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Zentrum für Med. Mikrobiologie, Krankenhaushygiene und Virologie Praktikumsbegleitendes Skript für Studierende der Pharmazie Sommersemester 2016 1 2 Inhaltsverzeichnis Einführung Kurs 1 ............Färbungen, ,Rachenabstrich, Fingerabdruck Kurs 2 ............Streptokokken, Staphylokokken, Pneumokokken, Neisserien Kurs 3............Salmonellen, Shigellen, Fakultativ pathogene Darmbakterien, Resistenzbestimmung Kurs 4............ Mykobakterien, Anaerobier Kurs 5........... Treponemen, Borrelien, Serologie, TPHA, IFT, ELISA . Kurs 6............Parasiten Kurs 7 ............Mykologie, Wiederholung 3 Mikrobiologisches-Immunologisches Praktikum Allgemeine Regeln für das Arbeiten im Praktikum Mit der zugeteilten Nummer sind Sie Inhaber eines Arbeitsplatzes geworden, für dessen Zustand Sie während und nach der Arbeit verantwortlich sind. Weil das Material, mit dem Sie umgehen, auch Krankheitserreger enthalten kann, müssen während der gesamten Kursdauer - ohne dass in Zukunft besonders darauf hingewiesen wird - folgende Verhaltensregeln eingehalten werden: Fenster und Türen müssen während der Arbeit geschlossen sein. In den Arbeitsräumen darf nicht gegessen, getrunken oder geraucht werden. Im Sicherheitsbereich müssen Laborkittel getragen werden. Diese Kittel dürfen außerhalb des Labors nicht getragen werden. Schutzbrille mitbringen. Mund pipettieren ist untersagt; Pipettierhilfen sind zu benutzen.. Bei den Arbeiten mit Mikroorganismen dürfen keine Aerosole entstehen. Nach Beendigung der Arbeit und vor Verlassen des Labors müssen die Hände desinfiziert und sorgfältig gewaschen werden. Die Laborräume sollen sauber und aufgeräumt sein. Die Arbeitstische dürfen nicht als Abstellflächen benutzt werden - Vorräte müssen in den dafür vorgesehenen Räumen bzw. Schränken gelagert werden. Die Identität der verwendeten Mikroorganismen und mögliche Kontaminationen sind regelmäßig zu überprüfen. Ungeziefer muss regelmäßig bekämpft werden. Alle Arbeitsplätze sind täglich zu desinfizieren. Kontaminierter flüssiger oder fester Abfall in die gelben Eimer werfen. Wird kontaminiertes Material verschüttet, ist der betroffene Bereich sofort zu desinfizieren. Lassen Sie infektiöses Material nicht aus den Augen. Sorgen Sie dafür, daß entsprechende Gefäße nach der Entnahme des Materials sofort wieder verschlossen werden und dass nicht mehr benötigtes Material sofort einem Desinfektionsvorgang bzw. -mittel ausgesetzt wird. 4 Anweisungen für den Kurssaal Die Platinösen sind vor und unmittelbar nach Gebrauch in der nicht leuchtenden Bunsenbrennerflamme bis zur Rotglut auszuglühen, und der Halter ist mit der Öse nach oben in den Halterklotz zu stecken. Sämtliche Petrischalen müssen mit dem Deckel nach u n t e n abgelegt werden, um Verunreinigungen der Kulturen durch herablaufendes Kondenswasser zu vermeiden. Beschriftungen von Kulturgefäßen mit dem roten Fettstift müssen grundsätzlich auf dem unverwechselbaren Teil mit der Platznummer gekennzeichnet werden (z. B. bei Petrischalen auf dem Gefäßboden). Öffnen Sie Gefäße, in denen sich Bakterienkulturen befinden, nur bei Bedarf und möglichst kurzzeitig, um Verunreinigungen aus der Luft zu vermeiden. Die Öffnungen von Glasgefäßen sollen nach dem Öffnen und vor dem Schließen leicht mit dem Bunsenbrenner abgeflammt werden. Sollte es bei einem Bunsenbrenner zum Durchschlagen der Flamme kommen, dann muß der Gashahn geschlossen werden. Weil 96%iger Alkohol auf den Arbeitsflächen steht, ist größte Vorsicht bei der Benutzung des Bunsenbrenners geboten. Es wird erwartet, dass Sie die Mikroskope sorgfältig behandeln. Wenn Sie die Ölimmersion benützen und Tubus und Objektträger einander genähert sind, ist die Mikrometerschraube mit der nötigen Vorsicht zu betätigen, weil sonst Gefahr besteht, daß der Objektträger zerdrückt und die Objektivlinse beschädigt wird. Reinigen Sie die Objektive nach Benutzung am Ende jeder Kursstunde mit dem dafür vorgesehenen Läppchen von anhaftendem Immersionsöl. 