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1. Nennen sie HPLC-Detektoren, welche sie für die Spurenanalytik einsetzen
können. In welchem Konzentrationsbereich liegen bei diesen Detektoren
typischerweise die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen? Welche Eigenschaften
(chemische Strukturen) müssen die Analyte besitzen, um mit diesen genannten
Detektoren bestimmbar zu sein?
Fluoreszenz Detektoren
Messen das nach Anregung der Analyt-Moleküle von diesen emittierte
Licht. Die Anregung erfolgt über De oder Xe Lampen. Durch eine zweimalige
spektrale Zerlegung kann man sowohl die λdes anregendem Lichtes als auch die
des emittierten Lichtes einschränken und auswählen. Das trägt zu einer hohen
Selektivität dieser Methode bei.
Iem= Io* ελ * l * c * Φ λ
Diese Methode eignet sich zum Einsatz von Lasern und ist für Kapilartechniken
von Bedeutung. Vorteile: hohe Empfindlichkeit
Hohe Selektivität
Begrenzungen: Bei Gradientenelution muss das Lösung frei von
fluoreszendierenden Verunreinigungen sein
LLOD [ng] 0,01
[ppb] 0,1
Viele Substanzen, die keine Fluoreszenz zeigen, können über einem
chemischen Derivatisierungsschritt mit einer fluoreszierenden Gruppe
(fluorophor) versehen werden oder in eine fluoreszierende Verbindung
umgewandelt werden. Dieses verfahren wird eingesetzt zur Detektion von
Aminen und Aminosäuren.
Elektrochemische Detektoren
Oxidieren, bzw. reduzieren leicht oxidierbare, bzw. reduzierbare
Substanzen und messen die dabei fliessenden Strom. Meistens werden
amperometrische Detektoren eingesetzt, die bei einer vorgegebenen Spannung
die Stromstärke messen. Der Spannungsbereich liegt zwischen -1,2V und +1,2V.
Wichtige Anylytgruppen, die auf diese Weise detektiert werden sind:
Phenole, Halogen-, Nitro- und Azoverbindungen und einige Amine.
Vorteile: sehr empfindlich
Selektiv
Nachteile: mobile Phase muss leitfähig sein  flüssig, wenn die Arbeitselektrode
kathodisch gepollt ist, muss aus der mobile Phase das O 2 entfernt werden.
Änderungen an den Elektroden Oberflächen verändern die Empfindlichkeit der
Detektoren und erfordern eine häufigere Nachstandardisierung
tLOD [ng] 0,1
[ppb] 1
Bei UV-, Leitfähigkeits- und Massenspektrometern reicht die
Empfindlichkeit für Spurenanalytik meistens nicht aus. Daher werden sie nicht
eingesetzt.
FR.8 UV Detektoren haben für Spurenanalytik zu geringe Empfindlichkeit
(10-100ppb Bereich). Fluoreszenzdetektoren sind besser dafür geeignet, ca. um
einen Faktor 100 Empfindlicher als UV-Detektoren, auch ihre LOD ist um einen
Faktor 100 tiefer. Z.B. Verunreinigungen im Trinkwasser im 0,1 ppb-Bereich
damit detektierbar. Es ist nicht gut geeignet für hohe Konzentrationen: man
bekommt in diesem Bereich kein Linearität mehr. Analyte müssen fluoreszierend
sein, die meisten sind das nicht von selbst. Durch chemische Modifikationen.
Analyte werden zuerst angeregt, 8geht sehr gut wenn mehrere Doppelbindungen
hintereinander liegen, Einzelstehende DB nur mit viel Energie anregbar), dann
wird das emittierte Licht gemessen.
Φ λ gibt an wieviel der in Form von Licht adsorbierten R auch wieder als
Licht emittiert wird. Gut fluoreszierende Verbindungen haben ein Φ λ von ca. 1.
Zucker und Alkane könne mit Fluoreszenz nicht nachgewiesen werden, da sie
keine Doppelbindungen und kein Pi-Elektronensystem besitzen.
Es gibt auch die Möglichkeit statt normaler Xe oder D-Lampen Laser
einzusetzen  Laser induziert Fluoreszenz. Manchmal um den Faktor 10-100 as
normale Fluoreszenzdetektoren. Vorteile der Laser: monochromatisches Licht,
kein Streulicht.
- Beschränkt Laser – Induced – Fluoreszenz einerseits, anderseits dadurch
jedoch hohe Selektivität.
-
Massenspektrometern mit ESI- Ionisation 0,1-1ppB Konz.Bereich
2. Erklären Sie das Prinzip von Ionenaustausch- und von Reversed-Phase
Chromatographie.
Welche Wechselwirkungskräfte sind dabei jeweils dominierend. Wie können Sie
deren Stärke durch die mobile Phase beeinflussen? Wie wirken "modifier" in der
mobilen Phase?
Ionenaustausch Chromatographie
Oberflächen mit immobilisierten geladenen Gruppen können in wässrigen
Elementen als Anionen- oder Kationenaustauscher eingesetzt werden. Die
statische Phase besteht aus einem Grundträger = Silica, PSIDV8 an den
geladene Gruppen immobilisiert sind.
