Färbung mit Ethiumdibromid
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Mikrobiologisch-hygenische Übungen für Studierende der Lebensmittelchemie Ergebnisprotokoll Mareike Grabs Ralf Wüstkamp 1 4. Grundzüge des mikrobiologischen Arbeitens 4.1 Prüfung von Heißluftsterilisatoren bzw. Autoklaven auf ihre Funktionstüchtigkeit Versuchsprinzip: Um eine ausreichende Sterilisation von Arbeitsgeräten und Lösungen in Laboratorien gewährleisten zu können wird in diesem Versuch die Funktionstüchtigkeit des Autoklaven getestet. Versuchsdurchführung: Zwei mit Geobacillus stearothermophilus beimpfte Teststreifen werden in je 10 ml TryptonSoja-Bouillon (TSB) gegeben und eine Probe autoklaviert. Beide Proben werden für 24 Stunden bei 55-60°C bebrütet. Eine Vermehrung des Keimes ist durch eine Trübung der Lösung zu erkennen. Ergebnis: In der autoklavierten Probe ist kein Wachstum zu erkennen. Das nicht autoklavierte Kontrollröhrchen zeigt eine Vermehrung des Organismus. Dies ist der Beweis für eine wirksame Sterilisation. 4.2 Sterilisation von Flüssigkeiten mit Hilfe der Membranfiltration Versuchsprinzip: Bei hitzeempfindlichen Lösungen kann zur Sterilisation kein Autoklav benutzte werden. Daher bietet es sich an Lösungen über einen Membranfilter (Porendurchmesser 0,22μm – 0,1μm) zu sterilisieren, da Mikroorganismen wie Bakterien (ca. 1μm) und Hefen (ca. 10μm) im Filter zurückbleiben. Versuchsdurchführung: 1ml der Keimsuspension wird mit einer sterilen Spritze aufgenommen und durch einen Membranfilter (0,22μm) in 3ml sterile TS-Bouillon filtriert. Ein weiteres Reagenzglas mit 3 ml TSB wird mit ungefilterter Keimsuspension versetzt. Beide Ansätze werden für 24h bei 37°C bebrütet. Ergebnis: Bei der filtrierten Probe ist keine Trübung zu erkennen. Die unfiltrierte Probe ist getrübt. Die Membranfiltration ist eine weitere zuverlässige Sterilisationsmethode bei hitzeempfindlichen Lösungen. 2 4.3 Gewinnung von Einzelkolonien durch fraktioniertes Ausstreichen auf Agarplatten mit einer Impföse Versuchsprinzip: Für die Untersuchung von Mischkulturen ist die Gewinnung von Reinkulturen der enthaltenen Mikroorganismen notwendig. Dies ist durch den 3-Ösen-Ausstrich möglich, der einer Verdünnung entspricht. Versuchsdurchführung: Mit einer ausgeglühten und abgekühlten Impföse wird aus der Mischkultur (Citerobacter freundii, Rhodotorula glutinis) Flüssigkeit entnommen und nach dem im Praktikumsskript beschriebenem Schema auf Trypton-Soja-Agar (TS-Agar, Universal-Nährmedium), Violet Red Bile Dextrose Agar (VRBD-Agar, selektiv für Enterobacteriaceae) und Yeast-GlucoseChloramphenicol-Agar (YGC-Agar, selektiv für Hefen und Schimmelpilze) ausgestrichen. Nach jedem Ausstrich wird die Impföse erneut ausgeglüht und abgekühlt. Die Platten werden bei 37°C für 1-3 Tage bebrütet. Ergebnis: Auf der TS-Agar-Platte ist beim ersten Ausstrich ein dichter Bakterienrasen zu erkennen, der nach weiteren Ausstrichen zu Einzelkolonien führt. Da es sich um ein Universalnährmedium handelt kann zwischen den Bestandteilen der Mischkultur nicht differenziert werden. Es scheint, als sei die Hefe von der Enterobacteriaceae überwachsen worden. Auf der VRBD-Agar-Platte ist beim ersten Ausstrich ein dichter Bakterienrasen zu erkennen, der nach weiteren Ausstrichen zu Einzelkolonien führt. Der VRBD-Agar ist selektiv für Enterobacteriaceae. Auf der YGC-Agar-Platte ist mäßiges Wachstum zu erkennen, beim ersten Ausstrich sind bereits Einzelkolonien zu erkennen. Der YGC-Agar ist selektiv für Hefen und Schimmelpilze. Durch dieses Verfahren können verschiedene Kolonien nachgewiesen werden und die Einzelkolonien können als Reinkultur weiter verwendet werden. 4.4 Demonstration unterschiedlicher Nährböden TS-Agar Wachstumsintensität starkes Wachstum VRBDAgar starkes Wachstum YGC-Agar Koloniebeschreibung rund, glatt, hell orange. Abgeflachte linsenförmige Kolonien mit gelber Färbung rund, glatt, konvex, hellrosa rund, glatt, rötlich, moderates Wachstum halbkugelig Ergebnis: Mit Hilfe von Selektivnährböden ist eine Trennung von Mischkulturen möglich, welche die Identifizierung und Charakterisierung der Bestandteile erleichtert. 3 5. Makroskopische und mikroskopische Beurteilung von Mikroorganismen 5.1 Koloniemorphologie Versuchsprinzip: Die Koloniemorphologie liefert erste Erkenntnisse über die vorliegenden Mikroorganismen, nach der der weitere Versuchsablauf geplant werden kann. Versuchsdurchführung: Die ausliegenden Reinkulturen werden aufgrund von Konsistenz, Ausmaß des Wachstums und des Geruchs charakterisiert. Ergebnis: Mikroorganismus: Koloniemorphologie: Enterobacter aerogenes auf TS-Agar auffallender Geruch, rund, glatter Rand Mikroorganismus: Koloniemorphologie: Micrococcus luteus auf TS-Agar konvex, rund, gelb, glatter Rand Mikroorganismus: Koloniemorphologie: Saccharomyces cervisiae auf YGC-Agar Hefegeruch, weiß, rund, glatter Rand 5.2 Mikroskopische Beurteilung 