Beispieldatei in Wordformat

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1 ZUSAMMENFASSUNG
Lateralwurzeln vergrößern die Oberfläche des Wurzelstocks beträchtlich und sind
deshalb für die Maispflanze (Zea mays L.) sowohl zur Verankerung im Boden wie auch
zur optimalen Nährstoffaufnahme äußerst wichtig. Bislang ist nur wenig über die
molekularen Netzwerke, die der Bildung des komplexen Wurzelsystems bei Mais
zugrunde liegen, bekannt. Die Verfügbarkeit spezifischer Mutanten der
Lateralwurzelinitiation bei Mais und die molekularbiologische Untersuchung dieser
Mutanten können zum verbesserten Verständnis der genetischen und molekularen
Vorgänge während der Lateralwurzelbildung beitragen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden in einem Screening zuvor mit dem Mutator (Mu)Transposonsystem mutagenisierte F2-Familien nach neuen Lateralwurzelmutanten
durchmustert. Dabei wurde die monogen, rezessiv vererbte Mutante rum1 (rootless with
undetectable meristems 1) isoliert, die weder Lateral- noch Seminalwurzeln bildet. Die
Mutante rum1 ist in der späten embryonalen und der frühen postembryonalen Phase der
Wurzelentwicklung gestört, was sie von bisher identifizierten Wurzelmutanten bei Mais
unterscheidet. Histologische Untersuchungen der Mutante rum1 zeigten, dass die Mutante
vor Initiation der Primordien für Lateral- und Seminalwurzeln betroffen ist.
Physiologische Analysen wiesen darauf hin, dass die Reaktion auf exogen appliziertes
Auxin sowie der polare Auxintransport in der Primärwurzel der Mutante gestört ist.
Zudem war die gravitrope Reaktion der Primärwurzel der Mutante verzögert. Genetische
Untersuchungen durch Auskreuzung der Mutante in verschiedene Maisinzuchtlinien
demonstrierten die Stabilität und Penetranz der Mutation. Alleltests von rum1 mit
anderen Maiswurzelmutanten zeigten, dass es sich bei rum1 um eine neue Mutante
handelt. Die Doppelmutante von rum1 mit der Lateral¬wurzelinitiationsmutante lrt1
(lateral rootless1) zeigte einen neuartigen Phänotyp und weist somit auf Interaktion der
beiden Gene hin. Demgegenüber war die Doppelmutante von rum1 und der Mutante der
sprossbürtigen Wurzelbildung rtcs (rootless concerning the crown and seminal roots)
additiv, was auf eine unabhängige Bildung der Lateralwurzeln und der sprossbürtigen
Wurzeln schließen lässt. Grobkartierung der Mutation rum1 mit BA-Translokationslinien
lokalisierten die Mutation auf dem kurzen Arm von Chromosom 1.
Die Initiation der Lateralwurzeln findet im Perizykel statt. Eine molekulare
Charakterisierung der Mutante rum1 wurde mit zelltypspezifischen
Transkriptomanalysen von Perizykelzellen kurz vor Initiation der Lateralwurzeln mittels
Laser Capture Microdissection (LCM) in Kombination mit Microarrayexperimenten
durchgeführt. Dabei wurden sowohl Transkriptionsprofile von Perizykelzellen im
Vergleich zu Nicht-Perizykelzellen in der Maisinzuchtlinie B73 als auch
Transkriptionsprofile von Perizykelzellen der Mutante rum1 im Vergleich mit dem
Perizykel des entsprechenden Wildtyps erstellt. Dabei waren 210 Gene präferentiell im
Perizykel im Vergleich zu Nicht-Perizykelzellen exprimiert. Der Vergleich des
Trans¬kriptoms von Wildtyp mit rum1 Perizykelzellen führte zur Identifizierung von 163
Genen, die bevorzugt im Wildtypperizykel exprimiert waren und zu 116 Genen, die
präferentiell im rum1 Perizykel exprimiert waren. Die dabei identifizierten differentiell
exprimierten Gene wurden funktionell annotiert. Eine überwiegende Anzahl der
präferentiell im Perizykel akkumulierten Transkripte wurde der Klasse der
Proteinsynthese und der Transkription zugeordnet, was darauf hinweist, dass diese
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Vorgänge bereits kurz vor der Initiation der Zellteilung im Perizykel aktiviert werden.
Zusätzlich konnten Transkripte als differentiell im Perizykel exprimiert identifiziert
werden, die mit der Auxinantwort in Verbindung stehen und daher vermutlich eine
wichtige Rolle in der Lateralwurzelbildung einnehmen. Beim Vergleich der
Genexpression im Perizykel des Wildtyps gegenüber der Mutante rum1 waren viele der
bevorzugt im Wildtyp akkumulierten Gene der Transkriptionsregulation zugeordnet.
Diese scheinen zusammen mit Zellzyklus regulierenden Genen, die ebenfalls im Wildtyp
präferentiell transkribiert wurden, eine wichtige Rolle bei der Lateralwurzelinitiation zu
spielen.
Die Identifizierung und Charakterisierung der neuen Wurzelmutante rum1 zusammen mit
vergleichenden zelltypspezifischenTranskriptomanalysen des Perizykels kurz vor der
Initiation der Lateralwurzeln können zum besseren Verständnis der genetischen und
molekularen Netzwerke beitragen, die der Lateralwurzelbildung zugrunde liegen.
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2 EINLEITUNG
Mais (Zea mays L.) liefert mit einem Ertrag von etwa 636 Millionen Tonnen pro Jahr
weltweit noch vor Reis und Weizen die höchsten Erträge aller Getreide (Deutsches
Maiskomitee e.V., 2003; http://www.maiskomitee.de) und nimmt somit eine
entscheidende Rolle bei der Ernährung von Menschen und Tieren ein. Zur Produktion
dieser enormen Menge an Biomasse ist neben einem optimierten Photo¬synthese¬system
und einer effektiven Anpassung an variable Umweltbedingungen die Aufnahme von
Wasser und Nährstoffen und gerade bei Mais die Verankerung und Stabilisierung der
Pflanze im Boden von großer Bedeutung (AIKEN and SMUCKER, 1996). Diese
vielfältigen Anforderungen werden im Wesentlichen durch das bei Mais stark
ausgeprägte Wurzelsystem erreicht.