5 Maßnahmen bei Zwischenfällen Bei Hautkontakt mit Mikroorganismen ist der kontaminierte Bereich mit Haut-desinfektionsmitteln (Sterilium, Meliseptol) zu behandeln. Bei Verletzungen und nach Inkorporation von Mikroorganismen (Verschlucken, Einatmen von Aerosolen, Kontakt mit Schleimhäuten) ist der Betroffene nach einer evtl. erforderlichen Erste-Hilfe-Behandlung dem Betriebsarzt vorzustellen. Im Gefahrenfall ist analog der Brandschutzordnung zu verfahren. Brennbare Flüssigkeiten (Alkohol etc.) dürfen nicht in Flammennähe aufbewahrt werden. Notfallplan 1. Ruhe bewahren 2. Brand bzw. Unfall melden Feuerwehr 112 bzw. 88-112 Feuermelder betätigen 3. Inhalt der Meldung - Was ist passiert? - Wo ist es passiert? - Sind Menschen in Gefahr? - Wer meldet? (Name, Tel.) 4. In Sicherheit bringen - Gefährdete Personen warnen - Hilflose in Sicherheit bringen - Türen und Fenster schließen - gekennzeichneten Fluchtweg benutzen - im Brandfall keinen Aufzug benutzen 5. Löschversuch unternehmen - vorhandene Löschgeräte benutzen 6 Hygieneplan für den Kurssaal Was Händedesinfektion Wann Nach Kontamination Nach Beendigung kontaminationsträchtiger Tätigkeiten Nach dem Ausziehen von Handschuhen Vor Verlassen des Labors Wie1 Womit2 Eine Hohlhand voll 30 Sek. verreiben (Bei Labortätigkeiten mit Kontaminationsgefahr und Notwendigkeit der Händedesinfektion keinen Schmuck an Händen und Unterarmen tragen!) Mehrmals täglich und bei Bedarf Nach Hautreinigung in die trockenen Hände einreiben Bei Gefahr der Kontamination mit erregerhaltigem Material Handschuhe anziehen, nach dem Ausziehen der Handschuhe eine hygienische Händedesinfektion durchführen Bei der Arbeit in den Laborräumen Schutzkittel geschlossen tragen Entsorgung: nach Kontamination/Verunreinigung in dichten Wäschesäcken Sterillium classic pure Siehe Hautschutzplan des Betriebsärztlichen Dienstes (im Hygieneordner) Hände pflegen Handschuhe Kittel Arbeitstäglich und bei Bedarf Desinfektion der Arbeitsflächen Fläche mit Einmal-Papiertuch, Zellstoff oder ähnlichem feucht abwischen, trocknen lassen., Des.tücher in blauen Eimern Dabei Handschuhe tragen, Hautkontakt mit dem Flächendesinfektionsmittel vermeiden (Allergie-Gefahr)! Nach Gebrauch In Abfallbehälter sammeln autoklavieren und in Abfall entsorgen Nach Gebrauch Maschineller Aufbereitung zu führen Nach Gebrauch Maschineller Aufbereitung zu führen Routinemäßig: Incidin rapid 0,25 % Kulturplatten, sonstige erregerhaltige Materialien Laborgefäße Instrumente, Objektträger Gemäß Medizinprodukte-Betreiber-VO erfolgt die Aufbereitung nach Herstellerangaben. Medizinisch-technische 1 2 Nach Kontamination und bei Bedarf Äußere Flächen (z.B. Gehäuse) können oft, falls nicht anders vom Hersteller angegeben, mit Standard-Flächendesinfektionsmittel abgewischt werden. Die Angaben der Arbeitssicherheit und des Arbeitsschutzes sind zu beachten. Herstellerangaben zur Materialverträglichkeit sind zu beachten. 7 Incidin rapid 0,25 % Geräte Ausstattung des bakteriologischen Arbeitsplatzes Für die Herstellung mikroskopischer Präparate: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Objektträger Ständer mit Ösenhaltern und Ösen 0,9%ige NaCl-Lösung, steril Glasschreiber Deckgläschen Fettstift Für Färbungen: 9. 10. 11. 12. Färbebank Färbepinzette Färbelösungen Färbeküvette mit. 3%igem Aceton –Alkohol 70% 13. Fließpapier zum Trocknen der gefärbten Präparate Zur Betrachtung von mikroskopischen Präparaten: (Plastikhaube der Mikroskope unterhalb der Tischplatte unterbringen) 14. Mikroskop: Binokular/Monokular 10-fach Objektive a) Trockensystem (2,5-, 10-, 40-fach) b) Immersionssystem (100-fach) Vergrößerung = Objektivvergrößerung mal Okularvergrößerung 15. 16. Immersionsöl Tücher für die Reinigung der Objektive Zur Keimabtötung: 17. 18. Bunsenbrenner Töpfe mit Desinfektionslösung für Spatel und Objektträger 8 9 Kurs 1 Themen: Färbungen Rachenabstrich Fingerabdruck 10 Aufgaben: 1. Präparate „Bakteriengemisch“ 2. Beschreiben Sie im Protokollblatt „Mikroskopie“ - die Farbe (grampositiv, gramnegativ) - die Form (rund, oval, lanzettförmig,stäbchenförmig) - die Lage der Bakterien zueinander(einzeln,paarweise,kettenförmig,traubenförmig) - sonstige Gebilde(Zellkern, Epithelien,Leukozyten,Zelldetritus) - die Lage der Bakterien zu Leukozyten (intra- oder extrazellulär) - Grössenverhältnisse Bakterien – Zellen 3. Rachenabstrich anfertigen - Präparat: Gramfärbung - Ausstrich auf Blutagarplatte; Beschriftung nicht vergessen! 4. Hygienische Händedesinfektion „Fingerabdruck“ Arbeitsanleitungen zu Kurs 1 Herstellung des Ausstrichpräparates 1. 2. Mit dem Glasschreiber Präparate markieren. Auf einen sauberen Objektträger mit der ausgeglühten und abgekühlten Öse eine Öse Bakteriengemisch bringen. 3. Präparat an der Luft trocknen. 4. Das völlig luftgetrocknete Präparat hitzefixieren: Objektträger - Schichtseite nach oben - dreimal durch die Flamme des Bunsenbrenners ziehen. 