise zur Quantifizierung von Adenovirus-DNA. Die Probenahme, die Extraktion und die Quantifizierung der viralen DNA erfolgten gemäß den vom Kantonalen Laboratorium Basel-Stadt im Internet veröffentlichten Standardanweisungen: Probenahme: www.kantonslabor-bs.ch/files/48/analysenm_04_01_SOPP220.pdf DNA-Extraktion: www.kantonslabor-bs.ch/files/48/analysenm_03_01_SOPP221.pdf Quantitative PCR: www.kantonslabor-bs.ch/files/48/analysenm_01_01_SOPP239.pdf -1- Dabei wird das adenovirale fiber-Gen mittels Real Time PCR quantitativ nachgewiesen. Die verwendete Untersuchungsmethode erlaubt aufgrund des vertretbaren experimentellen Aufwandes einen hohen Probendurchsatz und eignet sich daher insbesondere für ein vergleichendes Screening größerer Laborbereiche auf mögliche Kontaminationen mit viralem Material. Hinsichtlich der konkreten Interpretation der Ergebnisse ergeben sich jedoch durch den Nachweis des fiber-Gens die folgenden Einschränkungen: 1. Rekombinante und konventionelle Adenoviren werden nicht unterschieden, da beide das fiber-Gen besitzen. 2. Infektiöse und inaktivierte Adenoviren werden aufgrund des Nachweises auf DNAEbene ebenfalls nicht unterschieden. 3. Virale DNA und Plasmid-DNA mit adenoviralen Inserts, die das fiber-Gen enthalten, werden in gleicher Weise detektiert. Aufgrund der vorliegenden Untersuchungsergebnisse können zu diesen Punkten aber zumindest die folgenden Anmerkungen gemacht werden: Zu 1.: Um Hinweise zu erhalten, ob an den in Genlaboratorien untersuchten Probenahmestellen auch von einer nennenswerten Hintergrundbelastung mit konventionellen Adenoviren (durch z. B. entsprechend infizierte Mitarbeiter) auszugehen ist, wurden an mehreren Stellen im Staatlichen Veterinäruntersuchungsamt Krefeld vergleichende Wischproben genommen. In diesen Proben konnte das adenovirale fiber-Gen nicht nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten nicht auf eine Grundbelastung von Arbeitsplätzen mit konventionellen Adenoviren hin. Zu 2.: Erste Untersuchungen von Herrn Dr. Vogel vom Kantonalen Labor Basel-Stadt haben ergeben, dass Adenoviren zwar in Flüssigkeiten recht stabil sind, auf trockenen Oberflächen ihre Infektiösität aber bereits nach mehreren Stunden verlieren. Sollten sich diese Ergebnisse bestätigen, ist davon auszugehen, dass die in Wischproben detektierten Adenoviren in der Regel überwiegend nicht mehr infektiös sind. Entscheidend für die Bewertung der Ergebnisse ist jedoch der Umstand, dass die detektierten Viren zumindest für einen Zeitraum von mehreren Stunden infektiös waren. -2- Zu 3.: Da in den beprobten Genlaboratorien in der Regel auch mit rekombinanter Plasmid-DNA mit adenoviralen Inserts gearbeitet wird, kann nicht ausgeschlossen werden, dass an den beprobten Stellen auch entsprechende DNA-Kontaminationen zu den gemessenen Belastungswerten beigetragen haben. Obwohl es sich hierbei nicht um Organismen im Sinne des GenTG handelt, sollten entsprechende DNAKontaminationen jedoch bei Anwendung der vorgeschriebenen Einschließungs- und Hygienemaßnahmen ebenfalls nicht vorkommen. Zudem werden gegenwärtig weitere experimentelle Methoden zur Differenzierung von adenoviraler DNA und entsprechender Plasmid-DNA erarbeitet. II. Ergebnisse Bei der bislang durchgeführten Beprobung von 8 gentechnischen Anlagen wurde in 6 Anlagen adenovirale DNA in Kopienzahlen zwischen 2 x 10 2 und 2 x 108 pro Wischprobe nachgewiesen. Die Anlage mit den höchsten Belastungswerten wurde wiederholt beprobt nachdem sich herausstellte, dass die Entfernung der viralen DNA von den beprobten Flächen in vielen Fällen schwierig war. Nachfolgend sind einige Ergebnisse der wiederholten Messungen nach verschiedenen Vorbehandlungen der beprobten Flächen wiedergegeben. 