5.2.1 Zelluläre Morphologie von Bakterien Versuchsprinzip: Die Zellmorphologie wird untersucht. Dabei kann festgestellt werden, ob es sich um begeißelte oder unbegeißelte Mikroorganismen handelt. Versuchsdurchführung: Koloniematerial wird mit einer sterilen Impföse entnommen, in einen Wassertropfen auf einem Objektträger verrieben und mit einem Deckglas abgedeckt. Die Probe wird bei verschiedenen Vergrößerungen mikroskopiert. Ergebnis: Mikroorganismus: Zellmorphologie: Enterobacter aerogenes auf TS-Agar Stäbchen, begeißelt Mikroorganismus: Zellmorphologie: Micrococcus luteus auf TS-Agar Coccus, einzel Mikroorganismus: Zellmorphologie: Saccharomyces cervisiae auf YGC-Agar Coocus, einzeln und als Zellaggregate 4 5.2.2 Gefärbte Präparate 5.2.2.1 GRAM-Färbung, KOH- und Aminopeptidase-Test Versuchsprinzip: Aufgrund des unterschiedlichen Aufbaus der Bakterienzellwand kann mit Hilfe einer Färbungsreaktion eine Unterteilung in Gram-positive und Gram-negative Bakterien erfolgen. Diese Unterteilung kann mit weiteren Nachweisreaktionen wie dem KOH-Test und dem Aminopetidase-Test bestätigt werden. Gram-positive Bakterien haben eine sehr viel dickere Mureinschicht als Gram-negative. Die Mureinschicht wird mit Kristallviolett eingefärbt. Bei gramnegativen Mikroorganismen wird der Farbstoff im Gegensatz zu grampositiven nicht fixiert und mit EtOH wieder ausgewaschen. Grampositive Zellen erscheinen blau-violett. Gramnegative nach der Gegenfärbung mit Safranin hellrot. Versuchsdurchführung: Gram-Färbung: Etwas Koloniematerial wird mit einer sterilen Impföse in einen Wassertropfen auf einem Objektträger verrieben und luftgetrocknet. Durch kurzes ziehen des Objektträgers durch die Bunsenbrennerflamme wird das Präparat hitzefixiert und anschließend mit KristallviolettLösung gefärbt. Nach 2 Minuten wird der Farbstoff abgegossen. Im nachfolgenden Schritt wird das Präparat mit Lugol´scher Lösung behandelt. Die Differenzierung erfolgt durch Behandlung mit 96%igem Alkohol, die Kontrastfärbung mit Safranin. KOH-Test: Mit einer sterilen Impföse wird etwas Koloniematerial in 1-2 Tropfen 3%ger KOH auf einem Objektträger verrieben. Bei einer Schleimbildung (Fadenziehen) liegt eine positive Reaktion vor, mit Verdacht auf eine gramnegative Kolonie. L-Alanin-Aminopeptidase-Test: Der Reaktion wird das Vorhandensein von L-Aminopeptidase in der Zellwand gramnegativer Bakterien zugrunde gelegt. Das Enzym katalysiert die Umsetzung von L-Alanin-4-nitroanilid zu L-Alanin und 4-Nitroanilin. Eine positive Reaktion wird durch eine Gelbfärbung angezeigt, was auf ein gramnegatives Bakterium schließen lässt. Ergebnis: Mikroorganismus Micrococcus luteus Enterobacter aerogenes Bacillus subtilis Gram-Färbung Positiv Negativ Positiv KOH Negativ Positiv Negativ Aminopeptidase Negativ Positiv Negativ Die verschiedenen Methoden bestätigen das Ergebnis der Gram-Färbung Micrococcus luteus: Enterobacter aerogenes: Bacillus subtilis : grampositives Bakterium gramnegatives Bakterium grampositives Bakterium 5 5.2.2.2 Sporenfärbung Versuchsprinzip: Sporen sind als Dauerform unempfindlich gegenüber chemischen und physikalischen Beanspruchungen. Da Sporen pathogen sind, ist deren Identifizierung von großer Bedeutung. Die Endosporen werden mit Malachitgrün angefärbt. Versuchsdurchführung: Etwas Koloniematerial wird mit einer sterilen Impföse in einen Wassertropfen auf einem Objektträger verrieben und luftgetrocknet. Durch kurzes ziehen des Objektträgers durch die Bunsenbrennerflamme wird das Präparat hitzefixiert. Das fixierte Präparat wird mit MalachitLösung unter leichtem erhitzen bis zum Sieden gefärbt, mit dest. Wasser gewaschen und mit Safranin nachgefärbt. Ergebnis: Bacillus subtilis übrige Zellen: rötlich Sporen: grün 5.2.3 Bestimmung der Zellgröße Versuchsprinzip: Die Zellgröße von Bakterien und Hefen wird mit Hilfe eines Okularmikrometers und eines Objektivmikrometers bestimmt. Versuchsdurchführung: Eichen des Okularmikrometers: Das Okularmikrometer wird in das Okular eingelegt und auf den Rand scharf eingestellt. Anschließend wird das Objektmikrometer wie ein Objektträger aufgelegt. Durch drehen des Okulars werden beide Skalen parallel nebeneinander gelegt. Der Abstand zweier Striche des Objektivmikrometers beträgt 10µm. Nun wird bestimmt, welcher absoluten Länge der Abstand zwischen 100 Strichen des Okularmikrometers entspricht. Das Objektivmikrometer wird entfernt und ein Nativpräparat von Sacchoromyces cerevisiae unter das Mikroskop gelegt. Ergebnis: 100 Teilstriche des Okularmikrometers entsprechen 27 Teilstrichen im Objektmikrometer, also 270 µm. Ein Teilstrich im Okularmikrometer entspricht dann 270 µm / 100 = 2,7 µm Eine Zelle von S. cerevisiae ist 2 Teilstriche lang. Das entspricht einer Größe von 5,4 µm. 6 6. Mikroskopische und kulturelle Zellzahlbestimmung 6.1 Mikroskopische Zellzahlbestimmung Versuchsprinzip: Die mikroskopische Zellzahlbestimmung