11 Färbung nach G r a m (Differentialfärbung) Prinzip: Karbol-Gentianaviolett bilden mit Lugol-Lösung (verdünnte Jod-Kaliumjodid-Lösung) in der Zellwand einen Farbstoff-Jod-Komplex. Durch Differenzieren mit Alkohol oder Aceton wird dieser Komplex nur aus gramnegativen Bakterien wieder entfernt. Die Gegenfärbung kann dann mit Fuchsin erfolgen. Durchführung: 1. Hitzefixierten Ausstrich vollständig mit Karbol – Gentianaviolett bedecken. Nach 2 min Farbe abgießen. 2. Lugol-Lösung 2 min einwirken lassen. Kurz mit Wasser abspülen. 3. Entfärben mit Aceton-Alkohol (in Küvette), bis keine Farbwolken mehr abgehen. 4. Gründlich mit Wasser abspülen. 5. Gegenfärbung mit verdünnter Fuchsinlösung 1 - 2 min. 6. Objektträger mit Wasser abspülen und anschließend zwischen Filterpapier trocknen. Beurteilung: Grampositive Bakterien sind blauschwarz gefärbt. Gramnegative Bakterien sind rot gefärbt. Gefärbte Präparate werden o h n e Deckglas mit Öl mikroskopiert. Sie benötigen v o l l e s Licht. 3 – Ösen-Ausstrich: Das Ziel ist die Gewinnung gut isolierter Einzelkolonien. - Mit Impfmaterial behaftete Öse in Zickzacklinien über etwa die Hälfte der Nähbodenoberfläche führen, ohne sie aufzukratzen. - Öse ausglühen lassen, dann zwei- bis dreimal durch den ersten Ausstrich gehen und ein weiteres Viertel der Oberfläche beimpfen. - Mit der erneut ausgeglühten Öse das letzte Viertel beimpfen mit Material, das analog vom vorhergehenden Viertel gewonnen wurde. 12 13 Kurs 2 Streptokokken Staphylokokken Pneumokokken Neisserien 14 Aufgaben: 1. Kulturplatte des Fingerabdruckes betrachten. 2. Kulturplatte des Rachenabstriches betrachten. 3. Keime wurden auf Blutagar ausgestrichen und 24 Std. lang im Brutschrank bei 37°C bebrütet. Beschreiben Sie im Protokollblatt: - Farbe , Form der Kolonie - Hämolyse ( - ,- ,-Hämolyse ) 4. Koagulase testen.( Staph. aureus, Staph. epidermidis ) 5. DNAase Test für Staphylococcus aureus und S. epidermidis auswerten. ( pro Reihe ausgeteilt ) 6. Katalase testen. (Staphylokokken, Streptokokken ) 7. Überprüfung der Optochinempfindlichkeit. 8. Cytochromoxydase testen ( apathogene Neisserien ). 9. Zur Ansicht steht auf der ersten Bank eine CTA Reihe. 10. Mikroskopieren Sie die pro Team ausgeteilten Präparate: - Staphylokokken-Eiter - Streptokokken-Eiter - Pneumokokken-Eiter - Meningokokken-Liquor - Gonokokken-Eiter - Erythrozyten + Leukozyten 15 Arbeitsanleitungen zu Kurs 2 Beurteilung der Hämolyse: Alpha-Hämolyse: -hämolysierende Bakterienkolonien sind auf Frischblutagar von grünen Höfen umgeben. Bei partiell intakten Erythrozytenmembranen ist es zur Umwandlung von Hämoglobin in Met- und Sulfhämoglobin gekommen. Beta-Hämolyse: -hämolysierende Bakterienkolonien sind auf Frischblutagar von vollständig entfärbten, durchsichtigen Höfen umgeben. Die roten Blutkörperchen wurden vollständig aufgelöst und das Hämoglobin wurde zu farblosen Substanzen abgebaut. Gamma-Hämolyse: Dieser Begriff (-Hämolyse) steht für keine makroskopisch sichtbare Veränderung des Frischblutagars im Kolonienbereich. Koagulase : Durch dieses Enzym wird das Fibrinogen im Citratplasma von Menschen und Kaninchen in Fibrin überführt. Suspendiert man Staphylococcus aureus in einen auf einem Objektträger befindlichen Citratplasma-Tropfen, so kommt es zur Ausfällung von Fibrin, in dessen Netzwerk die Staphylokokken eingebettet sind. Makroskopisch erkennt man die Bildung kleiner Klümpchen in klarer Flüssigkeit (positives Ergebnis), die an eine Agglutination denken lassen. Im Gegensatz zu anderen Staphylokokken besitzen fast alle Staphylococcus aureus-Stämme diesen "Clumping factor" an ihrer Zelloberfläche. Durchführung: Führen Sie den Test mit Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis durch. Nehmen Sie eine zu prüfende Kolonie und verreiben Sie diese auf einem Objektträger zwischen 1 Tropfen Kochsalzlösung und daneben 1 Tropfen Plasma. Vermischen Sie anschließend den Keim mit dem Kochsalztropfen und dann mit dem Plasmatropfen. Achten Sie darauf, dass die beiden Tropfen nicht miteinander vermischt werden. DNase (Desoxyribonuklease) – Test: DNase, ein von verschiedenen Bakterienarten produziertes, extrazelluläres Enzym, hydrolysiert DNA zu kleineren aus Nukleotiden bestehenden Einheiten. Im Gegensatz zur DNA sind Nukleotide im sauren Milieu löslich. Wird ein DNA-haltiger Nährboden nach Ausbildung von Wachstum mit Säure geflutet, 16 zeigen sich um DNase positive Kolonien klare Zonen, während der übrige Nähboden durch Ausfällung der DNA getrübt ist. Staphylokokken Stämme wurden strichförmig auf die DNA Platte aufgeimpft; nach 24stündiger Bebrütung bei 36°C mit 1M Salzsäure vorsichtig überflutet. Betrachten Sie die Platte und tragen das Ergebnis in den Protokollbogen ein: Positiv: Klare Zone um den Wachstumsbereich. Negativ: Keine