1. Probenahmewert: Probenahme durch das StUA Köln und das SVUA Krefeld ohne vorherige Anmeldung beim Betreiber und ohne Vorbehandlung der Flächen 2. Probenahmewert: Probenahme durch den Betreiber 2 Monate nach der 1. Probenahme ohne Vorbehandlung der Flächen 3. Probenahmewert: Probenahme durch den Betreiber 2 Monate nach der 1. Probenahme nach einer Desinfektion (Terralin, Schülke & Mayr) und Reinigung (Haushaltsreiniger) der Flächen 4. Probenahmewert: Probenahme durch den Betreiber 3 Monate nach der 1. Probenahme nach Desinfektion (Terralin), Reinigung (Haushaltsreiniger) und anschließender Behandlung mit DNA-Off (AppliChem GmbH) -3- Rotorkammer einer gekühlten Tischzentrifuge 1. Probe: 1,95 x 108 Kopien/Wischprobe 2. Probe: 3,40 x 106 Kopien/Wischprobe 3. Probe: 1,44 x 105 Kopien/Wischprobe 4. Probe: 1,37 x 105 Kopien/Wischprobe Deckelbereich eines Abfallbehälters 1. Probe: 2,46 x 106 Kopien/Wischprobe 2. Probe: 2,43 x 106 Kopien/Wischprobe 3. Probe: 6,04 x 104 Kopien/Wischprobe 4. Probe: 1,29 x 104 Kopien/Wischprobe Rotorkammer einer Ultrazentrifuge 1. Probe: 3,66 x 106 Kopien/Wischprobe 2. Probe: 4,24 x 105 Kopien/Wischprobe 3. Probe: In Spuren nachgewiesen 4. Probe: 0 Kopien/Wischprobe Innere Seitenwand einer Sicherheitswerkbank 1. Probe: 5,08 x 104 Kopien/Wischprobe 2. Probe: 3,04 x 103 Kopien/Wischprobe 3. Probe: 4,04 x 102 Kopien/Wischprobe 4. Probe: 0 Kopien/Wischprobe Gestell einer Sicherheitswerkbank 1. Probe: 7,39 x 105 Kopien/Wischprobe 2. Probe: 2,62 x 105 Kopien/Wischprobe 3. Probe: 2,22 x 102 Kopien/Wischprobe 4. Probe: 0 Kopien/Wischprobe Mikroskoptisch 1. Probe: 1,73 x 104 Kopien/Wischprobe 2. Probe: 3,35 x 104 Kopien/Wischprobe 3. Probe: 1,66 x 103 Kopien/Wischprobe 4. Probe: 2,18 x 103 Kopien/Wischprobe -4- Inkubatortür 1. Probe: 8,53 x 104 Kopien/Wischprobe 2. Probe: 3,59 x 104 Kopien/Wischprobe 3. Probe: 8,27 x 102 Kopien/Wischprobe 4. Probe: 2,21 x 103 Kopien/Wischprobe Autoklavengriff 1. Probe: 4,69 x 105 Kopien/Wischprobe 2. Probe: 1,23 x 103 Kopien/Wischprobe 3. Probe: 3,00 x 102 Kopien/Wischprobe 4. Probe: 0 Kopien/Wischprobe Türgriff der Labortür 1. Probe: 1,15 x 104 Kopien/Wischprobe 2. Probe: 1,13 x 103 Kopien/Wischprobe 3. Probe: 7,05 x 102 Kopien/Wischprobe 4. Probe: 7,13 x 102 Kopien/Wischprobe Die dargestellten Ergebnisse deuten auf Defizite bei der mikrobiologischen Arbeitsweise in den beprobten Bereichen hin. Insbesondere könnten die gefundenen Kontaminationswerte durch folgende Verhaltenweisen verursacht worden sein: - Zentrifugationsgefäße und Rotoren werden nicht dicht verschlossen oder wurden vor der Zentrifugation beaufschlagt. - Stoffaustritte bei den Arbeiten in der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank werden nicht unverzüglich dekontaminiert. - Die Schutzhandschuhe werden nicht sofort nach Beendigung der Arbeiten in der Sicherheitswerkbank entsorgt. - Die Abfallsammelbehälter werden mit offenen oder äußerlich kontaminierten Kulturgefäßen und Instrumenten befüllt. - Die Anschlüsse oder Abluftfilter der Flüssigabfallsammelbehälter sind undicht oder die Sammelbehälter werden vor dem Autoklavieren außerhalb der Werkbank umgefüllt. - Die regelmäßige prophylaktische Desinfektion bzw. Reinigung potentiell kontaminierter Oberflächen (z. B. Griffbereiche verwendeter Geräte, Türklinken etc.) wird vernachlässigt bzw. nicht mit geeigneten Mitteln durchgeführt. -5- Da die höchsten Belastungswerte in den Rotorkammern der Zentrifugen gefunden wurden, erfolgten weitere Untersuchungen dieser Bereiche. Dabei wurde von der Annahme ausgegangen, dass während der Zentrifugation virushaltige Aerosole entstehen, die entweder während des Laufs durch Evakuierung der Rotorkammer (Ultrazentrifuge) oder nach Beendigung des Laufs und Öffnen des