Vortrag zum BTS
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Vortrag zum Seminar Biotechnologische Laborübungen 1) Begrüßung der Teilnehmer: Ich begrüße sie hier in Wolfpassing sehr herzlich und freue mich das sie doch für dieses Seminar Zeit gefunden haben. Ich darf Teilnehmer aus Elmberg, Sitzenberg, Graz, Kematen, Pitzelstätten, Raumberg, Wieselburg begrüßen. 2) Vorstellung: Wie sie bereits wissen, ist mein Name Dr. Gudrun Nagl und ich werde sie durch das Seminar begleiten. Zu meiner Person: Meine Ausbildung zum Lebensmitteltechnologen begann schon hier in Wieselburg und Wolfpassing im FJ später dann auf der BOKU in Wien. In Ober St. Veit machte ich meine Lehramts- und Befähigungsprüfung. Während meiner Dissertation konnte ich bereits als Lehrer hier am FJ beginnen und nun unterrichte ich das 3. Jahr ganzbeschäftigt Chemie + Übungen, MILA und ERL. 3) Begrüßung der Referenten: Mag. Alfred Langeder Fa. Schott-Eppendorf Dr. Renate Pfleger, BA für MW in Wolfpassing Abt.leiter der Mikro Nachmittag. Mag Susanne Baumgartner, Fa. bioMérieux 4) Organisatorisches 5) Ziele des Seminars: Überblick über die Biotechnologie geben Grundlagen der BT vermitteln Lehrinhalte der BTÜ festlegen Laborausstattung zusammenstellen Beschaffung wichtiger Materialien Möglichkeiten dieses Gegenstandes aufzeigen 1 Grundlagen und Lehrinhalte der Biotechnologischen Laborübungen Definition: Biotechnologie ist die intergrierte Anwendung von Natur- und Ingenieurwissenschaften mit dem Ziel, Organismen, Zellen, Teile von Zellen und molekulare Analoge technisch zu nutzen. European Federation of Biotechnology EFB Die Kenntnis von Stoffwechselprozessen wird also in biologischen Stoffumwandlungsverfahren zur Herstellung von Produkten verwendet. Biotechnologie ist ein Zusammenspiel von Biologie, Chemie und Technik. Keine neue Wissenschaft, sondern ein Arbeitsgebiet mit speziellen Möglichkeiten und Zielsetzungen. Biologie Mikrobiologie Genetik Zellbiologie Zellkultur Biochemie Enzymchmie Molekularbiologie Gentechnik Chemie Analytische Chemie Physikalische Chemie Naturstoffchemie Chemische Verfahrenstechnik Reaktionstechnik Aufarbeitung Trennprozesse Technik Apparatebau Meß- und Regeltechnik Prozesstechnik Mitten drinnen Biotechnologie 2 Traditionelle Arbeitsgebiete der Bt: Technische MIKRO: nutzt best. biochemische Leistungen der Organismen Gewinnung von Zellmasse – Massenkulturen, nun dr.Verwendung von Enzymen ergänzt Technische Biochemie: Aufreinigung, Isolierung und Charakterisierung von Lebewesen gebildete Substanzen, auch für Herstellung und Veränderung von Stoffen genutzt Bioverfahrenstechnik: Verfahrenstechnische Aspekte von Biotechnologie und Biochemie Analyse, Beschreibung und Entwicklung der einzelnen Verfahrensschritte bei Produktionsund Entsorgungsprozessen mit MO, Zellkulturen und Enzymen technische Mikro und Biotechnologie befassen sich mit Produktions- und Entsorgungsprozessen ( Abwasser, kompost..)und Konservierungsmethoden für die Lanswirtschaft (Silage) industrielle Mikro ist noch umfassender, weil vieles nicht der Biotechnologie zuzuordnen ist Angewandte Mikro: umfasst alle praktischen Nutzanwendungen von Mo, und deren Maßnahmen zur Bekämpfung geht so weit über die industrielle Mikro hinaus. Lebensmittel-Mikrobiologie Landwirtschaftliche M. (Bodenmikro., Pflanzenpathologie) Abwasser- und Gewässermikro. Medizinische Mikro. Hygiene Biotechnologie und chem Technologie sind ähnlich: Stoffliche Umsetzungen –Kochen, Braten, Alkohol- und Milchsäureproduktion = biochem. Vorgänge Beide befassen sich mit Herstellung und Veränderung von Stoffen. Verfahrensschritte - Produktionsverfahren Meilensteine der Biotechnologie: Vor 8000 Jahren Sumerer aus dem Zweistromland zw. Euphrat und Tigris brauten schon ein alkoholisches Getränk (lat. fermentare = gären) Vor 6000 Jahren Wein in Ägypten, Bier in Babylon und Ägypten, Brotherstellung mit Sauerteig, Mo wurden damals schon genutzt 1683 erste mikroskopische Betrachtung von Bakterien und Hefezellen (Leeuwenhoek) 3 1857 Beschreibung der Milchsäurebakterien (Pasteur) 1870 Grundlegende Methoden der Bakteriologie (Koch, Cohn, Petri, Roux...) 1929 Entdeckung des Penicillins (Fleming) 1945 Penicillin-Herstellung in Submerskultur, Entwicklung der Fermenters und Steriltechnik 1949 Essigproduktion 1973 Neukombination von DNA: „Gentechnologie“ In einer Kneipe auf Hawaii wurde die Grundoperation der Gentechnik geboren. Die Biochemiker Herbert Boyer und Stanley Cohen lösten Gene aus Zellen, zerstückelten, rekombinierten und schleusten diese wieder in Zllen zurück. Diese Technik erlaubte es Gene nach Wunsch in Bakterien oder andere Zellen einzuschleusen und ebenso zu vermehren. 