Veränderung der Kolonieumgebung Katalase – Test: Katalase-positive Bakterien (z. B. Staphylokokken) spalten das Wasserstoffperoxid einer 3 %igen H2O2-Verdünnung, wobei der freiwerdende Sauerstoff zur Bläschenbildung führt. Durchführung: Verreiben Sie mit einer Öse 2 - 3 Kolonien von den Staphylokokken, bzw. Streptokokken auf einen Objektträger. Tropfen Sie Katalasereagenz (H2O2) auf diesen Bereich. Eine positive Reaktion erkennt man an der Bläschenbildung. Positiv: Rasche Entwicklung von Gasblasen in der Flüssigkeit Negativ: Keine Gasentwicklung Darstellung und Überprüfung der Optochinresistenz zur Differenzierung von S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae („Pneumokokken“) bildet auf Blutagar kleine, vergrünende Kolonien, die denen von Viridansstreptokokken ähneln. Wegen des sehr unterschiedlichen Virulenzpotentials ist die Differenzierung der Gruppen von wesentlicher Bedeutung; etwa im Mund-/Rachenraum oder in bronchoskopisch gewonnenem Material können beide Spezies vorkommen, Viridansstreptokokken als Bestandteil der normalen Flora, Pneumokokken als nicht ungewöhnlicher Erreger von Pneumonien. Obwohl die Kolonieform und eine Färbung nach Gram dem Geübten gute Hinweise liefern, sollte zur sicheren Differenzierung die Testung auf Optochinresistenz durchgeführt werden. Optochin (Ethyl-Hydrocuprein) aktiviert in S. pneumoniae, nicht jedoch anderen Streptokokken, eine Muraminidase, deren Aktivität zur Autolyse der Bakterien führt; entsprechend können die Bakterien in Gegenwart von Optochin nicht wachsen. Praktisch ist diese Empfindlichkeit in einem Agardiffusionstest einfach nachweisbar (mehr zur Resistenztestung von Bakterien im Kursteil E): Suspensionen der zu testenden Bakterienstämme oder -isolate werden auf einer Agarplatte ausgestrichen. Anschließend werden kleine Testblättchen, die das Antibiotikum (hier Optochin) enthalten, aufgelegt, und die Platte wird über Nacht im Bakterieninkubator inkubiert. Während dieser Zeit diffundiert das Antibiotikum in den Agar ein, und es entsteht ein Konzentrationsgradient der Chemikalie (am höchsten am Plättchen, nach außen abfallend). Am nächsten Tag erfolgt die Auswertung: Das zu bewertende Kriterium ist die Hemmhofgröße, d.h. mittelbar die Konzentration, die das Bakterienwachstum inhibiert (für diese Bewertung gibt es nationale und internationale Referenzwerte, die je nach Testverfahren herangezogen werden). Tragen Sie das Ergebnis für Pneumokokken in den Protokollbogen. 17 Cytochromoxidase-Reaktion: Dieses letzte Enzym der Atmungskette wird nachgewiesen. Positiv reagieren z. B. Neisseria, Aeromonas und Pseudomonas aeruginosa. Durchführung: Mit dem Oxidase-Teststreifen ( pro Team verteilt) eine Kolonie der apathogenen Neisserien antippen. Bei positivem Testausfall verfärbt sich der Streifen innerhalb von 20 Sekunden tiefblau. CTA (Cystin Trypticase Agar ) Reihe: Bunte Reihe zur Kohlenhydratspaltungsprüfung ( Dextrose, Fruktose, Maltose, Saccarose, Lactose ) von Neisserien. Durchführung: Der zu testende Keim wird nur auf die Oberfläche des Mediums aufgeimpft. Da entstehende Säure im halbfesten Medium nicht in die übrigen Bereiche des Nährbodens diffundiert, lässt sich die Kohlenhydratspaltung im Bereich des Bakterienwachstums erkennen, Positiv: Gelbfärbung(in der oberen Substratschicht) Negativ:Kein Farbumschlag Differenzierung grampositiver Kokken Katalase - + Enterococcus Staphylococcus Koagulase + S.aureus (ß-Hämolyse) a -Hämolyse vergrünende Streptokokken S. epidermidis S. saprophyticus 18 Streptococcus ß-Hämolyse Streptokokken der serologischen Gruppen A,B -Hämolyse Enterococcus Protokollblatt Staph. aureus Staph. Pneumokok Vergr. Enterokokk epidermidis ken Streptokokk en en Form der Kolonie Farbe der Kolonie Hämolyse Katalase Koagulase DNase Oxidase Optochin Mikroskop. Bild 19 Streptokokk Neisseria Neisseria en meningitidis gonorrhoeae z. B. Gruppe A,B 20 Kurs 3 E. coli Salmonellen Proteus Klebsiella Pseudomonas Serratia Keimzahlbestimmung Resistenzbestimmung 21 Aufgaben: 1. Beschreiben Sie im Protokollbogen die Keime auf den Kulturen und im Präparat. 2. Suchen Sie im Kauffmann White Schema S. düsseldorf 3. Betrachten Sie die KLIGLER – Reihe 4. Führen Sie den Oxydasetest beim Pseudomonas und Proteus im Team durch. 5. Zur Ansicht pro Reihe: Bunte Reihe, Api`s 6. Führen Sie den Indol-Nachweis im Team durch. 7. Werten Sie die Resistenzbestimmung aus! 8. Uriculte (pro Team zur Ansicht ) 9. Zur Ansicht Blutkulturen. 