Zentrum für Med

Zentrum für Med. Mikrobiologie,
Krankenhaushygiene und Virologie
Praktikumsbegleitendes Skript
für Studierende der Pharmazie
Sommersemester 2016
1
2
Inhaltsverzeichnis
Einführung
Kurs 1
............Färbungen, ,Rachenabstrich, Fingerabdruck
Kurs 2
............Streptokokken, Staphylokokken,
Pneumokokken, Neisserien
Kurs 3............Salmonellen, Shigellen, Fakultativ pathogene
Darmbakterien, Resistenzbestimmung
Kurs 4............ Mykobakterien, Anaerobier
Kurs 5........... Treponemen, Borrelien, Serologie, TPHA, IFT,
ELISA
.
Kurs 6............Parasiten
Kurs 7 ............Mykologie, Wiederholung
3
Mikrobiologisches-Immunologisches
Praktikum
Allgemeine Regeln für das Arbeiten im Praktikum
Mit der zugeteilten Nummer sind Sie Inhaber eines Arbeitsplatzes geworden, für dessen Zustand Sie
während und nach der Arbeit verantwortlich sind.
Weil das Material, mit dem Sie umgehen, auch Krankheitserreger enthalten kann, müssen während der
gesamten Kursdauer - ohne dass in Zukunft besonders darauf hingewiesen wird - folgende
Verhaltensregeln eingehalten werden:







Fenster und Türen müssen während der Arbeit geschlossen sein.
In den Arbeitsräumen darf nicht gegessen, getrunken oder geraucht werden.
Im Sicherheitsbereich müssen Laborkittel getragen werden. Diese Kittel dürfen außerhalb des
Labors nicht getragen werden. Schutzbrille mitbringen.
Mund pipettieren ist untersagt; Pipettierhilfen sind zu benutzen..
Bei den Arbeiten mit Mikroorganismen dürfen keine Aerosole entstehen.
Nach Beendigung der Arbeit und vor Verlassen des Labors müssen die Hände desinfiziert und
sorgfältig gewaschen werden.
Die Laborräume sollen sauber und aufgeräumt sein.
 Die Arbeitstische dürfen nicht als Abstellflächen benutzt werden - Vorräte müssen in den dafür
vorgesehenen Räumen bzw. Schränken gelagert werden.
 Die Identität der verwendeten Mikroorganismen und mögliche Kontaminationen sind
regelmäßig zu überprüfen.


Ungeziefer muss regelmäßig bekämpft werden.
Alle Arbeitsplätze sind täglich zu desinfizieren.



Kontaminierter flüssiger oder fester Abfall in die gelben Eimer werfen.
Wird kontaminiertes Material verschüttet, ist der betroffene Bereich sofort zu desinfizieren.
Lassen Sie infektiöses Material nicht aus den Augen. Sorgen Sie dafür, daß entsprechende
Gefäße nach der Entnahme des Materials sofort wieder verschlossen werden und dass nicht mehr
benötigtes Material sofort einem Desinfektionsvorgang bzw. -mittel ausgesetzt wird.
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Anweisungen für den Kurssaal
Die Platinösen sind vor und unmittelbar nach Gebrauch in der nicht leuchtenden
Bunsenbrennerflamme bis zur Rotglut auszuglühen, und der Halter ist mit der Öse nach oben in den
Halterklotz zu stecken.
Sämtliche Petrischalen müssen mit dem Deckel nach
u n t e n
abgelegt werden, um
Verunreinigungen der Kulturen durch herablaufendes Kondenswasser zu vermeiden. Beschriftungen
von Kulturgefäßen mit dem roten Fettstift müssen grundsätzlich auf dem unverwechselbaren Teil mit
der Platznummer gekennzeichnet werden (z. B. bei Petrischalen auf dem Gefäßboden).
Öffnen Sie Gefäße, in denen sich Bakterienkulturen befinden, nur bei Bedarf und möglichst
kurzzeitig, um Verunreinigungen aus der Luft zu vermeiden. Die Öffnungen von Glasgefäßen sollen
nach dem Öffnen und vor dem Schließen leicht mit dem Bunsenbrenner abgeflammt werden.
Sollte es bei einem Bunsenbrenner zum Durchschlagen der Flamme kommen, dann muß der Gashahn
geschlossen werden.
Weil 96%iger Alkohol auf den Arbeitsflächen steht, ist größte Vorsicht bei der Benutzung des
Bunsenbrenners geboten.
Es wird erwartet, dass Sie die Mikroskope sorgfältig behandeln. Wenn Sie die Ölimmersion benützen
und Tubus und Objektträger einander genähert sind, ist die Mikrometerschraube mit der nötigen
Vorsicht zu betätigen, weil sonst Gefahr besteht, daß der Objektträger zerdrückt und die Objektivlinse
beschädigt wird. Reinigen Sie die Objektive nach Benutzung am Ende jeder Kursstunde mit dem dafür
vorgesehenen Läppchen von anhaftendem Immersionsöl.
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Maßnahmen bei Zwischenfällen



Bei Hautkontakt mit Mikroorganismen ist der kontaminierte Bereich mit Haut-desinfektionsmitteln
(Sterilium, Meliseptol) zu behandeln. Bei Verletzungen und nach Inkorporation von
Mikroorganismen (Verschlucken, Einatmen von Aerosolen, Kontakt mit Schleimhäuten) ist der
Betroffene nach einer evtl. erforderlichen Erste-Hilfe-Behandlung dem Betriebsarzt vorzustellen.
Im Gefahrenfall ist analog der Brandschutzordnung zu verfahren.
Brennbare Flüssigkeiten (Alkohol etc.) dürfen nicht in Flammennähe aufbewahrt werden.
Notfallplan
1.
Ruhe bewahren
2.
Brand bzw. Unfall melden
Feuerwehr
112 bzw. 88-112
Feuermelder betätigen
3.
Inhalt der Meldung
- Was ist passiert?
- Wo ist es passiert?