2.1 Wurzelsysteme von mono- und dikotylen Modellpflanzen im
Vergleich
Schon äußerlich sichtbar unterscheidet sich das homorhize Wurzelsystem von Mais, wie
bei allen anderen monokotyledonen Pflanzen, von dem allorhizen Wurzelsystem der
dikotylen Modellpflanze Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.. Bei Mais wird von
Homorhizie gesprochen, da dieses Wurzelsystem von überwiegend gleich¬rangigen und
ähnlich gestalteten Wurzeln aufgebaut ist. Dennoch variiert die Ausprägung der
Homorhizie zwischen den Familien der monokotylen Pflanzen stark. Das komplexe
Wurzelsystem von Mais besteht aus embryonalen und postembryonalen Wurzeln. Die
Anlage für die embryonale Primärwurzel ist früh im Embryo schon etwa 9-15 Tage nach
der Bestäubung sichtbar (INGRAM et al., 1999; FELDMANN, 1994). Etwa zwei Tage
nach Keimung schiebt sich die Primärwurzel unter Ausprägung der sie schützen¬den
Koleorhiza durch die Samenschale. Die zweite, in der späten embryonalen
Entwicklungs¬phase angelegte Wurzelart, die Seminalwurzeln, sind je nach Maislinie in
variabler Anzahl 22-40 Tage nach Bestäubung im Skutellarknoten angelegt (ERDELSKA
and VIDOVENKOVA, 1993). Sie wachsen etwa fünf Tage nach Keimung aus dem
Skutellarknoten aus. Zu den postembryonalen Wurzeln gehören die sprossbürtigen Kronund Stützwurzeln. Diese entwickeln sich jeweils aus den Knoten und werden etwa 10
Tage nach Keimung sichtbar (HOCHHOLDINGER et al., 2004a und 2004b), wobei alle
Wurzeln, die aus unterirdischen Knoten herauswachsen als Kronwurzeln und alle
Wurzeln, die aus oberirdischen Knoten herauswachsen als Stützwurzeln bezeichnet
werden. An den Stützwurzeln bilden sich Lateralwurzeln nur unterirdisch, nachdem die
Stützwurzeln ins Erdreich eingewachsen sind. Die Bildung von Lateralwurzeln und
Wurzelhaaren ist allen vier beschriebenen Wurzeltypen des Maiswurzelsystems
gemeinsam. Diese tragen enorm zur Vergrößerung der Wurzeloberfläche und somit zur
optimalen Versorgung der Pflanze mit Wasser und Nährstoffen bei (WANG et al., 1994).
Anders hingegen sieht das Wurzelsystem bei dikotylen Pflanzen aus. Bei Arabidopsis
entwickelt sich die Keimwurzel zur Primärwurzel, die hier auch Hauptwurzel genannt
wird. Diese Primärwurzel bildet im Laufe der Entwicklung Seitenwurzeln (erster
Ordnung), die wiederum Seitenwurzeln (zweiter Ordnung) bilden können. Lediglich
durch Umwelteinflüsse wie zum Beispiel Verletzung oder exogene Hormoneinflüsse
können bei dikotylen Pflanzen Adventivwurzeln gebildet werden (z.B. TAKAHASHI et
al., 2003). Aufgrund dieser auch unter den Dikotyledonen einzigartigen Einfachheit im
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Aufbau ist das Wurzelsystem von Arabidopsis bisher am detailliertesten untersucht und
kann somit als Anhaltspunkt für die Analyse anderer Wurzelsysteme dienen.
2.2 Vergleich der Anatomie von Primärwurzeln mono- und
dikotyler Pflanzen
Nicht nur morphologisch unterscheiden sich die Wurzelsysteme mono- und dikotyler
Modellpflanzen voneinander. Auch beim Querschnitt durch die Primärwurzeln von
Arabidopsis und Mais können gravierende Unterschiede in der Anatomie der Wurzeln
festgestellt werden. Das Grundgewebe besteht im Querschnitt von Arabidopsis aus einer
Cortexzellschicht, die in jungen Wurzeln aus 8 Zellen zusammengesetzt ist, während der
Primärwurzelquerschnitt bei Mais aus 8-15 Cortexzellschichten mit unterschiedlicher
Zellzahl besteht. Im Längsschnitt der Primärwurzel wird der klare Aufbau der
Arabidopsiswurzel im Vergleich zum variableren Maiswurzelaufbau bei der Organisation
des ruhenden Zentrums deutlich. Während das ruhende Zentrum bei Arabidopsis aus 4
Zellen besteht, machen bei Mais 800-1200 Zellen das ruhende Zentrum aus (JIANG et
al., 2003). Allen Wurzeltypen gemeinsam ist deren longitudinaler Aufbau. Direkt an die
Wurzelhaube schließt sich die Wurzelspitze an, die das meristematische und
teilungsaktive Gewebe enthält. Weiter basal gelegen befinden sich die Elongationszone
und schließlich die Differenzierungszone, die durch Wurzelhaare gekennzeichnet ist
(ISHIKAWA and EVANS, 1995). In der Differenzierungszone findet auch die erste
morphologisch sichtbare Zellteilung zur Initiation von Lateralwurzeln statt
(DUBROVSKY et al., 2000). Die Bildung von Lateralwurzeln wird bei Arabidopsis in
Perizykelzellen über Lateralwurzelmeristeme und Lateralwurzelprimordien initiiert
(LASKOWSKI et al., 1995). Dabei treten bereits differenzierte Perizykelzellen, die in der
G1-Phase des Zellzyklus arretiert sind wieder in den Zellzyklus ein und werden so zu
Initialzellen für sich entwickelnde Lateralwurzelmeristeme und -primordien
(BEECKMAN et al., 2001). Sie durchlaufen daraufhin ein definiertes Progamm
orientierter Zellteilungen bis zur vollständigen Entwicklung der Lateralwurzel, die durch
das Cortexgewebe hindurch wächst und schließlich äußerlich sichtbar wird (MALAMY
and BENFEY, 1997; MALAMY and RYAN, 2001). Bei Mais wird angenommen, dass
als Initiationsort von Lateralwurzeln neben dem Perizykel zusätzlich die Endodermis eine
Rolle spielt (BELL and MCCULLY, 1970).