22 Mac Conkey: Eingesetzt zur Isolierung von Enterobacteriaceae und verwandten gramnegativen enterischen Bakterien. Haupbestandteile: Pepton Gallensalze Kristallviolett Lactose Neutralrot ( Indikator, Rotfäbung bei ph <6,5 ) Gallensalze und Kristallviolett verhindern das Wachstum von grampositiven Bakterien. Lactose ist die einzige Kohlenhydratquelle im Agar. Lactose verstoffwechselnde Bakterien bilden gemischte Säuren, es kommt zur Rotfärbung der Kolonien. Positiv: rote Kolonien (E.coli, Klebsiellen, u.a.) Negativ: farblose , klare Kolonien (Salmonellen, Shigellen u.a.) Kauffmann-White Schema: Diagnostische Antigentabelle der Salmonella-Arten. Aufgrund unterschiedlicher Antigenformeln lässt sich die Gattung Salmonella in über 2000 Serovare unterteilen. Kligler – Reihe: Schrägagar zur Identifizierung von Enterobacteriaceae auf der Basis einer zweifachen Zuckerverwertung und der Sulfid-Bildung. Der Nährboden enthält zwei Zucker – Lactose und Glucose – und Eisencitrat als Indikator. Gelbe Hochschicht/rote Schrägschicht: Glucose positiv, Lactose negativ Gelbe Hochschicht/gelbe Schrägschicht: Glucose positiv, Lactose positiv Rote Hochschicht/ rote Schrägschicht: Glucose negativ, Lactose negativ H2S-Bildung: Schwärzung Gasbildung: 23 Aerob: Blasen-Bildung oder Aufreissen des Nährbodens 24 Anaerob: keine Gasbildung Protokollbogen: E.coli S. yphimurium Klebsiella Serratia Koloniefor m -farbe Mikroskop. Bild Kligler Schrägteil Hochschicht H2S Gas 25 Proteus Pseudomonas Kurs 4 I Mykobakterien II. Anaerobier 26 I Mykobakterien Aufgaben: 1. An Ihrem Arbeitsplatz steht pro Team eine Kultur M. smegmatis. Fertigen Sie davon ein mikroskopisches Präparat an. Reiben Sie den Keim auf dem Objektträger vom Rand her in den NaCl Tropfen ein. Nach Trocknen des Präparates Hitzefixierung und Färbung nach Ziehl-Neelsen. 2. Mikroskopieren Sie die fertigen Präparate M. tuberculosis / Sputum und M. tuberculosis / Kultur – Cord-Faktor Tbc – Färbung nach Ziehl-Neelsen: 1. Präparate trocknen und hitzefixieren 2. Mit Karbolfuchsinlösung bedecken 3. Objektträger mit Bunsen-Flamme von unten bis zur Dampfbildung erhitzen ( nicht kochen!) 4. Abkühlen lassen 5. Das Erhitzen und Abkühlen zweimal wiederholen 6. Abspülen mit Wasser 7. Entfärben mit HCL-Alkohol bis keine Farbwolken mehr abgehen 8. Abspülen mit Wasser 9. Gegenfärben mit Malachitgrün 1 Minute 10. Abspülen mit Wasser Ergebnis: Säurefeste Stäbchen rosa bis rot, sonstige Keime und Zellen grün.. Sie können bei dieser Färbung nicht zwischen Tuberkulosebakterien und nichttuberkulösen Mykobakterien unterscheiden. Deshalb lautet der Befund nicht "Tuberkulosebakterien nachweisbar", sondern "säurefeste Stäbchen nachweisbar". _________________________________________________________________________ Cord – Faktor: Trehalose – 6,6 – dimycolat hemmt die Wanderung von Leukozyten und verursacht Granulombildung. 27 II Sporenbildner und Anaerobier In diesem Praktikum sollen zwei sich überlappende Gruppen von Bakterien besprochen werden, die sog. Anaerobier (Bakterien, die nur in der Abwesenheit von Sauerstoff wachsen können) sowie die Sporenbildner, die Dauerformen ausbilden und dadurch extrem gut haltbar (oder, aus medizinisch-hygienischer Sicht, schwer zu beseitigen) sind. Die Überlappung besteht in der Gattung der Clostridien, das sind anaerobe Sporenbildner. Aufgaben: 1. Betrachten Sie die Kulturen : - Bacillus cereus auf Nähagar - Clostridium perfringens - Clostridium difficile 2. Betrachten Sie den Clost – Test. 3. Fertigen Sie ein Grampräparat von Bacillus cereus an. 4. Mikroskopieren Sie die ausgeteilten Präparate: - Gasbrand – Wundabstrich - Clostridium tetani – Sporenpräparat - Clostridium difficile – subterminale Spore - Fusobakterien ( Angina Plaut – Vincent ) 5. Zur Ansicht sind in Ihrer Reihe und vorne verschiedene anaerobe Kulturverfahren ausgeteilt. CLOSTRIDIUM PERFRINGENS WUNDABSTRICH 28 Clostridium perfringens Clostridium tetani Clostridium difficile Kultur: Farbe, Form, Grösse Geruch Mikroskopie: Gramverhalten Spore: ja / nein Lage 29 Bacillus cereus Anaerobiermedien enthalten sauerstoffbindene Reduktionsmittel, wie z.B. Cystein Natriumthioglykolat, Glucose, Ascorbinsäure. Durch Autoklavieren wird den Nährmedien der gelöste Sauerstoff ausgetrieben. Da jedoch durch Diffusionsprozesse aus der Raumluft wieder ein langsamer Sauerstoffanstieg im Medium stattfindet, sollten Anaerobiermedien unter anaeroben Bedingungen gelagert werden. Anaerobe Kuturverfahren: Fortner – Platte: Auf einer Hälfte einer Nähragarplatte werden sauerstoffzehrende Bakterien ( z.B. Serratia marcescens ) ausgestrichn; auf die andere Hälfte das Untersuchungsmaterial, aus dem anaerobe Keime Atmosphäre