Prevalence of exposure and infection of Lawsonia intracellularis

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Prevalence of exposure and infection of Lawsonia intracellularis among
slaughter-age pigs
H. M. J. F. van der Heiden et al.
Research in Veterinary Science 77, 2004, 197-202
Serologie
%
PCR KolonInhalt
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PCR
Mukosa
%
Immunohistochemie
%
SilberFärbung
%
Histopathologie
%
Sektion
%
Tage nach
Diagnose
Anzahl
getester
Schweine
Herden Typ
und Nummer
Eine Fall-Kontroll-Studie bei schlachtreifen Schweinen in Holland wurde durchgeführt, um die
natürliche Verbreitung von L. intracellularis darzustellen und verschiedene Nachweismethoden zu
vergleichen. Insgesamt wurden pro Betrieb 40 Tiere post mortem untersucht aus sechs Betrieben, in
denen kürzlich PHE diagnostiziert wurde und aus sechs Betrieben, bei denen keine Hinweise für das
Vorkommen von Lawsonien bekannt waren. Zur Diagnose wurden folgende Tests durchgeführt:
Serologie, Sektion, HE- und Warthin-Starry Silber-Färbung, Lawsonia-spezifische indirekte
Immunohistochemie des Ileums und PCR der Ileum-Schleimhaut und von Kolon-Inhalt.
In den Fallherden konnten 59% serologisch positive Tiere gefunden werden, während in den
Kontrollherden 26% der getesteten Tiere seropositiv waren. Mittels Immunohistochemie konnten in
57% der getesteten Fall-Tiere Lawsonia-Antigen in der Ileum-Schleimhaut nachgewiesen werden
während in 46% der Kontroll-Tiere ebenfalls Lawsonia-Antigen gefunden wurde.
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Tabelle 1: Prozentzahlen der positiv getesteten Schweine für PHE in Kontrollherden (K) und
Fallherden (F).
Mittels Silberfärbung und PCR der Gewebeproben des Ileums und Koloninhalt konnten nur wenige
Tiere aus den Fallgruppen positiv getestet werden. Da sowohl die Serologie als auch die
Immunohistochemie als sehr spezifisch gelten wurde aus den Resultaten geschlossen, dass die
Mehrheit von holländischen Mastschweinebeständen L. intracellularis-infizierte Tiere beherbergen. In
manchen Herden führt dies zu Ausbrüchen von akuten hämorrhagischen Enteropathien während sich
in anderen Herden keine klinischen Symptome ausbilden.
Viele der seropositiven Tiere in den Herden ohne klinische Symptome präsentierten mittels
Immunohistochemie Lawsonia-Antigen, jedoch nicht an den dafür üblichen Stellen (im apikalen
Zytoplasma) sondern vor allem in der supranukleären Region der Enterozyten in den Krypten oder im
Zelldetritus. Die Autoren stellten die Hypothese auf, dass diese gesunden Schweine zu einem
früheren Zeitpunkt Lawsonien ausgesetzt waren und einige lebende oder tote Bakterien im Darm
persistierten. Es war nicht möglich diese Tiere als von einer Infektion erholt, subklinisch oder
Ersteller : Riccarda Ursprung
Datum : 06.05.05
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chronisch infiziert zu deklarieren. Die Rolle diese Tiere für das Fehlen oder die Ausbildung einer
Herdenimmunität ist noch unklar.
Die Autoren schlossen aus den Untersuchungen, dass die Serologie und die PCR von Kotproben ante
mortem am besten zur Diagnostik geeignet sind. Als Screening Methode für eine Lawsonia-Infektion
bei der Sektion wird die Immunohistochemie der Ileum-Schleimhaut empfohlen.
The influence of diet on Lawsonia intracellularis colonization in pigs upon
experimental challenge
H. T. Boesen et al.
Veterinary Microbiology 103, 2004, 35-45
In diesem Versuch wurde der Einfluss verschiedener Fütterungsstrategien auf eine L. intracellularisInfektion getestet. Insgesamt wurden 144 abgesetzte Jager mit fünf verschiedenen Diäten gefüttert,
welche alle auf einer Standardzusammensetzung beruhten. Im Standardfutter dienten Weizen und
Gerste als Kohlenhydratquelle und Sojabohnen als Proteinquelle. Es wurde fein gemahlen (2mm) und
pelletiert verfüttert. Als Varianten wurde das Standardfutter fermentiert und als Flüssigfutter
eingesetzt. Dazu wurden in einem 80 l Tank das Standardfutter und Wasser im Verhältnis 1:2.5 unter
ständigem Umrühren während 3-4 Tagen bei 24°C fermentiert. Anschliessend wurde immer ein Viertel
des Tankes zur Fütterung verbraucht und wieder mit der gleichen Mischung aufgefüllt. Als weitere
Variationen wurde das Standardfutter mit 1.8% Fumarsäure oder mit 2.4% Milchsäure versetzt. Als
letzte Möglichkeit wurde das normale Standardfutter grob gemahlen (5mm) und nicht pelletiert
ausgetestet. Alle Diäten wurden ad libitum zur Verfügung gestellt. Nach einer Adaptationszeit von
einer Woche an das Futter wurden 24 Tiere aus jeder Gruppe per oral mit L. intracellularis infiziert und
anschliessend die Wachstumsrate (Gewichtsmessung alle 7 Tage) und die fäkale Lawsonia-Exkretion
(Probenentnahme alle 2-3 Tage, Nachweis mittels real time PCR) überwacht. Die 24 Tiere der
Kontrollgruppe wurden mit dem Standardfutter versorgt und nicht mit Lawsonien infiziert. Die
Versuchstiere wurden 4 oder 5 Wochen nach erfolgter Infektion getötet. Mittels Immunohistochemie
wurde Lawsonia-Antigen im Ileum nachgewiesen. Die Schweine in den infizierten Gruppen schieden
alle Lawsonien aus. Das fermentierte Flüssigfutter verzögerte die Lawsonien-Ausscheidung. Während
in den anderen Gruppe eine Ausscheidung bereits 6 Tage nach erfolgter Infektion nachgewiesen
werden konnte schieden die Tiere aus der Gruppe mit der fermentierten Flüssigfütterung erst nach 10
Tagen Lawsonien aus. Auch konnte mittels dieser Fütterungsvariante die signifikant verkürzt werden.