2.3 Genetische Analyse der Wurzelentwicklung
Die Modellpflanze Arabidopsis zeichnet sich durch günstige anatomische und
entwicklungsgenetische Eigenschaften wie die geringe Größe und kurze
Generationsdauer, konstante Zellabstammung von bestimmten Initialzellen, Transparenz
der Gewebe (BENFEY and SCHIEFELBEIN, 1994) und einfache radiale Organisation
im Aufbau der Wurzeln (DOLAN et al., 1993) aus. Diese günstigen Eigenschaften
führten zur Isolierung einer Vielzahl von Wurzelmutanten. Bei Arabidopsis sind mehr als
zehn Mutanten beschrieben, die in der Entwicklung der Lateralwurzeln betroffen sind.
Darunter sind zwei Mutanten, die in der Lateralwurzelinitiation beeinträchtigt sind. In
den Mutanten alf4 (aberrant lateral root formation4; CELENZA et al., 1995) und Slr
(solitary root; FUKAKI et al., 2002) werden keine Lateralwurzeln initiiert und es können
keine Lateralwurzelprimordien nachgewiesen werden. Die Gene dieser beiden Mutanten
alf4 und Slr wurden bereits kloniert. Das alf4-Gen kodiert für ein 69.2 kD-Protein, das im
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Pflanzenreich konserviert auftritt, für das jedoch keine Homologie außerhalb des
Pflanzenreichs bekannt ist (DIDONATO et al., 2004). Das slr-Gen kodiert für das Protein
IAA14, ein Mitglied der Aux/IAA Proteinfamilie. Proteine der Aux/IAA-Familie sind an
der Regulation der auxinverantwortlichen Transkription in den Wurzeln beteiligt (ABEL
et al., 1994). Die konkrete Rolle der beiden Gene bei der Lateralwurzelinitiation blieb
bisher jedoch ungeklärt. Zusätzlich zu den Mutanten, die unter standardisierten
Umweltbedingungen gefunden wurden, wurden bei Arabidopsis Untersuchungen zum
Einfluss von Nährstoffen auf die Lateralwurzelinitiation durchgeführt. Unter
Nährstoffverhältnissen, die die Lateralwurzelinitiation inhibieren, wurde die Mutante lin1
(lateral root initiation 1) identifiziert. Diese Mutante bildet trotz der inhibierenden
Nährstoffverhältnisse Lateral¬wurzeln (MALAMY and RYAN, 2001). Bei Mais
beschränkt sich aufgrund der komplexen Wurzelorganisation und der erst kürzlich
begonnenen gezielten Suche nach Maiswurzelmutanten die Anzahl der Mutanten, die in
der Entwicklung von Lateralwurzeln beeinträchtigt sind, auf drei Mutanten. Neben den
zwei Mutanten slr1 und slr2, die in der Lateralwurzelelongation gestört sind (short lateral
roots1 und 2; HOCHHOLDINGER et al., 2001), wurde die Mutante lrt1 (lateral
rootless1) isoliert, bei der die Initiation der Lateralwurzeln gestört ist
(HOCHHOLDINGER and FEIX, 1998).
Mutanten sind ein geeignetes Hilfsmittel, um Einblicke in die genetische Regulation der
Wurzelentwicklung zu bekommen. In klassisch genetischen Ansätzen („forward
genetics“) wird zunächst vom Phänotyp ausgehend eine Mutante isoliert und dann das
mutierte Gen durch genetische und molekularbiologische Experimente kloniert. Dadurch
kann diesem Gen eine direkte oder indirekte Funktion zugeschrieben werden. Bei Mais
macht man sich zur Mutagenisierung das Vorhandensein von mobilen genetischen
Elementen bekannter Struktur, die Transposons, zu Nutze. Ein häufig zur Mutagenese bei
Mais eingesetztes Transposonsystem ist die Familie der Mutator-Transposons (Mu).
Aktive Mais-Mutatorlinien besitzen autonome Mu-Elemente in ihrem Genom,
sogenannte MuDR-Elemente (BENNETZEN, 1996), die für Transposasen (MURA und
MURB; ONO et al., 2002) kodieren. Die Transposasen regulieren auch die Transposition
der nichtautonomen Mu1-Mu8 Elemente. Das Mu-Transposonsystem ist besonders zur
Mutagenisierung geeignet, da die Transposons nicht nur in die direkte Nachbarschaft, wie
bei anderen Transposonsystemen (LISCH et al., 1995), sondern im ganzen Genom
vorwiegend in single-copy Genbereiche integrieren (CRESSE et al., 1995) und eine
höhere Transpositionsfrequenz als andere Mais Transposonsysteme besitzen
(BENNETZEN et al., 1996). Wird eine aktive Mutatorlinie mit einer Inzuchtlinie von
Mais gekreuzt und kommt es dabei durch Insertion eines Mu-Transposons in ein Gen zu
einer monogen, rezessiv vererbten Mutation, so liegt diese in der F1-Generation
heterozygot vor. Nach Selbstung der F1-Pflanze erscheint die Mutation entsprechend der
Mendelschen Gesetze in 25% der F2-Nachkommen homozygot und wird damit
phänotypisch sichtbar.
2.4 Zelltypspezifische Transkriptomanalysen
Die Klonierung von Genen, die für phänotypische Mutationen verantwortlich sind, trägt
zum Verständnis der molekularen Prozesse bei der Maiswurzelentwicklung bei.
Genklonierungen sind bei Mais wegen des hohen Anteils an repetitiver DNA im
Maisgenom allerdings immer noch sehr zeitaufwendig. Globale
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Genexpressions¬analysen sind nach Isolierung neuer Mutanten relativ bald etablierbar,
vermitteln einen Einblick über die koordinierte Expression bestimmter Gene und lassen
somit Rückschlüsse auf regulatorische Netzwerke zu, die an bestimmten
Entwicklungsphasen beteiligt sind.