hergestellt angezüchtet werden sollen. Danach wird der Deckel aufgelegt und die Petri – Schale mit Klebeband verschlossen. Serratia marcescens vebraucht bei Ihrem raschen Wachstum den Luftsauerstoff und schafft damit die Grundlage für das Wachstum der obligat anaeroben Mikroorganismen. Anaerobiertöpfe:Hier handelt es sich meist um durchsichtige Kunststoffbehälter mit abgedichtetem Deckelaufsatz, in die jeweils eine ganze Anzahl von Plattenkulturen eingebracht werden können. In den Topf kommt ein Reduktionsmittel, dass den Luftsauerstoff bindet, sowie ein Sauerstoff – Indikatorstreifen, der kontrolliert, ob auch tatsächlich eine anaerobe wird. Clost – Test: = revers CAMP – Test Der Test beruht auf der Lyse von Erythrozyten bei gleichzeitiger Einwirkung von Faktoren, die von den Streptokokken und von dem zu untersuchenden Clostridien perfringens Stamm gebildet werden. Auf eine Columbia – Agarplatte wird mit einer sterilen Öse, strichförmig ein Streptococcus agalactiae Stamm geimpft. Senkrecht dazu wird der zu untersuchende Stamm geimpft, wobei sich die Impfstriche nicht berühren dürfen. Der Agar wird anaerob bei 36° C über Nacht bebrütet. Erscheint eine pfeilförmige Hämolysezone, mit der Pfeilspitze zum Ammenstrich weisend, so handelt es sich um C. perfringens. 30 Kurs 5 Treponemen Borrelien TPHA FTA 31 Aufgaben: 1. Diskutieren Sie den TPHA - Test im Team. 2. Betrachten Sie die Präparate: - Treponemen, Kabolfuchsinfärbung - Borrelia recurrentis Blutausstrich, Giemsafärbung 3. Im hinteren Laborraum ist ein Fluoreszenzmikroskop mit einem FTA - Abs - Test aufgebaut. 4. In der letzten Reihe finden Sie eine Zecke und eine Kleiderlaus im Lichtmikroskop. 32 Antigen-Antikörper-Reaktionen Treffen ein Antigen und ein gegen dieses Antigen gerichteter Antikörper in gelöster Form aufeinander, so bildet sich ein Antigen-Antikörper-Komplex (Immunkomplexe). Die Art der dabei entstehenden Komplexe wird weitgehend durch das Verhältnis von Antigen und Antikörper bestimmt. Sind die Reaktionspartner nahezu äquimolar vorhanden, bilden sich große, netzwerkartige Komplexe, die ausfallen: Es entsteht ein vom bloßen Auge erkennbares Präzipitat. Im Gegensatz dazu bilden sich im Antigen- oder Antikörperüberschuß kleine Immunkomplexe mit nur geringer oder ohne erkennbare Präzipitatbildung. Mit der quantitativen Präzipitationsreaktion (Heidelberger, 1930) wird die Folge der Interaktion verschiedener Mengenverhältnisse von Antigen und Antikörper quantitativ erfaßt. Nur wenn Antigen und Antikörper in einem ausgewogenen Verhältnis vorliegen (Äquivalenz), führen die Bindungen zwischen Antigen und Antikörpermolekülen zu großen, netzartigen Immunkomplexen. Heidelberger Kurve: - + + - + + freies AG - - freier AK Präzipitate - Antigen Bei Ag–Unterschuss oder -Überschuss entstehen nur kleine, nicht sichtbare Präzipitate. Grössere Präzipitate entstehen erst bei äquimolaren Mengen von AG und AK. 33 TPHA - Test = Treponema pallidum - Häm – Agglutinationstest Vorbereitung und Arbeitsmaterial: 1. Antigen: Schaferythrozyten werden mit Formalin und Tannin - Gerbsäure behandelt. Dies bewirkt eine Aufrauhung der Erythrozytenoberfläche und somit Freilegung von Bindungsstellen. An diese Rezeptoren werden jetzt Antigene angelagert, den Nichols - Stamm. Dies ist ein hochspezifisches Antigen, aus dem Hoden infizierter Kanninchen gewonnen. Diese sensibilisierten Schaferythrozyten bilden die Grundlage des TPHA - Test. 2. Serum: Unverdünntes Patientenserum wird 30 Minuten bei 56° C inaktiviert. 3. Zur Verdünnung wird ein Absorptionsmedium eingesetzt, der den Reiterstamm enthält. Dies ist kein echter Treponemen - Stamm. Er entfernt unspezifische Antikörper, die sich gegen alle Treponemen richten. Weiterhin enthält es Zellmembran von Schaferythrozyten, um heterophile Antikörper zu absorbieren, die in fast jedem Patientenserum sind. 4. Negativ Kontrolle: nicht sensibilisierte Schaferythrozyten Bei Bildung einer Zellmatte, hat der Patient immer noch heterophile Antikörper. 5. Positiv Kontrolle: reaktives Kontrollserum Reaktionsablauf: Sind im Patientenserum Antikörper gegen Treponema pallidum, agglutinieren diese die Schaferythrozyten. Es bildet sich eine Zellmatte. Wenn keine Antikörper im Serum vorhanden sind, sedimentieren die Erythrozyten zu einem Knöpfchen. Der TPHA gilt als Suchtest in der Syphilis Diagnostik. Er kann als qualitativer und quantitativer Test in Verdünnungsstufen durchgeführt werden. Er weist IgG und IgM nach, kann jedoch nicht zwischen IgG und IgM unterscheiden. 