- Sind Menschen in Gefahr?
- Wer meldet? (Name, Tel.)
4.
In Sicherheit bringen
- Gefährdete Personen warnen
- Hilflose in Sicherheit bringen
- Türen und Fenster schließen
- gekennzeichneten Fluchtweg
benutzen
- im Brandfall keinen Aufzug
benutzen
5.
Löschversuch unternehmen
- vorhandene Löschgeräte
benutzen
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Hygieneplan für den Kurssaal
Was
Händedesinfektion
Wann
 Nach Kontamination
 Nach Beendigung
kontaminationsträchtiger
Tätigkeiten
 Nach dem Ausziehen von
Handschuhen
 Vor Verlassen des Labors
Wie1
Womit2
Eine Hohlhand voll 30 Sek. verreiben
(Bei Labortätigkeiten mit
Kontaminationsgefahr und Notwendigkeit der
Händedesinfektion keinen Schmuck an
Händen und Unterarmen tragen!)
Mehrmals täglich und bei Bedarf
Nach Hautreinigung in die trockenen Hände
einreiben
Bei Gefahr der Kontamination mit
erregerhaltigem Material
Handschuhe anziehen, nach dem Ausziehen
der Handschuhe eine hygienische
Händedesinfektion durchführen
Bei der Arbeit in den Laborräumen
Schutzkittel geschlossen tragen
Entsorgung:
nach Kontamination/Verunreinigung in
dichten Wäschesäcken
Sterillium classic pure
Siehe Hautschutzplan des
Betriebsärztlichen Dienstes (im
Hygieneordner)
Hände pflegen
Handschuhe
Kittel
Arbeitstäglich und bei Bedarf
Desinfektion der
Arbeitsflächen
Fläche mit Einmal-Papiertuch, Zellstoff oder
ähnlichem feucht abwischen, trocknen
lassen., Des.tücher in blauen Eimern
Dabei Handschuhe tragen, Hautkontakt mit
dem Flächendesinfektionsmittel vermeiden
(Allergie-Gefahr)!
Nach Gebrauch
In Abfallbehälter sammeln
autoklavieren und in Abfall entsorgen
Nach Gebrauch
Maschineller Aufbereitung zu führen
Nach Gebrauch
Maschineller Aufbereitung zu führen
Routinemäßig:
Incidin rapid 0,25 %
Kulturplatten, sonstige
erregerhaltige Materialien
Laborgefäße
Instrumente, Objektträger
Gemäß Medizinprodukte-Betreiber-VO erfolgt
die Aufbereitung nach Herstellerangaben.
Medizinisch-technische
1
2
Nach Kontamination und bei Bedarf Äußere Flächen (z.B. Gehäuse) können oft,
falls nicht anders vom Hersteller angegeben,
mit Standard-Flächendesinfektionsmittel
abgewischt werden.
Die Angaben der Arbeitssicherheit und des Arbeitsschutzes sind zu beachten.
Herstellerangaben zur Materialverträglichkeit sind zu beachten.
7
Incidin rapid 0,25 %
Geräte

Ausstattung des bakteriologischen Arbeitsplatzes
Für die Herstellung mikroskopischer Präparate:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Objektträger
Ständer mit Ösenhaltern und Ösen
0,9%ige NaCl-Lösung, steril
Glasschreiber
Deckgläschen
Fettstift
Für Färbungen:
9.
10.
11.
12.
Färbebank
Färbepinzette
Färbelösungen
Färbeküvette mit. 3%igem Aceton –Alkohol 70%
13.
Fließpapier zum Trocknen der gefärbten Präparate
Zur Betrachtung von mikroskopischen Präparaten:
(Plastikhaube der Mikroskope unterhalb der Tischplatte unterbringen)
14.
Mikroskop:
Binokular/Monokular 10-fach
Objektive
a) Trockensystem (2,5-, 10-, 40-fach)
b) Immersionssystem (100-fach)
Vergrößerung = Objektivvergrößerung mal Okularvergrößerung
15.
16.
Immersionsöl
Tücher für die Reinigung der Objektive
Zur Keimabtötung:
17.
18.
Bunsenbrenner
Töpfe mit Desinfektionslösung für Spatel und Objektträger
8
9
Kurs 1
Themen:
Färbungen
Rachenabstrich
Fingerabdruck
10
Aufgaben:
1. Präparate „Bakteriengemisch“
2. Beschreiben Sie im Protokollblatt „Mikroskopie“
- die Farbe (grampositiv, gramnegativ)
- die Form (rund, oval, lanzettförmig,stäbchenförmig)
- die Lage der Bakterien
zueinander(einzeln,paarweise,kettenförmig,traubenförmig)
- sonstige Gebilde(Zellkern, Epithelien,Leukozyten,Zelldetritus)
- die Lage der Bakterien zu Leukozyten (intra- oder extrazellulär)
- Grössenverhältnisse Bakterien – Zellen
3. Rachenabstrich anfertigen
- Präparat: Gramfärbung
- Ausstrich auf Blutagarplatte; Beschriftung nicht vergessen!
4. Hygienische Händedesinfektion „Fingerabdruck“
Arbeitsanleitungen zu Kurs 1
Herstellung des Ausstrichpräparates
1.
2.
Mit dem Glasschreiber Präparate markieren.
Auf einen sauberen Objektträger mit der ausgeglühten und abgekühlten Öse eine Öse
Bakteriengemisch bringen.
3. Präparat an der Luft trocknen.
4. Das völlig luftgetrocknete Präparat hitzefixieren:
Objektträger - Schichtseite nach oben - dreimal durch die Flamme des Bunsenbrenners ziehen.
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Färbung nach G r a m (Differentialfärbung)
Prinzip:
Karbol-Gentianaviolett bilden mit Lugol-Lösung (verdünnte Jod-Kaliumjodid-Lösung) in der
Zellwand einen Farbstoff-Jod-Komplex. Durch Differenzieren mit Alkohol oder Aceton wird dieser
Komplex nur aus gramnegativen Bakterien wieder entfernt. Die Gegenfärbung kann dann mit Fuchsin
erfolgen.
