Peroxidase

15.06.06
Kurstag: 2+3
Melanie Thompson (Autor)
Gruppe 4
Pflanzenphysiologischer Kurs Sommersemester 2006
Versuch 5: Entwicklungs- und organabhängige Regulation der Genexpression
am Beispiel von Peroxidase-Isoenzymen
1. Einleitung
Peroxidasen sind Enzyme, die die Fähigkeit haben H2O2 und andere Peroxide in Zellen
abzubauen oder als Substrat zu nutzen.
Im Allgemeinen katalysieren Peroxidasen folgende Reaktion:
RH2 + H2O2 
2 H2 O + R
Sie kommen in den Peroxisomen vor, neben den Mitochondrien, die einzigen Organellen
höherer Zellen, die Fettsäuren im Vorgang der –Oxidation abzubauen vermögen.
Vor dem Schritt Energie durch Atmung zu gewinnen, dienten Peroxisomen vermutlich der
Entgiftung des für die Zelle toxischen Sauerstoffs, eine Funktion, die sie auch heute noch bei
Tieren und Pflanzen in leicht veränderter Form ausüben.
Dies macht sie zu recht ursprünglichen Organellen, und könnte eine Erklärung für ihre
Entstehung sein, denn anders als Lysosomen entstehen Peroxisomen nicht durch Abfaltung
aus dem Golgi-Apparat, sondern durch Einschnürungen des glatten ER.
Sie beinhalten nicht direkt ihre gesamte Enzymausstattung, diese wird ihnen erst später, vom
momentanen Bedarf abhängig über spezielle Transportproteine aus dem Cytoplasma
eingeschleust.
Um dies zu gewährleisten werden den Peroxisomenproteinen bei der Translation
Signalsequenzen angehängt, die behilflich sind bei der Einschleusung in die Peroxisomen.
Die Peroxisom-Membranen sind, ihrer Funktion entsprechend, ungewöhnlich durchlässig für
viele Moleküle, die andere Membranen nicht passieren können (bspw. Saccharose).
Peroxidasen befinden sich jedoch nicht ausschließlich in Peroxisomen, sondern sind u.a. auch
im Cytoplasma und in Apoplasten zu finden.
Zusammengefasst werden Peroxidasen zur Gruppe der Isoenzyme.
Isoenzyme sind multiple Formen von Enzymen, die die gleiche Reaktion katalysieren.
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Verschiedene Isoenzyme können in der gleichen Spezies, im gleichen Gewebe und auch in
gleichen Zellen nebeneinander vorliegen.
Die verschiedenen Enzymformen unterscheiden sich in der Regel in kinetischen oder
regulatorischen Eigenschaften, in den verwendeten Cofaktoren oder in der Lokalisation
innerhalb der Zelle (bspw. lösliche oder membrangebundene Isoenzyme).
Isoenzyme haben oft ähnliche, jedoch nicht identische Aminosäuresequenzen, jedoch in
vielen Fällen eindeutig den gleichen evolutionären Ursprung.
Der gleiche evolutionäre Ursprung wird dadurch untermauert, dass nebst der Zugehörigkeit
zur Gruppe der Isoenzyme, Peroxidasen in höheren Pflanzen als Genfamilien kodiert sind.
Genfamilien sind Kollektionen mehrfache Kopien von Genen, die zumeist eine große
Sequenzähnlichkeit oder sogar identische Sequenzen aufweisen.
Die Mitglieder einer Genfamilie können lokal gehäuft oder im Genom verstreut sein.
In diesem Versuch soll nun die Genexpression anhand von Peroxidase-Isoenzymen
nachgewiesen werden.
Eine Pflanze besteht aus verschiedenen Organen, die wiederum aus verschiedenen Geweben
mit unterschiedlichen Zellen aufgebaut sind.
In allen Zellen befindet sich in der Regel das gleiche Genom, dennoch sehen diese zuweilen
ganz unterschiedlich aus und können jeweils spezielle Funktionen ausüben.