Deckels (Tischzentrifuge) in die Raumluft geraten und dort sedimentieren bzw. von den Beschäftigten inhaliert werden. Sollten solche virushaltigen Aerosole in nennenswertem Umfang entstehen, wäre davon auszugehen, dass sie sich im gesamten Laborbereich verteilen und der Niederschlag auch an solchen Stellen des Labors nachzuweisen ist, die im üblichen Laborbetrieb nicht durch direkten Kontakt kontaminiert werden. Zu diesem Zweck wurden entsprechende Stellen in der Nähe der Zentrifugen und in weiter entfernten Bereichen mit folgenden Ergebnissen beprobt: Probenahmestellen in der Nähe der Zentrifugen: Tischoberfläche hinter der Tischzentrifuge 1,15 x 104 Kopien/Wischprobe Fußboden neben der Tischzentrifuge 1,14 x 105 Kopien/Wischprobe Regalbrettoberseite über der Tischzentrifuge 9,85 x 103 Kopien/Wischprobe Regalbrettunterseite über der Tischzentrifuge 0 Kopien/Wischprobe -6- Fußboden neben der Entlüftungsöffnung der Ultrazentrifuge 1,68 x 104 Kopien/Wischprobe Fensterbank hinter der Ultrazentrifuge 4,98 x 103 Kopien/Wischprobe Probenahmestellen in entfernteren Bereichen: Oberseite eines Kühlgerätes im Abstand von ca. 3 Metern zur Tischzentrifuge 1,62 x 104 Kopien/Wischprobe Fußboden hinter dem Kühlgerät im Abstand von ca. 3 Metern zur Tischzentrifuge 1,60 x 105 Kopien/Wischprobe Schreibfläche im Abstand von ca. 6 Metern zur Tischzentrifuge 3,17 x 103 Kopien/Wischprobe Regalbrettoberseite über der Schreibfläche im Abstand von ca. 6 Metern zur Tischzentrifuge 1,51 x 103 Kopien/Wischprobe -7- Demnach wurden in unmittelbarer Nähe zu den Zentrifugen Belastungswerte von ca. 104-105 Kopien/Wischprobe und in den entfernteren Bereichen von 10 3-105 Kopien/Wischprobe gefunden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die während der Zentrifugation entstehenden Aerosole sich im gesamten Labor (im vorliegenden Fall beträgt die Grundfläche des Labor 48 m²) weitgehend homogen verteilen und auf den vorhandenen Oberflächen niederschlagen. III. Schlussfolgerungen für den Vollzug des Gentechnikrechts III.1 Maßnahmen zur Verbesserung der mikrobiologischen Arbeitsweise Die GenTSV enthält umfangreiche Vorschriften zum Umgang mit gentechnisch veränderten Mikroorganismen in geschlossenen Systemen. Hinsichtlich der Frage, ob eine Nullbelastung außerhalb der primären physikalischen Einschließungsmaßnahmen (z. B. Kultur- oder Reaktionsgefäß) gefordert werden kann, sind die folgenden Regelungen zu berücksichtigen: § 8 GenTSV Allgemeine Schutzpflicht, Arbeitsschutz (2) Der Betreiber einer gentechnischen Anlage hat zum Schutz der in § 1 Nr. 1 des Gentechnikgesetzes genannten Rechtsgüter die erforderlichen Maßnahmen nach den Vorschriften dieser Verordnung einschließlich ihrer Anhänge sowie die nach dem Stand von Wissenschaft und Technik erforderlichen Vorsorgemaßnahmen zu treffen, um eine Exposition der Beschäftigten und der Umwelt gegenüber dem gentechnisch veränderten Organismus so gering wie möglich zu halten. Anhang III Teil A II zur GenTSV Maßnahmen für den S2-Bereich Nr. 2: Arbeiten mit gentechnisch veränderten Mikroorganismen der Risikogruppe 2 sollen so erfolgen, dass eine Exposition der Beschäftigten so weit wie möglich vermieden wird. Demnach existiert keine Rechtsgrundlage für die Forderung nach einer Nullbelastung. Die damit zwangsläufig verbundene Frage nach einem Grenzwert ist jedoch schwer zu beantworten. Ein Bezug zur Mindestinfektionsdosis lässt sich kaum herstellen, da die rekombinanten Adenoviren replikationsdefekt sind und nicht das für replikationskompetente Viren charakteristische Krankheitsbild verursachen. Da das -8- Gefährdungspotential der rekombinanten Viren vornehmlich durch die in seltenen Fällen mögliche Bildung replikationskompetenter Viren oder durch die