Durchführung:
1. Hitzefixierten Ausstrich vollständig mit Karbol – Gentianaviolett bedecken. Nach 2 min Farbe
abgießen.
2. Lugol-Lösung 2 min einwirken lassen. Kurz mit Wasser abspülen.
3. Entfärben mit Aceton-Alkohol (in Küvette), bis keine Farbwolken mehr abgehen.
4. Gründlich mit Wasser abspülen.
5. Gegenfärbung mit verdünnter Fuchsinlösung 1 - 2 min.
6. Objektträger mit Wasser abspülen und anschließend zwischen Filterpapier trocknen.
Beurteilung:
Grampositive Bakterien sind blauschwarz gefärbt.
Gramnegative Bakterien sind rot gefärbt.
Gefärbte Präparate werden o h n e Deckglas mit Öl mikroskopiert. Sie benötigen v o l l e s Licht.
3 – Ösen-Ausstrich:
Das Ziel ist die Gewinnung gut isolierter Einzelkolonien.
- Mit Impfmaterial behaftete Öse in Zickzacklinien über etwa die Hälfte der Nähbodenoberfläche
führen, ohne sie aufzukratzen.
- Öse ausglühen lassen, dann zwei- bis dreimal durch den ersten Ausstrich gehen und ein
weiteres Viertel der Oberfläche beimpfen.
- Mit der erneut ausgeglühten Öse das letzte Viertel beimpfen mit Material, das analog vom
vorhergehenden Viertel gewonnen wurde.
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13
Kurs 2
Streptokokken
Staphylokokken
Pneumokokken
Neisserien
14
Aufgaben:
1. Kulturplatte des Fingerabdruckes betrachten.
2. Kulturplatte des Rachenabstriches betrachten.
3. Keime wurden auf Blutagar ausgestrichen und 24 Std. lang im Brutschrank bei 37°C bebrütet.
Beschreiben Sie im Protokollblatt:
- Farbe , Form der Kolonie
- Hämolyse ( - ,- ,-Hämolyse )
4. Koagulase testen.( Staph. aureus, Staph. epidermidis )
5. DNAase Test für Staphylococcus aureus und S. epidermidis auswerten. ( pro Reihe ausgeteilt )
6. Katalase testen. (Staphylokokken, Streptokokken )
7. Überprüfung der Optochinempfindlichkeit.
8. Cytochromoxydase testen ( apathogene Neisserien ).
9. Zur Ansicht steht auf der ersten Bank eine CTA Reihe.
10. Mikroskopieren Sie die pro Team ausgeteilten Präparate:
- Staphylokokken-Eiter
- Streptokokken-Eiter
- Pneumokokken-Eiter
- Meningokokken-Liquor
- Gonokokken-Eiter
- Erythrozyten + Leukozyten
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Arbeitsanleitungen zu Kurs 2
Beurteilung der Hämolyse:
Alpha-Hämolyse: -hämolysierende Bakterienkolonien sind auf Frischblutagar von grünen
Höfen umgeben. Bei partiell intakten Erythrozytenmembranen ist es zur Umwandlung von Hämoglobin
in Met- und Sulfhämoglobin gekommen.
Beta-Hämolyse: -hämolysierende Bakterienkolonien sind auf Frischblutagar von vollständig
entfärbten, durchsichtigen Höfen umgeben. Die roten Blutkörperchen wurden vollständig aufgelöst
und das Hämoglobin wurde zu farblosen Substanzen abgebaut.
Gamma-Hämolyse: Dieser Begriff (-Hämolyse) steht für keine makroskopisch sichtbare Veränderung
des Frischblutagars im Kolonienbereich.
Koagulase :
Durch dieses Enzym wird das Fibrinogen im Citratplasma von Menschen und Kaninchen in Fibrin
überführt. Suspendiert man Staphylococcus aureus in einen auf einem Objektträger befindlichen
Citratplasma-Tropfen, so kommt es zur Ausfällung von Fibrin, in dessen Netzwerk die Staphylokokken
eingebettet sind. Makroskopisch erkennt man die Bildung kleiner Klümpchen in klarer Flüssigkeit
(positives Ergebnis), die an eine Agglutination denken lassen. Im Gegensatz zu anderen
Staphylokokken besitzen fast alle Staphylococcus aureus-Stämme diesen "Clumping factor" an ihrer
Zelloberfläche.
Durchführung:
Führen Sie den Test mit Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis durch.
Nehmen Sie eine zu prüfende Kolonie und verreiben Sie diese auf einem Objektträger zwischen 1
Tropfen Kochsalzlösung und daneben 1 Tropfen Plasma. Vermischen Sie anschließend den Keim mit
dem Kochsalztropfen und dann mit dem Plasmatropfen. Achten Sie darauf, dass die beiden Tropfen
nicht miteinander vermischt werden.
DNase (Desoxyribonuklease) – Test:
DNase, ein von verschiedenen Bakterienarten produziertes, extrazelluläres Enzym, hydrolysiert DNA
zu kleineren aus Nukleotiden bestehenden Einheiten. Im Gegensatz zur DNA sind Nukleotide im sauren
Milieu löslich. Wird ein DNA-haltiger Nährboden nach Ausbildung von Wachstum mit Säure geflutet,
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zeigen sich um DNase positive Kolonien klare Zonen, während der übrige Nähboden durch Ausfällung
der DNA getrübt ist.
Staphylokokken Stämme wurden strichförmig auf die DNA Platte aufgeimpft; nach 24stündiger
Bebrütung bei 36°C mit 1M Salzsäure vorsichtig überflutet.
Betrachten Sie die Platte und tragen das Ergebnis in den Protokollbogen ein:
Positiv: Klare Zone um den Wachstumsbereich.
Negativ: Keine Veränderung der Kolonieumgebung
Katalase – Test:
Katalase-positive Bakterien (z. B. Staphylokokken) spalten das Wasserstoffperoxid einer
3 %igen H2O2-Verdünnung, wobei der freiwerdende Sauerstoff zur Bläschenbildung führt.