1982 Insulin aus gentechnischer Produktion mit Bakterien Bildungs- und Lehraufgabe: Der Schüler soll elementare mikrobiologische Arbeitmethoden selbstständig durchführen die hygienische Unbedenklichkeit von Lebensmitteln und daraus abgeleiteten Erzeugnissen in allen Produktions- und Vermarktungsstufen beurteilen können. aufbauend auf den Kenntnissen der Biologie und Chemie den interdisziplinären Charakter der Biotechnologie kennen lernen. die Ergebnisse seiner Untersuchungen interpretieren können. sich seiner Verantwortung für die menschliche Gesundheit bewusst sein. Lehrstoff im 3. Jahrgang mit 2 Wochenstunden: 2003/4 aktuell Einführung in die mikrobiologische Arbeit: Mikrobiologische Präparate, Mikroskopieren, Konzentrationsbestimmungen, Keimgruppennachweise Nachweis und Kultivierung: Isolierung, Identifizierung, Verdünnungsreihen, Stammerhaltung, Kultivierung, Produktion Kontrollmethodik der Personal- und Betriebshygiene Biotechnologische Analytik und Verfahren: Hemmstoffe, Wuchsstoffe, Stoffwechselprodukte, Gel-Elektrophorese, Fermentationen 4 Inhalt und Abfolge der Übungseinheiten: Laborordnung – Einführung in die Laborbegebenheiten Definition von mikrobiologischem - aseptischem Arbeiten Mikroskop – mikroskopische Präparate Nährmedienbereitung – Sterilisationstechnik Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen Bouillonkulturen Agarstrich-, Agarstichkulturen Kultivierung auf Agarplatten Koch`sches Plattenguss-Verfahren Spatel-Verfahren Petrifilm-Methode Most probable number MPN-Technik Titer-Verfahren Schüttelkulturen Nachweismethoden gleich an verschiedenen Lebensmitteln Rohmilch; Wasser, Eis, Käse, Wurst Personal- und Betriebshygiene Hemmstoffe Identifizierung – API, VIDAS.... Stoffwechselprodukte – Essigsäureproduktion im Schüttelkolben Gel-Elektrophorese - Einsatzbereiche Begriffe und Definition des aseptischen Arbeitens: Sterilisation: Vorgang, um Sterilität zu erreichen Steril: frei von vermehrungsfähigen Mikroorganismen jeglicher Art (Phagen, Viren, Sporen miteinbezogen) Aseptisch: arbeiten unter Bedingungen, die Fremdorganismen ausschalten Infektion: ein pathologischer Begriff: Anwesenheit bzw. Parasitierung von einem Organismus durch einen anderen Organismus Kontamination: Anwesenheit von Fremdorganismen Desinfektion: weitgehende Abtötung von Mikroorganismen auf Oberflächen Dekontamination: weitgehende Abtötung von Mikroorganismen in Nährmedien Keim: vermehrungsfähiger Mikroorganismus Pasteurisation: Erhitzung auf Temperaturen unter 100°C zwecks Herabsetzung der Keimzahl 5 Mikrobiologische Präparate: Verschiedene Färbetechniken: Methylenblau-Färbung Tusche-Färbung Gram-Färbung schon bekannt aus der Biologie zum Zweck der Differenzierung, Erkennung morphologischer Merkmale FÄRBEN VON MIKROORGANISMEN Mo werden dadurch leichter erkennbar Darstellen von gewissen Inhaltsstoffen wie, Strukturen, Geißeln, Sporen, Kapseln, Zellkerne... – Morphologie erkennbar Erreichen einer diagnostischen Differenzierung z.B. Gram-Färbung Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen z.B. Vitalfärbung Kultivierungsmethoden: Stammhaltung Glycerolmethode Anzucht aus gefriergetrockneter Kultur mit Standardmedium – in exponentieller Wachstumsphase abzentrifugieren – in frischem Vollmedium aufnehmen und 1:2 mit Glycerol mischen und in kleinen Portionen bei –70°C lagern und an 2 verschiedenen Standorten lagern, wenn ein Gefrierschrank auffällt.... Andere modernere Methoden – teurer aber gleiches Prinzip KONSERVIEREN VON REINKULTUREN Agarschrägkultur: Auf der schrägen Agarfläche werden die Bakterien ausgestrichen und anschließend bebrütet. Wegen der Gefahr der Austrocknung sollen Schraubverschlusseprouvetten Verwendung finden, Gefriertrocknung von Kulturen: Kulturen werden in einem flüssigen Medium angezüchtet und anschließend gefriergetrocknet. Die Ampullen oder Durchstichflaschen können jahrelang aufbewahrt werden. Einfrieren von Kulturen bei –80°C: Kulturen werden in eine Bouillon