Integration des adenoviralen Genoms in das Chromosom der Zielzelle bestimmt wird, ist insbesondere eine dauerhafte Exposition der Beschäftigten mit diesen Viren als kritisch anzusehen. In der Tat deuten die dargestellten Untersuchungsergebnisse jedoch gerade auf eine dauerhafte Exposition der Beschäftigten hin. Die Festlegung eines naturwissenschaftlich begründbaren Grenzwertes bei dauerhafter Exposition erscheint jedoch in Ermangelung entsprechender Untersuchungen zur Zeit nicht möglich. Auf der Grundlage des Minimierungsgebots wurden die Betreiber, bei denen Kontaminationen in den beprobten S2-Anlagen festgestellt wurden, zur Durchführung der folgenden Maßnahmen aufgefordert: a) Stoffaustritte bei den Arbeiten in der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank sind unverzüglich zu dekontaminieren. b) Kontaminierte Schutzhandschuhe dürfen außerhalb der Sicherheitswerkbank nicht getragen werden. c) Instrumente und Geräte, die in der Sicherheitswerkbank durch kontaminierte Handschuhe beaufschlagt wurden, sind vor der Entnahme aus der Sicherheitswerkbank zu desinfizieren. d) Um beim Befüllen der Abfallsammelbehälter Aerosolbildung zu vermeiden, sind Kulturgefäße und kontaminierte Instrumente zuvor zu verschließen bzw. vollständig zu entleeren. e) Die Anschlüsse und Abluftfilter der Flüssigabfallsammelbehälter im Bereich der Sicherheitswerkbänke sind auf Dichtheit zu überprüfen. Die gefüllten Sammelbehälter sind unmittelbar in den Autoklaven zu überführen. f) Alle Geräte, Einrichtungsgegenstände, Arbeitsflächen, Böden, Türen und Wände im Arbeitsbereich sind einer regelmäßigen prophylaktischen Desinfektion mit anschließender Reinigung zu unterziehen. Die Oberflächenbehandlung sollte so erfolgen, dass auch die dort vorhandene DNA entfernt wird. g) Außerhalb der primären physikalischen Einschließung (z. B. Kulturgefäß) ist regelmäßig auf das Vorhandensein in der Anwendung eingesetzter Organismen zu prüfen. Die Prüfungen sind monatlich durchzuführen. Sofern keine -9- Kontaminationen festgestellt werden, können in Absprache mit der Behörde die Prüfintervalle verlängert werden. Die Ergebnisse sind in einem Prüfbuch festzuhalten. III.2 Maßnahmen zur Vermeidung der Aerosolbildung in Zentrifugen Als Rechtsgrundlage hinsichtlich der Vermeidung einer Aerosolbildung während der Zentrifugation liegen in der GenTSV für den Laborbereich erst ab der Sicherheitsstufe 4 Regelungen vor (Betrieb in einer geschlossenen Sicherheitswerkbank). Für den Produktionsbereich wurden im Anhang III Teil B II Nr. 7 für Arbeiten ab der Sicherheitsstufe 2 die folgenden Regelungen getroffen: Die technischen Apparaturen sind konstruktionsmäßig so auszulegen, dass Aerosolbildung und Undichtigkeiten vermieden werden. Zur Sicherstellung, dass keine Aerosole in den Arbeitsbereich gelangen, sind insbesondere folgende Maßnahmen geeignet: a) bei der Verwendung von Zentrifugen und Separatoren - Betreiben der Zentrifuge in Abzügen mit Abluftfilter oder Sicherheitswerkbänken, - Verwendung dichter Zentrifugen (z.B. kontinuierlich betriebene in-line-Geräte), - Verwendung eines Rotors mit dicht schließendem Deckel, Verwendung bruchsicherer und geschlossener Zentrifugeneinsätze oder -gefäße oder - Einstellung nicht bruchsicherer Zentrifugengefäße in geschlossene und bruchsichere Einsätze, Um festzustellen, welche technischen Lösungen zur Vermeidung einer Aerosolbildung bei Tischzentrifugen auf dem deutschen Markt verfügbar sind, wurden 6 Zentrifugenhersteller entsprechend befragt. Demnach bieten alle befragten Firmen für die von ihnen vertriebenen Tischzentrifugen Rotoren mit aerosoldichten bzw. hermetisch schließenden Deckeln an. Ein Hersteller machte zusätzlich die folgenden Angaben: „Die Aerosoldichte