Durchführung: Verreiben Sie mit einer Öse 2 - 3 Kolonien von den Staphylokokken, bzw.
Streptokokken auf einen Objektträger. Tropfen Sie Katalasereagenz (H2O2) auf diesen Bereich. Eine
positive Reaktion erkennt man an der Bläschenbildung.
Positiv: Rasche Entwicklung von Gasblasen in der Flüssigkeit
Negativ: Keine Gasentwicklung
Darstellung und Überprüfung der Optochinresistenz zur Differenzierung von S. pneumoniae
Streptococcus pneumoniae („Pneumokokken“) bildet auf Blutagar kleine, vergrünende Kolonien, die
denen von Viridansstreptokokken ähneln. Wegen des sehr unterschiedlichen Virulenzpotentials ist die
Differenzierung der Gruppen von wesentlicher Bedeutung; etwa im Mund-/Rachenraum oder in
bronchoskopisch gewonnenem Material können beide Spezies vorkommen, Viridansstreptokokken als
Bestandteil der normalen Flora, Pneumokokken als nicht ungewöhnlicher Erreger von Pneumonien.
Obwohl die Kolonieform und eine Färbung nach Gram dem Geübten gute Hinweise liefern, sollte zur
sicheren Differenzierung die Testung auf Optochinresistenz durchgeführt werden.
Optochin (Ethyl-Hydrocuprein) aktiviert in S. pneumoniae, nicht jedoch anderen Streptokokken, eine
Muraminidase, deren Aktivität zur Autolyse der Bakterien führt; entsprechend können die Bakterien in
Gegenwart von Optochin nicht wachsen.
Praktisch ist diese Empfindlichkeit in einem
Agardiffusionstest einfach nachweisbar (mehr zur Resistenztestung von Bakterien im Kursteil E):
Suspensionen der zu testenden Bakterienstämme oder -isolate werden auf einer Agarplatte
ausgestrichen. Anschließend werden kleine Testblättchen, die das Antibiotikum (hier Optochin)
enthalten, aufgelegt, und die Platte wird über Nacht im Bakterieninkubator inkubiert. Während dieser
Zeit diffundiert das Antibiotikum in den Agar ein, und es entsteht ein Konzentrationsgradient der
Chemikalie (am höchsten am Plättchen, nach außen abfallend). Am nächsten Tag erfolgt die
Auswertung: Das zu bewertende Kriterium ist die Hemmhofgröße, d.h. mittelbar die Konzentration,
die das Bakterienwachstum inhibiert (für diese Bewertung gibt es nationale und internationale
Referenzwerte, die je nach Testverfahren herangezogen werden).
Tragen Sie das Ergebnis für Pneumokokken in den Protokollbogen.
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Cytochromoxidase-Reaktion:
Dieses letzte Enzym der Atmungskette wird nachgewiesen. Positiv reagieren z. B.
Neisseria, Aeromonas und Pseudomonas aeruginosa.
Durchführung: Mit dem Oxidase-Teststreifen ( pro Team verteilt) eine Kolonie der apathogenen
Neisserien antippen. Bei positivem Testausfall verfärbt sich der Streifen innerhalb von 20 Sekunden
tiefblau.
CTA (Cystin Trypticase Agar ) Reihe:
Bunte Reihe zur Kohlenhydratspaltungsprüfung ( Dextrose, Fruktose,
Maltose, Saccarose, Lactose ) von Neisserien.
Durchführung: Der zu testende Keim wird nur auf die Oberfläche des Mediums aufgeimpft.
Da entstehende Säure im halbfesten Medium nicht in die übrigen Bereiche des Nährbodens diffundiert,
lässt sich die Kohlenhydratspaltung im Bereich des Bakterienwachstums erkennen,
Positiv: Gelbfärbung(in der oberen Substratschicht)
Negativ:Kein Farbumschlag
Differenzierung grampositiver Kokken
Katalase
-
+
Enterococcus
Staphylococcus
Koagulase
+
S.aureus
(ß-Hämolyse)
a -Hämolyse
vergrünende
Streptokokken
S. epidermidis
S. saprophyticus
18
Streptococcus
ß-Hämolyse
Streptokokken der
serologischen
Gruppen A,B
-Hämolyse
Enterococcus
Protokollblatt
Staph.
aureus
Staph.
Pneumokok Vergr.
Enterokokk
epidermidis ken
Streptokokk en
en
Form der
Kolonie
Farbe der
Kolonie
Hämolyse
Katalase
Koagulase
DNase
Oxidase
Optochin
Mikroskop.
Bild
19
Streptokokk Neisseria
Neisseria
en
meningitidis gonorrhoeae
z. B.
Gruppe A,B
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Kurs 3
E. coli
Salmonellen
Proteus
Klebsiella
Pseudomonas
Serratia
Keimzahlbestimmung
Resistenzbestimmung
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Aufgaben:
1. Beschreiben Sie im Protokollbogen die Keime auf den Kulturen und im Präparat.
2. Suchen Sie im Kauffmann White Schema S. düsseldorf
3. Betrachten Sie die KLIGLER – Reihe
4. Führen Sie den Oxydasetest beim Pseudomonas und Proteus im Team durch.
5. Zur Ansicht pro Reihe: Bunte Reihe, Api`s
6. Führen Sie den Indol-Nachweis im Team durch.
7. Werten Sie die Resistenzbestimmung aus!
8. Uriculte (pro Team zur Ansicht )
9. Zur Ansicht Blutkulturen.
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Mac Conkey:
Eingesetzt zur Isolierung von Enterobacteriaceae und verwandten gramnegativen enterischen
Bakterien.
Haupbestandteile: Pepton
Gallensalze
Kristallviolett
Lactose
Neutralrot ( Indikator, Rotfäbung bei ph <6,5 )
Gallensalze und Kristallviolett verhindern das Wachstum von grampositiven Bakterien.