mit 10% Glycerinanteil übergeführt und anschließend im Tiefkühlschrank aufbewahrt. Eine Variante stellt das adsorbieren von Mikroorganismen an Perlen dar, die in einem Schutzmedium eingefroren werden (z.B. Microbank) 6 KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN Bei Anwendung von Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen muß die Tatsache berücksichtigt werden, daß die Mikroorganismen einen unterschiedlichen Bedarf an Luftsauerstoff haben. Obligat (=strikt) aerob: Mikroorganismen, die Sauerstoff zum Wachstum brauchen. Obligat anaerob: Mikroorganismen, die durch Sauerstoff im Wachstum gehemmt werden. Fakultativ anaerob bzw. fakultativ aerob: Mikroorganismen, die sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen gedeihen. Bei der Kultur aerober und anaeroben Mikroorganismen ist diesem Unterschied durch die Wahl entsprechender Verfahren, die einen Sauerstoffzutritt zulassen bzw. einen Sauerstoffausschluß bewirken, Rechnung zu tragen. Für die Anzucht von Mikroorganismen werden sterile Kolben, Reagenzgläser und Petrischalen verwendet. 1. Bouillonkulturen Mit einer Öse werden Keime in eine Bouillon eingebracht. Die Bouillon kann in Röhrchen oder Kölbchen abgefüllt sein, (meist 10 ml pro Eprouvette oder 100 ml Erlenmeyerkolben). Das Wachstum erkennt man an der zunehmenden Trübung während der Bebrütung oder auch Oberflächenwachstum oder Sedimentbildung am Boden. 2. Agarstrichkultur Reinkulturen werden bei diesem Verfahren auf Schrägagar mit einer Öse entweder geradlinig oder wellenförmig ausgestrichen. Anschließend wird die Eprouvette mit der ausgestrichenen Kultur bei geeigneter Temperatur bebrütet, bis der Ausstrich makroskopisch sichtbar ist. Manche Arten wachsen sehr charakteristisch: Oberfläche ist glatt, glänzend, rauh, ausgefranst...; Farbbildung,... Die Agarstrichkultur mit Schraubverschluß wird auch zum Aufbewahren (4-8°C) von aeroben Reinkulturen verwendet; sogen. Stammkulturen. 3. Stichkultur Die Stichkultur wird in Agar oder Gelatinenährböden (in Eprouvetten abgefüllt und mit gerader Oberfläche erstarren gelassen) durchgeführt. Mit der Agarstichkultur kann man das Verhalten der Kultur gegenüber Sauerstoff feststellen. Aerobe Kulturen wachsen an der Oberfläche des Stiches, während anaerobe Organismen sich im unteren Drittel des Stichkanals ansiedeln. 4. Kultivierung auf Agarplatten Ausstrich mit Öse, Plattengußverfahren (n. Koch), Spatelverfahren 5. Fraktionierter Austrich auf Agarplatten zur Gewinnung von Einzelkolonien zur genaueren Identifizierung von MO 7 1. Koch'sches Plattenverfahren Prinzip: Dieses Verfahren basiert auf der Annahme, daß aus 1 Keim durch die Bebrütung eine Kolonie entsteht (es kann aber auch aus einer Keimgruppe eine Kolonie entstehen KbE), die mit freiem Auge sichtbar ist. Um die Keimzahl erfassen zu können, bzw. zu sog. "auszählbaren" Platten zu kommen, muß die Probe entsprechend verdünnt werden. Ist die Probe fest oder pastös, muß diese zuerst mit einer bestimmten Menge Verdünnungslösung aufgelöst oder aufgeschwemmt werden. Für diese Probenaufbereitung gibt es internationale Standards (IMVStandard 122B:1992). Von der Probe oder den Verdünnungen werden dann Platten gegossen und nach der Bebrütung die aus den Zellen oder Zellklumpen entstandenen Kolonien gezählt. Die Keimzahl (neue Definition: Anzahl der kolonienbildenden Einheiten = KbE) der Probe erhält man, wenn man die Zahl der Kolonien auf der auszählbaren Platte mit dem jeweiligen Verdünnungsfaktor multipliziert. Die Probennahme ist eine Momentaufnahme, d. h. nach 1 Tag ergibt die Probe nicht mehr das selbe Ergebnis. Somit ist es sehr wichtig, daß die Proben sofort oder nach kurzer Kühllagerung mikrobiologisch untersucht werden. Vorbereitung der Proben: Milch und Milchprodukte -Probenaufbereitung und Herstellung der Verdünnungen für die mikrobiologische Untersuchung Auszug aus dem IMV-Standard 122B: 1992 Es wird unterschieden: Probe (z.B. Milch) Erstverdünnung weitere Verdünnungen Die Erstverdünnung (Ausgangssuspension) wird aus dem Probenmaterial und der 9-fachen Menge einer Verdünnungslösung hergestellt, indem man 1:10 Verdünnungen anlegt (im Routineverfahren sind 1: 100-Verdünnungen gestattet), dabei wird die Probe sorgfältig gemischt (25mal stürzen) und eine Verdünnung 1 : 10 mit einer ¼ starken Ringerlösung