Immobilisierte Gruppe: -NH3+ , -NRxH+, -NR3+ , -BR-, -COO -, -SO3 Die geladenen Ionen verstärken die Konkurrenz mit dem Analyten um die
geladenen Adsorptionsplätze. Dadurch sinkt k i’ bei Erhöhung der Puffer-, bzw.
Salzkonzentration und el. Ionenstärke.
k i’ wird von der Ladung der Wechselwirkungspartner beeinflusst. Die
Ladung wird durch den α bestimmt. α ist abhängig von pH- und pKa-Werten.
Formule:
Der pH-Wert bestimmt, wie viel Prozent der Moleküle zu einem Zeitpunkt als
Ionen vorliegen und daher als Austauschergruppen wirksam werden können
Statische Phase: immobilisierte geladene Gruppe
Mobile Phase: Hauptkomponente = Wasser, Modifier = MeOH, EtOH 20-50%
Hauptparametern = pH, Pufferkonzentration.
Reversed-Phase Chromatographie
Adsorbens: unpolar, OS oder ODS
Unpolare stationäre Phase, z.B. PS/DVP – Kopoplymere.
Mobile Phase: polar, Wasser + Modifier (EtOH, MeOH, Acetonitril, THF) 40-80%
Die Zugabe der weniger polaren organische Kompponentenzum Wasser
verbessert die Solvatation der Analyte in der mobilen Phase
Bei der Derivatisierung des Grundsilicas gelingt es nicht alle SiOH -Gruppen zu
derivatisieren. Es bleiben „Rest-Silvandgruppen“, dadurch kommt es zu einer
starken Adsorption von basischen Analyten. Sie sind die Ursache, dass bei
basischen Analyten oft „Peak-Tailing“ beobachtet wird. 0,1-0,2% Triethylamin!!
α beeinflusst die Verteilung von sauren und basischen Analyten. α bestimmt die
Ladung der Analyte. Diese ist dafür entscheidend, wie gut der Analyt in der
mobilen Phase solvatisiert wird.
Haupt Parametern: %Modifier, pH
Auch polare Wirkung der mobilen Phase finden unopolare Strukturen der
Statistische Phase und der Analyt-Moleküle zusammen.
 WWK zw. Analytmolekülen und stat. Phase = hydrophob, bewirken Retention
WWK zw. hydrophoben Str
3) Beschreiben Sie möglichst detailliert und in Einzelschritten, wie Sie bei der
Kalibrierung mit Internem Standard im Fall einer Chromatographischen Analyse
vorgehen. Wie erhalten Sie die Kalibrierfunktion und wie verwenden Sie diese?
Welche Fehler können Sie mit diesem Verfahren minimieren?
Kalibrierung mit internem Standard
Dabei wird allen Analyt-Standardlösungen und der Probe eine Substanz (interne
Standard IS) in bekannter und konstanter Menge zugesetzt. So kann man vor
allem Schwankungen im Injektionsvolumen korrigieren.  Reduktion stat. Fehler
Nachteil: Die Probe wird durch den Zusatz von IS komplexer, daher gilt:
- Der IS soll in der Nähe zum Analytpeak eluiert werden, darf aber mit
keiner Probenkomponente Peaküberlappung zeigen
- Es soll dem Analyt chemisch ähnlich sein
- Es darf keine Zersetzung zeigen während der Trennung
Vorgangsweise:
- IS wird den verschiedenen Analyt-Standardlösungen in bekannten und
konstanten Menge zugefügt.
- AI/AIS Werte messen
- Kalibrierungsfunktion einstellen
- IS in der Probe zufügen in gleicher Menge wie dem Analyt Standards
- IS/AIS Wert in der Probe messen.
Man kann eine sehr hohe Präzision erreichen. Man kann zum Teil auch subtile
Fehler in der Probenvorbereitung korrigieren. Dabei ist die Auswahl der IS
sehr wichtig.
(4) Diskutieren Sie folgende allgemeine chromatographische Trennparameter:
Selektivität
Effizienz
Auflösung = dissolution, Resolution
Selektivität: Wie genau lässt mit dieser Methode die gewünschte Substanz
heraustrennen (herausselektieren)
Effizienz: Trennenstuffenzahl
Auflösung: Ist die charakteristische Größe, die das Ausmaß der Trennung zweier
chromatographischen Peaks beschreibt.
(5) Diskutieren Sie das Konzept der Beweglichkeit oder Mobilität (bes. die pH
Abhängigkeit) von Ionen
Repräsentiert die Wanderungsgeschwindigkeit bei einer angelegten Feldstärke.
Da. die Ionenbeweglichkeit jene Eigenschaft ist, die auch das Trennverhalten
bestimmt.
Ionen werden nicht durch Chromatographie sondern durch Elektrophorese
getrennt.
Mobilität: µ i=u i/E
Mobilität typischer Ionen (Cl, Mg, Co, K) liegt zwischen 20 und 80.10 -9m2 / Vs
Chloridionen 80  gehören zu den mobilsten Ionen überhaupt. Ionen
werden durch Ionenelektrophorese getrennt.