erfolgt mit einer Zählkammer nach Thoma. Dabei handelt es sich um einen dicken Objektträger, auf dem ein Netzquadrat eingeätzt ist. Durch Auflegen eines Deckglases erhält man ein definiertes Volumen für den Raum zwischen Deckglas und Objektträger. Versuchsdurchführung: Zunächst wird eine Hefesuspension von Saccharomyces cerevisiae hergestellt. Dazu werden 3 Einzelkolonien in dem Suspensionsmedium suspendiert. Um eine homogene Verteilung der Zellen zu erzielen wird gründlich gevortext. Ein Tropfen der Zellsuspension wird mittels der Kapillarkräfte zwischen Deckglas und Zählkammer gebracht. Es werden insgesamt 8 Großquadrate ausgezählt. Ergebnis: Großquadrat Anzahl 1 34 2 33 3 30 4 37 5 37 6 25 7 37 8 25 Durchschnittliche Anzahl der Mikroorganismen pro Großquadrat: 258 / 8 = 32 Anzahl der Mikroorganismen pro ml Suspension: N = 32 * 106 / 4 = 8,1 * 106 Die Anzahl an Mikroorganismen pro ml Keimsuspension beträgt 8,1 * 106. 6.2 Kulturelle Zellzahlbestimmung Versuchsprinzip: Es stehen verschiedene Methoden zur kulturellen Zellzahlbestimmung zur Verfügung. Grundlage ist das erstellen einer Verdünnungsreihe, sowie nach Inkubation, das Auszählen der Platten mit mehr als 10 und weniger als 300 Kolonien. Bei der MPN-Methode werden Indexziffern verwendet, die eine Angabe der Zellzahlen auf statistischer Basis erlaubt. Versuchsdurchführung: Herstellen einer Verdünnungsreihe ( 10-1 bis 10-8 ) Unter sterilen Bedingungen wird 1ml der Bakteriensuspension entnommen und in ein mit 9 ml Ringer-Lösung gefülltes Röhrchen gegeben. Die Flüssigkeiten werden durch votexen vermischt ( Verdünnungsstufe 10-1 ). Anschließend wird mit einer sterilen Pipette 1ml aus dem Röhrchen entnommen und in ein weiteres mit 9 ml Ringer-Lösung gefülltes gegeben. Es wird wieder gründlich vermischt ( Verdünnungsstufe 10-2 ). Die weiteren Verdünnungsstufen bis 10-8 werden durch fortsetzten der Reihe hergestellt. 7 Plattengussverfahren: Je 1ml der Suspension wird in eine leere und sterile Petrischale pipettiert. Die Verdünnungsstufen 10-7 bis 10-3 werden verwendet, wobei mit der höchsten Verdünnungsstufe begonnen wird. Anschließend wird flüssiger Plate-Count-Agar zugesetzt und alles durch schwenken vermischt. Die Platten werden 2-3 Tage bei 30°C inkubiert und die Kolonien gezählt. Oberflächenverfahren: Je 0,1 ml der Zellsuspension wird auf eine sterile TS-Agar-Platte gegeben und mit einem sterilen Drigalski-Spatel ausgestrichen. Es werden die Verdünnungsstufen 10-6 bis 10-2 verwendet, wobei wieder mit der höchsten begonnen wird. Die Platten werden 2-3 Tage bei 30°C inkubiert und die Kolonien gezählt. MPN-Methode: Es werden die Verdünnungsstufen 10-8 bis 10-5 eingesetzt. Je drei Kulturröhrchen, gefüllt mit 10 ml Brilliantgrün-Galle-Lactose-Bouillon, werden mit jeweils 1ml der jeweiligen Verdünnungsstufen beimpft. In dem Röhrchen befindet sich in der Flüssigkeit ein DurhamRöhrchen für den Gasnachweis. Die Röhrchen werden 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Ein positives Ergebnis ist durch Trübung oder Gasbildung zu erkennen. Das Positivergebnis geht in die Ermittlung der Indexziffer ein. Die Anzahl der positiven Ergebnisse pro TripelBestimmungen werden gezählt und die Indexziffer gebildet. Membranfiltration: Die Zellsuspensionen der Verdünnungsstufen 10-7 bis 10-5 werden über einen sterilen Filter abgesaugt. Der Filter wird auf eine TS-Agar-Platte gelegt und bei 25-30°C inkubiert und die Kolonien ausgezählt. Ergebnis: Verdünnung Oberflächenverfahren Plattengussverfahren Anzahl der Kolonien Anzahl der Kolonien -3 10 212 10-4 34 481 -5 10 12 0 -6 10 10 0 10-7 0 -8 10 Membranfiltration Anzahl der Kolonien 142 17 <10 8 Bestimmung der Gesamtkeimzahl/ml der Ausgangssuspension als gewogenes arithmetisches Mittel der Koloniezahlen: Die Ergebnisse ergeben sich durch Einsetzen in die Formel im Praktikumskript auf Seite 44. Es muss beachtet werden, dass bei dem Oberflächenverfahren 0,1 ml Suspension eingesetzt wurde. Das Ergebnis laut Formel muss noch mit dem Faktor 10 multipliziert werden. Bei der Membranfiltration werden 4,9 ml eingesetzt. Um das richtige Ergebnis zu erhalten muss durch den Faktor 4,9 geteilt werden. Oberflächenverfahren: Plattengussverfahren: Membranfiltration. C gew. = 2,2 * 106 KbE/ml C gew. = 4,8 * 106 KbE/ml C gew. = 2,9 * 106 KbE/ml MPN-Methode: Verdünnung Röhrchen 1 Röhrchen 2 Röhrchen 3 Index 10-5 10-6 10-7 10-8 + + + 0 + + 0 0 + + 0 0 3 3 1 0 Die Indexziffer ist 3-3-1 und die wahrscheinlichste Anzahl beträgt in diesem Fall 46 ( siehe Tabelle im Praktikumskript Seite 45 ). Multipliziert mit dem Faktor der niedrigsten Verdünnung (105) ergibt dies einen Wert von 4,6 * 106 KbE/ml. Gegenüberstellung der Ergebnisse: Oberflächenverfahren Plattengussverfahren [KbE/ml] [KbE/ml] 2,2 * 106 4,8 * 106 Membranfiltration [KbE/ml] 2,9 * 106 MPN [KbE/ml] 4,6 * 106 Zählkammer [KbE/ml] 8,1 * 106 Beim Plattengussverfahren war der verwendete Agar zu heiß, so dass nur bei einer Platte ein Ergebnis erhalten wurde. Das erhaltene Ergebnis wird im Normalfall nicht ausgewertet, da über 300 Kolonien gebildet wurden. Insgesamt können die Ergebnisse der verschiedenen Methoden als einheitlich bezeichnet werden. Die Ergebnisse liegen alle innerhalb einer Zehnerpotenz. Daraus kann geschlossen werden, dass sauber gearbeitet wurde. Das Zählkammerverfahren liefert ein höheres Ergebnis, da es sich um eine andere Keimsuspension handelte. 