Die unterschiedlichen Funktionen der Zellen bedingen eine ganz unterschiedliche Bildung
(Exprimierung) verschiedenster Proteinen, so kann, obwohl in allen Zellen das gleiche Genom
vorhanden ist, ein spezifisches Protein in einigen Zellen häufig, in anderen nur in geringer
Stückzahl und in wieder anderen gar nicht vorhanden sein.
Diese Differenzierung läuft nach einem „genetischen Programm“ ab, dabei sind nicht alle
Gene in einem Organismus permanent aktiv, sie können an- und abgeschaltet werden je nach
gegebener Situation.
Die Expression von Genen kann entwicklungs- oder organ- bzw. gewebeabhängig sein, durch
Hormone und abiotische Faktoren reguliert oder durch Wunden/Stress induziert werden.
Diese differenzielle Genaktivität ist auch bei Genfamilien, zu denen auch die Peroxidasen
gehören, sichtbar, da die einzelnen Gene, obwohl sie zu einer Genfamilie gehören, durch
verschiedene Promotoren reguliert werden und damit auch hier eine, von den gegebene
Bedingungen abhängige Expression möglich ist.
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2. Material und Methoden
Als Versuchspflanzen dienten uns Tomatenpflanzen, wobei je 1g Frischgewicht aus dem
Bereich Wurzel, Spross oder Blatt entnommen und bearbeitet wurden.
Systematische Zuordnung:

Abteilung: Spermatophyta
o Unterabteilung: Angiospermae
 Klasse: Dicotyledoneae
 Unterklasse: Asteridae
o Ordnung: Scrophylariales
 Familie: Solanáceae
 Gattung: Solánum
o Art: Lycopersicon esculentum
(Tomate)
Die Tomate gehört zur Gattung der Nachtschattengewächse, verwandte Arten sind die
Kartoffen – Solánum tuberósum, der Stachel-Nachtschatten – Solánum cornútum oder der
bittersüße Nachtschatten – Solánum dulcamára.
Die gelelektrophoretische Trennung der Peroxidase-Isoenzyme, sowie der Gesamtheit der
Proteine wird unter nativen Bedingungen durchgeführt, d.h. die Proteine sind zum Teil noch
gefaltet und behalten ihre Aktivität.
Das verwendete SDS reagiert mit dem Rückgrat der Proteine, die daraufhin negativ geladen
sind und zum +-Pol wandern.
Da SDS dafür sorgen würde, dass die Proteine denaturieren, wird es in diesem Versuch in
geringer Konzentration eingesetzt um die Funktion der Proteine beizubehalten.
3. Ergebnisse
OD-Bestimmung bei 595nm
Blatt
g BSA
0
1. Wert
0,000
2. Wert
0,002
Mittelwert
3
pro 10l BSA
-
5
10
20
0,044
0,271
0,504
0,050
0,263
0,51
1. Wert
0,027
0,055
0,103
2. Wert
0,026
0,056
0,087
0,047
0,267
0,507
0,094
0,267
0,254
Durchschnitt: 0,205
Spross
g BSA
0
5
10
20
Mittelwert
0,027
0,056
0,095
pro 10l BSA
0,053
0,056
0,048
Durchschnitt: 0,0523
Wurzel
g BSA
0
5
10
20
1. Wert
0,008
0,052
0,088
2. Wert
0,017
0,051
0,081
Mittelwert
0,013
0,052
0,085
pro 10l BSA
0,025
0,052
0,042
Durchschnitt: 0,04
Mit Hilfe der zuvor angefertigten Eichkurve (Siehe Anhang), erhält man anhand der
Durchschnittswerte folgende Gesamtproteinmenge pro 1g Frischgewicht:
Pflanzl. Organ
Blatt
Spross
Wurzel
Gesamtproteingehalt pro 1g Frischgewicht
4,2
1,2
0,8
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Abb. 1: Gelelektrophoretisches Bild, oben: Nachweis der Peroxidaseaktivität in Blatt, Spross und Wurzel bzw.