Man unterscheidet starke Elektrolyte (permanente Ionen), die immer
ionisch sind, von schwachen Elektrolyten (ionogene Verbindungen), die von sich
aus nicht ionisch sind, aber zu Ionen getrennt werden können. Bei schwachen
Elektrolyten ist Mobilität von Diss.Grad abhängig.
Der Dissoziationsgrad (z.B. eines schwachen Säure wie Essigsäure) ist abhängig
vom ph-Wert
Bsp. Eisessig. Besteht nicht aus Ionen und hat somit keine Leitfähigkeit. Es
bewegt sich bei Elektrophorese nicht. Gibt man aber Eisessig in Wasser, reagiert
es mit diesem
Essigsäure ist an sich keine Säure, sondern wird erst dann wenn sie Partner hat.
Bringt man Essigsäure in el. System, wandert Ac- und HAC bleibt zurück, da
keine Ladung. Umso mehr AC- vorliegen, umso größer ist Diss. Grad. Und umso
größer wird auch µi eff
Die AC-Konzentration ist nun pH-Wert abhängig
Arbeitet man im basischen bereich Essigsäure vollständig dissoziert,
hohe Mobilität
Sauren Bereich  Essigsäure kaum bis nicht dissoziert,
sehr niedrige bis keine Mobilität
Für eine schwache Base ist es genau umgekehrt:
Mobilität von Ionen ist abhängig von:
ihre Größe
ihrer Form
ihrer Ladung
Stärke des elektrisches Feld ( wenn angelegte Spannung sehr hoch ist,
wandern die Ionen auch schnell)
Aufgrund der Eigenschaften des unterschiedlichen Ionen ist eine Trennung
möglich.
(6) Beschreiben Sie jene elektrophoretische Trennmethode, welche speziell zur
Trennung von potentiellen Zwitterionen verwendet werden kann.
Isoelektrischer Fokussierung:
Auftrennung nach Ladung. Isoelektrischer Punkt: pH bei dem eine Substanz
keine Nettoladung hat und sich nicht bewegt. pH Gradienten aufbauen (z.B.
durch Auflegen eines elektrischen Feldes). Ampholyten wandern bis sie zu dem
pH kommen, bei dem ihre Ladung aufgehoben wird. Sie bleiben dort stehen:
Trennung.
Zwitterionen (Proteine, Aminosäuren) können durch isoelektrisches
Fokussieren getrennt werden. Man verwendet hier Puffer, der linearisiertem pHGradienten folgt. Zwitterionen können positiv, negativ oder neutral geladen
werden
Bsp.: AS
Beim isoelektrischen Punkt kompensieren sich die Ladungen  Zwitterion
wandert bei Ep. Nicht.
A- und B+ bei pH6
eingebracht. Beide werden
solange wandern bis sie pH
wert erreicht haben, das pI
identisch ist  dort werden
sie stehenbleiben
ist z.B. pI A=4  A- wandert bis zu pH4, ist dort neutral
pIB=8  B+ wandert bis zum pH8
Nun müsste jedoch Diffusion stattfinden und Ionen immer breiter werden. Wenn
A von pH4 nach links diffundiert wird es positiv geladen  minus Pol zieht es
wieder an, und fokussiert es wieder in pI. pH Gradienten wirken also der
Diffusion entgegen
 solange Spannung angelegt ist, bleibt A bei 4 und b bei 8 fokussiert
Das gilt aber nur für Analyte, die potentiell Zwitterionen bilden können.
Trennung von Proteinen durch isoelektrische Fokusierung erfolgt durch die
unterschiedlichen Ladungen in den Seitenketten.
7. Zwei Säuren Al und A2 besitzen die pKa Werte 3.5 und 4.5, resp. Sie sollen an
einem starken Anionenaustauscher getrennt werden. Beide Säuren werden im
nicht-dissoziierten Zustand an dieser Säule nicht retentiert, im komplett
dissoziierten Zustand haben sie die Kapazitätsfaktoren von 3 und 4, resp. Bei
welchen pH Werten können Sie diese Säuren mit der genannten Säule trennen?
Zeichnen Sie die Graphen k vs. pH für beide Säuren und die Chromatogramme,
die Sie bei pH 2, 4 und 6 erwarten. Wählen Sie in dieser Zeichnung für tRO
jeweils die Länge von 1 cm
8. Zeichnen Sie vergleichend (und unter näherungsweiser Berücksichtigung der
zu erwartenden jeweiligen Peakbreiten) die Chromatogramme, die Sie für die
Trennung zweier Verbindungen (die in vergleichbarer Menge vorliegen und mit
vergleichbarer Empfindlichkeit detektiert werden ) unter folgenden Bedingungen
erhalten:
(a) RP-HPLC k1 =2, k2 = 4, isokratische Elution bzw. unter Einwirkung eines
Eluens-Gradienten
(b) Affinitäts-Chromatographie: typische Elutionsbedingungen
(c) Größenausschluß-Chromatographie (SEC) Verbindung 1 besitzt sehr niedriges
Molgewicht, Verbindung 2 ein sehr hohes Mw.