Als mögliche Erklärung wird angeführt, dass durch die Fermentierung der pH-Wert im Magenfutterbrei
auf 4-5 abgesenkt wird und eine Reduktion der coliformen Keime im gesamten Gastrointestinal-Trakt
erfolgt. Der pH-Wert des Futters scheint das Überleben der Lawsonien zu beeinflussen und somit
auch die Dauer der Ausscheidung. Zusätzlich enthält das fermentierte Futter einen hohen Anteil an
Laktobazillen und eine hohe Konzentration von Milchsäure was zu einer Hemmung der LawsoniaKolonisierung führen könnte.
Die Fütterung mit dem 2.4%igen Milchsäuregehalt führte zu verminderten pathologischen Läsionen
(Verdickung und Fältelung) an der Darmschleimhaut. Es wird vermutet, dass durch die pH-Absenkung
im Futterbrei ebenfalls eine Reduktion der Lawsonien stattgefunden hat und somit weniger Schaden
angerichtet werden konnte.
In einer früheren Untersuchung (Stege et al., 2001) wies man darauf hin, dass in Betrieben, die ihr
Futter selber mischen weniger häufig Lawsonia-Infektionen vorkommen. Da diese Futter meist in grob
gemahlener, nicht-pelletierter Form zur Verfügung gestellt werden, wurde in diesem Versuch ein
ebenso zubereitetes Standardfutter verwendet. Es konnten jedoch keine Einflüsse auf eine Infektion
festgestellt werden.
Die Wachstumsrate bei allen Gruppen, die mit Lawsonien infiziert wurden war reduziert. Nur wenige
infizierte Jager zeigten Durchfall, dies galt auch für die Tiere, die Lawsonien ausschieden.
Unterschiede in der Wachstumsrate zeigten sich erst 2 Wochen nach erfolgter Infektion. Die Werte
waren jedoch nur für die Fütterung der infizierten Gruppen mit dem Standardfutter und der
fermentierten Flüssigfütterung signifikant gegenüber der Kontrollgruppe.
Ersteller : Riccarda Ursprung
Datum : 06.05.2005
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Futterbestandteil
Weizen
Gerste
Geschältes Sojabohnenmehl
Rapsmehl
Sonnenblumenmehl
Tierische Fette
Kalziumcarbonat
Dikalziumphosphat
Natriumchlorid
L-Lysin, 40%
Vitamin und MineralstoffPrämix
DL-Methionin, 40%
Threonin, 50%
Menge (g/kg)
360.8
360.7
122.9
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0.8
Tabelle 2: Futterzusammensetzung des Standardfutters
Stege et al. Risk factors for intestinal pathogens in Danish finishing pig herds. Prev. Vet. Med. 50,
2001, 153-164.
Routine diagnostics of Lawsonia intracellularis performed by PCR, serological
and post mortem examination, with special emphasis on sample preparation
methods for PCR
M. Jacobsen et al.
Veterinary Microbiology 102, 2004, 189-201
Die Proliferative Enteropathie ist eine wichtige und weit verbreitete Erkrankung der Schweine. Bisher
wurde die Diagnose meist durch Sektion mit intrazellulärem Erregernachweis gestellt. Die Entdeckung
eines monoklonalen Antikörpers erlaubte jedoch die Entwicklung eines Immunfluoreszenz-Tests, der
es erlaubt den Organismus sowohl in Gewebsproben als auch im Kot nachzuweisen. Es stellte sich
jedoch heraus, dass die Sensitivität im Kot gering ist. Weiters wurde eine serologische Methode
entwickelt, welcher eine hohe Sensitivität und Spezifität zugesprochen wird. 1993 wurde eine
verschachtelte PCR zum Erregernachweis im Kot und im Darmgewebe entwickelt. Auch bei diesem
Test wurde eine hohe Spezifität festgestellt, über die Sensitivität im Kot wurden jedoch
unterschiedliche Aussagen getätigt. Negativen Einfluss auf die Test-Sensitivität können verschiedene
biologische Kotkomponenten haben, welche z.B. die DNA-Polymerase inaktivieren, Nukleinsäuren
degradieren oder mit der Zelllyse interagieren.