hergestellt. Herstellen der Verdünnungsreihe für das Plattengießverfahren nach KOCH: Referenz- (Standard-) verfahren: Routineverfahren: 3 Verdünnungsstufen Verdünnung erfolgt in 10er Schritten 3 Verdünnungsstufen Verdünnung erfolgt in 100er Schritten 99 ml Verdünnungslösung + 1 ml Probe 8 Milch 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml 9 ml 9 ml 10 -1 10 -2 10 -3 10 0 1 ml 1 ml V0 V1 1 ml 1 ml V2 V3 Plattengießen: Vor dem Plattengießen muß der Agar (in Eprouvetten oder Kölbchen) vollständig aufgeschmolzen werden (30 Minuten im Dampftopf) und im Wasserbad auf ca. 47°C abgekühlt werden. Bei Entnahme eines Röhrchens aus dem Wasserbad ist das außen anhaftende Wasser zur Vermeidung von Kontaminationen mit einem Tuch abzuwischen und der Rand der Eprouvette ist vor dem Ausgießen in die Petrischale abzuflammen. Beschriften der Platten: Datum, Probennummer, Name, V und was wurde untersucht Mischen des Nährbodens mit der Probe: (Hiefür gibt es eine Standardvorschrift) Im Routinebetrieb genügt es, sofort nach dem Eingießen des Agars die Platten in kreisende oder 8-schleifenförmige Bewegung zu versetzen und so eine Durchmischung zu erreichen. Zwischen dem Herstellen der Verdünnungsreihe und dem Ausgießen des Agars sollten maximal 15 Minuten verstreichen. Bebrüten der Petrischalen: Nach dem Erstarren des Nährbodens werden die umgedrehten Petrischalen (mit dem Boden nach oben) bei verschiedenen Temperaturen, abhängig von der optimalen Wachstumstemperatur der Organismen, bebrütet. Gelatineplatten dürfen nicht umgedreht werden, da hier die Verflüssigung der Gelatine geprüft wird. 9 Auswertung der Platten: Zählen der Kolonien: Unter Zuhilfenahme eines Plattenzählgerätes wird jede Kolonie markiert und gleichzeitig ein Zählwerk betätigt. Platten, die weniger als 10 Kolonien und mehr als 300 Kolonien aufweisen, werden ausgeschieden ("auszählbare" Platte: 10 bis 300 Kolonien – GKZ). Zuviele Keime auf der Platte hemmen sich gegenseitig im Wachstum, weiters wird der Zählfehler und somit der mathematische Fehler zu groß. "Laufkolonien" und "pin point"-Kolonien werden jeweils als eine Kolonie gezählt. Platten, die mehr als ein Viertel von Laufkolonien bedeckt sind, werden verworfen. Berechnung des Keimgehaltes: Die Keimzahl wird immer auf 1 ml (bei flüssigen Produkten) bzw. 1 g (bei festen Produkten) der Probe bezogen. Die Berechnung des Keimgehaltes erfolgt mit dem gewogenen arithmetischen Mittel, d. h. die Summe aller ausgezählten Kolonien wird dividiert durch die Summe der untersuchten. Berechnung des Ergebnisses erfolgt nach der Formel: c -------------------------- x d = KBE/ml bzw. g (1 x n1 + 0,1 x n2) c = Summe aller ausgezählten Kolonien n1 = Zahl der Platten der 1. Verdünnungsstufe n2 = Zahl der Platten der 2. Verdünnungsstufe d = Verdünnungsstufe der ersten ausgezählten Platte(n) n = ausgezählten Platten Das ermittelte Ergebnis wird mit lediglich 2 Stellen angegeben. Die 3. Stelle wird auf 0 gerundet. Beträgt sie 5, wird abgerundet, wenn die zweite Stelle eine gerade Zahl ist, und aufgerundet, wenn sie eine ungerade Zahl ist. Bspl.: 124 120 125 120 135 140 Werden weniger als 10 Kolonien auf der Platte gefunden d ist der Faktor der niedrigsten Verdünnungstufe. < 10xd Werden mehr als 300 Kolonien auf der Platte gefunden „geschätzte Keimzahl je g oder ml“ Weitere Möglichkeit: 124000 1,2 x 105 2. Spatelverfahren Von der Probe bzw. den Verdünnungen werden 0,1 ml auf der Oberfläche eines festen Nährbodens ausgespatelt. Das Verfahren ist anwendbar bei der Untersuchung aller Lebensmittel. 10 Teilmengen von etwa 15 ml des geschmolzenen Nährbodens werden in sterile Petrischalen überführt und zum Verfestigen stehengelassen. Platten, die vorher hergestellt wurden, sollten nicht länger als 4 Std. bei Raumtemperatur oder einen Tag bei 5 °C aufbewahrt werden. Wenn die Platten gegen Austrocknung geschützt sind, können sie bei einer Aufbewahrung bei 5 °C bis zu 7 Tagen verwendet werden. Unmittelbar vor der Verwendung werden die Platten mit der Agaroberfläche nach unten, schräg auf dem abgenommenen Deckel liegend, in einem Brutschrank ca. 30 min. bei 50 °C getrocknet. Beginnend bei der höchsten Verdünnung werden 0,1 ml auf die Agarplatten geben. Mit einem sterilen Drigalski-Spatel wird die Menge gleichmäßig unter kreisenden Bewegungen verteilt. Für jede Platte ist ein steriler Spatel zu verwenden. Die Platten werden mit dem Boden nach oben bei der für die nachzuweisenden Mikroorganismen erforderlichen Temperatur und Zeit bebrütet. 