Wählen Sie in den Zeichnungen (a) und (b) für tRO die Länge von 1 cm, in
Zeichnung (c) die Länge von 4 cm.
a) Rp-HPLC k1=2, k2=4
Isoelektrischer Elution
Mit der Zeit werden Peaks immer kleiner und die Auflösung immer schlechter, da
Ki immer größer wird und die Komponenten die Später eluieren länger retentiert
werden. Das kann durch Gradientenelution verhindert werden.
Gradientenelution
Dadurch dass man Modifierkonzentration mit der Zeit immer mehr erhöht, wird
Ki der Komponenten immer kleiner  dadurch verschlechtert sich die Auflösung
mit der Zeit nicht, und Peaks werden immer ungefähr gleich groß.
b) Affinitätschromatographie = ja/Nein Chromatographie. Stoffe werden
damit angereichert.
Man immobilisiert Liganden an einer Oberfläche. Liganden sind größere
Moleküle wie Lektin, Farbstoffe, Proteine, Hormone, Kohlenhydrate. Das Analyt
bildet stark WWK mit Liganden aus, da zu beginn Ki sehr groß gewählt ist.
Bindungskonstante K: 10 4 -109
= Bioaffine WWK  sehr stark
Zu beginn kommt alles, das nicht affin. Gebunden ist in einem Peak =
Durchlauf. Ist dieser großes Peak vorbei, werden die Elutionsbedingungen stark
verändert, sodass die affine Bindung geschwächt wird und auch die vorher affin.
Gebundene Moleküle eluiert werden können. Im 2. Peak ist also die gewünschte
Verbindung in höhere Konzentration als in der Probe vorhanden, es wurde also
angereichert.
Die Elutionsbedingungen können geändert werden durch z.B. pH Sprung,
Veränderung der Ionenstärke, Zugabe von Chaotropen, Acetonitril…
C) Großenausschlusschromatographie (SEC)
- ist extrem anderes
Bei AFC ist K sehr groß, extrem starke Retention
Bei SEC k=0, keine Retention ( Bei extrem große Molekülen)
- Extrem große Moleküle befinden sich nur in der Zwischenkorn Volumen der
mobile Phase, und nicht in der Proben, da sie nicht hineinpassen.
- Sie erreichen Detektor schon vor der mobilen Phase, da sie nicht die Zeit
brauchen, um die Poren zu füllen
Es gibt auch Zwischenstufen, also Molekülen, die in manche Poren
hineinpassen, in andere wiederum nicht  der Peak dieser Komponenten kommt
zw. Dem Peak des geringer und dem Peak der ganz kleinen Moleküle
Ganz kleine Moleküle, die in alle Poren passen, befinden sich in dem
stagnierenden Teil der mobilen Phase, als auch in Zwischenkornbereich
- Sie kommen mit der Mobile Phase (tR 0) zum Detektor, da sie nicht retentiert
werden.
Die normale Chromatographie beginnt erst bei tR 0 , bei SSc ist hier die
Chromatographie schon beendet  Extremfall
AFC ist anderes Extrem
9. Welche sind die häufigsten systematischen Fehler in der quantitativen Analyse
mittels Chramtographie und Elektrophorese? Wie können sie verringert werden?
Welche sind die häufigsten statistischen Fehler ? Wie lassen sich diese
verringern? Nennen Sie die wichtigsten Fehlerquellen in der Probenvorbereitung.
Welche der Fehler lassen sich durch interne Standardisierung verringern?
Systematische Fehler:
- unrichtige Peakabgrenzung bessere Trennung erforderlich
- Ddetektorresponse nicht linear  Probe verdünnen
- Detektorempfindlichkeit in der Probe ungleich der in der reinen
Standardlösung –> Standaradditionsmethode
- Diskriminierungseffekte bei elektrochemischer Injektion in de CE 
Kontrolle durch andere Injektionsart
- Probenverluste in der Probenvorbereitung  Ausbeutebestimmung
Statistische Fehler
- ΔVinj  Interne Standardisierung
- Limitierte Präzision der Peakabgrenzung durch geringes SIN Verhältnis 
Höhere Analytkonzentration, oder Messmethode mit niedrigerem LOD
erforderlich.
- Schwankungen in der Detektorempfindlichkeit  IS
- Schwankungen in der Probenvorbereitung  IS
Systematische Fehler in der Probenvorbereitung
- Einschluss und Adsorption der Analyte aus ausgewählte
Probenbestandteile
- Metabolisierung und Zersetzung
- Nicht einheitlicher Derivatisierungsgrad
- Nicht einheitliche enzymatische Reaktion
- Verunreinungen der Probe
Ausmaß der Abtrennung von Matrixkomponenten kann Einfluss auf die
Detektorempfindlichkeit haben.
10) Wovon hängt die Wanderungsgeschwindigkeit eines Analyten in der (i)
Chromatographie und in der (ii) Elektrophorese ab? Geben Sie die Beziehungen
für die Wanderungsgeschwindigkeit an; differenzieren Sie die Parameter, welche
substanzspezifisch sind, und jene, welche durch das Analysesystem vorgegeben
werden.
Ui ist abhängig von Verteilungskoeffizienten ki’ und von der
Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase. ki’ ist wiederum abhängig von
Volumensverhältnis = Phasenverhältnis q und von Ki’
V ist vom Analysesystem vorgegeben
Ki’ ist substanzspezifisch.
