Bachelor-Modul biol113 ZELLBIOLOGIE 1: Themen und Stichwörter WS2013/14 Stand: 11.11.2013 In schwarz sind die aktuellen Angaben zu finden, in grau die Stichwörter vom letzten Jahr. Die Folien, die im Rahmen der Vorlesung gezeigt werden, sind u.a. folgenden Büchern entnommen: Buchanan, Gruissem, Jones (2000, 2002) Biochemistry and Molecular Biology of Plants, ASPB, Rockville, Maryland Strasburger (2008) Allgemeine Botanik, Spektrum Verlag Alberts (2011) Molekularbiologie der Zelle, Wiley/VCH Lodish (2012) Molecular Cell Biology, Int. Student Version Karp (2008) Molekulare Zellbiologie, Springer-Verlag Karp (2013) Cell Biology, Int. Student Version Ude/Koch (1994): Die Zelle – Atlas der Ultrastruktur, G. Fischer Verlag Gunning/Steer (1996) Bildatlas zur Biologie der Pflanzenzelle, G. Fischer-Verlag 1. Doppelstunde Allgemeines zur Zelle Die Zelle als Grundeinheit des Lebens, Kriterien, Grundeigenschaften aller Zellen Geschichte der Zellbiologie und Mikroskopie Größe von Zellen Vergleich von Procyte und Eucyte Definition: Kompartiment, Organellen (Plastiden und Mitochondrien) Kompartimente der Eucyte Kompartimentierungsregel Meristematische und ausdifferenzierte Zellen, Anteile der Kompartimente Mikroskopie Literatur: BIUZ 4:244-253 Auflösungsvermögen 2. Doppelstunde Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie (TEM, REM) Fluoreszenzmikrokopie und GFP als Reporter Hochauflösende Mikroskopie jenseits der Auflösungsgrenze (PALM) Synthese von Proteinen an verschiedenen Ribosomen 80S (40S und 60S) 70 S (30S und 50S) Targeting von Proteinen, die an 80S Ribosomen hergestellt werden Kompartiment Sequenz Lage der Sequenz Zellkern Peroxisom Plastide NLS PTS: SKL PTP Transitsequenz MTP Präsequenz Signalsequenz im Protein C-Terminus N-Terminus Signalsequenz und VSS N- oder C-Terminus Mitochondrium ER/Golgi Vakuole N-Terminus N-Terminus Transport, Prozessierung gefaltet gefaltet ungefaltet Protease im Stroma ungefaltet Protease in Matrix ungefaltet Protease im ER-Lumen Spaltung vor oder nach Transport Posttranslationale Prozessierung bei Organellenproteinen und ER-Proteinen. N-terminale Targetsequenzen werden abgespalten. Duales Targeting durch unterschiedliche Targetinformation in den Vorstufenproteinen, z.B. 2 Formen der Invertase (Apoplast, Vakuole) werden beide am ER synthetisiert. Die erste From gelangt über das Endomembransystem zur Zellwand; die zweite Form hat eine Vakuolen Targeting-Information am C-Terminus und gelangt in die Vakuole. Biolistische Transformation von Zwiebelepidermiszellen zur Überprüfung des Targeting, Bild aus Krupinska (2010) BIUZ 40: 162-170 3. Doppelstunde am 11.11.2013 Membranen Funktionen von Membranen: Abgrenzung, Rezeption, Energiegewinnung etc. Membranen sind dünne zweidimensionale Flüssigkeiten (Fluid mosaic Modell) Grundlage der Struktur: Membranlipide sind amphipatisch Membranlipidklassen: Phopholipide Galaktolipide Ceramide bzw. Sphingolipide Sterole wie Cholesterin Beweglichkeit der Lipide 2 Grundeigenschaften von Membranen: 1. Asymmetrie Phosphatidylserin als Marker der endoplasmatischen Seite 2. und laterale Heterogenität Lipid Rafts Fluidität, Schmelztemperatur Regulation von Änderungen durch Umbau Fettsäuren, Sterole, LTP, PLA2 Vergleich verschiedener Membranen der Pflanzenzelle (prozentuale Angaben): Lipidklasse