0,1 ml aus V0 V1 3. Petrifilm-Methode Die Petrifilmmethode ist eine Abart des Koch’schen Plattenverfahrens; anstelle von Petrischalen werden vorgefertigte Scheiben benutzt, die den betreffenden Agar in teilentwässerten Zustand enthalten. Auf jede Agarscheibe wird 1 ml Probelösung aufgebracht und der Agar quillt auf. Mit Hilfe eines Stempels wird das Deckblatt auf das Agar-areal gedrückt. Der Petrifilm kann bebrütet werden. Vorteil: Fertigmedium (kein Nährbodenkochen mehr!) geringer Platzbedarf im Brutschrank (es können bis zu 20 Petrifilme übereinandergestapelt werden) Nachteil: hohe Materialkosten. MO-Züchtung mit flüssigen Medien 4. Ermittlung der höchstwahrscheinlichen Keimzahl Most probable number (MPN) a) Für die Ermittlung einer MPN müssen Röhrchen über einen weiten Bereich (mindestens drei aufeinander folgende Verdünnungsstufen) beimpft werden. Für jede Verdünnungsstufe sind mindestens zwei, überlicherweise drei Parallelröhrchen notwendig. Die Verdünnungsreihe wird nach demselben Prinzip, wie bei Koch'schen Plattenverfahren beschrieben, durchgeführt. b) Die beimpften Röhrchen werden bei der jeweils festgesetzten Zeit bei der vorgegebener Temperatur bebrütet. c) Die bebrüteten Röhrchen werden hinsichtlich des Auftretens eines positiven Ergebnisses beurteilt (z.B. Gasbildung im Durhamröhrchen, Schwarzfärbung, Farbumschlag u.a.) und die Anzahl der positiven Ergebnisse für jede Verdünnungsstufe festgestellt. Es gibt nur positiv-negativ-Ergebnisse! 11 d) Ermittlung der Indexziffer (Stichzahl): Die Indexziffer beschreibt den Bereich der "Grenzverdünnung", also den Bereich, in dem die Probemengen sowohl Keime enthalten oder auch nicht enthalten. (Probemengen, die soviele Keime enthalten, daß auf jeden Fall ein positives Ergebnis nach der Bebrütung auftritt oder Probemengen, die keine Keime mehr enthalten und daher auf jeden Fall negative Reaktionen ergeben, sind für die Bildung der Indexziffer nicht brauchbar). Aus den aus drei aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen erhaltenen Ergebnisse wird die Indexziffer gebildet. Nach Möglichkeit sollen dazu die drei Verdünnungsstufen, die noch positive Ergebnisse zeigen, herangezogen werden. Enthält die Verdünnungsreihe keine drei Verdünnungsstufen mit positiven Ergebnissen, so dürfen auch Verdünnungsstufen mit negativen Ergebnissen zur Bildung der Indexziffer herangezogen werden. e) Berechnung der Keimzahl: Aus der MPN-Tabelle für dreifachen Ansatz wird die zur Indexziffer gehörige wahrscheinliche Anzahl entnommen. Diese bezieht sich auf die niedrigste Verdünnungsstufe, die zur Bildung der Indexziffer herangezogen wurde. Die Keimzahl je ml bzw. g Probe wird durch Multiplikation der Keimzahl mit dem Verdünnungsfaktor errechnet. Sind sämtliche angelegten Verdünnungsstufen negativ (Indexziffer 000), so ist die Keimzahl kleiner als das 0,3 fache der niedrigsten vorhandenen Verdünnungsstufe. Sind sämtliche Ansätze positiv (Indexziffer 333), so ist die Keimzahl größer als das 110fache der niedrigsten zur Bewertung herangezogenen Verdünnungsstufe. Die Vertrauensgrenzen berücksichtigen ausschließlich die zufällige Streuung der Ergebnisse. Andere Variationsquellen, wie z.B. Fehler beim Ansatz der Proben, gehen damit nicht in die MPN-Schätzung ein. Um derartige Einflüsse erkennen zu können, wurden die Röhrchenkombinationen nach der Wahrscheinlichkeit ihres Vorkommens in Kategorien eingeteilt. Der Anwender kann seine Arbeitsweise kontrollieren, indem er überprüft, wie häufig die unwahrscheinlichen Kategorien 2 und 3 im Material vorkommen. Durchführung: FOLIE Beispiel: 1 2 3 4 5 Vo 3 3 2 3 2 V1 3 3 2 3 2 Anzahl der positiven Röhrchen V2 V3 V4 1 0 2 0 3 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 Kategorie 1: Sehr wahrscheinliche Auftretens insgesamt 95%. Röhrchenkombination. MPN V5 0 0 0 0 0 1 x 102 2,4 x 102 7,4 x 101 2,4 x 101 2,1 Wahrscheinlichkeit des Kategorie 2: Weniger wahrscheinliche Röhrchenkombination. Wahrscheinlichkeit des Auftretens maximal 5%. 12 Kategorie 3: Sehr wenig wahrscheinliche Röhrchenkombination. Wahrscheinlichkeit des Auftretens maximal 1%. Röhrchenkombinationen, die nach der Wahrscheinlichkeit ihres Vorkommens noch unterhalb der Grenze der Kategorie 3 liegen, sind in der Tabelle nicht enthalten. 