9 7. Methoden und Anwendung betriebshygienischer Maßnahmen 7.1 Untersuchung der Mikroorganismen in der Raumluft (Sedimentationsverfahren) Versuchsprinzip: Ausnutzung der Sedimentation von Luftkeimen im Sedimentations-Platten Verfahren auf TS-Agar-Platten. Versuchsdurchführung: Drei TSA Platten werden für 5, 10, 15 Min. der Raumluft ausgesetzt und für 24 h bei 30°C bebrütet. Ergebnis: Anzahl der Kolonien Öffnungszeit [min] 5 10 15 2 8 19 Je länger die Platten der Raumluft ausgesetzt waren, desto mehr Kolonien konnten gezählt werden. 7.2 Keimbelastung auf Flächen 7.2.1 Prüfung der Keimbelastung von Oberflächen durch Abstreichen mit Tupfern Versuchsprinzip: Eine Fläche mit definierter Größe wird mit einem getränkten sterilen Wattetupfer abgestrichen. Anschließend wird der Tupfer in Kochsalz-Lösung überführt und ausgeschwemmt. Anschließend wird eine TS-Agarplatte beimpft. Versuchsdurchführung: Der sterile Metallrahmen wird auf die Arbeitsfläche gelegt und die von ihm eingeschlossene Fläche (7x7cm) mit dem Wattetupfer abgestrichen. Der Tupfer wird in die Kochsalzlösung überführt. 0,1 ml werden mit dem Oberflächenverfahren auf einer TSA-Platte ausgestrichen und bebrütet. Ergebnis: Anzahl der Kolonien auf der TSA-Platte: 5 Verdünnung: 1:100 KbE/cm2: 5/4900 = 1,0 * 10-3KbE/cm2 Die Keimbelastung ist sehr gering, was darauf zurück zuführen ist, dass die Probe von der sterilen Arbeitsfläche entnommen wurde. 10 7.2.2 Prüfung der Keimbelastung von Oberflächen mit Hilfe des Abklatschverfahrens Versuchsprinzip: Verwendung von Rodac-Platten, mit konvexer Agar-Oberfläche, welche das Abklatschen von gleich großen Oberflächen erlaubt. Versuchsdurchführung: Abklatschen mit der TSA-Platte: Abklatschen mit der VRB-Platte: Geldstück Löschdeckenkasten Ergebnis: Auf der TSA-Platte sind 18 Kolonien zu finden, auf dem VRB-Agar keine. Die Keimbelastung des Geldstücks ist hoch, wobei nicht zwischen Hefen, Schimmelpilzen und Enterobacteriaceae differenziert werden kann, da es sich um ein Universalnährmedium handelt. 7.3 Nachweis der Verbreitung von Mikroorganismen durch ein infiziertes Handtuch Versuchsprinzip: Der Kontaminationsverlauf ausgehend von einer kontaminierten Hand mit Microccus luteus wird einmal sternförmig und einmal reihenförmig mit TSA-Platten verfolgt. Versuchsdurchführung: Sternförmig: Die kontaminierte Person schüttelt nacheinander 6 anderen Personen die Hand. Von jeder Hand wird ein Abdruck auf TSA genommen. Reihenförmig: Die kontaminierte Person schüttelt einer Person die Hand. Diese Person schüttelt einer zweiten die Hand usw. Von jeder hand wird ein Abdruck auf TSA genommen. Ergebnis: Sternförmiger Versuch: Person Anzahl der Kolonien 1 2 sehr ausgeprägter Rasen 3 4 ausgeprägter Rasen 5 6 7 mäßiger Rasen Reihenförmiger Versuch: Person Anzahl der Kolonien 1 2 3 ausgeprägter Rasen 4 5 6 stetig abnehmende Dichte, immer noch Rasen 7 11 8. Mikrobiologische Lebensmitteluntersuchung Kultureller Nachweis Mikrobiologische Untersuchung von Hackfleisch Die mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln dient dem Schutz des Verbrauchers vor gesundheitlichen Gefahren durch überhöhte Keimbelastung, welche bei unsachgemäßer Produktion oder Lagerung auftreten kann. Versuchsprinzip: Nach der Überprüfung physikalischer Parameter wie pH-Wert und Temperatur der Lebensmittelprobe (in diesem Fall Hackfleisch) wird das Homogenisat mehreren mikrobiologischen Untersuchungen unterzogen. Darunter fallen Untersuchungen auf Escherichia coli (als Fäkalindikator) sowie coliformen Keime, Salmonella ssp. und Staphylococcus aureus durch den IMViC-Test, Koagulase-Test und die „Bunte Reihe“. Versuchsdurchführung: Je 10g der Hackfleischprobe werden mit 90g Ringer-Lösung und 90g Peptonwasser versetzt, im Stomacher homogenisiert und für 18h bei 37°C inkubiert. Das Homogenisat mit Ringerlösung wird benötigt um die Gesamtkeimzahl, die Belastung mit E. coli und coliformen Keimen sowie die S. aureus Belastung zu bestimmen. Zum Nachweis von Salmonella ssp. wird das Peptonwasser-Homogenisat für 16-20h bei 37°C inkubiert. Durch diese Primäranreicherung werden auch subletal geschädigte Keime angereichert. Bestimmung von Salmonella ssp: ( wurde im Praktikum nicht durchgeführt ) 1. Sekundäranreicherung: 1. Tetrathionat-Novobiocin-Bouillon: 1 ml der Primäranreicherung wird in 10ml Bouillon überführt und bei 37°C für 24h inkubiert. 