Neue molekularbiologische Methoden ermöglichen globale Transkriptomanalysen von
mehreren tausend Genen gleichzeitig (ZHU, 2003). Bei der Microarraytechnologie
werden PCR-Produkte verschiedener cDNAs auf Objektträger gedruckt und diese mit
zwei unterschiedlich fluoreszenzmarkierten cDNAs hybridisiert, die miteinander
verglichen werden sollen (RICHMOND and SOMMERVILLE, 2000; AHARONI and
VORST, 2002). Bis vor kurzem konnte nur die mRNA aus kompletten Pflanzenorganen
oder Organteilen analysiert werden, die aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen mit
unterschiedlichen Genexpressionsmustern aufgebaut sind. Bei einem
Transkriptomvergleich mit Micro¬arraychips wird dabei möglicherweise das
Expressionsprofil eines Zelltyps durch die Expressionsprofile der zusätzlich in diesem
Organ befindlichen Zelltypen überlagert (SCHNABLE et al., 2004). Deshalb wurden
verschiedene Methoden entwickelt, um spezifische Zelltypen aus dem Gewebeverband zu
isolieren. Mit der Mikrokapillar¬methode konnten lediglich spezifische Zelltypen, die an
der Organoberfläche liegen, angereichert werden. Jedoch ist es oft schwierig aus derartig
isolierten Zellen RNA zu extrahieren und zu amplifizieren (KARRER et al., 1995). Eine
weitere Methode, mit der protoplastierte Zellen von zelltypspezifischen GFPMarkerlinien mittels eines Fluoreszenzsorters von anderen getrennt und in hoher Anzahl
gewonnen werden, wurde vor kurzem zur Analyse von Genexpressionsprofilen fünf
verschiedener Zelltypen in Arabidopsiswurzeln angewandt (BIRNBAUM et al., 2003).
Bei Mais stehen nur wenige zelltypspezifische Promotoren zur Verfügung, um sich diese
Methode zur Erstellung zelltypspezifischer Transkriptionsprofile zu Nutze zu machen.
Bei tierischen Geweben wird die Technik der LCM in Kombination mit
Microarrayanalysen angewandt, um dieses Problem zu umgehen (EMMERT-BUCK et
al., 1996; LUO et al., 1999). Diese Methode ermöglicht es, einzelne Zellen aus dem
Gewebeverband herauszulösen und die geringe Menge der darin enthaltenen mRNA zu
isolieren. Nach linearer Amplifikation der mRNA kann diese für Microarrayanalysen
eingesetzt werden, was erstmals von NAKAZONO et al. (2003) auch an pflanzlichen
Geweben demonstriert wurde. Diese technischen Fortschritte sind vielversprechend, um
in Zukunft neue Informationen über Genexpressionsmuster in spezifischen Zellen zu
erlangen (SCHNABLE et al., 2004).
Eine ausführliche Einführung in das Gebiet der genetischen und molekularen Analyse der
Maiswurzelentwicklung wird in den Übersichtsartikeln im Anhang 6.1.3 - 6.1.5 gegeben.
2.5 Ziel der Arbeit
Ziel dieser Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung neuer Mutanten, die
spezifisch in der Lateralwurzelbildung gestört sind. Dazu wurden zunächst etwa 2.000
mit dem Mutator (Mu)-Transposonsystem mutagenisierte F2-Familien unter
standardisierten Bedingungen für 14 Tage in Papierrollen gekeimt und auf neue
Wurzel¬mutanten durchmustert. Nach genetischer Bestätigung monogen rezessiver
Defekte der dabei isolierten Wurzelmutanten sollte eine ausgewählte, neue Mutante
eingehend charakterisiert werden. Diese Untersuchungen sollten morphologische,
histologische, physiologische, genetische und molekularbiologische Analysen umfassen.
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Morphologische Untersuchungen sollten über die gesamte Wurzelentwicklung
durchgeführt werden, wobei auch das ältere Maiswurzelsystem der Mutante und deren
Reaktion auf Nährstoffe in verschiedenen Konzentrationen mittels hydroponischer Kultur
einbezogen werden sollte. Weiterhin sollten mikroskopische Analysen von
Gewebeschnitten einen detaillierteren Aufschluss auf die histologischen Defekte der neu
isolierten Mutante geben. Bei der genetischen Charakterisierung sollte diese Mutante zur
Betrachtung der Stabilität und Penetranz der Mutation in andere Maislinien ausgekreuzt,
sowie mit bereits bekannten Maiswurzelmutanten Alleltests durchgeführt und
Doppelmutanten hergestellt werden. Eine BA-Translokationsanalyse zur Grobkartierung
des in der Mutante betroffenen Genlocus und die Generierung neuer unabhängig
induzierter Allele sollten als Vorbereitung für eine spätere Genklonierung durchgeführt
werden.
Zur molekularbiologischen Charakterisierung der ausgewählten Mutante standen bei
dieser Arbeit die Technik der Laser Capture Microdissection und maisspezifische 12k
cDNA-Microarrays zur Verfügung. Mit Hilfe der LCM sollten spezifisch die
Perizykel¬zellen, in denen Lateralwurzelinitiation stattfindet, isoliert werden. RNA dieser
Zellen sollte zur differentiellen Transkriptomanalyse des Perizykels mit MicroarrayHybridsierungsexperimenten untersucht werden. Die dabei gewonnenen differentiellen
Expressionsmuster sollten somit einen besseren Einblick in die molekulare Regulation
der Lateralwurzelinitiation bei Mais geben.
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3 ERGEBNISSE
Wurzelsysteme müssen funktionellen Anforderungen der Pflanze wie der Versorgung mit
Nährstoffen und Wasser als auch der Verankerung im Boden gerecht werden. Bisher ist
nur wenig über die genetischen und molekularen Prozesse bekannt, die der
Wurzelentwicklung der monokotylen Getreidearten zugrunde liegen. Unter den weltweit
für die Ernährung wichtigen Getreiden ist Mais das am besten untersuchte genetische
System (CHANDLER and BRENDEL, 2002). Wurzelmutanten bei Mais und die
molekularbiologische Untersuchung dieser Mutanten können deshalb zum verbesserten
Verständnis der genetischen und molekularen Vorgänge während der Wurzelbildung bei
Monokotyledonen beitragen.
3.1 Isolierung und morphologische Charakterisierung der
Lateral¬wurzel¬mutante rum1
Zur Isolation neuer Wurzelmutanten wurden mit dem Papierrollentest (nach HETZ et al.,
1996; Abb. 2) etwa 40.000 Maiskeimlinge, die aus knapp 2.000 ver¬schiedenen mit MuTransposons mutagenisierten F2-Familien stammten, unter standardisierten
Klimakammerbedingungen gekeimt. 14 Tage nach Keimung wurde das Wurzelsystem
der Keimlinge phänotypisch analysiert.
Durch Selbstung der dabei gefundenen putativen Mutanten konnte bei diesem Screening
eine neue, rezessiv vererbte monogene Maiswurzelmutante genetisch bestätigt werden.
Diese Maismutante rum1 (rootless with undetectable meristems 1) ist in der Initiation der
embryonal angelegten Seminalwurzeln und der postembryonal angelegten Lateralwurzeln
der Primärwurzel gestört (Abb. 3). Die Primordien für Lateral- und Seminalwurzeln
fehlen komplett, wie durch histologische Analysen gezeigt wurde.