5. Titerverfahren Das Titerverfahren ist eine Abart des MPN-Verfahrens, wobei nur 1 Verdünnungsstufe angelegt wird. Es wird meist dann angewendet, wenn man nur „Negativ-Positiv“-Ergebnisse benötigt (Presence-Absence-Tests). Für Titeransätze gibt es ebenfalls Tabellen, aus welchen man die wahrscheinliche Keimzahl ablesen kann (verschiedene Tabellen je nach Anzahl der Parallelröhrchen). BEISPIELE: 1. Bestimmung der Gesamtkeimzahl in Rohmilch: Prinzip der Methode: Es werden alle Mikroorganismen (Bakterien, Hefen und Schimmelpilze) gezählt, die unter den Bebrütungsbedingungen anwachsen. Es werden in erster Linie aerobe und fakultative anaerobe mesophile Keime erfaßt. Anlegen einer Verdünnungsreihe (1:9) Herstellung von Gussplatten: 2 Platten pro Verdünnungsstufe Kulturmedium: Plate-Count-Agar mit Magermilchzusatz (12-15 ml) Bebrütung: aerob bei 30°C +/- 1°C; 72+/- 2 Stunden Nur Platten auswerten, die mit 10 - 300 Kolonien besetzt sind. Die Berechnung des Ergebnisses erfolgt nach der Formel. Zur Unterscheidung von Säurebildnern und Nichtsäurebildnern wird Chinablau-Laktose-Agar herangezogen. Das Chinablau dient als pH-Indikator um laktosevergärende von nichtlaktosevergärenden Mikroorganismen zu unterscheiden. Säurebildner: blaue Kolonien oder Kolonien mit blauem Rand Nicht-Säurebildner: weiße Kolonien SB: Lactobacillen Milchsäurestreptokokken Coliforme Keime, E. coli manche Aeromonaden manche Staphylokokken NSB: Aerobe Sporenbildner Salmonellen Serratia Proteus Da das Wachstum von Kokken nicht beeinträchtigt wird, können neben den Bakterien der Coli-Aerogenes-Gruppe auch Staphylokken und Streptokokken ungehindert zur Entwicklung kommen. 2. Bestimmung von Coliformen in Rohmilch: Bedeutung der Coliformen Keime: technologische Bedeutung bei innerbetrieblichen Untersuchungen und Qualitätskontrollen (Erfolg bei Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen) 13 bes. Bedeutung bei allen Produktuntersuchungen (Rekontaminationsflora besteht nicht nur aus Coliformen) Schadkeim (z.T. pathogen, Toxinbildner und Bildung von biogenen Aminen oder Fehllochung bei Käse) Zur Beurteilung der hygienischen Beschaffenheit – Hygieneindikator Koloniezähltechnik bei 30°C ohne Wiederbelebung (FIL-IDF 73B:1998 Teil 1) Nährmedium: Methode: Bebrütung: Auswertung: Bestätigung: VRBL-Agar (15ml) Plattengussverfahren mit Overlayer. Die erstarrten Agarplatten werden mit ca. 4 ml VRB-Agar überschichtet, um anaerobe Bedingungen zu erhalten. 24+/- 2 h bei 30 °C 10 – 150 Kolonien/Platte, rote Kolonien mit/ohne rötl. Präzipitathof von jeder Platte werden 5 Kolonien abgeimpft und in BGGL-Bouillon mit Durhamröhrchen (24h bei 30°C) bestätigt. Gasbildung wird beurteilt. NACHWEIS VON HEMMSTOFFEN IN MILCH Im weitesten Sinn versteht man unter Hemmstoffen Substanzen mit antimikrobieller Wirkung. Wenn aber von "Hemmstoffnachweis" gesprochen wird, meint man im allgemeinen den Nachweis von Antibiotika, speziell von Penicillin. Agardiffusionsverfahren Beispiel: Papierscheibchenmethode nach Galesloot Ein Filterpapierscheibchen wird mit der zu untersuchenden Milch getränkt und auf die Oberfläche eines Agarnährbodens aufgelegt, der mit dem besonders penicillinempfindlichen Bac. stearothermophilus beimpft ist. Die Bebrütung des Testorganismus bewirkt eine Trübung des Nährbodens. Das Vorhandensein von Hemmstoffen wird durch eine klare Zone rund um das Filterpapierscheibchen angezeigt. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 0,0025 IE/ml. Brillantschwarz-Reduktionstest (BR-Test) §35 LMBG 01.0042-52(EG) Kap. VIII Die Kavitäten einer Mikrotiterplatte sind mit einem Nährmedium gefüllt, welches Brillantschwarz als Redox-Indikator enthält. Im Nährboden ist auch der Testkeim (Bacillus stearothermophilus var. calidolactis) enthalten. Kann sich der Testkeim ungehindert entwickeln schlägt der Indikator von blau nach gelb um. Ist jedoch ein Hemmstoff vorhanden, ist kein Keimwachstum möglich und das Näpfchen bleibt blau (=positiv). Je 100 l Milchprobe, hemmstofffreie Milch (Magermilch) und mit Penase behandelte Milch werden in je eine Kavität der Mikrotiterplatte pipettiert. Die Bebrütung erfolgt schwimmend im Wasserbad oder in einem speziellen Wärmeblock mind. 2,5 Stunden bei 64 °C. Beim BR-AS-Test (für Antibiotika und Sulfonamide) wird in eine Kavität zusätzlich 25 l wässrige-PABA (para-Aminobenzoesäure)–Lösung (5 g/ml) und 100 l Milchprobe einpipettiert. Da PABA die bakterizide Wirkung der Sulfonamide hemmt, kann zwischen antibiotika- und sulfonamidhaltiger Milch unterschieden werden. 