Lactose ist die einzige Kohlenhydratquelle im Agar. Lactose verstoffwechselnde Bakterien
bilden gemischte Säuren, es kommt zur Rotfärbung der Kolonien.
Positiv: rote Kolonien (E.coli, Klebsiellen, u.a.)
Negativ: farblose , klare Kolonien
(Salmonellen, Shigellen u.a.)
Kauffmann-White Schema: Diagnostische Antigentabelle der Salmonella-Arten.
Aufgrund unterschiedlicher Antigenformeln lässt sich die Gattung Salmonella in über 2000
Serovare unterteilen.
Kligler – Reihe:
Schrägagar zur Identifizierung von Enterobacteriaceae auf der Basis einer zweifachen
Zuckerverwertung und der Sulfid-Bildung. Der Nährboden enthält zwei Zucker – Lactose und
Glucose – und Eisencitrat als Indikator.
Gelbe Hochschicht/rote Schrägschicht:
Glucose positiv, Lactose negativ
Gelbe Hochschicht/gelbe Schrägschicht:
Glucose positiv, Lactose positiv
Rote Hochschicht/ rote Schrägschicht:
Glucose negativ, Lactose negativ
H2S-Bildung:
Schwärzung
Gasbildung:
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Aerob: Blasen-Bildung oder Aufreissen des Nährbodens
24
Anaerob: keine Gasbildung
Protokollbogen:
E.coli
S. yphimurium
Klebsiella
Serratia
Koloniefor
m
-farbe
Mikroskop.
Bild
Kligler
Schrägteil
Hochschicht
H2S
Gas
25
Proteus
Pseudomonas
Kurs 4
I Mykobakterien
II. Anaerobier
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I Mykobakterien
Aufgaben:
1. An Ihrem Arbeitsplatz steht pro Team eine Kultur M. smegmatis.
Fertigen Sie davon ein mikroskopisches Präparat an.
Reiben Sie den Keim auf dem Objektträger vom Rand her in den NaCl Tropfen ein.
Nach Trocknen des Präparates Hitzefixierung und Färbung nach Ziehl-Neelsen.
2. Mikroskopieren Sie die fertigen Präparate
M. tuberculosis / Sputum und
M. tuberculosis / Kultur – Cord-Faktor
Tbc – Färbung nach Ziehl-Neelsen:
1. Präparate trocknen und hitzefixieren
2. Mit Karbolfuchsinlösung bedecken
3. Objektträger mit Bunsen-Flamme von unten bis zur Dampfbildung erhitzen ( nicht
kochen!)
4. Abkühlen lassen
5. Das Erhitzen und Abkühlen zweimal wiederholen
6. Abspülen mit Wasser
7. Entfärben mit HCL-Alkohol bis keine Farbwolken mehr abgehen
8. Abspülen mit Wasser
9. Gegenfärben mit Malachitgrün 1 Minute
10. Abspülen mit Wasser
Ergebnis: Säurefeste Stäbchen rosa bis rot, sonstige Keime und Zellen grün..
Sie können bei dieser Färbung nicht zwischen Tuberkulosebakterien und nichttuberkulösen Mykobakterien unterscheiden. Deshalb lautet der Befund nicht
"Tuberkulosebakterien nachweisbar", sondern "säurefeste Stäbchen nachweisbar".
_________________________________________________________________________
Cord – Faktor: Trehalose – 6,6 – dimycolat hemmt die Wanderung von Leukozyten und
verursacht Granulombildung.
27
II Sporenbildner und Anaerobier
In diesem Praktikum sollen zwei sich überlappende Gruppen von Bakterien
besprochen werden, die sog. Anaerobier (Bakterien, die nur in der Abwesenheit von
Sauerstoff wachsen können) sowie die Sporenbildner, die Dauerformen ausbilden
und dadurch extrem gut haltbar (oder, aus medizinisch-hygienischer Sicht, schwer zu
beseitigen) sind. Die Überlappung besteht in der Gattung der Clostridien, das sind
anaerobe Sporenbildner.
Aufgaben:
1. Betrachten Sie die Kulturen :
- Bacillus cereus auf Nähagar
- Clostridium perfringens
- Clostridium difficile
2. Betrachten Sie den Clost – Test.
3. Fertigen Sie ein Grampräparat von Bacillus cereus an.
4. Mikroskopieren Sie die ausgeteilten Präparate:
- Gasbrand – Wundabstrich
- Clostridium tetani – Sporenpräparat
- Clostridium difficile – subterminale Spore
- Fusobakterien ( Angina Plaut – Vincent )
5. Zur Ansicht sind in Ihrer Reihe und vorne verschiedene anaerobe Kulturverfahren
ausgeteilt.
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS WUNDABSTRICH
28
Clostridium
perfringens
Clostridium
tetani
Clostridium
difficile
Kultur:
Farbe, Form,
Grösse
Geruch
Mikroskopie:
Gramverhalten
Spore: ja / nein
Lage
29
Bacillus
cereus
Anaerobiermedien enthalten sauerstoffbindene Reduktionsmittel, wie z.B.
Cystein Natriumthioglykolat, Glucose, Ascorbinsäure. Durch Autoklavieren
wird den Nährmedien der gelöste Sauerstoff ausgetrieben. Da jedoch durch
Diffusionsprozesse aus der Raumluft wieder ein langsamer Sauerstoffanstieg im
Medium stattfindet, sollten Anaerobiermedien unter anaeroben Bedingungen
gelagert werden.
Anaerobe Kuturverfahren:
Fortner – Platte: Auf einer Hälfte einer Nähragarplatte werden
sauerstoffzehrende Bakterien ( z.B. Serratia marcescens ) ausgestrichn; auf die
andere Hälfte das Untersuchungsmaterial, aus dem anaerobe Keime
Atmosphäre hergestellt angezüchtet werden sollen. Danach wird der Deckel
aufgelegt und die Petri – Schale mit Klebeband verschlossen. Serratia
marcescens vebraucht bei Ihrem raschen Wachstum den Luftsauerstoff und
schafft damit die Grundlage für das Wachstum der obligat anaeroben
Mikroorganismen.