Dabei sind sowohl die Lateralwurzelinitiation an sprossbürtigen, postembryonalen
Wurzeln als auch die Entwicklung der oberirdischen Organe bei dieser Mutante nicht
beeinträchtigt. Nährstoffe wie Nitrat oder Phosphat, die im Wildtyp in erhöhten
Konzentra¬tionen die Bildung von Lateralwurzeln fördern, zeigen keine Wirkung auf die
Lateralwurzel¬initiation bei in hydroponischer Nährlösung gehaltenen 30 Tage alten
Pflanzen der Mutante rum1. Auch das in ver¬schiedenen Konzentrationen exogen
applizierte Pflanzen¬hormon Auxin (α-NAA) bewirkt keine Bildung von
Lateral¬wurzeln, wie es im Wildtyp der Fall ist. Zudem weist diese Mutante im
Vergleich zum Wildtyp eine verzögerte Reaktion auf gravitrope Stimulierung auf.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Auxintransport in der Primärwurzel der
Mutante rum1 stark reduziert ist. Daher wurde die Expression der Maishomologe
bekannter putativer Auxintransporter von Arabidopsis der pin- und aux1-Genfamilie
untersucht. Jedoch wurden keine Expressions¬unterschiede dieser Gene zwischen
Wildtyp und rum1 in der Primärwurzel nachgewiesen. Weitere morphologische
Unterschiede der Mutante rum1 zum Wildtyp sind, dass sie eine signifikant kürzere
Primärwurzel und im Dunkeln gewachsen zudem ein längeres Mesokotyl und längere
Koleoptilen besitzt. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass das rum1-Gen eine
Rolle bei der Regulation des Auxintransports in der Primärwurzel bzw. der
Auxinaufnahme im Perizykel spielt. Da der Auxintransport in der Koleoptile bei der
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Mutante rum1 nicht beeinträchtigt ist, kann man annehmen, dass der Auxintransport in
rum1-Keimlingen zwischen Spross und Wurzel unterbrochen ist.
3.2 Genetische Charakterisierung der Lateralwurzelmutante
rum1
Zur genetischen Analyse wurde die rum1 Mutation durch Rückkreuzungen in
verschiedene genetische Maislinien eingeführt. Bei den reziprok durchgeführten
Rückkreuzungen wurde kein Unterschied für maternale oder paternale Herkunft der
Mutation festgestellt. Die Erzeugung von Doppelmutanten durch Kreuzung mit anderen,
ähnlichen Phänotypen dient zur Analyse der Interaktion verschiedener Gene. Dabei kann
es zu epistatischen, additiven oder neuartigen Phänotypen in der Doppelmutante
kommen. Die Doppelmutante von rum1 mit der bereits charakterisierten
Lateral¬wurzelinitiationsmutante lrt1 (HOCHHOLDINGER and FEIX, 1998) zeigte
einen neuartigen Phänotyp mit stark verkürzter Primärwurzel und fehlenden
Lateralwurzeln, was auf die Interaktion der betroffenen Gene hinweist. Da die
Zellelongation in dieser Doppelmutante nicht beeinträchtigt scheint, kann man daraus
schließen, dass die meristematische Aktivität in der Doppelmutante reduziert oder
gehemmt ist. Im Gegensatz zu dem neuartigen Phänotyp dieser Doppelmutante ist der
Phänotyp der Doppelmutante von rum1 mit der Kronwurzelinitiationsmutante rtcs (HETZ
et al., 1996) additiv. Die Merkmale der beiden Mutanten sind in der Doppelmutante
rum1/rtcs vereint, sie bildet also ausschließlich eine Primärwurzel, aber keine Seminal-,
Kron-, Stütz- oder Lateralwurzeln. Dies zeigt, dass die mutierten Gene unabhängig
voneinander wirken. Sowohl die Doppelmutanten rum1/lrt1 als auch die Doppelmutante
rum1/rtcs sterben nach dem Transfer ins Gewächshaus und sind nicht vermehrungsfähig.
Da ein langfristiges Ziel die Isolation des mutierten rum1-Gens sein wird, wurden in
dieser Arbeit Vorleistungen zur Klonierung des rum1-Locus erbracht. Zum einen wurden
homozygote rum1-Mutanten mit aktiven Mutatorlinien gekreuzt und 52.800 Keimlinge
der F1-Generation auf rum1-Phänotypen zur Identifizierung neuer rum1-Allele hin
durchsucht. Die dabei gefundenen acht Allele waren phänotypisch dem
Referenzmutantenallel gleich und wurden im Gewächshaus durch Selbstung vermehrt.
Zum anderen sollte eine Grobkartierung des Gens auf einem der 20 Chromosomenarme
von Mais zur Erleichterung der Klonierung beitragen. Dazu wurde die Mutante rum1 mit
BA-Translokationslinien gekreuzt, bei denen jeweils ein bestimmter Chromosomenarm
durch einen informationslosen Abschnitt eines B-Chromosoms ersetzt ist. Erscheint die
Mutation in der F1-Generation bei einer bestimmten Kreuzung, so kann man darauf
schließen, dass das mutierte Gen auf dem Chromosomenarm lokalisiert ist, der in der zur
Kreuzung eingesetzten Linie informationslos ist. So konnte bei der Mutante rum1 das
mutierte Gen durch Kreuzungen auf dem kurzen Chromosomenarm von Chromosom 1
lokalisiert werden. Eine detaillierte Charakterisierung der Mutante rum1 wird im
Manuskript in Kapitel 6.1.1 gegeben.
3.3 Transkriptomanalyse der perizykelspezifischen
Genexpression
Die Mutante rum1 ist in der Lateral- und Seminalwurzelinitiation gestört. Lateralwurzeln
werden durch Dedifferenzierung von Perizykelzellen und anschließen¬der Teilung dieser
Zellen während der postembryonalen Entwicklung initiiert. Zur molekularbiologischen
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Analyse der Mutante wurden mit Hilfe von Microarray-Hybridisierungen vergleichende
Transkriptomprofile von Perizykelzellen erstellt.