MGDG DGDG SL PC PE PS andere Plastide, Hülle 35 30 6 20 1 0 8 Thylakoidmembran 51 26 7 3 0 0 13 Mito. Inn. Membran 0 0 0 27 29 25 19 Plasmamembran 0 0 0 32 46 0 22 Peroxisom 0 0 0 52 48 0 0 Lipide geben Auskunft über die Evolution: Die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran verschiedener Bakterien und der Membranen der eukaryotischen Organellen liefert Belege für die Endosymbiontentheorie. Beispielsweise kommen in der Plasmamembran von Cyanobakterien Galaktolipide vor, die in der Eucyte nur in den Plastidenmembranen zu finden sind. Markerlipide der Organellen: Chloroplasten: MGDG, DGDG, Sulfolipid Mitochondrien: Cardiolipin Membranproteine: Vergleich von Membranen im Hinblick auf Verhältnis von Proteinen zu Lipiden Membran Myelinscheide PM Erythrocyten PM Leberzellen Äußere Mitochondrienmembran Innere Mitochondrienmembran Purpurmembran Protein 18 49 44 52 Lipide 79 43 52 48 Kohlenhydrate 3 8 4 0 75 25 0 75 25 0 75% Protein in innerer Mitochondrienmembran und in Purpurmembran weniger als 20% Protein in Myelinscheidenmembranen Integrale und periphere Membranproteine: Integrale MP: Single und multi pass Proteine (alpha-Helices) ß-Fass-Proteine bei Bakterien und Organellen, u.a. Porine mit 16 ß-Faltblättern Integrale MP und Transport: Durchlässigkeit von Membranen Transporter: Carrier (Symporter, Antiporter), Ionenkanäle und Pumpen Verankerung peripherer MP an Membran: 1. nichtkovalente Wechselwirkungen mit integralen MP 2. kovalente Bindung an Lipidanker, z.B. innen: Prenylreste, Myrsitinsäure außen: Phosphatidylinositol (PIP) Gefrierbruchpräparate zur Untersuchung von Membranen: 4 Flächen einer Membranen: Oberflächen und Bruchflächen Visualisierung von Proteinkomplexen (Größe, Verteilung) Das Endomembransystem Übersicht über das Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum Hauptdomänen des ER: Kernhülle; raues und glattes ER Weitere funktionelle Subdomänen: Kontaktstelle zu Organellen Stellen für Proteinkörperchenbildung (raues ER) Stellen für Ölkörperchenbildung (glattes ER) Kontakte mit Cytoskelett Ribosomen am ER, Polysomenbildung Vektorielle Translation von Proteinen mit Signalsequenzen Signalsequenzerkennungspartikel (SRP): Aufbau aus 5 Proteine und einer RNA 4. Doppelstunde am 18.11.2013 Nachbereitungsempfehlung: Alberts (2011) Übersicht über das Endomembransystem: ER, Kernhülle, Golgiapparat Prozessierung von löslichen Proteinen ER-Membranproteine können wie die löslichen Proteine im Lumen prozessiert werden (Abspaltung des N-terminalen Signalpeptids). Dann weist der neue N-Terminus zum Lumen. Das Protein bleibt mit einem hydrophoben Sequenzabschnitt in der Membran (StoppTransfer-Sequenz). anterograder und retrograder Vesikeltransport zwischen ER und Dictyosomen cis- und trans-Seiten von ER und Dictyosomen Was passiert mit Proteinen im ER? Prozessierung durch Signalpeptidase Faltung und Oligomerisierung unter Beteiligung von Chaperonen, u.a. Bip, Calnexin S-S Brücken (intra- und intermolekular) N- Glykosylierung an Asparaginresten – Dolichol als Lipid-Carrier für Oligosaccharide Qualitätskontrolle im ER, Export von falsch gefalteten Proteinen ins Cytoplasma zum Abbau durch Proteasom im Zellkern Besondere Domänen des ER in der Pflanzenzelle: Bildung von Ölkörperchen am glatten ER. Diese auch Oleosomen genannten Körperchen