14 Joghurt-Test nach FRANK Die Milchprobe wird durch Erhitzen keimarm gemacht, mit Joghurt, Methylenblau und einem Wuchsfaktor für Streptococcus thermophilus versetzt und bebrütet. Die Reduktion des Methylenblaus wird als Maß für eventuell in der Milch vorhandene Hemmstoffe gewertet. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 0,01 IE/ml Penzymtest Der Penzymtest ist ein enzymatischer Farbschnelltest zum Nachweis von ß-LaktamAntibiotika (z.B. Penicillin). Das Enzym DD-Carboxipeptidase geht mit Penicillin einen stabilen Komplex ein, wodurch es unwirksam wird. Die Enzymaktivität wird überprüft. Dieses Enzym spaltet von einem künstlichen Substrat, das endständig 2 Alaninreste enthält Alanin ab. Das Alanin wird in einer 2. Reaktion durch das Enzym Aminsäureoxidase in Brenztraubensäure übergeführt, wobei gleichzeitig Wasserstoffperoxid gebildet wird. Dieses oxidiert einen organischen Redoxindikator und es entsteht ein rosa Farbstoff. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei ca 0,017 IU/ml. Der Test dauert ca. 20 Minuten. Charm-Test Der Charmtest ist ein sogenannter mikrobieller Rezeptortest. Die Rezeptoren (Bakterien, z.B. Bac. stearothermophilus oder Antikörper) werden der zu untersuchenden Milchprobe zugesetzt. Die Rezeptoren verbinden sich mit dem Antibiotikum. Anschließend werden radioaktiv markierte Rezeptoren der Probe zugegeben. Waren nun Antibiotika in der Probe, ist für die radioaktiv markierten Rezeptoren kein Bindungsplatz mehr frei und sie werden im Zuge der Probenaufbereitung wieder ausgewaschen. War die Milch hemmstofffrei, konnten sich die markierten Substanzen anlagern. Das Maß der Anlagerung kann durch Zählung der Strahlungsimpulse gemessen werden. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 3-4 ppb Penicillin. Nachweis von Antibiotika mittels ELISA Zum Nachweis von Antibiotika mittels ELISA werden üblicherweise Festphasentests eingesetzt, bei denen die Antikörper auf einer Mikrotiterplatte fixiert sind. Die Farbintensität ist umgekehrt proportional der Antibiotikumkonzentration. Durch Aufstellung einer Eichkurve kann die Menge an Antibiotikum exakt bestimmt werden. Dieser Test wird z.B. zum Nachweis von Chloramphenicol eingesetzt. Personal- und Betriebshygiene: Vortrag von Dr. Pfleger METHODEN DER KEIMZAHLBESTIMMUNG VON OBERFLÄCHEN, GEBINDEN UND LUFT Der bakteriologische Status eines Nahrungsmittels wird von Art und Menge der Keime mitbestimmt, mit denen es während der Herstellung kontaminiert wird. Mit den nachstehend beschriebenen Techniken ist es möglich, Aussagen über Keimarten als auch Keimzahlen zu treffen. Bei Abklatsch-, Abstrich- sowie Abschwemmverfahren bezieht 15 sich die gefundene Keimzahl auf eine untersuchte Flächengröße. Die Keimzahl wird pro Quadratzentimeter (cm2) angegeben Abklatschverfahren Diese Methode eignet sich gut zur Untersuchung der Keimgehalte auf ebenen Flächen, (Tische, Wände, Messer etc.), dabei wird eine Agarnährbodenfläche auf die zu untersuchende Oberfläche gedrückt. Die Keime der Untersuchungsfläche bleiben weitgehend auf dem Nährboden haften. Anschließend wird der Nährboden im Brutschrank bebrütet. Abklatsch mit Schwämmen Als Nährbodenträger dient ein 15 x 10 cm großer und 3 cm hoher feinporiger Polyesterschwamm mit einer seichten Vertiefung (Schwämme sind bei der Fa. GREINER, erhältlich). Die Schwämme werden bei 121°C 15 min. autoklaviert und in desinfizierte Plastik -dosen gegeben. Die Vertiefung wird nun möglichst unter sterilen Bedingungen mit ca. 70 bis 80 ml auf 50°C abgekühlten Nährboden, gefüllt und erstarren gelassen. Der Schwamm wird aus der Dose entnommen und auf die zu kontrollierende Oberfläche gedrückt. Danach wird er wieder in die Plastikdose gegeben, diese verschlossen und bebrütet Vorteile: Abklatschfläche beträgt ca. 90 cm2. Auf Grund der hohen Elastizität des Schwammes können sowohl schwach als auch stark gekrümmte Oberflächen (Tank, Fertiger, usw.) abgeklatscht werden. Geringer Kostenaufwand, obwohl die meisten