2 - 3 Wochen nach Primärinfekt ist der TPHA - Test positiv. Ein Titer ab 1: 80 gilt als positiv. Aufgrund des echtem Treponemen Stamm ist der Test hoch spezifisch. Syphyilis, Frambösie und Pinta sind serologisch nicht unterscheidbar. +K -K 1 2 3 1:40 NS 1:80 S 1:160 S S = sensibilisierte Erythrozyten 34 NS = nicht sensibilisierte Erythrozyten DIREKTE UND INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ Hierbei werden Antigen - Antikörper - Reaktionen dadurch sichtbar gemacht, dass einer der Reaktionspartner mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert ist. Das meist benutzte Fluorochrom heisst Fluorescein ( FITC ). Die Reaktion ist im UV – Mikroskop beurteilbar. Trift weisses kurzwelliges energiereichesn Licht von Halogen- oder Quecksilberlampen auf diese Fluorochrome, nehmen sie Energie auf und strahlen sie in Form von langwelligem grünen Licht wieder ab. Die direkte Immunfluoreszenz dient zum direkten Nachweis von Bakterien, Viren, Parasiten im Untersuchungsmaterial. Durchführung: Untersuchungsmaterial wird auf einen Objektträger fixiert ( Hitze, Trocknung, chemisch ) . Anschliessend wird der fluoreszenzmarkierte Antikörper, der gegen das gesuchte Antigen gerichtet ist, auf die Auftragsstelle gegeben. Nach einem Waschprozess legt man den Objektträger unter ein UV - Mikroskop. Im positiven Falle sind die gesuchten Antigene durch den Antikörper markiert und erscheine leuchtend grün. Entsteht keine Fluoreszenz, sind die Antikörper nicht spezifisch gewesen und ausgewaschen worden. Mit der indirekten Methode weist man Antikörper nach. Dazu gehört der FTA Abs. Test. FTA Abs. Test: Fluoreszenz - Treponema - Antikörper Absorptiosnstest. Bestätigungstest, wenn TPHA positiv oder zweifelhaft positiv ausfällt. Er ist spezifischer und empfindlicher als der TPHA -Test: Vorbereitung: Absorptionsschritt:Kreuzreagierende Antikörper im Patientenserum werden mit apathogenen ( Reiter- ) Spirochäten absorbiert. Das Patientenserum wird in einer Verdünnungsreihe auf einen Objektträger gebracht, der mit abgetöteten pathogenen Treponemen beladen ist. Reaktionsablauf: Positive Reaktion: Ak im Patientenserum binden an die Treponemen und lassen sich dann nicht mehr durch Waschen entfernen. 35 Negative Reaktionen: AK im Patientenserum erkennen die Treponemen nicht und lassen sich abwaschen. Detektionstreaktion: Es soll nachgewiesen werden, ob die Treponemen auf dem Objektträger mit Antikörpern beladen sind. Dazu werden AK verwendet, die gegen humane Immunglobuline gerichtet sind, und mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt sind. Werden Treponemen markiert, leuchten diese im fluoreszierenden Licht auf. Bei einem unklaren Reaktionsausfall wird ein Western - Blot angeschlossen. 36 Kurs 6 Trichomonaden Lamblien Trypanosomen Helminthen Cryptosporidien Malaria Toxoplasmen 37 FLAGELLATEN: TRICHOMONAS VAGINALIS Trichomonas vaginalis, Giemsa-Färbung 1 vier nach vorn gerichtete Geißeln (Flagella) 2 Schleppgeißel, die als undulierende (gewellte) Membran ausgebildet ist 3 Kinetosomen 4 Zellkern 5 Achsenstab 38 Giardia intestinalis Giardien – vegetative Form – Giemsa Färbung TRYPANOSOMA 39 HELMINTHEN Suchen Sie diese Eier in den Ihnen ausgeteilten Präparaten und ordnen Sie die Bilder von Wurmeiern den zugehörigen Helminthen zu , die an der Seite aufgebaut sind ! 40 Sporozoen: PLASMODIUM Beim Menschen wird Malaria von 4 verschiedenen PlasmodienSpezies verursacht: Plasmodium falciparum - Malaria tropica Plasmodium vivax - Malaria tertiana Plasmodium ovale - Malaria tertiana Plasmodium malariae - Malaria quartana MIKROSKOPIE PLASMODIUM INKUBATIONSZEIT SPEZIES (TAGE) STADIUM PARASIT ERYTHROZYT P. falciparum 12 (7-14) Ring normal exoerythrozytäres Stadium: 5,5 - 7 dünnes Zytoplasma, MehrfachInfektion häufig Schizont 8-24 kleine Merozoiten normal Gametozyt bananenförmig verformt Ring dickes Zytoplasma, MehrfachInfektion möglich normal bis vergrößert, Schüffnersche Tüpfelung Schizont groß, 12-24 Merozoiten, gesamter Ery gefüllt Gametozyt fast gesamter Ery vergrößert Ring dichtes Zytoplasma Schizont 6-12 Merozoiten „Gänseblümchen“ Gametozyt rund bis oval, fast gesamter Ery P. vivax 13 (12-17) oder bis 6-12 Monate exoerythrozytäres Stadium: 6-8 28 (18-40) P. malariae oder länger exoerythrozytäres Stadium: 12-16 41 normal bis vergrößert Mikroskopieren Sie die fertigen Präprate: Malaria tertiana: Erythorzyten vergrößert Schüff`nersche Tüpfelung kein Mehrfachbefall Malariae tropica: keine vergrößerten Erythrozyten Mehrfachbefall 42 Cryptosporidien Mit einer Ziehl-Neelsen-Färbung werden die runden Oozysten der Kryptosporidien (ca. 3 – 4 m) rot gefärbt. 