enthalten Triglyzeride, sind von einer monomolekularen Schicht von Phospholipiden umgeben, auf die Oleosine aufgelagert sind. Oleosine stabilisieren die Oleosomen. Bildung von Proteinkörperchen am rauen ER; Speicherproteine (Globuline, Prolamine) Der Golgiapparat Aufbau aus Dictyosomen Subzelluläre Lokalisation von Dictyosomen. Tierzelle: um den Kern herum Pflanzenzelle: um Kern und im Cytoplasmasaum am Rand der Zellen Eine normale Pflanzenzelle enthält ca. 20-400 Dictyosomen. Dictyosomen können durch Teilung vermehrt werden. Sortierung von Proteinen zwischen ER und Dictyosomen KDEL-Sequenz bei ER-Proteinen Allgemeine Funktionen des Golgiapparates: O-Glykosylierung Glykolipidsynthese Spezielle Funktionen in der Pflanzenzelle: Synthese komplexer Polysaccharide für die Zellwand Synthese von Lignin-Vorstufen Schleimproduktion bei Zellen der Wurzelhaube (Kalyptra) Vesikel des Endomembransystems: Vesikelbildung, Hüllproteine: COPI für retrograden Transport (Golgi zum ER) COPII für anterograden Transport (ER zum Golgi) Clathrin für Transport zur Vakuole und für Endocytose Hülle der Vesikel erfüllt mehrere Funktionen: - Bildung der Vesikel (mechanisch) - Sortierung des Inhalts - Zielsteuerung Zielsteuerung über SNARE-Proteine: v-SNARE t-SNARE SNARE-Proteine bilden Dimere an der Zielmembran Energiebedürftiger Prozess: Beteiligung von Rab-GTPasen (phylogenetsich alte Proteinfamilie, typisch für Eucyten) 5. Doppelstunde am 25.11.2013 (H.-P. Mock) Aufbau von Proteinen, Primär- Sekundär-, Tertiärstruktur, Dimere/Komplexe Isoelektrischer Punkt von Proteinen Enzymaktivität Omics-Techniken, Vergleich Transkriptom/Proteom (mehrfach erhöhte Komplexität durch Modifikationen wie Phosphorylierung, Glycosilierung etc) Dynamik des Proteoms, Einfluss von Entwicklungsprogrammen und Stressfaktoren Trenntechniken für komplexe Proteinproben (SDS-PAGE, 2-D Gelelektrophorese) Färbetechniken für Proteine (Sensitivität, dynamischer Bereich) Gezielter Nachweis und Quantifizierung von Proteinen: Western-Blotting Identifizierung von Proteinen über Massenspektrometrie: Typtischer Verdau, PeptidmassenFingerprint, Peptidsequenzierung mit MS/MS-Techniken Funktionsweise eines MALDI-TOF-MS. LC-basierte Analyse von komplexen Proteingemischen; ESI-MS/MS Sub-Proteomanalysen: Chromatographische Techniken, Zellfraktionierung (Organellen, Plasmamembran) 6. Doppelstunde am 2.12.2013 Das Cytoskelett Funktionen: Verankerung, Bewegungen von Zellbestandteilen (Komparetimenten, Vesikeln, Ribosomen u.a.), Information über Polarität Grundkomponenten: Untereinheit Aktin Mikrotubuli Intermediärfilamente Grundbaustein G-Aktin α-, ß-Tubulin Heterodimer nicht besprochen Polymer Aktinfilament Mikrotubulus aus 13 Protofilamenten nicht besprochen Durchmesser 6 nm 25 nm 10 nm Polarer Aufbau von Aktinfilamenten und Mikrotubuli (+- und – Pol) Zerfall und Assemblierung Gifte, die auf das Cytoskelelett abzielen: Colchicin, Taxol: Mikrotublin Phalloidin, Cytochalasin B: Aktin Bewegung und Verankerung von Organellen und anderen Kompartimenten bei Tier und Pflanze Kompartiment ER Golgi Mitochondrien Plastiden Zelkern Aktinfilamente Pflanze Pflanze Pflanze Pflanze alle Eucyten Mikrotubuli Tier Tier Tier alle Eucyten Der Zellkern Aufbau des Zellkerns: Kernhülle (doppelte Hüllmembran, verbunden mit ER) Poren mit