RNA-Proben für Microarray

RNA-Probeneingang Nr.
Bitte nicht beschriften
Datum
Tel.:
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Institut:
Bitte nicht
beschriften
1) Abgegebene RNA-Proben
RNAProbenNr.
RNA-Nr.
Probenbezeichnung
(Kurzbeschreibung der Proben)
Ratio
OD260/OD280
Konzentration Volumen
(µg/µl)
(µl)
1
2
3
4
5
6
7
8
2) Agarosegel-Dokumentation: alle Proben
Gelbild mit Beschriftung
(Proben-Nummern.)
RNAMenge
(µg)
3) Experimentelle Fragestellung der Microarray-Analyse
Bitte kurz die experimentelle Fragestellung darstellen. Dabei kurz auch auf die folgenden Punkte
eingehen:
1) Benennung des Zellsystems/Gewebes (ggbf. GVOs bzw. manipulierte Zellinien
benennen/beschreiben)
2) Zu untersuchende +/- Situation beschreiben: zum Beispiel eingesetzte Stimuli und deren
Konzentrationen angeben.
3) Angeben, welche Proben jeweils gegeneinander hybridisiert werden sollen.
4) Bereits bekannte Änderungen spezieller mRNAs unter vergleichbaren Bedingungen
(Positivkontrollen) angeben.
5) Bitte angeben, ob die einzusetzenden RNA-Proben dauerhaft als Ressourcen zur Verfügung
stehen und ggbf. erneut RNA für weitere Array-Experimente zur Verfügung gestellt werden
kann.
4) Bitte folgende Punkte einhalten:
-Bestimmung des Ratios OD260/OD280 : in 10mM Tris, pH7,5 !
-Während oder nach RNA-Isolierung: DNase I-Verdau und anschließend komplette Entfernung oder
Inaktivierung der DNase I !
-Konzentration der RNA: mindestens 0,5 g/l !
-Geldokumentation mitliefern !
5) Material für die Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellkulturzellen
für die Microarray-Analyse
QIAGEN:
RNase free DNase set: Nr.:79254
QIAshredder (50): Nr.:79654
RNeasy Mini Kit (50): Nr.:74104
Protokoll siehe Rneasy Mini Handbook:
Protocol for Isolation of Total RNA from Animal Cells and On-Column DNase Digestion
oder folgendes Protokoll:
6) Gesamt-RNA-Isolierung mit dem Qiagen RNeasy-Kit
Protokoll: Institut fuer Pharmakologie
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Es wird steril und mit Handschuhen gearbeitet.
In einer konfluenten T75 Flasche sind ca. 1-2.107 Zellen, daraus erhält man ca. 100-200 µg
Gesamt-RNA (maximale Kapazität einer Säule: 100 µg Gesamt-RNA!).
Das Medium wird abgekippt und die Zellen 1 mal mit kaltem PBS gewaschen.
Dann werden die Zellen in 10 ml kaltem PBS abgescrapt und in ein 50 ml Röhrchen überführt.
Die Flasche wird nochmals mit 5 ml PBS ausgespült.
Die Zellen werden 5 min bei 1.600 rpm und 4°C abzentrifugiert und der Überstand vollständig
entfernt.
Das Pellet wird durch leichtes „Schnipsen“ aufgelockert.
Auf die abzentrifugierten Zellen wird sofort 600 µl Lysepuffer RLT gegeben. Dem Puffer RLT
muss vor Gebrauch 10 µl ß-ME pro ml unter dem Abzug zugegeben werden. Die
Resuspendierung/Homogenisierung sollte möglichst schnell erfolgen
Es wird bei RT weitergearbeitet.
Das Lysat wird vollstandig auf eine Qiashredder-Säule gegeben und 2 min bei 13.000 rpm
zentrifugiert.( Auffanggefäße beschriften! )
Dabei wird die genomische DNA geschert und das Lysat homogenisiert.
Jetzt werden 600 µl 70% Ethanol ins Auffanggefäß gegeben und dies mit dem Homogenat sehr
gründlich durchmischt.
Hierbei werden die Bindekonditionen an die Säule angepaßt.
Die ersten 700 µl werden auf die beschriftete RNA-Spin-Säule gegeben und bei 13.000 rpm 15
s zentrifugiert.Der Durchfluß wird verworfen, dann werden die zweiten 700 µl wie die ersten
zentrifugiert.
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Hierbei wird die RNA an die Silicagelmembran gebunden.
700 µl Waschpuffer RW1 werden auf die Säule gegeben und bei 13.000 rpm 15 s zentrifugiert,
der Durchfluß wird verworfen.
ODER FUR DNA-MICROARRAYS : Bei Benutzung von DNAse wird nur mit der Hälfte,
also 350 µl, gewaschen. Anschließend
-Werden pro Probe 10 µl DNAse im dazugehörigen Puffer RDD vorsichtig (nicht vortexen)
verdünnt (Zugabe von 70 µl Puffer RDD).
Diese 80 µl werden direkt auf die Membran pipettiert und 15 min bei RT inkubiert.
Dann wird mit den restlichen 350 µl RW1 gewaschen.
Es wird ein neues Auffanggefäß genommen und mit je 500 µl Waschpuffer RPE das erste Mal
15 s bei 13.000 rpm, das zweite Mal 2 min bei 13.000 rpm gewaschen (Zwischendurch das
Auffanggefäß entleeren).
Hierbei wäscht man die restlichen Kontaminationen und auch das restliche Ethanol weg.
Es wird ein frisches 1,5 ml Eppi als Auffanggefäß genommen und die RNA mit 2 mal 40 µl
RNase-free water eluiert. Dazu wird das Wasser direkt auf die Membran pipettiert und erst 1
min stehen gelassen, um eine bessere Ausbeute zu erzielen. Dann wird 1 min bei 13.000 rpm
zentrifugiert.(Die Deckel der Eppis müssen dabei offen bleiben.)
Die RNA wird bei einer OD von 260 nm gemessen und dazu 1:40 (2µl RNA+78 µl 10mM Tris
pH 7,5) verdünnt.
Die OD sollte zwischen 0,15 und 1,0 liegen, da darunter und darüber die Genauigkeit der
Messung abnimmt. Der Ratio 260/280 sollte im optimalen Fall zwischen 1,9 und 2,1 liegen.