Zunächst wurden Versuche mit der Maisinzuchtlinie B73 durchgeführt, um die Technik
der Laser Capture Microdissection (LCM) auf pflanzliches Wurzelgewebe anzupassen,
und um die Genexpression im Perizykel im Vergleich zu den umliegenden
Nicht¬perizykelzellen zu untersuchen. Bei der Analyse der Genexpression in
Perizykelzellen 64 Stunden nach Keimung und somit kurz vor der ersten Zellteilung zur
Lateral¬wurzelinitiation sollten Gene, die an der Initiation der Lateralwurzeln beteiligt
sind, erfasst werden. Perizykelzellen können mittels LCM aus dem Gewebeverband
isoliert werden. Um das Genexpressionsmuster der Perizykelzellen im Vergleich zu den
Nicht¬perizykelzellen des Wurzelquerschnitts miteinander mittels Microarrayanalyse
vergleichen zu können, wurden für ein biologisches Replikat je mindestens 13.000
Perizykel- und Nichtperizykelzellen gesammelt. Diese hohe Anzahl an Zellen
berücksichtigt die Variabilität der Genexpression einzelner Zellen, zum anderen ist diese
Anzahl nötig, um genügend RNA zur weiteren Amplifikation der mRNA extrahieren zu
können. Sechs unabhängige biologische Replikate des Transkriptoms von Perizykel- und
Nichtperizykelzellen wurden durch entsprechende Amplifikation, Markierung mit
Fluoreszenzfarbstoffen und Hybridisierung von 12k cDNA Mais-Microarrays
miteinander verglichen. Die statistische Auswertung dieser Microarray-Experimente
ergab, dass 210 Gene im Perizykel differentiell stärker exprimiert sind. Hierbei wurde als
Grenzwert für differentielle Genexpression ein p-Wert von <0,01 und eine Änderung des
Expressionsniveaus von mindestens einem Faktor von 2 festgesetzt. 18 der differentiell
exprimierten Gene wurden mit Hilfe von quantitativen real-time PCR-Experimenten als
im Perizykel überexprimiert bestätigt. Die differentiell exprimierten Gene wurden nach
Homologievergleichen mit bereits bekannten Proteinen (Blastx-Analysen nach
ALTSCHUL et al., 1997) entsprechend der MIPS-Datenbank
(http://mips.gsf.de/proj/thal/db) in funktionelle Kategorien klassifiziert. Dabei waren 34%
Proteine mit unbekannter Funktion, 19% gehörten zur funktionellen Kategorie der
Proteinsynthese oder waren Proteine, die zur Synthese von Zellwandbestandteilen nötig
sind. Weiterhin wurden 14 Transkriptionsfaktoren und drei Gene, die mit der Reaktion
auf Auxin in Verbindung stehen, als präferentiell im Perizykel exprimiert identifiziert.
Dies gibt einen Hinweis darauf, welche Gene 64 Stunden nach Keimung spezifisch im
Perizykel aktiv sind, dort koordiniert exprimiert werden und deshalb möglicherweise
einen Einfluss auf die Lateralwurzelinitiation haben. Details zu dieser Analyse sind im
Manuskript im Anhang 6.1.2 gegeben.
3.4 Vergleichende Transkriptomuntersuchung von
Perizykelzellen der Lateralwurzelmutante rum1 mit dem
Wildtyp
Neben der Analyse von Genen, die im Perizykel stärker exprimiert sind als in den
umliegenden Zellen wurde die Kombination von LCM und anschließender MicroarrayHybridisierung angewandt, um die Genexpression im Perizykel von Wildtyp-Pflanzen
mit der Genexpression im Perizykel der Lateralwurzelmutante rum1 zu vergleichen.
Auch hier wurden mehr als 13.000 Perizykelzellen je biologischem Replikat vor
Initiation der Lateralwurzeln isoliert. 12k cDNA Mais-Microarraychips wurden mit vier
biologischen Replikaten hybridisiert. Von jeder Hybridisierung wurden drei Scans bei
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verschiedenen Lasereinstellungen angefertigt, die separat statistisch ausgewertet wurden.
163 Gene wurden als präferentiell im Wildtyp, 116 Gene als stärker im rum1-Perizykel
exprimiert ermittelt. Die höchste Scaneinstellung ergab dabei die größte Anzahl
differentiell exprimierter Gene (112 von 163 bzw. 64 von 116), die beiden niedrigeren
Scaneinstellungen gaben die zusätzlichen differentiell exprimierten Gene zu etwa
gleichen Teilen. Diese differentiell exprimierten Gene wurden ebenso mittels einer
Blastx-Analyse und der MIPS-Datenbank funktionell annotiert. Dabei zeigte sich, dass
fast ein Viertel der im Wildtyp-Perizykel überexprimierten Gene der Kategorie des
Metabolismus zugehören (22 von 90 annotierten Proteinen) und 19% der annotierten
Proteine mit der Transkriptionsregulation in Verbindung stehen. Diese im Wildtyp stark
vertretene funktionelle Proteinklassen ist im Perizykel der Mutante rum1 mit 6% der
annotierten Proteine eher unterrepräsentiert. Im Wildtyp liegt ein Netzwerk von
Transkriptionsfaktoren vor, das in der Mutante gestört ist. Diese scheinen zusammen mit
im Wildtyp gleichzeitig überexprimierten Zellzyklus-regulierenden Genen wichtig zu
sein, um schließlich die Bildung der Lateralwurzeln zu initiieren. Details zu dieser
Analyse sind im Manuskript in Kapitel 6.1.2 gegeben.
3.5 Analyse der Wurzelspezifität differentiell exprimierter Gene
Alle Gene, die bei den Microarrayexperimenten als differentiell exprimiert identifiziert
wurden, wurden einer MPSS (Massively Parallel Signature Sequencing)
Datenbankanalyse unterzogen. Die von der Firma DuPont bereitgestellte MPSSDatenbank ermöglicht, die quantitative Expression eines Gens in verschiedenen
Maisgeweben bzw. Entwicklungsstadien in silico zu analysieren (BRENNER et al.,
2000). Dabei wurde herausgefunden, dass elf der in der Inzuchtlinie B73
perizykel¬spezifisch exprimierten Gene zusätzlich überwiegend in Wurzeln exprimiert
werden. 13% (21/163) der Gene, die im Perizykel von Wildtyp höher exprimiert sind als
im Perizykel der Mutante rum1 und 5% (6/116) der Gene, die in der Mutante höher
exprimiert sind als beim Wildtyp wurden durch die MPSS-Daten als wurzelspezifisch
identifiziert. Dies wurde für ausgewählte Gene mittels Northern Blot Analyse bestätigt.