Elektrophorese
Die Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von
- Ladung des Proteins
- Molekulare masse
- Konformation
Die Reibungskraft ist proportional zu Geschwindigkeit der Teilchen.
u i = Mi * E
ui =
- Term fällt weg, da die Stationäre Phase V=0 hat
 Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von Auswahl der Moleküle in der
mobilen Phase und der Geschwindigkeit der mobilen Phase
Durch n im dividieren  u i
k i’ … Verteilungskoeffizient, Retentionsfaktor oder Kapazitätskoeffizient.
Konz. Verteilungskoeffizient
Phasenverhältnis q
Da in Lösungen gilt: c * V= n
Ki  Substanzspezifisch von Analyte abhängig, immer verschieden
q für alle Analyte gleich, kann eingestellt werden, vom Analysesystem
vergeben
k i’- somit auch substanzspezifisch, Verteilung zw. mobile und stationäre Phase
von Analyt zu Analyt verschieden
In planerer Chromatographie wird nicht Wanderungsgeschwindigkeit sondern Rf Wert bestimmt
(man misst den Weg, den die Komponenten über best. Zeitraum zurückgelegt
haben)
In Säulenchromatographie wird das Retentionszeit bestimmt t Ri = Zeit, die
Komponenten im chromatographischen System zurückgehalten werden
tR0  vom System vorgegeben = Totzeit, Zeit die mobile Phase braucht um die
Säule durchzuwandern (Hier misst man die Zeit, die einzelne Komponente
brauchen, um ein best. Weg zurückzulegen)
c) Elektrophorese
Ganz anderer Trennungsprinzip als bei der Chromatographie, hat nur eine
Phase (meist flüssig)
u i= µ i *E
µ i … Proportionalitätsfaktor, Ionenbeweglichkeit oder Mobilität
E… elektrische Feldstärke
 Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von Mobilität und Feldstärke
µ i  Substanzspezifisch, von Analyt zu Analyt verschieden
Es gibt starke und schwache Analyte
Schwache Analyte sind im Gegensatz zu starkem nicht vollständig dissoziert. Di
Mobilität ist hier vom Dissoziationsgrad abhängig.
Der Dissoziationsgrad α ist wiederum vom pH-Wert der verwendeten
Pufferlösung abhängig, wird über Henderson-Hasselbalch-Gleichung erklärt
Spannung und Lange ist variierbar, kann eingestellt werden  vom
Analysesystem abhängig
11) Diskutieren Sie die Inkremente, aus welchen sich die Trennstufenhöhe in der
Chromatographie zusammensetzt. Welche sind die Ursachen der
Peakverbreiterung?
H = Hdiff + Hconv + Hex,s + Hex,m
Hdiff = Longitufinale Diffusion: Aufgrund eines Konzentrationsgradienten
Di = Diffusionskoeffizient
Hdiff = 2 Di / V
Kann quantitativ beschrieben werden
Hconv = konvektive Durchmischung. Es wird nicht quantitativ beschrieben
Parabolisches Strömungsprofil
Mittlere Geschwindigkeit =1/2 Vmax
Hconv =
Migration  ermöglicht Auftrennung der Analyte
Dispersion  führt zur Peakverbreitung
Diese sind 2 gegenläufige Prozesse
Ziel der Chromatographie ist diese beiden Prozesse so zusteuern, dass
hinreichende Auftrennung Peaks möglich wird, dass eine relativ gute Auflösung
erreicht wird.
Grundsätzlich kann man sagen dass ein Peak umso breiter wird, je weiter
es wandert und je langsamer die Geschwindigkeit der mobilen Phase ist
H=
Es gibt 4 Prozesse, die die Trennstufen Höhe beeinflussen – Peakverbreitung
a)
b)
c)
d)
longitudinale Diffusion  führt zu Hdiff
konvektive Durchmischung  führt zu Hconv
Stoffaustausch in der mobilen Phase  führt zu Hex,m
Stoffaustausch in der statische Phase  führt zu Hex,s
Ad a) Bringt man eine Substanz in ganz schneller Zone ein (Direc- oder DelloFunktion), und betrachtet man nur die mobile Phase in Ruhe, also unbewegt
(keine statische Phase=, kommt es trotzdem mit der Zeit zur Probenverbreitung
- radiale Bewegung: gleichviel Moleküle gehen in eine und andere Richtung
- longitudinale Bewegung: durch Konzentrationsgradienten (wie er z.B.
durch den Strömungsprofil bei b9 kann entstehen) kommte es zu
Bewegung in einer Richtung und Nettomassentransport
Diffusion bewirkt also, dass Probenzonen mit der Zeit immer breiter werden. Die
Verbreitung nimmt mit der Zeit zu.
Umso größer die V ist, desto kleiner ist Hdiff und umgekehrt
Ad b)
Parabolisches Strömungs- bzw. Geschwindigkitsprofil entsteht
Teilchen am Rande des Rohres bewegen sich kaum. Teilchen in der Mitte
bewegen sich relativ schnell. Mittlere Geschwindigkeit daraus  V der mobile
Phase.