Anaerobiertöpfe:Hier handelt es sich meist um durchsichtige Kunststoffbehälter
mit abgedichtetem Deckelaufsatz, in die jeweils eine ganze Anzahl von
Plattenkulturen eingebracht werden können. In den Topf kommt ein
Reduktionsmittel, dass den Luftsauerstoff bindet, sowie ein Sauerstoff –
Indikatorstreifen, der kontrolliert, ob auch tatsächlich eine anaerobe wird.
Clost – Test:
= revers CAMP – Test
Der Test beruht auf der Lyse von Erythrozyten bei gleichzeitiger
Einwirkung von Faktoren, die von den Streptokokken und von dem
zu untersuchenden Clostridien perfringens Stamm gebildet werden.
Auf eine Columbia – Agarplatte wird mit einer sterilen Öse, strichförmig ein
Streptococcus agalactiae Stamm geimpft. Senkrecht dazu wird der zu
untersuchende Stamm geimpft, wobei sich die Impfstriche nicht berühren dürfen.
Der Agar wird anaerob bei 36° C über Nacht bebrütet.
Erscheint eine pfeilförmige Hämolysezone, mit der Pfeilspitze zum Ammenstrich
weisend, so handelt es sich um C. perfringens.
30
Kurs 5
Treponemen
Borrelien
TPHA
FTA
31
Aufgaben:
1. Diskutieren Sie den TPHA - Test im Team.
2. Betrachten Sie die Präparate:
- Treponemen, Kabolfuchsinfärbung
- Borrelia recurrentis Blutausstrich,
Giemsafärbung
3. Im hinteren Laborraum ist ein Fluoreszenzmikroskop mit einem FTA - Abs - Test
aufgebaut.
4. In der letzten Reihe finden Sie eine Zecke und eine Kleiderlaus im Lichtmikroskop.
32
Antigen-Antikörper-Reaktionen
Treffen ein Antigen und ein gegen dieses Antigen gerichteter Antikörper in gelöster Form
aufeinander, so bildet sich ein Antigen-Antikörper-Komplex (Immunkomplexe). Die Art
der dabei entstehenden Komplexe wird weitgehend durch das Verhältnis von Antigen und
Antikörper bestimmt. Sind die Reaktionspartner nahezu äquimolar vorhanden, bilden
sich große, netzwerkartige Komplexe, die ausfallen: Es entsteht ein vom bloßen Auge
erkennbares Präzipitat. Im Gegensatz dazu bilden sich im Antigen- oder
Antikörperüberschuß kleine Immunkomplexe mit nur geringer oder ohne erkennbare
Präzipitatbildung.
Mit der quantitativen Präzipitationsreaktion (Heidelberger, 1930) wird die Folge der
Interaktion verschiedener Mengenverhältnisse von Antigen und Antikörper quantitativ
erfaßt. Nur wenn Antigen und Antikörper in einem ausgewogenen Verhältnis vorliegen
(Äquivalenz), führen die Bindungen zwischen Antigen und Antikörpermolekülen zu
großen, netzartigen Immunkomplexen.
Heidelberger Kurve:
-
+
+
-
+
+
freies AG
-
-
freier AK
Präzipitate
-
Antigen
Bei Ag–Unterschuss oder -Überschuss entstehen nur kleine, nicht sichtbare Präzipitate.
Grössere Präzipitate entstehen erst bei äquimolaren Mengen von AG und AK.
33
TPHA - Test
= Treponema pallidum - Häm – Agglutinationstest
Vorbereitung und Arbeitsmaterial:
1. Antigen:
Schaferythrozyten werden mit Formalin und Tannin - Gerbsäure behandelt. Dies bewirkt eine
Aufrauhung der Erythrozytenoberfläche und somit Freilegung von Bindungsstellen.
An diese Rezeptoren werden jetzt Antigene angelagert, den Nichols - Stamm. Dies ist ein
hochspezifisches Antigen, aus dem Hoden infizierter Kanninchen gewonnen.
Diese sensibilisierten Schaferythrozyten bilden die Grundlage des TPHA - Test.
2. Serum: Unverdünntes Patientenserum wird 30 Minuten bei 56° C inaktiviert.
3. Zur Verdünnung wird ein Absorptionsmedium eingesetzt, der den Reiterstamm enthält.
Dies ist kein echter Treponemen - Stamm. Er entfernt unspezifische Antikörper, die sich gegen
alle Treponemen richten. Weiterhin enthält es Zellmembran von Schaferythrozyten, um
heterophile Antikörper zu absorbieren, die in fast jedem Patientenserum sind.
4. Negativ Kontrolle: nicht sensibilisierte Schaferythrozyten
Bei Bildung einer Zellmatte, hat der Patient immer noch heterophile Antikörper.
5. Positiv Kontrolle: reaktives Kontrollserum
Reaktionsablauf:
Sind im Patientenserum Antikörper gegen Treponema pallidum, agglutinieren diese die
Schaferythrozyten. Es bildet sich eine Zellmatte.
Wenn keine Antikörper im Serum vorhanden sind, sedimentieren die Erythrozyten zu einem
Knöpfchen.
Der TPHA gilt als Suchtest in der Syphilis Diagnostik. Er kann als qualitativer und
quantitativer Test in Verdünnungsstufen durchgeführt werden.
Er weist IgG und IgM nach, kann jedoch nicht zwischen IgG und IgM unterscheiden.
2 - 3 Wochen nach Primärinfekt ist der TPHA - Test positiv.
Ein Titer ab 1: 80 gilt als positiv.
Aufgrund des echtem Treponemen Stamm ist der Test hoch spezifisch.
Syphyilis, Frambösie und Pinta sind serologisch nicht unterscheidbar.
+K
-K
1
2
3
1:40
NS
1:80
S
1:160
S
S = sensibilisierte Erythrozyten
34
NS = nicht sensibilisierte Erythrozyten
DIREKTE UND INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ
Hierbei werden Antigen - Antikörper - Reaktionen dadurch sichtbar gemacht, dass einer der
Reaktionspartner mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert ist.
