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Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis _____________________________________ V
1.
Einleitung ________________________________________________1
1.1
Adenoviren _________________________________________________________ 1
1.1.1
Die produktive Infektion ______________________________________________ 2
1.1.2
Die abortive Infektion ________________________________________________ 4
1.2
Struktur und Proteine der E1A-Region des onkogenen Serotyps Ad12 __________ 4
1.3
Kontrolle der Genexpression durch die E1A-Proteine:
Aktivierung und Repression ____________________________________________ 6
1.4
Interaktion der zellulären Koaktivatoren p300/CBP mit den E1A-Proteinen ______ 8
1.4.1
Die Koaktivatorfunktionen von p300/CBP ________________________________ 9
1.4.2
Modulation der Koaktivatorfunktionen von p300/CBP durch die E1A-Proteine __ 11
1.4.2.1 Repression der Koaktivatorfunktionen von p300/CBP durch die E1A-Proteine ___ 11
1.4.2.2 Aktivierung der Koaktivatorfunktionen von p300/CBP durch die E1A-Proteine __ 12
1.5
Koaktivatoren als Schaltstellen der E1A-vermittelten Modulation zellulärer
Signaltransduktionswege: der cAMP/PKA-abhängige Signalweg _____________ 13
1.5.1
Regulation des cAMP/PKA-Signaltransduktionswegs durch die E1A-Proteine:
Repression und Aktivierung ___________________________________________ 14
1.6
Zielsetzung ________________________________________________________ 16
2.
Material ________________________________________________17
2.1
Chemikalien _______________________________________________________ 17
2.2
Enzyme ___________________________________________________________ 18
2.3
Peptide und Proteine _________________________________________________ 18
2.4
Antikörper ________________________________________________________ 19
2.5
Nukleinsäuren ______________________________________________________ 20
2.6
Medien, Seren, Transfektionsreagenzien und Zellkulturplatten _______________ 20
2.7
Radioaktive Substanzen ______________________________________________ 21
2.8
Molekulargewichtstandards ___________________________________________ 21
2.9
Kits ______________________________________________________________ 21
2.10
Filme, Filter, Membranen und besondere Verbrauchsmaterialien ______________ 22
2.11
Spezielle Laborgeräte ________________________________________________ 22
2.12
Puffer und Lösungen ________________________________________________ 23
2.13
Bakterienstämme ___________________________________________________ 27
2.14
Hefen ____________________________________________________________ 28
2.15
Zellinien __________________________________________________________ 28
Inhaltsverzeichnis
II
2.16
Expressionsplasmide ________________________________________________ 28
2.17
Zur Verfügung gestellte Plasmide ______________________________________ 29
2.18
Oligonukleotide ____________________________________________________ 32
3.
Methoden _______________________________________________34
3.1
Allgemeine Methoden _______________________________________________ 34
3.2
Zellkultur _________________________________________________________ 34
3.3
Transfektion eukaryontischer Zellen ____________________________________ 35
3.3.1
Lipofektion ________________________________________________________ 35
3.3.2
Elektroporation _____________________________________________________ 35
3.4
Bestimmung der CAT-Aktivität in Zellextrakten __________________________ 35
3.5
Präparation von Cytoplasma- und Kernextrakten __________________________ 36
3.6
Protein-Protein-Interaktionsanalysen _________________________________ 36
3.6.1
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese __________________________________ 36
3.6.2
Aufreinigung des HIS6-E1A12S-Proteins über Ni-NTA-Metall-Affinitätschromatographie ____________________________________________________ 37
3.6.2.1 Aufreinigung des HIS6-E1A12S-Proteins unter denaturierenden Bedingungen ____ 37
3.6.2.2 Renaturierung des HIS6-E1A12S-Proteins _________________________________ 37
3.6.3
Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen ________________________________ 38
3.6.4
GST-Fusionsprotein-Interaktionsanalysen ________________________________ 39
3.6.5
Western-Blot ______________________________________________________ 39
3.6.6
Immunpräzipitationen _______________________________________________ 40
3.6.7
Immunfluoreszenz-Untersuchungen ____________________________________ 40
3.6.8
Protein-Protein-Interaktionsstudien mittels des SOS-„Two-Hybrid“-Systems ____ 41
3.6.8.1 Herstellung kompetenter cdc25-2-Hefen _________________________________ 41
3.6.8.2 Transformation kompetenter cdc25-2-Hefen ______________________________ 41
3.6.8.3 Selektive Wachstumsbedingungen zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen
im SOS-„Two-Hybrid“-System ________________________________________ 41
3.6.9
Histonacetyltransferase-Analysen (Brownell und Allis, 1995) ________________ 42
3.6.9.1 HAT-Analysen mit rekombinanten Proteinen _____________________________ 42
3.6.9.2 Kombinierte GST-Fusionsprotein-Interaktions-/HAT-Analysen_______________ 42
3.6.9.3 Kombinierte Immunpräzipitations-/HAT-Analysen ________________________ 43
3.6.9.4 HAT-Analysen _____________________________________________________ 43
3.6.9.5 Qualitative HAT-Analysen____________________________________________ 43
3.7
DNA-Protein-Interaktionsanalysen ___________________________________ 43
3.7.1
Gelretardationsanalysen ______________________________________________ 43
3.7.2
DNA-abhängige Protein-Protein-Interaktionsanalysen ______________________ 44
3.7.3
Chromatin-Immunpräzipitationen ______________________________________ 45
Inhaltsverzeichnis
III
4.