2. Rappaport-Vassiliadis-Bouillon: 0,1 ml der Primäranreicherungslösung werden in 10 ml Bouillon gegeben und für 24 Stunden bei 42°C inkubiert. 2. Beimpfung der Selektivmedien: Beide Sekundäranreicherungen werden fraktioniert auf einem vorgeschriebenen Selektivnährboden ( XLD-Agar ) sowie auf einem Selektivnährmedium nach Wahl ( BPLSoder Rambach-Agar ) ausgestrichen. Die Inkubation erfolgt bei 37°C für 24 Stunden. Für die Ausstriche wird die jeweilige Agarplatte in zwei Hälften geteilt und beschriftet. Die eine Hälfte wird mit der Tetrathionat-Novobiocin-Bouillon beimpft, die andere Hälfte mit der Sekundäranreicherung aus der Rappaport-Vassiliadis-Bouillion. Zusätzlich wird eine weitere Platte des jeweiligen Nährmediums mit einer Positivkontrolle ( Salmonella poona ) ausgestrichen. 12 3. Auswertung der Selektivmedien, Anlegen einer “bunten Reihe” und Agglutinationstest Bei Verdacht auf Salmonella erscheinen auf dem Rambach-Agar ( rosa ) rote Kolonien und auf dem XLD-Agar ( rot ) transparente Kolonien mit schwarzem Zentrum. Zur Herstellung der “bunten Reihe” werden folgende Medien mit einer Salmonella verdächtigen Kolonie beimpft: SIM-Agar: Harnstoff-Agar: Eisen-3-Zucker-/Lysin-Agar: Hochschichtröhrchen ( Stichbeimpfung ) Schrägröhrchen ( nur Schrägfläche wird beimpft ) Hoch-/Schrägschicht ( zuerst wird im Stich beimpft, dann die Schrägfläche ) Für den Agglutinationstest wird eine verdächtig Kolonie auf TSA-Agar fraktioniert ausgestrichen. 4. Auswertung der “bunten Reihe” und Salmonella-Agglutination SIM-Agar: Indol-Bildung H2S-Bildung Beweglichkeit = nach Zugabe von Kovac´schem Reagenz: gelb ( Indol negativ ) = Schwarzfärbung ( positiv ) = positiv Harnstoff-Agar: Harnstoffverwertung = gelb ( negativ ) Eisen-3 Zucker-Agar: Glucosevergärung = Hochschicht gelb ( positiv ) Lactosevergärung = Schrägfläche rot ( negativ ) H2S-Bildung = Schwarzfärbung ( positiv ) Lysin-Agar: LCD-Nachweis = Hochschicht violett und schwarz, Schrägfläche violett ( positiv ) Für den Agglutinationstest wird eine Einzelkolonie der verdächtigen Kultur vom TSA-Agar auf einem Objektträger mit einem Tropfen Testserum vermischt. Es handelt sich hierbei um einen serologischen Test. Um das Ergebnis abzusichern wird eine Negativkontrolle mit steriler Ringer-Lösung ( Prüfung auf Selbstagglutination ) und eine Positivkontrolle mit einem Teststamm ( Salmonella poona ) durchgeführt. Bei einem positiven Ergebnis wird mit spezifischen O- und H-Antiseren die Identifizierung des Serovars durchgeführt. 13 Bestimmung der Gesamtkeimzahl, Anzahl an E. coli / coliformen Keimen, S. aureus: Aus der mit Ringer-Lösung homogenisierten Probe wird eine Verdünnungsreihe bis 10-8 hergestellt. Die Gesamtkeimzahl wird mit Hilfe des Plattengussverfahrens mit Plate-Count-Agar der Verdünnungsstufen 10-3 bis 10-8 bestimmt. Die Kolonien werden nach der Inkubationszeit ausgezählt. Für den Test auf E. coli / coliforme Keime wird das Oberflächenverfahren auf VRB-Agar angewendet. Es werden ebenfalls die Verdünnungsstufen 10-3 bis 10-8 benutzt. Als Positivkontrolle für E. coli wird eine VRB-Platte mit E. coli beimpft. Die Kolonien werden ausgezählt. E. coli verdächtige Kolonien werden auf TS-Agar überimpft. Nach Inkubation wird mit einer Einzelkolonie ein IMViC-Test durchgeführt. Um Koagulase-positive Staphylokokken nachzuweisen wird das Oberflächenverfahren mit den Verdünnungsstufen 10-1 bis 10-4 auf BP-Agar durchgeführt. Als Positivkontrolle für S. aureus wird eine BP-Platte mit diesem beimpft. Die Auswertung erfolgt durch auszählen verdächtiger Kolonien. Verdächtige Kolonien sind schwarz, rund und konvex. Weiter weisen sie einen schwachen Glanz auf und sind von einem Hof umgeben. Verdächtige Kolonien werden in ein Serologie-Röhrchen mit Kaninchenplasma überführt. Die Inkubation erfolgt bei 37°C für 4-6 Stunden. Tritt eine Verklumpung ein, ist die Kolonie Koagulase-positiv. Ergebnisse: Art der Probe: Verpackungsart: Lagertemperatur bis zur Probennahme: Eingangstemperatur: Lagertemperatur im Labor: pH-Wert: Hackfleisch Originalverpackung 22°C 2°C 22°C 6,2 Gesamtkeimzahl, E.coli, coliforme Keime und Staphylokokken Verdünnung 10.1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Gesamtkeimzahl nicht getestet nicht getestet 0 0 0 0 E.coli, coliforme Keime nicht getestet nicht getestet 0 0 0 0 Koag.-pos. Staphylokokken verdächtig 1 1 0 0 Nicht getestet Nicht getestet Gesamtkeimzahl: Auf keiner Agarplatte konnten Kolonie nachgewiesen werden. Das Ergebnis ist anzuzweifeln, da der Test auf S. aureus zu einem positiven Ergebnis führte. Entweder war der verwendete Agar zu heiß oder die Inkubationszeit war zu gering. E. coli / coliforme Keime: Es konnten keine Kolonien nachgewiesen werden. 