Sprossstücken unterschiedlich behandelter Pflanzen, unten: Nachweis des Gesamtproteingehalts (auch der nicht
mehr funktionstüchtigen Proteine!) des jeweiligen Pflanzenorgans durch Anfärben mit Coomassie-Blau
Im gelelektrophoretischen Ergebnis ist in den oberen vier Bildern der PeroxidaseAktivitätsnachweis dargestellt.
Dieser wurde bei einer nicht-dekapitierten Kontrollpflanze, einer dekapitierten, mit
Wasserpaste behandelten Pflanze und einer mit IAA-Paste behandelten Pflanze an Blatt,
Spross und Wurzel durchgeführt.
Bei drei weiteren Pflanzen, die entweder mit Wasserpaste, einer 2,4-D-haltigen Paste oder
einer IAA-haltigen Paste behandelt worden sind, wurden jeweils Teile des Sprosses, kurz
unter der Schnittstelle, auf die die jeweilige Paste aufgetragen wurde, für den PeroxidaseAktivitätsnachweis herangezogen.
Die unteren vier Bilder zeigen die Gesamtheit aller im jeweiligen Organ vorhandenen
Proteine, wobei hier auch nicht mehr funktionsfähige Proteine angezeigt werden.
Es wurden die gleichen Regionen für diesen Nachweis verwendet, die auch schon beim
Peroxidase-Aktivitätsnachweis Anwendung fanden.
Die einzelnen Bänder zeigen die Proteinaktivität, wobei dicke Bänder auf überlagerte Proteine
hindeuten könnten.
Die Auftrennung der Proteine im Gel erfolgte zunächst nach ihrer Eigenladung bzw. durch die
leichte negative Aufladung durch SDS, hierdurch wandern sie im angelegten elektrischen
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Feld in Richtung des +-Pols, wobei die am stärksten geladenen Proteine sich am unteren Ende
des gelelektrophoretischen Bildes wieder finden.
Eine Rolle bei der Auftrennung könnte jedoch auch die Länge bzw. Größe oder Konformation
der Proteine spielen, die durch das aus 10%igem Acrylamid bestehendem Trenngel wandern.
Größere Proteine würden damit schwerer durch die Poren des Gels kommen als kleinere, es
würde so nicht nur eine ladungsmäßige, sondern auch eine größenspezifische Auftrennung der
Proteine auf dem Gel stattfinden.
Mit Sicherheit kann jedoch nur von der ladungsmäßigen Auftrennung gesprochen werden, da
diese eindeutig auf dem gelelektrophoretischen Bild zu erkennen ist.
Das gelelektrophoretische Bild zeigt recht eindrucksvoll, dass in allen Pflanzenteilen
unterschiedliche Peroxidaseaktivitäten festzustellen sind.
Jedes einzelne Band steht für die Aktivität einer Peroxidase, was recht anschaulich darstellt,
dass selbst in ein und dem selben Organ unterschiedliche Peroxidasen vorkommen,
nachvollziehbar daher, dass Peroxidasen, wie schon erwähnt, zur Gruppe der Isoenzyme
gehören, also selbst in einzelnen Organen, aber generell auch an unterschiedlichen Orten in
der Pflanze unterschiedliche Peroxidasen zu finden sind, die unter Umständen sogar leichte
unterschiede zueinander (hier bspw. dargestellt anhand der Ladung) aufweisen können.
Der Proteinnachweis in den einzelnen Pflanzen/Pflanzenteilen zeigt alle dort vorhandenen
Proteine, sogar solche, die während des Versuches ihre Funktionstüchtigkeit verloren haben.
Die Ergebnisse hier sind leider nicht ganz so anschaulich wie beim PeroxidaseAktivitätsnachweis, dennoch lässt sich recht gut erkennen, dass in allen
Pflanzen/Pflanzenteilen eine deutliche Anzahl verschiedenster Proteinen vorhanden ist.
4. Diskussion
Betrachtet man zunächst die Ergebnisse bei der Bestimmung des Gesamtproteingehalt der
Proben, so ist ziemlich deutlich zu erkennen, dass die Wurzel am wenigsten Protein enthält,
gefolgt vom Spross, angeführt durch die Blätter.