Durch Strömungsprofil wird aber auch der Konzentrationsgradient
gebildet, durch den es wieder der longitunalen Diffusion kommt. Das profil ist
umso ausgeprägter, je höher die Geschwindigkeit der mobilen Phase und je
größer der Radius r ist.
ad c) und d)
Wenn mobile Phase eine Geschwindigkeit V=0  je ein
gaußformiger Peak in mobilen und statischen Phase wird sich bilden,
Gleichgewicht stellt sich an
In Chromatographie aber normal mob. Phase
bewegt, hat Geschwindigkeit v  GGWzustand
kann in Chromatographie nie erreicht werden
Dadurch, dass sich mobile pHase mit bestimmte
Geschwindigkeit bewegt, bewegt sich das Peak
vor
Molekuüle werden hinter von statische Phase in
mobile Phase wandern und vorne von der mobile
Phase in die statische Phase. Da ihr Ziel
Gleichgewichteinstellung ist (kann aber nie
erreicht werden). Dadurch wird effektive Zon
edes Peaks breiter je höher V ist, desto größer
wird effektive Zone
Auch Massenaustausch zw. Den beiden Phasen nimmt mit der Geschwindigkeit
zu.
Da die 4 Prozesse, die Peakverbreitung verursachen unabhängig sind, können
die davon verursachte Trennstufenhöhe addiert und eine Summenkurve erstellt
werden. Auch die Varianten sind addierbar
Golay-Gleichung, gilt für offene Rohre
Van-Deente Gleichung, gilt für gepackte Rohre
Hier kommt additives Glied dazu, das aber nicht v-abhängig ist.
3)a) Wie ist die chromatographische Auflösung definiert?
b) Wie können Sie sie verbessern?
…ist eine charakteristische Größe, die das Ausmaß der Trennung zweier
chromatographische Peaks beschreibt. Sie ist ein Ausdruck der Qualität der
Trennung
Rji
α 
 hohe Auflösung
Hi 
Um die Auflösung zu bestimmen berechnet man immer ein Komponentenpaar
(i,j). j  Die Substanz, die nach i dem Detektor erreicht.
Retentionsterm (k i/(k i+1)) – es hat keine große Bedeutung für R ji, nähert sich
ziemlich rasch 1
Effizienzterm √ N
Wenn N groß ist, wird auch die Auflösung besser. N ist groß wenn die Länge
groß ist, oder wenn H klein ist: N= L/H
Wenn man die Länge verdoppelt verbessert sich die Auflösung jedoch nur um √2
Um die Auflösung zu verdoppeln muss man die Länge vervierfachen, aber dafür
braucht man die 4fache Analysezeit. Auch dieser Term hat nur kleines Potential
die Auflösung zu verbessern.
Selektivitätsterm (α – 1)
α = kj / k i
Dieser Term hat großes Potential die Auflösung zu verändern
k i’= Ki * q  Durch z.B. geringfügige Veränderung der Zusammensetzung der
mobile Phase können k i bzw. kj geringfügig verändert werden und die Auflösung
dadurch aber stark verbessert werden.
13. Welche mobilen Phasen verwenden Sie für die Normal-Phase (NP)- bzw. die
Reversed-Phase (RP)-HPLC?
(a) Nennen Sie die häufigst eingesetzten Hauptkomponenten und "Modifier"
und spezifizieren Sie den ungefähren Konzentrationsbereich, in dem diese "Modifier"
zumeist eingesetzt werden.
(b) Zeichnen Sie für die NP- und RP-Chromatographie die jeweiligen Graphen,
welche die Abhängigkeit der Kapazitätsfaktoren von der "Modifier"-Konzentration
angeben.
(c) Sie möchten 2 Verbindungen trennen, die sich
(i) lediglich um eine CH2-Gruppe in einer Seitenkette unterscheiden.
Wählen Sie für die Trennung bevorzugt RP-LC oder NP-LC aus?
Begründen Sie Ihre Entscheidung
(ii) in der Zahl der Hydroxyl-Gruppen unterscheiden
Erwarten Sie eine Trennung mittels RP-LC bzw. NP-LC?
Begründen Sie Ihre Erwartung.
a)
NP
Mobile Phase
Hauptkomponente
Modifier
RP
Unpolar
Alkan
EtOH
Polar
Wasser
MeOH
c)
I) RP, CH2 ist unpolar, d.h. es braucht eine polare statische Phase und eine
unpolare mobile Phase (Modifier MeOH, EtOH, ACM, THF 20-70%)
II) NP, OH ist polar, d.h. es braucht eine polare mobile Phase und eine
unpolare statische Phase (Modifier CH2Cl2, EtOH, PrOH 1-10 %)
NP-HPLC: polare statische Phase, meist Silica (SiO2 – können auch modifiziert
werden) Partikel, manchmal auch Al2O3. Unpolare mobile Phase. Hauptkomponenten:
Alkane (meist Hexan, Heptan oder Isooktan). Modifier: polare Verbindungen, die die
Solvatation etw. verbessern sollen und teilweise Adsorptionsplätze an der Oberfläche
des polaren statische Phase besetzen (konkurrieren mit Analytmolekulen)
0,5-10% Modifier zugesetzt, umso höher Modifierkonzentration, umso besser wird
auch Solvatation und umso kürzere Analyse Zeit
RP-HPLC: unpolare statische Phase, z.B. PS/DVB, polare mobile Phase, meist H20.
