Universität Konstanz Fachbereich Biologie Priv.

Universität Konstanz
Fachbereich Biologie
Priv.-Doz. Dr. Jörg H. Kleinschmidt
Datum: 21.5.2010
Übungen zur Einführung in die Spektroskopie für Studenten der Biologie
(SS 2010)
Übungsblatt 2, Besprechung am 10.6.2010
Aufgabe 1: zur CD Spektroskopie
Sie messen im Circular Dichroismus Spektrometer das CD Spektrum der Lösung eines
Proteins unbekannter Struktur und erhalten dabei vom Spektrometer die Elliptizität als
Funktion der Wellenlänge des polarisierten Lichtes. Für Vergleiche mit den Spektren anderer
Proteine gibt man konventionsgemäß in der Literatur den Mittelwert der molaren Elliptizität
pro Aminosäurerest an, d.h. man dividiert die molare Elliptizität durch die Anzahl der
Aminosäurereste im Protein.
Aufgabe: Die Elliptizität (d. h. der Circular Dichroismus) der Lösung eines Proteins
beträgt Θλ = –3.3 mgrad (milligrad) bei einer Wellenlänge von 218 nm. Die Konzentration
des Proteins ist cM = 3 μM (mikromolar) und das Protein besteht aus einer Polypeptidkette
von 325 Aminosäuren. Die verwendete Küvette habe eine optische Pfadlänge von d = 0.5
mm. Wie groß ist die mittlere molare Elliptizität bei 218 nm bezogen auf einen
Aminosäurerest in der Einheit grad cm2 dmol–1 (dmol = dezimol)? Hinweis: Benutzen Sie
die in der Vorlesung angegebene Formel und berücksichtigen Sie, daß der Formel die
Konzentration in der Einheit g · cm–3 bzw. die Pfadlänge d des Lichtes in der Küvette in der
Einheit cm zugrundeliegen.
Welche wichtige Information entnehmen Sie der Linienform des CD Spektrums eines
Proteins ?
Aufgabe 2:
Ein Protein hat 3 identische Bindungsplätze, die räumlich so lokalisiert sind, daß sie
sich in den Ecken eines gleichseitigen Dreiecks befinden. Wenn einer dieser Bindungsplätze
einen Fluoreszenzdonator enthält, so ist dessen Quantenausbeute D = 0.5. Wenn ein
Bindungsplatz mit einem Fluoreszenz-Donator besetzt ist, und ein weiterer mit einem
Fluoreszenzakzeptor, so sinkt die Quantenausbeute für den Donator auf D,A = 0.25. Wie
groß ist die Quantenausbeute D,2A des Donators, wenn ein Bindungsplatz mit einem
Donator und 2 Bindungsplätze mit einem Akzeptor besetzt sind ?
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Aufgabe 3:
Acrylamid ist ein dynamischer Fluoreszenzlöscher, der in Wasser löslich ist, aber nur
eine geringe Löslichkeit in Lipidmembranen besitzt. Die Fluoreszenzintensität eines Proteins
in wässeriger Lösung ist eine Funktion der Konzentration von zugegebenem Acrylamid. Für
ein bestimmtes Protein wurden die beiden folgenden Messreihen a und b aufgenommen:
Konzentration
c (Acrylamid), in mol/L
0.0
0.2
0.4
a. in wässeriger Lösung
0.5
0.1667
0.0961
b. in H2O mit Phospholipidmembranen
0.5
0.401
0.329
relative Fluoreszenzintensität,
F/F0, des Proteins bei 330 nm:
Stellen Sie die Daten in Form des Stern-Volmer Plots graphisch dar und ermitteln Sie
die Fluorezenzlöschungskonstanten K für die beiden Systeme a und b. Was lässt sich über
das Protein in Gegenwart von Lipidmembranen aussagen?
Aufgabe 4:
Resonanzenergietransfer ist eine sehr häufig in der Biologie benutzte Methode, um
Abstände zu messen. Die Methode wurde z.B. eingesetzt, um Abstände in t-RNA,
Immunoglobulinen, Rhodopsin, Oligopeptiden, bis hin zu Abständen in Ribosomen zu
untersuchen.
Das Donator/Akzeptor Paar Naphtyl/Dansyl hat eine charakteristische Transferdistanz
von R0=34 Å. Ein Protein enthält je einen Naphtyl bzw. Dansylrest, die an zwei CysteinAminosäurereste kovalent gebunden sind. Die Effizienz des Energietransfers zwischen dem
Donator/Akzeptorpaar wurde in Messungen zu 20% und in einem anderen Fall zu 40%
bestimmt. Welche Abstände haben Donator und Akzeptor im Protein für diese beiden Fälle?
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