Das meist benutzte Fluorochrom heisst Fluorescein ( FITC ).
Die Reaktion ist im UV – Mikroskop beurteilbar.
Trift weisses kurzwelliges energiereichesn Licht von Halogen- oder Quecksilberlampen auf
diese Fluorochrome, nehmen sie Energie auf und strahlen sie in Form von langwelligem
grünen Licht wieder ab.
Die direkte Immunfluoreszenz dient zum direkten Nachweis von Bakterien, Viren, Parasiten
im Untersuchungsmaterial.
Durchführung: Untersuchungsmaterial wird auf einen Objektträger fixiert ( Hitze,
Trocknung, chemisch ) . Anschliessend wird der fluoreszenzmarkierte Antikörper, der gegen
das gesuchte Antigen gerichtet ist, auf die Auftragsstelle gegeben. Nach einem Waschprozess
legt man den Objektträger unter ein UV - Mikroskop.
Im positiven Falle sind die gesuchten Antigene durch den Antikörper markiert und erscheine
leuchtend grün.
Entsteht keine Fluoreszenz, sind die Antikörper nicht spezifisch gewesen und ausgewaschen
worden.
Mit der indirekten Methode weist man Antikörper nach. Dazu gehört der FTA Abs. Test.
FTA Abs. Test:
Fluoreszenz - Treponema - Antikörper Absorptiosnstest.
Bestätigungstest, wenn TPHA positiv oder zweifelhaft positiv ausfällt.
Er ist spezifischer und empfindlicher als der TPHA -Test:
Vorbereitung:
Absorptionsschritt:Kreuzreagierende Antikörper im Patientenserum werden mit apathogenen
( Reiter- ) Spirochäten absorbiert.
Das Patientenserum wird in einer Verdünnungsreihe auf einen Objektträger gebracht, der
mit abgetöteten pathogenen Treponemen beladen ist.
Reaktionsablauf:
Positive Reaktion: Ak im Patientenserum binden an die Treponemen und lassen sich dann
nicht mehr durch Waschen entfernen.
35
Negative Reaktionen: AK im Patientenserum erkennen die Treponemen nicht und lassen sich
abwaschen.
Detektionstreaktion: Es soll nachgewiesen werden, ob die Treponemen auf dem Objektträger
mit Antikörpern beladen sind. Dazu werden AK verwendet, die gegen humane
Immunglobuline gerichtet sind, und mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt sind.
Werden Treponemen markiert, leuchten diese im fluoreszierenden Licht auf.
Bei einem unklaren Reaktionsausfall wird ein Western - Blot angeschlossen.
36
Kurs 6
Trichomonaden
Lamblien
Trypanosomen
Helminthen
Cryptosporidien
Malaria
Toxoplasmen
37
FLAGELLATEN:
TRICHOMONAS VAGINALIS
Trichomonas vaginalis, Giemsa-Färbung
1 vier nach vorn gerichtete Geißeln (Flagella)
2 Schleppgeißel, die als undulierende (gewellte) Membran ausgebildet ist
3 Kinetosomen
4 Zellkern
5 Achsenstab
38
Giardia intestinalis
Giardien – vegetative Form – Giemsa Färbung
TRYPANOSOMA
39
HELMINTHEN
Suchen Sie diese Eier in den Ihnen ausgeteilten Präparaten und
ordnen Sie die Bilder von Wurmeiern den zugehörigen
Helminthen zu , die an der Seite aufgebaut sind !
40
Sporozoen:
PLASMODIUM
Beim Menschen wird Malaria von 4 verschiedenen PlasmodienSpezies verursacht:
Plasmodium falciparum - Malaria tropica
Plasmodium vivax - Malaria tertiana
Plasmodium ovale - Malaria tertiana
Plasmodium malariae - Malaria quartana
MIKROSKOPIE
PLASMODIUM INKUBATIONSZEIT
SPEZIES
(TAGE)
STADIUM
PARASIT
ERYTHROZYT
P.
falciparum
12 (7-14)
Ring
normal
exoerythrozytäres
Stadium:
5,5 - 7
dünnes
Zytoplasma,
MehrfachInfektion häufig
Schizont
8-24 kleine
Merozoiten
normal
Gametozyt
bananenförmig
verformt
Ring
dickes
Zytoplasma,
MehrfachInfektion möglich
normal bis
vergrößert,
Schüffnersche
Tüpfelung
Schizont
groß, 12-24
Merozoiten,
gesamter Ery
gefüllt
Gametozyt
fast gesamter Ery vergrößert
Ring
dichtes
Zytoplasma
Schizont
6-12 Merozoiten „Gänseblümchen“
Gametozyt
rund bis oval, fast
gesamter Ery
P. vivax
13 (12-17)
oder bis 6-12
Monate
exoerythrozytäres
Stadium:
6-8
28 (18-40)
P. malariae oder länger
exoerythrozytäres
Stadium:
12-16
41
normal bis
vergrößert
Mikroskopieren Sie die fertigen Präprate:
Malaria tertiana: Erythorzyten vergrößert
Schüff`nersche Tüpfelung
kein Mehrfachbefall
Malariae tropica: keine vergrößerten Erythrozyten
Mehrfachbefall
42
Cryptosporidien
Mit einer Ziehl-Neelsen-Färbung werden die runden Oozysten der Kryptosporidien
(ca. 3 – 4 m) rot gefärbt.
43
Toxoplasmen
Aufgabe 1: Toxoplasma gondii
Ausgeteiltes Präparat nach Giemsa färben und mikroskopieren.