14 Koagulase-positive Staphylokokken: Der Koagulasetest liefert ein positives Ergebnis. Die Keimbelastung ist aber sehr gering. Es konnte je nur eine Kolonie bei den Verdünnungsstufen 10-1 und 10-2 festgestellt werden. Ergebnis der Demonstration: Salmonella auf Selektivagar XLD Tetrathionat RV + + Rambach + + Beschreibung weiße Kolonien, schwarze Zentren, glänzend, rund, glatte Oberfläche Farbumschlag Nährboden nach rot, Kolonien weiß-rosa, glänzend, glatte Oberfläche, nicht ganz rund Ergebnis „Bunte Reihe“ für Salmonella ( Demonstration ) - TSI-Agar: - Lysin-Agar: - SIM-Agar: - Harnstoffagar: H2S- Bildung durch Schwarzfärbung Violettfärbung keine Indolbildung, H2S- Bildung Gelbfärbung → positiv → positiv → negativ → negativ 15 9. Mikrobiologische Lebensmitteluntersuchung Molekularbiologischer Nachweis Detektion von Salmonellen in Hackfleisch mittels Polymerase-Kettenreaktion 9.1 Grundlagen Bei der Polymerase-Kettenreaktion wird von einer spezifischen Sequenz auf der DNA enzymatisch eine millionenfache Kopie hergestellt. Die Vervielfältigung ( Amplifikation ) gelingt mit Hilfe eines dreistufigen zyklischen Prozesses. 1. Denaturierung Die Probe wird auf ca. 95°C erhitzt. Dadurch wird die thermische Zersetzung des DNA-Doppelstranges in zwei Einzelstränge erreicht. 2. Annealing Die Probe wird auf 40-60°C abgekühlt. Zuvor zugesetzte synthetischen Oligonucleotidprimer binden an die spezifische komplementäre DNA-Sequenz. Die Primer bilden den Ansatzpunkt für die DNA-Polymerase. Ausgehend vom 3’OH-Ende der Primer setzt im nächsten Schritt die Synthese des komplementären Stranges an. 3. Elongation Die Probe wird auf ca. 72°C erhitzt. Es beginnt die Strangsynthese durch die DNA-Polymerase. Das Produkt des ersten Zyklus ist eine Matrize, die über die Grenzen der Primeranlagestellen hinaus synthetisiert wird. Erst nach dem zweiten Zyklus ist das Produkt eine Matrize, die nur die durch die Primerstellen begrenzte Zielsequenz enthält. Diese wird in den folgenden 30-35 Zyklen millionenfach amplifiziert. Das Reaktionsende wird eingeleitet, indem innerhalb von 10 Minuten auf 4°C abgekühlt wird. 9.2 Praktische Vorgehensweise Nukleinsäureextraktion Aus der Primäranreicherung wird die zu untersuchende DNA aus der Bakterienzelle freigesetzt. Dies wird durch Erhitzung der Probe erreicht. Dadurch werden auch zelleigene Proteine zerstört, die die DNA abbauen würden. PCR-Reaktion Die erhaltene DNA wird in die schon beschriebene PCR-Reaktion eingesetzt. 16 Gelelektrophorese Dabei handelt es sich um eine Auftrennung der amplifizierten Produkte. Das PCR-Produkt wird mit einem Blaupuffer ( dient zum Beschweren der Probe ) versetzt und in die Geltasche eingebracht. DNA-Moleküle sind negativ geladen und wandern aus diesem Grund in einem angelegten elektrischen Feld zur Anode. Auch das eingesetzte Gel hat eine bestimmte Porengröße. Mit zunehmender Molekülgröße sinkt die Wanderungsgeschwindigkeit. Moleküle gleicher Größe bewegen sich gleich schnell und wandern gemeinsam in einer Bande. Sind unterschiedliche PCR-Amplifikate vorhanden wird bei der Elektrophorese eine Auftrennung der Produkte nach ihrer Größe erzielt. Zusätzlich wird immer noch ein Längenmarker mit aufgetragen, der aus DNA-Fragmenten verschiedener bekannter Größe besteht. Die Größe des PCR-Produktes wird aufgrund seiner Lage im Gel im Vergleich zu der entsprechenden Bande des Längenmarkers bestimmt. Färbung mit Ethiumdibromid Ethiumdibromid wird zum Anfärben von Nukleinsäuren bei der Gelelektrophorese verwendet. Dabei interkalieren einzelne Moleküle zwischen die Basen der DNA, wobei sich das Anregungsspektrum verändert. Die Fluoreszenz der Substanz wird bei Anregung durch ultraviolettes Licht stark erhöht. Im UV-Licht leuchten im Agarosegel die Stellen hell auf, an denen sich Nukleinsäuren befinden. Stellen ohne Nukleinsäuren erscheinen dunkel. 17 10. Qualitative und quantitative Erfassung von Anaerobiern 10.1 Qualitativer Nachweis saccharolytischer Sporenbildner Versuchsprinzip: Zum qualitativen Nachweis anaerober Sporenbildner wurde eine angeschnittene, mit Erde verschmutzte Kartoffelscheibe in Leitungswasser 3 Tage bei 37°C inkubiert. Aus dieser Probe wird ein mikroskopisches Präparat hergestellt und eine Sporenfärbung durchgeführt. Zudem wird das Wachstum nach Pasteurisation unter aeroben und anaeroben Bedingungen im Anaerobentopf beobachtet. Versuchsdurchführung: Mit einer Impföse wird etwas Kartoffelsuspension entnommen und in ca. 1ml Leitungswasser im Reagenzglas suspendiert. Die Suspension wird im Wasserbad für 10 min bei 75°C erhitzt, um alle vegetativen Zellen abzutöten. Nur die Sporen bleiben erhalten. Zwei TSA-Platten werden gedrittelt. Je ein drittel wird mit der pasteurisierten Kartoffelsuspension, Clostridium butyricum (anaerobe Wachstumskontrolle) und Bacillus subtilis (aerobe Wachstumskontrolle) beimpft und 2 Tage bei 37°C bebrütet. Einmal unter aeroben Bedingungen einmal unter anaeroben Bedingungen. Ergebnis: a) Nativpräparat rote Stäbchen und grüne, freie Sporen zu erkennen in der B. subtilis Positivkontrolle. Bei der Kartoffelsuspension viele Einzeller, Stäbchen und Kokken. b) Anzucht Versuch: Aerob: Beim Kartoffelausstrich eine KbE, kein Wachstum von Clostridium butyricum, starkes Wachstum von Bacillus subtilis. Anaerob: Beim Kartoffelsausstrich fünf KbE, kein Wachstum von Bacillus subtilis, starkes Wachstum von Clostridium butyricum. 