43 Toxoplasmen Aufgabe 1: Toxoplasma gondii Ausgeteiltes Präparat nach Giemsa färben und mikroskopieren. GIEMSA-FÄRBUNG 1. Ausstrich auf den Objektträger bringen 2. lufttrocknen lassen 3. 5 Min. mit Methylalkohol fixieren 4. abgießen, verdunsten lassen 5. 20 – 30 Min. mit Giemsa-Gebrauchslösung färben 6. mit Wasser abspülen und lufttrocknen lassen Anfertigung der Giemsa-Gebrauchslösung: 1 Tropfen Giemsa-Stammlösung auf 1 ml Pufferlösung 44 PROTOZOEN (EINZELLER) Einige wichtige parasitische Protozoen des Menschen: ART SITZ KRANKHEIT Blut, Liquor Schlafkrankheit (chronisch) Blut, Liquor Schlafkrankheit (akut) Blut, Gewebe (Vermehrung nur im Gewebe) Makrophagen (RES, v. a. von Milz, Leber, Knochenmark, Lymphknoten) Makrophagen der Haut Chagas-Krankheit Haut, Nasen- und Rachenschleimhaut Mukokutane Leishmaniose (Espundia) Urethritis Flagellaten (Geißeltierchen) Trypanosoma brucei gambiense Vektor: Tsetsefliege (Glossina morsitans/palpalis) Trypanosoma brucei rhodesiense Vektor: Tsetsefliege (Glossina morsitans/palpalis) Trypanosoma cruzi Vektor: Raubwanze (Rhodnius prolixus) Leishmania donovani Vektor: Sandfliege (Phlebotomus spp.) Leishmania tropica Vektor: Sandfliege (Phlebotomus spp.) Leishmania brasiliensis Vektor: Sandfliege (Lutzomyia spp.) Trichomonas vaginalis Giardia lamblia / intestinalis Fluor vaginalis, Urethra (Mann und Frau) Duodenum, Gallenwege Viszerale Leishmaniose (Kala Azar) Kutane Leishmaniose („Orientbeule“) Giardiasis, Lambliasis Rhizopoden (= Wurzelfüßler) Entamoeba histolytica Dientamoeba fragilis Entamoeba coli (häufigste) Entamoeba hartmanni Jodamoeba bütschlii Endolimax nana Acanthamoeba spp. Hartmanella spp. Naegleria spp. Lumen u. Wand des Amoebiasis Kolons; Abszesse in der Leber u. a. Organen (z. B. Lunge) Kolon fraglich pathogen Kolon kommensal. apathogen freilebend, fakultativ parasitisch (NasenRachenraum, Meningen, Gehirn) Meningoenzephalitis, Keratitis 45 ART SITZ KRANKHEIT Leberparenchym und Erythrozyten Malaria tertiana Ovale-Malaria Malaria quartana Malaria tropica ZNS, Herz, Skelettmuskulatur RES, Dünndarm RES, Dünndarm Toxoplasmose Sporozoen (=Sporentierchen) a) Hämosporidien Plasmodium vivax Plasmodium ovale Plasmodium malariae Plasmodium falciparum Vektor: Mücke (Anopheles spp.) b) Kokzidien Toxoplasma gondii Isospora belli Sarcocystis spp. Cryptosporidium parvum Mikrosporidien (Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Enc. hellem) Dünndarm; bei Immunschwäche gesamter Gastrointestinaltrakt, Gallenwege, Pankreas, Lunge Isosporose Sarkozystose (Sarkosporidiose) Kryptosporidiose Ziliaten (= Wimperntierchen) Balantidium coli Kolon Balantidenruhr, Balantidose 46 Kurs 7 Mykologie: Mucor Penicillium Candida Wiederholung 47 Penicillium ssp.: Epidemiologie: weltweit, ubiquitär verbreitet Pathophysiologie: Humanpathogene Bedeutung nur als Mykotoxinbildner, als Allergenen und nur ganz selten als Erreger einer Infektion.Die Mykotoxine gelangen durch Verzehr verdorbener Lebensmittel in den Organismus des Menschen. Stoffwechselleistungen werden zur Lebensmittelveredelung genutzt: ( Penicillium camembertii und Penicillium roquefortii ) Bestimmte Penicilliumarten bilden Penicillin. Kulturverhalten: blau mit weissem Rand rasenförmig Mikroskopie: „ Pinselform“ 48 Mucor ssp. Epidemiologie: weltweit Mensch u. Tier, Gartenerde, Luft Keine Kontagiosität mensch – Mensch oder Tier - Tier = Zygomycet Pathophysiologie: Wachsen in Arterien ein und verursachen Pseudothromben. Oberflächliche Mykosen durch Anflug und nachfolgende Kolonisierung ausschliesslich auf , meist thermisch, geschädigter Haut. Verursachen Infektionen von Stirn- oder Kieferhöhle. Kulturverhalten: rasches Wachstum Hohes, graues Luftmycel Mikroskopie: Sporangium kugelig Columella Unseptierte Hyphen 49 Candida Erreger: meist Candida albicans, selten andere Candida Arten, wie z.B. tropicalis, C. krusei Epidemiologie: kosmopolitisch Als Kommensale in geringer Keimzahl im gesunden Digestionstrakt des Menschen. Patthophysiologie: Soor, Windelsoor, Kolpitis, Ösophagitis, Candida – Sepsis, Organmykose Kultur: Candida albicans bildet auf üblichen Nährböden in 2 – 3 Tagen kreisrund begrenzte, leicht erhabene opake bis mattglänzende, weisse Kolonien ohne Luftmyzel. Mikroskopie: Grampräparat Candida albicans bildet als einzige Hefeart auf Reisagar typisch Chlamydosporen aus . Pseudomyzelbildung innerhalb 3h ( „Keimschlauchtest“ ) ist typisch für die Gattung Candida albicans. Sprosspilze werden aufgrund ihrer Farbstoffbildung auf Chromagar oder biochemisch identifiert. 50 Wiederholung 51 52 53 54 55 56 57