Die MPSS-Daten dienen als Grundlage für weitere Untersuchungen zur zusätzlichen
Bestätigung von wurzelspezifischen Genen, die vermutlich an der
Lateral¬wurzelinduktion beteiligt sind.
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4 DISKUSSION
Eine systematische Analyse des Maiswurzelsystems wurde aufgrund seiner komplexen
Organisation, seiner Variabilität und der schweren Zugänglichkeit erst kürzlich initiiert
(zusammengefasst in HOCHHOLDINGER et al., 2004a und 2004b). Über die genetische
Regulation der Vorgänge, die zur Bildung des komplexen Wurzelsystems führen, ist
bislang nur wenig bekannt. Die Isolation neuer Wurzel¬mutanten kann einen Beitrag zum
Verständnis der Regulation der Wurzelbildung leisten. Im Rahmen dieser Doktorarbeit
wurde die monogen, resessiv vererbte Maiswurzelmutante rum1 isoliert, die in der
Initiation von Seminal- und Lateralwurzeln gestört ist. Damit ist die Mutante rum1 die
erste bisher beschriebene Maiswurzelmutante, die phänotypisch sowohl in der späten
embryonalen als auch in der frühen postembryonalen Wurzelentwicklung beeinträchtigt
ist. Bei Arabidopsis wurde eine solche Mutante nicht beschrieben, da das einfache
Wurzelsystem von Arabidopsis, das ausschließlich aus der Primärwurzel und deren
Lateralwurzeln besteht, eine differenziertere Unterteilung in diese Entwicklungsphasen
nicht zulässt. Eine monogene Mutation, bei der sowohl die embryonale als auch die
postembryonale Wurzelentwicklung betroffen ist, bestätigt, dass die embryonalen und
postembryonalen Entwicklungsprogramme der Wurzelentwicklung ineinander greifen
(HETZ et al., 1996).
Die Doppelmutante von rum1 mit lrt1 (HOCHHOLDINGER and FEIX, 1998) zeigt
einen neuartigen Phänotyp auf. Doppelmutanten von rum1/lrt1 sind sehr klein und bilden
einzig eine stark verkürzte Primärwurzel. Die Zellorganisation in der Doppelmutante ist
nicht gestört, was darauf hinweist, dass die beiden Gene rum1 und lrt1 zusammen wirken
und einen Einfluss auf die meristematische Aktivität in der Primärwurzel haben. Die
Doppelmutante der beiden Lateralwurzel¬elongationsmutanten slr1 und slr2
(HOCHHOLDINGER et al., 2001) zeigt ebenfalls einen neuartigen Phänotyp der nicht
die additive Kombination der beiden einzelnen Mutanten widerspiegelt. Untersuchungen
der slr1/slr2-Doppelmutante führten zur Schlussfolgerung, dass die Gene slr1 und slr2 in
der Zellorganisation der Primärwurzel und der Lateralwurzelelongation zusammen
wirken (HOCHHOLDINGER et al., 2001). Im Gegensatz dazu weist die Doppelmutante
von rum1 und der Kronwurzelmutante rtcs (HETZ et al., 1996) einen additiven Phänotyp
auf, der sich dadurch auszeichnet, dass diese Pflanze weder Seminal- noch Lateral- und
Kronwurzeln bildet. Dies lässt darauf schließen, dass die Initiation von Kron- und
Stützwurzeln unabhängig von der Initiation der Lateralwurzeln ist, und dass sowohl das
rum1-Gen als auch das rtcs-Gen Einfluss auf die Initiation von Seminalwurzeln haben.
Dies bestätigt die bisherigen Untersuchungen, in denen alle Doppelmutanten der zuvor
isolierten Lateralwurzelmutanten lrt1 (HOCHHOLDINGER und FEIX, 1998), slr1 und
slr2 (HOCHHOLDINGER et al., 2001) mit rtcs einen additiven Phänotyp zeigten
(HOCHHOLDINGER et al., 2004b), was auf eine generelle Entkopplung der
sprossbür¬tigen von der Lateralwurzelbildung schließen lässt.
Es ist bekannt, dass exogen appliziertes Auxin Lateralwurzeln induziert (REED et al.,
1998). Bei der Mutante rum1 wurden jedoch durch exogen appliziertes Auxin keine
Lateralwurzeln ausgebildet. Zudem ist der Auxintransport in der Primärwurzel gehemmt,
welches auch die verzögerte gravitrope Reaktion erklärt, die durch lokal unterschiedliche
Auxinkonzentrationen gesteuert wird. Eine andere Maismutante, die auch im
Auxintransport beeinträchtigt ist, ist die Mutante semaphore1 (sem1) (SCANLON et al.,
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2002). Bei dieser Mutante ist im Gegensatz zu rum1 der Auxin¬transport im Mesokotyl
betroffen, was sich pleiotrop auf mehrere Merkmale auswirkt, unter anderem auf die
Ausprägung der Lateralwurzeln. So scheint sem1 im Gegensatz zu rum1 generell im
Auxintransport betroffen zu sein, während rum1 spezifisch im Auxintransport in der
Primärwurzel sowie in der Aufnahme des Auxinreizes und der entsprechenden
Umsetzung des Auxinreizes durch Bildung von Lateralwurzeln beeinträchtigt ist.
Übereinstimmungen durch Vergleiche zu bisher beschriebenen
Lateralwurzelinitiationsmutanten bei Arabidopsis lassen sich nur schwer finden. Eine bei
Arabidopsis bekannte Lateralwurzelinitiationsmutante ist die Mutante Slr (FUKAKI et
al., 2002). Das slr-Gen wurde kloniert und gehört zur Familie der Aux/IAA Proteine. Die
Transkription der Aux/IAA-Gene wird schnell durch Auxin induziert (THEOLOGIS et
al., 1985) und Aux/IAA-Proteine vermitteln ein auxinreguliertes Wachstum wie unter
anderem die Bildung von Lateralwurzeln. Deshalb ist es sehr unwahrscheinlich, dass das
rum1-Gen der Lateralwurzelinitiationsmutante bei Mais dem slr-Gen der
Lateralwurzelinitiationsmutante slr bei Arabidopsis entspricht. Die andere bisher
beschriebene Lateral¬wurzel¬initiations¬mutante bei Arabidopsis ist die Mutante alf4
(CELENZA et al., 1995). Es wird angenommen, dass das Protein ALF4 erst nach der
Auxinproduktion und dem Auxintransport funktionell aktiv ist und deshalb auch sehr
wahrscheinlich nicht mit rum1, die im Auxintransport beeinträchtigt ist, korrespondiert.