18 10.2 Quantitative Bestimmung von anaeroben Mikroorganismen in Gewürzen Versuchsprinzip: Sporennachweis nach Pasteurisation. Thioglykolat als reduzierendes Argens in DRCMBoullion (Differential Clostridial Medium). Die Proben werden mit Paraffin verschlossen, um anaerobe Bedingungen zu simulieren. Versuchsdurchführung: 1g Paprikapulver wird in 9ml DRCM-Bouillon bei 80°C für 10 Minuten pasteurisiert. Aus dem Überstand wird eine Verdünnungsreihe bis 10-4 in DRCM hergestellt. Die Ansätze werden mit Paraffin überschichtet, um ein anaerobes Milieu zu schaffen und bei 37°C für 1-2 Tage inkubiert. Eine Schwarzfärbung zeigt ein positives Ergebnis an. Ergebnis: Verdünnung 10-1 10-2 10-3 10-4 Schwarzfärbung Ja Nein Nein Nein Nach Ergebnisangabe im Praktikumskript: 1-10 KbE/g Clostridium spp. nachgewiesen 19 11. Mikrobiologische Milchkontrolle 11.1 Feststellung der bakteriologischen Beschaffenheit von Milch 11.1.1 Quantitativer Nachweis aerober Mikroorganismen in Milch Versuchsprinzip: Herstellung einer Verdünnungsreihe aus Probe A mit anschließendem Plattengußverfahren zur Berechnung der Gesamtkeimzahl. Versuchsdurchführung: Aus der Milchprobe wird eine Verdünnungsreihe bis 10-7 mit Ringerlösung hergestellt. Die Verdünnungsstufen 10-7 bis 10-1 werden nach dem Plattengussverfahren mit SkimmilkPlate-Count-Agar (Hefeextrakt-Trypton-Glucose-Agar mit Magermilchzusatz) hergestellt, die bei 30°C für 72h inkubiert werden. Die Kolonien werden gezählt. Ergebnis: Bei keiner der Platten ist eine Kolonie zu finden. Diese Milchprobe ist keimfrei. Die Abwesenheit von Mikroorganismen könnte auf einen Zusatz von Hemmstoffen hinweisen. 11.1.2 Colititer Versuchsprinzip: Herstellung einer Verdünnungsreihe, Inkubation in LST-Bouillon (Laurylsulfat-Tryptose) mit anschließendem MPN-Verfahren. Versuchsdurchführung: Aus den Verdünnungsstufen 10-7 bis 10-5 der Milchverdünnungsreihe werden je 1ml der jeweiligen Stufe in drei Reagenzgläser mit 9ml LST-Bouillon gegeben und für 48h bei 37°C inkubiert. Ein positives Ergebnis wird durch Gasbildung oder Trübung angezeigt. Die Auswertung erfolgt nach der MPN-Methode. Ergebnis: Bei keinem der Röhrchen ist ein positiver Nachweis zu erkennen. Die Abwesenheit von Mikroorganismen könnte auf einen Zusatz von Hemmstoffen hinweisen. 20 11.2 Feststellung von Stoffen mit antibiotischer Wirkung 11.2.1 Plättchentest Versuchsprinzip: Agardiffusionstest mit Messung des Hemmhofdurchmessers Versuchsdurchführung: Die Milchproben A, B und C sowie die Penicillin-Standard-Lösungen (0,3μg/ml und 0,15μg/ml) werden mit kleinen Testplättchen aufgenommen und auf eine Agarplatte überführt. Auf der Agarplatte ist eine Sporensuspension von G. stearothermophilus var. calidolactis (2ml/200ml) zugegeben. Die Platten werden für 2.5-5h bei 65°C inkubiert. Ergebnis: Probe A B C Hemmhof[mm] 15 0 0 Hemmstoff Positiv Negativ Negativ 0,3μg/ml 32 Positiv 0,15μg/ml 30 Positiv In der Milchprobe A sind Hemmstoffe enthalten. Sie ist damit nicht zur Weiterverarbeitung geeignet. 11.2.2 Säuerungs -bzw. Koagulationshemmtest Versuchsprinzip: Bei diesem Test wird die Säuerungs- bzw. Koagulationsfähigkeit der Milchproben nach Beimpfung mit Joghurt bestimmt. Zur Unterscheidung der Phasengrenzen wird Methylenblau (Indikator) hinzugegeben. Die Koagulation wird durch Säurebildung hervorgerufen, die durch Hemmstoffe verhindert wird. Versuchsdurchführung: Die mit dem Indikator versetzte Joghurtkultur wird zu 50 ml Milch hinzugefügt und bei 42°C im Wasserbad inkubiert. Ergebnis: Bei Probe A ist keine Koagulation zu beobachten, der Indikator ist gleichmäßig in der Probe verteilt. Die Probe ist mit einem Hemmstoff belastet. Die Milch darf nicht in den Handel gelangen. Bei Probe B und C ist eine deutlich Koagulation zu erkennen, der Koagulierte Teil ist entfärbt, wobei die obere Phase noch gefärbt ist. 21 12. Nachweis und Differenzierung von Enterobacteriaceae 12.1 Trinkwasseruntersuchung Versuchsprinzip: Bestimmung der Gesamtkeimzahl, Nachweis von Escherichia coli und coliformen Keimen, Enterokokken, Clostridium perfringens und Pseudomonas aeruginosa nach der Trinkwasserverordnung 2001. Allgemeine Anforderungen an Wasser für den menschlichen Gebrauch Mikroorganismus Escherichia coli Enterokokken Coliforme Bakterien Grenzwert (KbE/100ml) 0 0 0 Versuchsdurchführung: Der Wasserhahn wird geöffnet und für 5 Minuten laufen gelassen. Danach wird 1Liter Leitungswasser in ein steriles Probengefäß abgefüllt. Bestimmung der Gesamtkeimzahl: Zur Bestimmung der GKZ wird das Plattengussverfahren mit Hefeextrakt-Agar verwendet. Es wird ein Doppelansatz durchgeführt. Die Inkubation der Platten erfolgt bei 22°C für 68 Stunden, die zwei anderen Platten werden bei 36°C für 44 Stunden inkubiert. Nachweis von Escherichia coli und coliformen Keimen: 100ml der Wasserprobe werden membranfiltriert. Der Membranfilter wird auf Lactose-TTCAgar gelegt. Die Inkubation erfolgt bei 36°C für 21 Stunden. Lactose-positive Kolonien sind gelb/orange und werden weiteren Tests ( Indol-Nachweis, Oxidase-Test ) unterzogen. Ergebnis: Auf keiner der Platten konnte eine Kolonie gezählt werden. Allerdings wurden die Platten auch nur für knapp 24h bebrütet, da das Praktikum endete. Das Wasser ist keimfrei. 