GIEMSA-FÄRBUNG
1. Ausstrich auf den Objektträger bringen
2. lufttrocknen lassen
3. 5 Min. mit Methylalkohol fixieren
4. abgießen, verdunsten lassen
5. 20 – 30 Min. mit Giemsa-Gebrauchslösung färben
6. mit Wasser abspülen und lufttrocknen lassen
Anfertigung der Giemsa-Gebrauchslösung:
1 Tropfen Giemsa-Stammlösung auf 1 ml Pufferlösung
44
PROTOZOEN (EINZELLER)
Einige wichtige parasitische Protozoen des Menschen:
ART
SITZ
KRANKHEIT
Blut, Liquor
Schlafkrankheit
(chronisch)
Blut, Liquor
Schlafkrankheit (akut)
Blut, Gewebe
(Vermehrung nur im
Gewebe)
Makrophagen (RES,
v. a. von Milz, Leber,
Knochenmark,
Lymphknoten)
Makrophagen der
Haut
Chagas-Krankheit
Haut, Nasen- und
Rachenschleimhaut
Mukokutane
Leishmaniose
(Espundia)
Urethritis
Flagellaten (Geißeltierchen)
Trypanosoma brucei gambiense
Vektor: Tsetsefliege (Glossina
morsitans/palpalis)
Trypanosoma brucei rhodesiense
Vektor: Tsetsefliege (Glossina
morsitans/palpalis)
Trypanosoma cruzi
Vektor: Raubwanze (Rhodnius
prolixus)
Leishmania donovani
Vektor: Sandfliege (Phlebotomus
spp.)
Leishmania tropica
Vektor: Sandfliege (Phlebotomus
spp.)
Leishmania brasiliensis
Vektor: Sandfliege (Lutzomyia
spp.)
Trichomonas vaginalis
Giardia lamblia / intestinalis
Fluor vaginalis,
Urethra (Mann und
Frau)
Duodenum,
Gallenwege
Viszerale Leishmaniose
(Kala Azar)
Kutane Leishmaniose
(„Orientbeule“)
Giardiasis, Lambliasis
Rhizopoden (= Wurzelfüßler)
Entamoeba histolytica
Dientamoeba fragilis
Entamoeba coli (häufigste)
Entamoeba hartmanni
Jodamoeba bütschlii
Endolimax nana
Acanthamoeba spp.
Hartmanella spp.
Naegleria spp.
Lumen u. Wand des
Amoebiasis
Kolons; Abszesse in
der Leber u. a.
Organen (z. B. Lunge)
Kolon
fraglich pathogen
Kolon
kommensal. apathogen
freilebend, fakultativ
parasitisch (NasenRachenraum,
Meningen, Gehirn)
Meningoenzephalitis,
Keratitis
45
ART
SITZ
KRANKHEIT
Leberparenchym und
Erythrozyten
Malaria tertiana
Ovale-Malaria
Malaria quartana
Malaria tropica
ZNS, Herz,
Skelettmuskulatur
RES, Dünndarm
RES, Dünndarm
Toxoplasmose
Sporozoen
(=Sporentierchen)
a) Hämosporidien
Plasmodium vivax
Plasmodium ovale
Plasmodium malariae
Plasmodium falciparum
Vektor: Mücke (Anopheles spp.)
b) Kokzidien
Toxoplasma gondii
Isospora belli
Sarcocystis spp.
Cryptosporidium parvum
Mikrosporidien (Enterocytozoon
bieneusi, Encephalitozoon
intestinalis, Enc. hellem)
Dünndarm; bei
Immunschwäche
gesamter Gastrointestinaltrakt,
Gallenwege,
Pankreas, Lunge
Isosporose
Sarkozystose
(Sarkosporidiose)
Kryptosporidiose
Ziliaten (= Wimperntierchen)
Balantidium coli
Kolon
Balantidenruhr,
Balantidose
46
Kurs 7
Mykologie:
Mucor
Penicillium
Candida
Wiederholung
47
Penicillium ssp.:
Epidemiologie:
weltweit, ubiquitär verbreitet
Pathophysiologie:
Humanpathogene Bedeutung nur als Mykotoxinbildner, als Allergenen
und nur ganz selten als Erreger einer Infektion.Die Mykotoxine
gelangen durch Verzehr verdorbener Lebensmittel in den Organismus
des Menschen.
Stoffwechselleistungen werden zur Lebensmittelveredelung genutzt:
( Penicillium camembertii und Penicillium roquefortii )
Bestimmte Penicilliumarten bilden Penicillin.
Kulturverhalten:
blau mit weissem Rand
rasenförmig
Mikroskopie:
„ Pinselform“
48
Mucor ssp.
Epidemiologie:
weltweit
Mensch u. Tier, Gartenerde, Luft
Keine Kontagiosität mensch – Mensch oder Tier - Tier
= Zygomycet
Pathophysiologie:
Wachsen in Arterien ein und verursachen Pseudothromben.
Oberflächliche Mykosen durch Anflug und nachfolgende
Kolonisierung ausschliesslich auf , meist thermisch,
geschädigter Haut.
Verursachen Infektionen von Stirn- oder Kieferhöhle.
Kulturverhalten:
rasches Wachstum
Hohes, graues Luftmycel
Mikroskopie:
Sporangium kugelig
Columella
Unseptierte Hyphen
49
Candida
Erreger: meist Candida albicans, selten andere Candida Arten, wie z.B. tropicalis, C. krusei
Epidemiologie:
kosmopolitisch
Als Kommensale in geringer Keimzahl im gesunden Digestionstrakt
des Menschen.
Patthophysiologie:
Soor, Windelsoor, Kolpitis, Ösophagitis, Candida – Sepsis,
Organmykose
Kultur:
Candida albicans bildet auf üblichen Nährböden in 2 – 3 Tagen
kreisrund begrenzte, leicht erhabene opake bis mattglänzende, weisse
Kolonien ohne Luftmyzel.
Mikroskopie:
Grampräparat
Candida albicans bildet als einzige Hefeart auf Reisagar typisch
Chlamydosporen aus . Pseudomyzelbildung innerhalb 3h
( „Keimschlauchtest“ ) ist typisch für die Gattung Candida albicans.
Sprosspilze werden aufgrund ihrer Farbstoffbildung auf Chromagar
oder biochemisch identifiert.
50
Wiederholung
51
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53
54
55
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57