Modifier: MeOH, EtOH, THF, ACN. 20-80% Modifier zugesetzt  sind oft sogar
Hauptkomponente, in viel größeren Mengen zugesetzt als bei NP-HPLC
Soll Polarität der mobilen Phase etw. herabsetzen und so die Solvatation
verbessert, kompetitive WWK(Adsorption= das Modifiermoleküle an Oberfläche der
statische Phase vorhanden, aber lange nicht so bedeutend wie bei NP
NP-HPLC
Modifier CH2Cl2, EtOH, PrOH 1-10 %)
RP-HPLC
Annährend linearer zusammenhang. Ki
sinkt mit zunehmender Modifier
Konzentration. Mir Modifierkonzentration
kann man somit die Kapazitätsfaktor,
Auflösung und auch Analysenzeit
berechnen
Auch hier sinkt ki mit
Modifierkonzentration, allderings
nicht so linearer Zusammenhang wie
bei NP-HPLC bei geringer
Modifierkonzentration  starke
Abweichungen
c)
I) RP-HPLC bevorzugt eingesetzt CH2
 unpolare statische Phase. Durch interschiedliche Anzahl an CH2 Gruppen 
verschieden Retentionszeiten, da Verbindungen mit mehr CH2 Gruppen mehr
WWK mit unpolarer Oberfläche der statische Phase hat. Verbindungen mit
wenigem dieser Gruppen haben geringere Affinität zu statische Phase  wird
rasch mit der mobilen Phase mitgeschwemmt werden
II) NP-HPLC bevorzugt OH-Gruppen
 polare statische Phase. Durch unterschiedliche Anzahl an OH-Gruppen 
verschiedene Retentionszeiten. Verbindungen mit mehr OH-Gruppen haben
stärkere WWK mit der statischen Phase. Wird starker retentiert
12. a) Welcher Parameter bestimmt die Migration in der Chromatographie?
b) Wie hängt die Trennstufenhöhe von der Geschwindigkeit der mobilen Phase
ab?
 Bruchteil der Mole, die sich zum bestimmten Zeitpunkt in der
mobilen Phase befinden
 Beschreibung der Migration
Di Migration ist abhängig von ki’. Dieses ist wiederum abhängig von q und Ki’
minimum
vor Minimum: H sinkt mit steigender Geschwindigkeit. Nach Minimum: H
steigt mit steigender Geschwindigkeit.
15. Diskutieren Sie (anhand der entsprechenden Gleichungen), warum man in der
Kapillar-Ionenelektrophorese so viele theoretische Trennstufen erzielen kann.
Ni ist in erster Linie abhängig von L= Länge der Säule und Hi = Trennstufenhöhe.
D.h. je länger die Säule ist, und je kleiner Hi ist, desto größer ist auch Ni. Wenn man
die Säule verlängert wird auch Ni größer. Aber Ni ist auch abhängig von u und Di
(Diffusionskoeffizient) Je größer u ist, und je kleiner Di ist, desto größer ist auch Ni.
(4) Welche 3 für die HPLC eingesetzten Detektoren zeichnen sich durch besonders
hohe Empfindlichkeit aus?
In welchem Konzentrationsbereich liegen dabei typischerweise die Nachweisgrenzen?
Geben Sie eine kurze Beschreibung der Arbeitsweise dieser Detektoren. Welche
Eigenschften8 chemische Strukturen) müssen die Analyte besitzen, um mit diesen
genannten Detektoren bestimmbar zu sein?
Fluoreszenz –Detektoren und Elektrochemische Detektoren : Frage 1
UV-Detektoren: messen die durch den Analyt verursachte Lictadsorption in der
Durchflusszelle. Die Grundlage für eine analytische Auswertung ist das LambertBeer’sche Gesetz. Dieses zeigt bei verdünnten Lösungen einen linearen
Zusammenhang zwischen der Extinktion E und der Konzentration c.
E= s*c= ελ * l * c
Es gibt Geräte, die mit einzelnen Wellenlängen arbeiten. Aber es gibt auch
Spektalphotometer. Diese arbeiten mit einem spektralen Kontinuum. Aus dem
kontinuierlichen Spektrum wird der Lichtstrahl mit der gewünschten λ vor der
Messzelle mittels eines Gitters herausselektiert.
Photodiodenarray-Detektoren arbeiten mit dem λ –Spektrum 200-800nm. Hat
ein holographisches Gitter.
Vorteile:
- weit einsetzbar
- für manche Verbindungen auch sehr sensitiv
- Wahl von λ möglich
- Gut einsetzbar in den Gradienten
- Geringes Einfluss con Temperatur- und Flussschwankungen
- Sehr verlässlich
- Nicht destruktiv
Nachteile:
- Empfindlichkeit nicht immer ausreichend für Spürenanalytik
- Substanzen müssen im UV-Bereich leicht absorbieren.