22 Nachweis von Enterokokken (Demonstration) 100ml der Wasserprobe werden membranfiltriert. Der Membranfilter wird auf SlanezBartley-Agar gelegt. Die Inkubation erfolgt bei 36°C für 44 Stunden. Es werden alle roten, kastanienbraunen oder rosa Kolonien gezählt. Der Membranfilter wird auf Galle-AsculinAgar überführt und bei 44°C für 2 Stunden inkubiert. Alle Kolonien mit gelbbraunem bis schwarzen Hof werden als interstinale Enterokokken gezählt. Nachweis von Clostridium perfringens (Demonstration) 100ml der Wasserprobe werden membranfiltriert. Der Membranfilter wird auf m-CP-Agar gelegt. Nach einer anaeroben Inkubationszeit von 21 Stunden bei 44°C werden alle dunkelgelben Kolonien , die sich nach Bedampfen mit Ammoniumhydroxid rot verfärben, als C. perfringens gezählt. Nachweis von Pseudomonas aeruginosa (Demonstartion) 250ml der Wasserprobe werden membranfiltriert. Der Membranfilter wird auf PseudomonasCN-Agar gelegt. Die Inkubation erfolgt bei 36°C für 44 Stunden. Alle blaugrünen Kolonien werden als P. aeroginosa gezählt. Fluoreszierende oder rot-braune Kolonien sind P. aerogenosa verdächtig. Es wird bei diesen Kolonien ein Oxidase-Test durchgeführt, sowie die Bildung von Ammoniak und Fluoreszenz überprüft, die bei P. aerogenosa positiv ausfallen müssen um den Verdacht zu bestätigen. 12.2 Differenzierung von Enterobacteriaceae 12.2.1 IMViC Test Versuchsprinzip: Verschiedene Bakterienarten haben unterschiedliche Stoffwechselaktivitäten. Dies kann zur Differenzierung genutzt werden durch unterschiedliche Enzymaktivitäten oder die Anlagerung von Stoffwechselprodukten. Versuchsdurchführung: Escherichia. coli und Enterobacter aerogenes werden als Reinkulturen untersucht. Es werden je einmal Tryptophan-Bouillon für den Indol Nachweis ( Medium I ), Medium für MethylrotReaktion (Medium M) und Voges-Proskauer Reaktion ( Medium V ), sowie ein Röhrchen mit Simmons-Citrat-Agar ( Medium C) mit den Reinkulturen beimpft und für 24h bei 37°C inkubiert. Indolnachweis: Medium I wird mit 3 Tropfen Kovacs-Reagenz versetzt und leicht geschüttelt. Rote Farbe in der alkoholischen Phase wird als positiv gewertet. 23 Säurebildung: Medium M wird mit 5 Tropfen Methylrot versetzt. Wenn sich Säure bildet, schlägt der Indikator nach rot um ( positive Reaktion ). Voges-Proskauer-Reaktion: Medium V wird mit 6 Tropfen α-Naphtollösung vermischt, anschließend werden 3 Tropfen 40%ige KOH hinzugegeben. Ein roter Farbkomplex an der Oberfläche ist ein positiver Nachweis. Verwertung von Citrat: Ein positives Ergebnis liegt vor, wenn ein Wachstum auf dem Schrägagar zu erkennen ist und der Indikator im Medium nach dunkelblau umgeschlagen ist. Ergebnis: Indol Escherichia coli Positiv Enterobacter aerogenes Negativ Methylrot VogesProskauer SimmonCitratagar Positiv Negativ Negativ Negativ Positiv Positiv Mit Hilfe der verschiedenen Nachweisreaktionen kann zwischen Enterobacteriaceae unterschieden werden. 12.2.2 Biochemische Differenzierung mit dem API-Enterobacteriaceae-System Versuchsprinzip: Dieses System ist für Routinediagnostik geeignet. Es besteht aus 20 Teströhrchen mit Testsubstanzen für den Nachweis von charakteristischen, biochemischen Merkmalen. Die Röhrchen werden mit einer Suspension der zu untersuchenden Substanz versetzt und bebrütet. Anschließend können, gegebenenfalls nach Zugabe benötigter Reagenzien, die Ergebnisse der Reaktionen abgelesen und Indexziffern gebildet werden. Anhand der erhalten Indexziffer wird aus einer Tabelle der Mikroorganismus bestimmt. Versuchsdurchführung: Die ausliegenden Teströhrchen werden anhand von Farbbeispielen gedeutet und die Indexziffern gebildet. Im Tabellenwerk werden dann die Mikroorganismen bestimmt. Ergebnis: Keim 1: Indexziffer 7144552 → Escherichia coli, P = 0,956 Keim 2: Indexziffer 5305773 → Enterobacter aerogenes, P = 0,977 24 13 Schimmelpilze und Hefen Versuchsprinzip: Verschiedene Schimmelpilze und Hefen werden mikroskopiert. Davon werden Zeichnungen angefertigt. Durchführung: Von den Reinkulturen werden Nativpräparate mit Wasser und Baumwollblau-Färbelösung ( höherer Kontrast ) angefertigt und mikrokopiert. Folgende Schimmelpilze und Hefen werden mikroskopiert: Geotrichum candidum Rhizopus stolonifer Penicillum Aspergillus niger Eurotium amstelodami Talaomyces flavus Saccharomyces cerevisiae Zeichnungen siehe Anhang 25