Kernporenkomplexen Kernmatrix Kernlamina: Lamine sind Intermediärfilamente, verankert in Kernmembran über einen Prenylrest Phosphorylierung: Auflösung der Lamina vor der Mitose Nucleolus: Transkription der ribosomalen Gene (rDNA, hochrepetitiv) Bildungsort für RNA-Proteinkomplexe Präribosomen, Prozessierung der rRNA durch sno-RNA (small nucleolar RNAs) SRP U6-snRNP (Untereinheit des Spleißapparats) Telomerase Kernporenkomplexe (NPC): 30 verschiedene Proteine Achtstrahlige Symmetrie, Korbbildung aus 8 Filamenten (Länge: 100 nm) Transport in den Kern und aus dem Kern, NLS, Importine, NES, Exportine, Ran GTP Kernproteine größer 40kD brauchen eine Kernlokalisationssequenz (NLS), Centromer mit Kinetochoren zur Verankerung der Mikrotubuli Chromatin: Eu- und Heterochromatin (fakultativ und konstitutiv) Histone: H1-Linkerhiston, H2A, H2B, H3, H4 Modifikationen an Histonen: Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung Nukleosomen: Histonoktamere aus H2A, H2B, H3, H4 und 168 bp DNA Epigenetik, Chromatinmodellierung, Histon-Code Histon-Modifikationen: Acetylierung, Phophorylierung, Methylierung Acetylierung: Lockerung des Chromatins, erhöhte Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren Telomere, Telomerase (RNA-als Matrize) Krebszellen haben erhöhte Telomeraseaktivität 7. Doppelstunde am 9.12.2013 Plastiden Entstehung durch Endosymbiose; ein einmaliger Vorgang in der Evolution? Paulinella hat Chromatophoren, die auf dem Weg zum Chloroplasten sind. Die Schnecke Elysia nimmt Chloroplasten auf und kann damit Energie gewinnen. Algen haben einen bis wenige Chloroplasten pro Zelle. Höhere Pflanzen haben viele (ca. 100) Chloroplasten pro Parenchym-Zelle. Verschiedene Plastidentypen, Differenzierungsmöglichkeiten Entwicklung von Chloroplasten aus Proplastiden im Gramineenblatt - Entstehung von Thylakoiden: Vesikel aus der inneren Hüllmembran fusionieren Entwicklung von Chloroplasten aus Etioplasten (Ergrünung) - Etioplasten, Prolammellarkörper - Chlorophyllbiosynthese, Lichtabhängigkeit bei Angiospermen, ProtochlorophyllidOxidoreduktase (POR) - Entstehung von Thylakoiden bei der Ergrünung: Primärthylakoide entwickeln sich ausgehend vom Prolamellarkörper Subkompartimentierung eines Chloroplasten Zwei Hüllmembranen mit Intermembranraum Stroma Thylakoidmembran mit Lumen Struktur des Thylakoidmembransystems: Grana- und Stromathylakoide Laterale Heterogenität in der Verteilung der Komplexe des Photosyntheseapparates: Komponente % Vorkommen in Granathylakoiden % Vorkommen in Stromathylakoiden PSII 85 15 PSI 10 90 Cyt f/b6 50 50 LHCII 90 10 ATP-Synthase 0 100 Plastocyanin (Lumen) 60 40 8. Doppelstunde am 16.12.2013 Vorteile der lateralen Heterogenität in der Thylakoidmembran: 1. Langfristige Anpassung an Lichtbedingungen durch Änderung des Verhältnisses von Stroma/Granatylakoiden bzw. des Verhältnisses zwischen den Photosystemen 2. Kurzfristige Anpassung an Lichtänderungen durch „State-Transition“ State-Transition: Wanderung des LHCII zwischen PSII und PSI, Wenn PSII aktiver ist als PSI kommt es zur Reduktion des Plastochinon-Pools, dadurch wird eine Kinase aktiv, die den LHC phosphoryliert, dieser wandert dann nach PSI. Umgekehrt, wenn PSI aktiver ist als PSII; wird LHC-P dephosphoryliert und LHC wandert zurück zum PSII im Granabereich. Literatur dazu: Buchanan