(5) welche mobile Phasen verwenden Sie für Normal-Phase, Reversed-Phase und
Ion-Exchange HPLC?
a) Geben Sie jeweils die Zusammensetzung typischer mobiler Phasen für diese 3
Chromatographie Methoden an
b) Nennen Sie die häufigste eingesetzten Hauptkomponenten und Modifier
c) Spezifizieren Sie den ungefähren Konzentrationsbereich, in dem diese Modifier
zumeist eingesetzt werden, und d) Zeigen Sie für die Normal-Phase, Reversed-Phase
und die Ion-Exchange Chromatographie die jeweiligen Graphen, welche die
Abhängigkeit der Kapazitätsfaktoren von der Modifier Konzentration angeben.
NP: Elutrope Reihe: Alkan<Ester<EtheryChloralkan<Alkohol
Wirkung der polaren Eluenskomponenten
Sie konkurriert mit dem Analyt um die Adsorption = Plätze an der Oberfläche
= kompetitive Adsorption von Eluenskomponenten!
Sie verbessert die Solvatation der Analyte in der mobile Phase
RP & IEX  Frage 2
18) Diskutieren Sie die Abhängigkeit der effektiven Mobilität einer einwertigen Säure
bzw. Base vom pH der Pufferlösung, in welcher diese beiden Elektrolyte jeweils
gelöst sind. Wie verhält sich die Mobilität einer Substanz, welche beide Funktionen im
Molekül hat (ein sog. Ampholyt), als Funktion des pH? Welche elektrophoretische
Methode kann solche Ampholyte trennen?
Je größer der pH desto kleiner ist α Je kleiner α desto kleiner ist auch Mdiff
Ampholyte: Frage 6
19. Wozu dient die Miniaturisierung der Säulenquerschnitte in der HPLC? Für welche
Typen von Analysenproblemen bringt der Einsatz von Kapillarsäulen Vorteile, für
welche nicht? Welche Vorteile kann man dadurch gewinnen? Welche Parameter muss
man an die Säulendimensionen anpassen?
Je kleiner der Säulendurchmesser ist, desto geringer ist die Peakdispersion,
d.h. desto geringer ist die Verdünnung der Analyte durch den chromatographische
Prozess. Säulen mit geringen Querschnitten werden vor allem für Proben eingesetzt,
die in ihrer menge beschränkt sind. Z.B. für die Auftrennung von Spalt-Peptiden von
Proteinen.
Wenn man Kapillarensäulen in der HPLC einsetzt ist es unbedingt erforderlich:
- Reduktion der Injektionsvolumina
- Reduktion der Volumina der Detektorzelle
- Reduktion der Flüsse der mobile Phase
Durch den Einsatz von Kapillarsäulen kann man sehr leicht die Ni vergrößern.
Kapillarsäulen sind nämlich oft sehr, sehr lang – 10-20m. Ni=L/Hi. Dadurch dass
sie so lang sind, kann man die Analyte besonderes gut voneinander trennen.
Sogar flüchtige Substanzen lassen sich sehr gut mit Kapillarsäulen trennen und
analysieren.
20) Erklären Sie das Prinzip der Größenausschlusschromatographie (SEC). Für welche
Trenn- bzw. Analysenprobleme wird SEC typischerweise eingesetzt? Wie wird die
mobile Phase gewählt? Wovon hängt der Selektivitätsbereich ab?
Prinzip: Auftrennung nach Größe (molekulare Masse= bei minimaler Adsorption.
Auftrennung erfolgt durch partielle Penetration der Porenvolumina der Matrix.
Trägermaterialen: hydrophile Polymere
Silica modifiziert mit Diol-Siloxanen
Linearität zw. lnMw und ksec
Typische Anwendung:
- Trennung und Fraktionierung nach Größe
- Trennung von Monomeren – Diemären – Multimären
- Bestimmung von Mw oder deren Verteilung
- Entsalzen, Pufferwechsel
Es ist eine Extrem schonende Methode und die mildeste Form der
Chromatographie. KEINE Denaturierung von Proteinen.
21) Beschreiben Sie den Zusammenhang zwischen (i) Retentionszeit tRi (in der
Säulenchromatographie) bzw. (ii) RF.i-Wert (in der planaren Chromatographie) und
dem Kapazitäts- (Retentions-) Faktor ki'?
Je stärker die Verteilung, desto langsamer ist die Retentionszeit. D.h., je
größer ki’ ist, desto länger brauchen die Analyt-komponenten um aus der Säule zu
kommen (desto länger werden die Komponenten in der statischen Phase
zurückgehalten)
RF-Wert:
Je größer ki’ ist, desto kleiner ist den RF-Wert.
22. Zwei Komponenten haben in einem chromatographischen System
Retentionsfaktionern (Kapazitätskoeffizienten) von 1.00 und 1.10. Die Säule ist 10 m
lang und hat unter den experimentellen Bedingungen eine Trennstufenhöhe von
1mm. Wie groß ist die Auflösung der Analyte? Wie groß ist sie, wenn Sie eine doppelt
so lange Säule (mit gleichem H) verwenden? Wenn zusätzlich die zweite Verbindung
einen Kapazitätskoeffizienten von 1.20 hat?