Daraus kann geschlossen werden, dass die Mutante rum1 in einer bisher unbekannten
Regulationsstelle der Lateral- und Seminalwurzelinitiation betroffen ist, die über den
Auxintransport und die Auxinperzeption reguliert wird. Eine endgültige Klärung der
Funktion des rum1 Gens wird jedoch erst nach dessen Klonierung möglich sein.
Auch bei anderen monokotylen Pflanzen mit komplexem Wurzelsystem wie Reis (Oryza
sativa L.) gibt es bislang nur wenige genetische und molekulare Informationen über die
Regulation der Lateralwurzelentwicklung (HOCHHOLDINGER et al., 2004a). Deshalb
ist es für das Verständnis der Wurzelentwicklung monokotyler Pflanzen von großer
Bedeutung, detaillierte molekulare Analysen der Wurzelbildung durchzuführen.
Die in dieser Arbeit durch Microarrayanalysen ermittelten Expressionsmuster von
Perizykelzellen im Vergleich zu Nichtperizykelzellen bzw. im Vergleich zum Perizykel
der Lateralwurzel¬initiationsmutante rum1 können Aufschluss darauf geben, welche
Gene vor der Initiation der Lateralwurzeln koordiniert exprimiert werden. Bei der
Trans¬kriptom¬analyse der Perizykelzellen im Vergleich zum umliegenden Gewebe war
die hohe Anzahl der Gene auffällig, die für ribosomale Proteine und Proteine, die an der
Translation beteiligt sind, kodieren (19% der annotierten Proteine). Dies zeigt, dass die
Proteinsynthese im Perizykel kurz vor der Lateralwurzelinitiation bedeutend höher ist als
in den umliegenden Zellen. Zusätzlich waren der Metabolismus (11% der annotierten
Gene) und die Produktion und Umsetzung von Zellwandkomponenten (41% der Proteine,
die zu den metabolismusrelevanten Genen gehören) über¬repräsentiert. Dies ist
konsistent mit der Tatsache, dass im Perizykel zur Lateral¬wurzelinitiation neue Zellen
etabliert werden müssen und dazu im Vergleich zu den umliegenden Zellen mehr
Zellwandmaterial produziert werden muss. Ferner ist bekannt, dass Auxin ein wichtiges
Signalmolekül bei der Initiation von Lateralwurzeln ist (HIMANEM et al., 2004).
Demzufolge liegt es nahe, dass im Perizykel Gene, die an der Umsetzung des Auxinreizes
beteiligt sind, höher exprimiert sind als in den umliegenden Zellen. Differentiell im
Perizykel exprimiert waren der Transkriptionsfaktor ARF1 (ULMASOV et al., 1997),
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eine AUX1-ähnliche Permease (HOCHHOLDINGER et al., 2000) und ein Ubiquitin
konjugierendes Enzym (GRAY and ESTELLE, 2000). Von allen drei Genen ist
beschrieben, dass sie in die Auxinantwort involviert sind.
Bei dem Vergleich des Expressionsmusters der Perizykelzellen des Wildtyps mit dem der
Mutante rum1 wurden 163 Gene als stärker im Wildtyp, 116 Gene als stärker im rum1Perizykel exprimiert ermittelt. Für diese Analyse wurden drei Scans mit ver¬schiedenen
Scannereinstellungen durchgeführt (ROMUALDI et al., 2003). Dies erwies sich als
hilfreich bei der zusätzlichen Identifizierung von differentiell exprimierten Genen. 24%
der annotierten Gene, die im Perizykel des Wildtyps überexprimiert sind, sind der
Kategorie des Metabolismus zuzuordnen. Diese Klasse ist auch im Perizykel von rum1
am stärksten repräsentiert (16%), wobei hier keine funktionelle Kategorie gegenüber den
anderen Kategorien auffallend herausragt. Augenscheinlich ist die Diskrepanz zwischen
Wildtyp und rum1-Perizykel in der Anzahl differentiell regulierter Gene, die Proteine für
die Transkriptionsregulation kodieren (19% im Wildtyp gegenüber 6% in rum1).
Transkriptionsfaktoren regulieren die differentielle Genaktivität, die eine entscheidende
Rolle für unterschiedliche Entwicklungsvorgänge in der Pflanze spielt (Birnbaum and
BENFEY, 2004). Die Vermutung liegt nahe, dass die hohe Anzahl an
Transkriptionsfaktoren, die im Wildtyp überexprimiert und damit in der Mutante rum1
weniger stark exprimiert sind, ausschlaggebend ist, um zahlreiche Gene zu aktivieren, die
schließlich die Bildung der Lateralwurzeln hervorrufen. Besonders zu erwähnen ist hier
ein SCARECROW ähnliches Protein, von dem bekannt ist, dass es wesentlich zur
Bestimmung des Wurzelradialmusters beiträgt (LIM et al., 2000). Ebenso sind zwei ßHelix-Loop-Helix Proteine überexprimiert, die für die Kontrolle der Zellvermehrung und
zur Entwicklung von zelltypspezifischen Ab¬stammungen verantwortlich sind (HEIM et
al., 2003). Sowie das Protein ZmMET, von dem bekannt ist, dass Trankripte dieses Gens
spezifisch in sich aktiv teilenden Zellen von Meristemen akkumulieren (STEWARD et
al., 2000).
Mit Hilfe der MPSS-Datenbankanalyse kann auf perizykel- und wurzelspezifische Gene
geschlossen werden. Durch diese zusätzliche Information über die Wurzelspezifität wird
die Fokussierung auf die Gene erleichtert, die tatsächlich an der Lateral¬wurzelinitiation
beteiligt sein könnten. Mit diesen Informationen können ausgesuchte Gene des Weiteren
zum Beispiel zur Identifizierung von Mutanten der entsprechenden Genloci mit Hilfe des
revers genetischen TUSC-Systems (Trait Utility System of Corn) einge¬setzt werden.
Die genauere Untersuchung der gefundenen Knock-out Mutanten sowie die aufwendige
Klonierung des rum1-Gens, die in dieser Arbeit aus Zeitgründen nicht durchgeführt
werden konnten, können zum besseren Verständnis des molekularen Netzwerks der
Lateralwurzelinitiation bei Mais beitragen.
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6 ANLAGEN
6.1 Publikationen mit direktem Bezug zu dieser Arbei
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7 LEBENSLAUF
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