et al. (2000) Biochemistry & Molecular Biology of Plants, ASPB, S. 590-596 Plastidenteilung arc-Mutanten mit unterschiedlicher Größe und Zahl an Plastiden Proteine des inneren Ringes: FtsZ1,2; ARC6 Proteine des äußeren Ringes: ARC3, ARC5 Ringpositionierung durch die Min-Proteine Immunologischer Nachweis der Ringproteine Methoden: Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen: - FRET (Fluoreszenzresonanzenergietransfer) - Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFc) Plastiden-DNA ist verpackt in Nukleoiden Hohe Kopienzahl pro Plastiden und pro Zelle Zur Vorbereitung der nächsten Stunden: Krupinska (2011) BIUZ 5 (41): 298-305 Plastiden-DNA (ptDNA) Größe und Struktur: LSC, IRa, IRb, SSC Kodierungspotential Gennomenklatur: Tabelle BIUZ, 2011 psa, psb, pet, atp, ndh, trn, rrn, rps, rpl Evolution: Gentransfer in den Kern Nukleoide, Polyploidie Beteiligung von kernkodierten und plastidenkodierten Proteinen am Aufbau des Photosynthesepparates u. a. Proteinkomplexe der Plastiden ca. 85 Proteine der Plastiden sind plastidenkodiert; 3000-4000 Proteine sind kernkodiert Aufbau des PS-Apparates erfordert Proteine von außen, innen und Kofaktoren wie Chlorophyll Genexpression allgemein Regulation auf verschiedenen Ebenen: Transkription Prozessierung von RNA Tranlation Stabilität von Proteinen, Proteasom (VL Sauter) Plastiden Genexpression verschiedene Ebenen der Genexpression: Gendosis (Kopienzahl) Transkription Prozessierung Translation Proteinabbau Import kernkodierter Plastidenproteine: TOC und TIC, Importexperiment mit radioaktioven in vitro Tranlationsprodukten Transkription: Initiationskomplex, Struktur von Transkriptionsfaktoren RNA-Polymerasen Duales Targeting durch mehrdeutige Targetsequenzen, z.B. Aminoacyl-tRNA-Synthetasen für die Organellen (17 von 24 Organellenformen werden in beide Organellen importiert) 9. Doppelstunde Übersicht über die Genexpression in Organellen RNA-Polymerasen in der Pflanzenzelle RNAPI, II, III, PEP, Phagen-Polymerasen: ptNEP, mtNEP Evolution der Mitochondrien Abgewandelte Mitochondrien in einzelligen Parasiten: Mitosomen in Archezoen, stark reduziert, ohne Genom Hydrogenosomen, entwickeln Wasserstoff, können Genom besitzen Mitochondrien: Größe, Form, Zahl pro Zelle Dynamik: Gleichgewicht von Fusion und Spaltung Vor Teilung von Zellen: Bildung eines grossen mitochondrialen Netzwerkes FtsZ in einer Rotalge, sonst während der Evolution verloren gegangen Spaltung erfordert DRP (Dynamin related proteins) Genom der Mitochondrien, Mastergenom und subgenomische Formen Kodierungsskapazität bei Mensch, Hefe, Pflanzen Plastidengene in mitochondrialer DANN CMS. Cytoplasmatisch männliche Sterilität Enstehung und Korrektur (Restorer-Gene) 10. Doppelstunde Funktionen von Mitochondrien Übersicht über die Atmung: Glykolyse, Citratzyklus, Atmungsketter Komplexe der Atumungskette, Alternative Oxidase ATP-Synthase, Protonengradient Photorespiration, Peroxisomen mit Katalase Gluconeogenese, Glyoxysomen Organellen - Ähnlichkeiten Wiederholung Endosymbiontentheorie Vergleich mtDNA und ptDNA, Gene DNA-Transfer in der Zelle Genexpression: Kontrolle auf verschiedenen Ebenen RNA-Polymerasen Edierung, PPR Proteinimport: TOC/TIC und TOM/TIM Präsequenzen für Import; Prozessierung in Matrix und Stroma Importexperimente mit radioaktiv markierten