ist nach dem Verfahren von Bennett et al. (veröffentlicht in Brit. Dent. J. 189:664-667, 2000) vom Centre for Applied Microbiology & Research in Porton Down, CAMR, Großbritannien, gemäß Annex AA der IEC 1010-2-020 getestet und bestätigt worden. Im Testverfahren wird biologisches Material (Bakterien) im verschlossenen Rotor bzw. im verschlossenen Rechteckbecher freigesetzt. Luftproben - 10 - und Abstriche aus dem Zentrifugenraum werden auf bakterielle Kontamination untersucht, um sicherzustellen, dass während des Laufs kein biologisches Material aus dem verschlossenen Rotor bzw. dem verschlossenen Rechteckbecher in Freiheit gesetzt wird.“ In dem o. g. beprobten Laborbereich werden keine aerosoldichten Rotoren verwendet. Unter Anwendung der Rechtsgrundlagen für den Produktionsbereich und unter Berücksichtigung der vorhandenen technischen Möglichkeiten werden bei der Zentrifugation von GVO ab der Risikogruppe 2 die folgenden Maßnahmen für erforderlich gehalten: a) Gentechnisch veränderte Organismen sollten nicht in ungekühlten Tischzentrifugen zentrifugiert werden, da bei diesen Zentrifugen die Kühlung der Rotoren durch Raumluft erfolgt, die durch die Rotorkammer geführt wird. Eventuell entstehende Aerosole werden bei diesen Zentrifugen in besonderem Maße in den Arbeitsbereich abgegeben. Bei gekühlten Zentrifugen wird die Rotorkammer durch den Deckel dicht verschlossen. b) Die Zentrifugationsgefäße müssen dicht verschlossen sein (Dichtung prüfen) und dürfen nicht äußerlich kontaminiert sein. c) Es dürfen nur Rotoren mit aerosoldichten Deckeln verwendet werden oder die Zentrifugen sind in einer Sicherheitswerkbank oder einem Abzug mit Abluftfilter zu betreiben. d) Die Rotoren sind nach Ende der Zentrifugation zur Entnahme der Zentrifugationsgefäße in einer Sicherheitswerkbank oder einem Abzug mit Abluftfilter zu öffnen. e) Ultrazentrifugen sind mit einem geeigneten Filter zwischen Rotorkammer und Vakuumpumpe auszustatten. VI. Fazit Aufgrund des Nachweises adenoviraler DNA in Wischproben in ca. 70% der bislang beprobten Anlagen ist davon aus zu gehen, dass es sich nicht nur um Einzelfälle - 11 - unzureichender mikrobiologischer Praxis handelt. Vielmehr liegt die Vermutung nahe, dass es sich um eine grundlegende Problematik in Bereichen handelt, in denen mit biologischen Agenzien geforscht wird. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass insbesondere durch den Betrieb von Zentrifugen mit nicht aerosoldicht geschlossenen Zentrifugengefäßen und Rotoren, Aerosole mit biologischen Agenzien entstehen, die sich in der Arbeitsbereichsatmosphäre verteilen und vom Experimentator inhaliert werden bzw. über Lüftungsanlagen in die Umwelt gelangen können. Da bislang im Gentechnikrecht eine Regelung zur Verwendung aerosoldichter Rotoren für den Laborbereich fehlt, sollte dies im Rahmen der anstehenden Novellierung nachgeholt werden. Darüber hinaus stellt sich die Frage, ob die Betreiber gentechnischer Anlagen ab der Sicherheitsstufe 2 zu einer betrieblichen Eigenüberwachung unter Anwendung der in diesem Bericht genannten oder ähnlicher Methoden verpflichtet werden sollten. Als Rechtsgrundlagen könnten hierfür der § 12 Abs. 7 GenTSV (Ist das Auftreten von humanpathogenen gentechnisch veränderten Organismen in einer Konzentration, die ein Risiko für die menschliche Gesundheit darstellt oder darstellen könnte, nach dem Stand von Wissenschaft und Technik nicht auszuschließen, ist der Arbeitsbereich durch geeignete Maßnahmen zu überwachen) oder der Anhang III, Teil A I, Nr. 19 zur GenTSV (Erforderlichenfalls ist außerhalb der primären physikalischen Einschließung auf das Vorhandensein lebensfähiger, in der Anwendung eingesetzter Organismen zu prüfen) herangezogen werden. - 12 -