Schwämme nur einmal verwendbar sind. Geeignet auch für die Kontrolle zur Personalhygiene (Hände, Kleidung usw.) Weitere Abklatschverfahren: RODAC-Platten Bacto-Strip-Streifen, Agaroid-Stangen, Die Abklatschmethoden erfassen nur einen Teil der Mikroorganismen. Abstrichverfahren Oberflächen, die sich an schlecht zugänglichen Stellen befinden, können durch Abstreichen mit einem Wattetupfer auf ihren Keimgehalt hin überprüft werden. Die Untersuchungsergebnisse sind in quantitativer Hinsicht sehr ungenau; es lassen sich aber auch durch diese Methode brauchbare Relativwerte erzielen. Die am Tupfer haftenden Keime können entweder direkt auf einer Agarplatte ausgestrichen oder vorher in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert werden. Abschwemmverfahren In einen Weithalskolben , der mit 100 ml steriler Peptonlösung gefüllt ist, werden die zu untersuchenden Stücke (Anzahl je nach Stückgröße) hinzugefügt und ausgeschüttelt. Das Peptonwasser wird hierauf bakteriologisch untersucht 16 Überschichtungsverfahren Folien, Papier, Pappen, Kunststoffeinsätze usw. können durch vorsichtige Überschichtung mit verflüssigten und temperierten Agarnährböden untersucht werden. Mit einer abgeflammten Schere werden 10 x 10 cm des Verpackungsmaterials steril ausgeschnitten. Diese werden mit einer sterilen Pinzette in sterile Petrischalen (140mm ) gelegt, welche zuvor mit einer dünnen Nährbodenschicht ausgegossen wurden Die Probe wird dünn – ca. 2mm - mit verflüssigtem Agar überschichtet. Die ermittelte Oberflächenkeimzahl wird in KBE pro 100 cm² angegeben. Bestimmung der Luftkeimzahl Obwohl die Luft als Kontaminationsträger häufig überschätzt wird, ist es trotzdem ratsam, die Luftkeimzahl besonders in Räumen mit unverpackten Roh- und Fertigwaren regelmäßig zu überprüfen. Dabei können unter Umständen nicht nur Keimmengen, sondern auch die vorhandenen Keimarten von Interesse sein. In der Praxis beschränkt man sich im allgemeinen auf den Nachweis koloniebildender Einheiten von Bakterien und Pilzen. Dabei bedient man sich folgender Methoden: - Sedimentationsverfahren - Gelatine-Membranfilter-Verfahren - Impingment-Verfahren - Impaction-Verfahren 17 Materialaufwendungen- und Beschaffung, Didaktik in den Übungen Materialaufwendungen: - Schüler gruppenweise arbeiten lassen Materialschlacht – Vorbereitung und Wegräumen - Max 12 Schüler im Labor – Übersichtlichkeit – Gefahrenpotential geringer auch im Gesetz verankert - Schüler auch in die Vorbereitung miteinbeziehen, z.B. Spitzen stecken und autoklavieren - Ebenso in die Nachbereitung – Dekontamination des gefährlichen biologischen Materials (BIOHAZARD) Materialbeschaffung: - diverse Firmen: Fa. BioMérieux, Merck, Noack, Schott-Eppendorf für Nährmedien und Geräte und Zubehör - abgelaufene Ware von Firmen gratis - in der Nähe Labors aufsuchen – ev. Zusammenarbeit suchen und Material beschaffen - Kulturen von diversen Firmen Pfleger hat eine Liste Inhalt und Abfolge der Übungseinheiten: Laborordnung – Einführung in die Laborbegebenheiten Definition von mikrobiologischem - aseptischem Arbeiten Mikroskop – mikroskopische Präparate Nährmedienbereitung – Sterilisationstechnik Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen Bouillonkulturen Agarstrich-, Agarstichkulturen Kultivierung auf Agarplatten Koch`sches Plattenguss-Verfahren Spatel-Verfahren Petrifilm-Methode Most probable number MPN-Technik Titer-Verfahren Schüttelkulturen Nachweismethoden gleich an verschiedenen Lebensmitteln Rohmilch; Wasser, Eis, Käse, Wurst Personal- und Betriebshygiene Hemmstoffe Identifizierung – API, VIDAS.... Stoffwechselprodukte – Essigsäureproduktion im Schüttelkolben Gel-Elektrophorese - Einsatzbereiche 18 Bücher: - Jürgen Baumgart, Mikrobiologische Untersuchungen von Lebensmittel. Behr´s Verlag Losblattsammlung - Behr´s Verlag: Grundlagen, Milch und Milchprodukte, Fleisch und Fleischerzeugnisse, Getränke, pflanzliche Lebensmittel, Hygiene Management, HACCP in der Praxis - R. Näveke & K. Tepper, Einführung in die mikrobiologischen Arbeitsmethoden mit Praktikumsaufgaben. Gustav Fischer Verlag - R. Süßmuth, Biochemisch-mikrobiologisches Praktikum. Thieme Verlag - H. G. Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie. Thieme Verlag - Bergey`s, Manual of Determinative Bakteriology, Williams-Wilkins Comp., Baltimore 19