Ergebnisse ______________________________________________46
4.1
Der E2Ad12-Promotor enthält ein cAMP-Response-Element __________________ 46
4.2
Das E1A12S-Protein aktiviert den E2Ad12-Promotor in Abhängigkeit des
N-Terminus und der CR1-Domäne _____________________________________ 49
4.3
Die zellulären Transkriptionsfaktoren CREB-1 und ATF-1 binden an das
E2-CRE des E2Ad12-Promotors _________________________________________ 51
4.4
Die zellulären Transkriptionsfaktoren CREB-1/ATF-1 aktivieren den
E2Ad12-Promotor ____________________________________________________ 54
4.5
Die zellulären Transkriptionsfaktoren CREB-1 und ATF-1 interagieren mit dem
E1A12S-Protein in vitro und in vivo _____________________________________ 56
4.6
Die E1A12S-vermittelte Aktivierung des E2Ad12-Promotors korreliert mit der
Fähigkeit des adenoviralen Proteins an die zellulären Koaktivatoren p300/CBP
zu binden _________________________________________________________ 59
4.7
Die Transkriptionsfaktoren CREB-1 und ATF-1 rekrutieren das E1A12S-Protein
an das E2-CRE _____________________________________________________ 62
4.8
Der CBP-Inhibitor Roscovitine und die Histondeacetylase HDAC-1 inhibieren
die E1A12S-vermittelte Aktivierung des E2Ad12-Promotors ___________________ 63
4.9
Die HDAC-1-vermittelte Repression des E2Ad12-Promotors wird durch die
Expression von p300/CBP aufgehoben __________________________________ 66
4.10
Das Histonprotein H4 wird im Prozeß der Aktivierung des E2Ad12-Promotors
acetyliert __________________________________________________________ 67
4.11
Das E1A12S-Protein moduliert die HAT-Aktivität von p300/CBP _____________ 68
4.12
Die E1A12S-vermittelte Aktivierung des E2Ad12-Promotors korreliert mit der
Fähigkeit des viralen Proteins mit der HAT-Funktion von p300/CBP in vivo
zu assoziieren ______________________________________________________ 71
4.13
Inhibitoren des cAMP/PKA-abhängigen Signaltransduktionswegs wirken der
Transaktivierung des E2Ad12-Promotors durch das E1A12S-Protein entgegen _____ 73
4.14
Die regulatorischen Untereinheiten RI und RII des PKA-Holoenzyms
interagieren mit dem E1A12S-Protein in vitro______________________________ 76
4.15
Die regulatorischen Untereinheiten RI und RII des PKA-Holoenzyms
interagieren mit dem E1A12S-Protein in vivo ______________________________ 78
4.16
Das E1A12S-Protein transloziert die RII-Untereinheit in den Zellkern _________ 81
4.17
Die Koexpression der RII-Untereinheit und des E1A12S-Proteins führt zu einer
starken Transaktivierung des E2Ad12-Promotors ___________________________ 84
5.
Diskussion ______________________________________________86
5.1
Aktivierung des E2Ad12-Promotors durch den E2-CRE-gebundenen Komplex
bestehend aus CREB-1/ATF-1, p300/CBP und dem E1A12S-Protein ___________ 87
5.2
Die E1A12S-vermittelte Translokation der RII-Untereinheit des PKA-Holoenzyms
als Voraussetzung für die Aktivierung des E2Ad12-Promotors _________________ 92
5.3
Modell der Aktivierung des E2Ad12-Promotors durch das E1A12S-Protein _______ 96
Inhaltsverzeichnis
IV
6.
Zusammenfassung und Ausblick ____________________________98
7.
Literaturverzeichnis _____________________________________100
8.
Eigene Publikationen ____________________________________113
9.
Lebenslauf _____________________________________________114
10.
Erklärungen ____________________________________________115