Zweck dieser Arbeit war es, geeignete Methoden für die Probenvorbereitung beim LawsonienNachweis zu finden.
Der Versuch wurde in drei Schritten durchgeführt:
1. Eine Methode zur Gewebevorbereitung für eine anschliessende PCR wurde ausgetestet.
2. Sieben verschiedene Methoden für die Präparation von Kotproben und vier verschiedene
DNA-Polymerasen wurden in einfachen oder verschachtelten PCR ausgetestet. Als Kontrolle
wurde gleichzeitig ein Mimic-Molekül1 mitgeführt.
3. Gewebe- und Kotproben wurden histopathologisch und mittels PCR untersucht und
Blutproben wurden serologisch getestet.
Der Nachweis von Lawsonia intracellularis in präpariertem Gewebe mittels PCR zeigte eine gute
Spezifität und korrelierte gut mit den Läsionen, die bei der Sektion gefunden wurden. Die Sensitivität
in Gewebe-Proben lag bei 101-102 Mimic-Molekülen pro Tube. In den Kotproben lieferte die
verschachtelte PCR von gekochten Lysaten die besten Resultate mit einer Sensitivität von 10 2-103
Mimic-Molekülen pro Tube. Wegen der zeitintensiven Durchführung und der Kontaminationsgefahr
aber ist ein kommerziell erhältlicher Test diesem Verfahren vorzuziehen, obwohl eine leichtgradig
geringere Nachweisrate bei subklinisch infizierten Tieren festgestellt wurde. In manchen Fällen
stimmten die Resultate der Serologie nicht mit den Resultaten der Sektionen und PCR-Tests überein.
Ersteller : Riccarda Ursprung
Datum : 06.05.2005
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Gemäss dieser Studie ist die beste Methode für den Erregernachweis in Jagern mit akuter Enteritis
PCR in Kot- oder Gewebeproben. Die Serologie hat den Nachteil, dass AK erst 2 Wochen nach
erfolgter Infektion nachgewiesen werden können. Der Nachweis von AK weist wohl auf einen Kontakt
zum Erreger hin, ist aber nicht unbedingt mit klinischen Erkrankungen verbunden. Will man jedoch die
Präsenz der Erreger in einer Herde nachweisen eignen sich PCR-Tests von wiederholt gesammelten
Kotproben von ausgesuchten Tieren oder Serologie oder beides.
1 Mimic-Molekül:
Das Mimic-Molekül wird als interner Standard im gleichen Tube amplifiziert wie das
Ziel-Molekül (DNA). Es besteht aus einem heterogenen DNA-Fragment, welches von den gleichen
Primer flankiert wird wie die Ziel-DNA. Durch den Einsatz von Mimic-Molekülen können falschnegative Resultate erkannt werden.
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In den holländischen Mastbetrieben konnten sowohl in Fall- als auch in
Kontrollgruppen ohne klinische Anzeichen für Lawsonien-Infektion mittels Serologie
und Immunohistochemie positive Tiere nachgewiesen werden.
Die Resultate zeigen, dass auch Tiere in einer späten Mastphase noch mit Lawsonien
infiziert werden können.
Bei Tieren der Kontrollgruppe wurde Lawsonia-AG nicht an den üblichen Stellen (im
apikalen Zytoplasma der proliferativen Epithelzellen) nachgewiesen, sondern in der
supranukläeren Region.
Es wird die Hypothese aufgestellt, dass diese klinisch gesunden Schweine zu einem
früheren Zeitpunkt Lawsonien ausgesetzt waren und tote und lebende Bakterien im
Intestinaltrakt verbleiben. Diese Tiere könnten eine wichtige Rolle in der Reaktivierung,
Exkretion und Reinfektion in einer Herde spielen.
PCR von Kotproben oder Darminhalt hatte die gleiche Sensitivität wie die histologische
Untersuchung von Ileumproben mittels Silberfärbung.
Serologie und PCR von Kotproben werden für die ante mortem Diagnostik empfohlen.
Post mortem wird die immunohistochemische Untersuchung von Ileum mittels
monoklonalen Antikörpern vorgeschlagen.
Mittels Fütterung eines fermentierten Standardfutters an Absetzjager konnte die
Ausscheidung von Lawsonien nach erfolgter Infektion um 2-4 Tage verzögert werden.
In den verschiedenen Diätgruppen variierte die Ausscheidungsdauer von 11.7-15.6
Tage. Mittels fermentierter Flüssigfütterung konnte die Dauer signifikant verkürzt
werden.
In der Gruppe mit 2.4%igem Milchsäurezusatz konnten keine pathologischen
Veränderungen der Darmschleimhaut festgestellt werden.
Absenkung des pHs des Darminhaltes und das Vorhandensein von Laktobazillen
scheinen die Vermehrung und Festsetzung von Lawsonien zu hemmen.
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Datum : 06.05.2005
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