Vergleicht man dies mit dem Teil der Gelelektrophorese, der durch Coomassie-Färbung die
Gesamtheit der in den jeweiligen Organen vorhandenen Proteine aufweisen soll (Abb.: die
vier unteren, längeren Gelelektrophorese-Bilder), erhält man jedoch andere Ergebnisse.
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Betrachtet man zunächst nur die Proteinmuster der Kontrollpflanze, der mit Wasserpaste
behandelten Pflanze und der mit IAA-Paste behandelten Pflanze, so ist es in allen drei Fällen
eigentlich der Spross, der den geringsten Proteingehalt zeigt.
Wird jetzt, der durch unsachgemäße Behandlung entstandene „Schmier“ außer Acht gelassen,
so ist nicht ganz eindeutig, welches Organ die größte Anzahl an Proteinen zeigt.
Bei der nicht-dekapitierten Kontrollpflanze scheint die Wurzel die meisten Proteine zu zeigen,
da hier doch stärkere und zahlenmäßig mehr Bänder zu erkennen sind.
Nicht ganz eindeutig ist das Ergebnis bei der dekapitierten mit Wasserpaste behandelten
Pflanze, hier liegt ein leichter Schmier über dem Streifen, der die Gesamtheit der Proteine in
der Wurzel anzeigen soll, es scheint jedoch so, als würden sich die Proteinmengen in Blättern
und Wurzel die Waage halten.
Bei der mit IAA-Paste behandelten Pflanze ist das Ergebnis eindeutig, hier liegt die zählenund Intensitäts-mäßig stärkste Proteinfärbung in den Blättern vor.
Der Proteinnachweis in den einzelnen Sprossstücken der mit H2O, 2,4-D und IAA-Pasten
behandelten Pflanzen ist recht gut gelungen und untereinander vor allem recht konsistent.
Unterschiede in der Dicke und der Anzahl der Banden gibt es natürlich trotzdem, dies wird
wahrscheinlich zurückzuführen sein auf die Unterschiedlich Expression von Genen
herrührend von der unterschiedlichen Behandlung der einzelnen Pflanzen.
Dennoch zeigt dieser Proteinnachweis ein recht breit gefächertes Proteinvorkommen, das vor
allem von recht großer Menge ist.
Betrachtet man nun die Peroxidase-Aktivität in den einzelnen Proben erhält man schon recht
deutliche Ergebnisse.
Vergleicht man die einzelnen Organe der Pflanzen untereinander auf ihre PeroxidaseAktivität und lässt hierbei die unterschiedlichen Behandlungen mal außer Acht, so erscheinen
die Banden recht konsistent, leichte Verschiebungen und Unterschiede in der Dicke sind zu
erkennen, dennoch befinden sie sich alle etwa in der gleichen Höhe und Ausprägung, was auf
eine ähnliche Enzymausstattung zumindest bezogen auf die Peroxidasen hinweist.
Schaut man jedoch genauer hin, so lässt sich erkennen, dass die nicht-dekapitierte
Kontrollpflanze eine weitere Bande in der Wurzel aufweist, diese Aktivität besitzt keine der
anderen Versuchspflanzen an dieser Stelle.
Nicht nur dieser zuletzt genannte Unterschied in den Banden, sondern auch alle weiteren
Veränderungen lassen sich anhand verschiedener Möglichkeiten erklären.
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Zum einen sei natürlich erwähnt, dass auch Messfehler bzw. Fehler beim Versuchsablauf,
kleiner Ungenauigkeiten etc. für veränderte Banden gesorgt haben könnten.
Da die Unterschiede jedoch in keinem Bereich so gravierend sind, dass man auf einen
eindeutigen Fehler kommen könnte, sei eine unzulängliche Versuchsdurchführung hier
einfach mal außer Acht zu lassen.
Am wahrscheinlichsten, und darauf sollte dieser Versuch auch abzielen, handelt es sich um
unterschiedliche genetische Expressionen der einzelnen Proteine.