Translationsprodukten Duales Targeting: Beispiel: Aminoacyl-tRNA-Synthetasen Alternativer Importweg in die Plastiden: ER-Vesikel Nachweis glykosylierter Proteine in den Plastiden Retrograde Signale (BIUZ 2011): u.a. ROS, Intermediate der Chlorophyllbiosynthese, Häm, Störungen der Proteinbiosynthese Stromuli, Mitochondrienvesikel 11. Doppelstunde Zellwand der Pflanzen Funktionen: Struktur, Signale, Pathogenabwehr, Kommunikation zwischen Zellen Bestandteile: Polysaccharide: Zellulose, Hemicellulose, Pektine, Lignin, Kallose Proteine: HRGP, u.a. Extensin; PRP; GRP; AGP Α-D-Glucose als Ausgangssubstrat für Umbau in andere Aldosen: 11 Zucker einschließlich von Zuckeralkoholen werden zum Aufbau der Zellwandpolysaccharide genutzt: u.a. Galaktose, Galakturonsäure, Glucuronsäure, Mannose, Xylose Cellulose, Fibrillen: Streuungstextur und Paralleltextur Experiment mit Colchicin hat gezeigt, dass Cellulosesynthase Kontakt zu den Mikrotubili unter der Plasmamembran braucht, damit Paralleltextur entsteht. In Zellwand gibt es mehrere Netze, ineinander geschlungen: Cellulosefibrillen Hemicellulose Pektine Proteine wie HRGPs Extensine Lignin Ligninbiosynthese: Hydroxyzimtsäuren-Vorstufen werden aus Phenylalanin gebildet Proteom der Zellwand: 1000 – 2000, obwohl für nur 500 Gene vorhergesagt wurde, dass die für Zellwandproteine kodieren; posttranslationale Modifikationen, vor allem Glykosylierung Biosynthese der Zellwand: Golgiapparat, Glykosylierung von Proteinen, Synthese von Hemicellulosen und Pektinen sowie von Ligninvorstufen Zellulosesynthase in der Plasmamembran Plasmodesmen: Primäre und sekundäre Plasmodesmen Aufbau mit Desmotubulus passiver Transport von Molekülen bis zu 1 kD aktiver Transport durch Erweiterung der Plasmodesmen, Transport von Proteinen bis zu 50 kD nachgewiesen Virus-Movement-Proteine, Transkriptionsfaktoren wie knotted 1 (KN1) Viren in Pflanzen: RNA, z.B. TMV (Tabakmosaikvirsus) ssDNA, z.B. Geminiviren dsDNA, z.b. CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) 12. Doppelstunde Zellteilung: Phragmoplast, Zellplatte, Aussparungen für Plasmodesmen Die Vakuolen der Pflanzenzellen Funktionen Osmoregulation, pH-Homeostase: Protonentransportsysteme: Pyrophosphatase und ATP-abhängige Protonenpumpe Entgiftung: Bildung von GSH-Konjugaten unter Katalyse durch Gluthathiontransferasen Transport der Konjugate über ABC-Transporter im Tonoplasten ABC-Transporter heißen auch MDRP (multidrug resistance proteins) GSH: Tripeptid aus Cystein, Glutamat, Glycin; enzymatische Biosynthese, Redoxsystem Bildung von Phytochelatinen durch Transpeptisierung von GSH: (Glu-Cys)nGly n=2-11 Phytochelatine komplexieren Schwermetallionen, z.B. Cd2+ Inhaltsstoffe: Salze, Protonen Fremdstoffe, Katabolite Sekudnäre Pflanzenstoffe; z.B. Alkaloide Proteintransport in die Vakuole: Prolamine in ER Proteinkörperchen, Aufnahme durch Phagocytose Globuline in Golgivesikel Rolle der Vakuole beim Zelltod bzw. bei der Autophagie Beispiel. Aleuronprotoplasten: Fusion von PSV und LV LV enthalten Proteasen, u.a. Cysteinproteasen Caspasen bei der Apoptose in Tierzellen: Cysteinproteasen Autophagie bei Hefezellen unter Mangelbedingungen Autophagie als Entgiftungsprozeß Autophagie-Mutanten: schnellere Seneszenz, weil Kompartimente mit toxischem Inhalt nicht mehr entfernt werden können