Da die genetische Expression beispielsweise wundinduziert ist, kommt es bei der nichtdekapitierten Tomatenpflanze zu einer anderen Protein-Ausprägung, als es bei den anderen,
„verwundeten“ Pflanzen der Fall ist, dies erklärt bspw. die zusätzliche Peroxidase-Aktivität in
der Wurzel die ausschließlich bei der nicht-dekapitierten Pflanze zu finden ist.
Des Weiteren ist die genetische Expression organ- bzw. gewebsabhängig.
Dies erklärt die unterschiedliche Protein-Ausstattung und –Aktivität der einzelnen Organe:
Blatt, Spross und Wurzel zueinander.
Jedes dieser Organe beinhaltet andere Gewebetypen, die zwar das gleiche Genom besitzen,
Gene dennoch unterschiedlich exprimieren, je nach den Bedürfnissen des Gewebes des
jeweiligen Organes.
Unterschiede, die innerhalb einer „Organgruppe“ auftreten, bspw. die Unterschiede in der
Proteinaktivität der mit Wasserpaste behandelten Pflanze zu der mit IAA-Paste behandelten
Pflanze könnten auf eine entwicklungsabhängige Expression der Gene hindeuten, was
bedeuten würde, dass eine Pflanze besser oder weniger gut entwickelt ist als die andere, und
damit schon andere Bedürfnisse aufweist.
Da die Tomatenpflanzen zur gleichen Zeit angezogen wurden, könnten diese Unterschiede
auch auf eine hormonregulierte Genexpression hindeuten.
Diese Vermutung wird dadurch untermauert, dass die Sprossstücke der mit Wasserpaste
behandelten Pflanze, der mit 2,4-D-Paste behandelten Pflanze und der mit IAA-Paste
behandelten Pflanze unterschiedliche Proteine aufweisen, was sich unter Umständen auf die,
zwar zur gleichen Hormongruppe gehörenden, dennoch unterschiedlichen Hormone
zurückführen lässt.
IAA, wie auch 2,4-D sind Phytohormone und gehören zur Gruppe der Auxine.
IAA ist, im Gegensatz zu 2,4-D ein natürlich in der Pflanze vorkommendes Hormon, welches
von ihr auch weiter verstoffwechselt werden kann.
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2,4-D hingegen ist ein synthetisches Auxin, für das in der Pflanze keine geeigneten
Transportmöglichkeiten bestehen, was die Pflanze nicht verstoffwechseln kann und welches,
aufgrund seiner extrem wachstumsfördernden Wirkung als Herbizid eingesetzt wurde
Dieser Fakt wirft eine weitere Art der Genexpression auf.
Leiden Pflanzen unter Stress, was die 2,4-D behandelte Pflanze durchaus getan haben wird, so
exprimieren sie andere Gene, als in Ruhezeiten der Fall ist.
Die Pflanze versucht sich, mit Hilfe ihrer genetischen Möglichkeiten, auf eine Stressphase
einzustellen und diese möglichst unbeschadet zu überstehen.
Dies sorgt natürlich für eine andere Genexpression und damit auch für eine andere
Proteinausstattung, was wiederum die Unterschiede in den Banden zu den anderen
Versuchspflanzen bestätigen würde.
Alles in allem spielen also verschiedenste Faktoren in die Genexpression und damit auch in
die Proteinausstattung mit ein, was wohl dafür sorgt, das keine Pflanze einer anderen in ihrer
Proteinausstattung oder –aktivität gleicht.
5. Literaturhinweise

Neil A. Campbell, Jane B. Reece, Biologie, 6. Auflage, Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg – Berlin, 2003

Wilhelm Nultsch, Allgemeine Botanik, 11. Auflage, Thieme Verlag, Stuttgart – New
York, 2001

Helmut Plattner, Joachim Hentschel, Zellbiologie, 2. Auflage, Thieme Verlag,
Stuttgart – New York, 2002

Hans Ulrich Koecke, Peter Emschermann, Eckhart Härle, Biologie, 4. Auflage,
Schattauer Verlag, Stuttgart – New York, 2000

David Nelson, Michael Cox, Lehninger Biochemie, 3. Auflage, Springer Verlag,
Berlin – Heidelberg – New York, 2005
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