Milch

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MIKROBIOLOGISCHE MILCH-UNTERSUCHUNG
Die Anforderungen an die mikrobiologische Beschaffenheit von Milch- und Milchprodukten
sind in der österreichischen Milchhygieneverordnung geregelt.
Kriterien mit Richt- und Grenzwerten:
Stand: MHV 1993 / 1998
Kuhmilch
1)
Rohmilch zur Herstellung von wärmebehandelter Konsummilch, fermentierter Milch,
Milch mit Labzusatz, gelierter Milch, aromatisierter Milch und Rahm:
Keimzahl: unter 100.000
Antibiotika: unter 0.003 g
2)
Zellzahl: unter 400.000
(Verordnung 2377/90 EWG2)
Rohmilch zur Herstellung anderer Erzeugnisse auf Milchbasis:
Gesamtkeimzahl: unter 100.000
Antibiotika:
3)
Somatische Zellen: unter 400.000
siehe Punkt 1
Rohmilch zur Herstellung von Rohmilcherzeugnissen:
siehe Punkt 1
zusätzlich Staph. aureus: n=5, m=500, M=2000, c=2
Rohe Konsummilch
Gesamtkeimzahl bei 30°C:
unter 50.000 (seit 1.1.2000) Hemmstoff: neg.
Staph.aureus:
n = 5, c=2, m=100, M=500
Salmonellen:
in 25 g negativ (n=5, c= 0)
Pasteurisierte Trinkmilch
Pathogene Keime:
keine in 25 g
Salmonellen:
die 25 g setzen sich aus 5 mal 5 g zusammen
Listerien:
negativ in 1 g; n=5, c=0, m=0, M=0
Coliforme (ml):
n=5, c=1,m=0, M=5
psychrotrophe Keime,
nach 5 tägiger Bebrütung bei 6 °C, Haltbarkeitsprüfung;
(Keimzahlbest. bei 21°C):
n=5, c=2, m=50.000, M=500.000
Nach LMG:
Freiheit von Antibiotika:
"nicht nachweisbar"
Chloramphenicol:
1 g/l
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Methoden:
Probenaufbereitung entfällt.
Gesamtkeimzahl:
FIL-IDF 100B:1991
Coliforme:
FIL-IDF 73B:1998
Psychrotrophe Keime:
FIL-IDF 132 A:1991
Antibiotika – Nachweis
FIL-IDF 57: 1970
BESTIMMUNG DER GESAMTKEIMZAHL (GKZ)
FIL-IDF 100B: 1991
Anwendungsgebiet:
 Milch, flüssige Milchprodukte
 Milchpulver, süßes Molkepulver, Buttermilchpulver, Laktose
 Säurekasein, Milchsäurekasein und Labkasein
 Kaseinate und saures Molkepulver
 Schmelzkäse
 Butter
 gefrorene Milchprodukte (einschließlich Speiseeis)
 Eiercreme, Desserts und Rahm
Prinzip der Methode:
Es werden alle Mikroorganismen (Bakterien, Hefen und Schimmelpilze) gezählt, die unter
den Bebrütungsbedingungen anwachsen. Es werden in erster Linie aerobe und fakultative
anaerobe mesophile Keime erfasst.
Durchführung:
Anlegen einer Verdünnungsreihe (1:10)
Verdünnungslösung: 1/4 starke Ringerlösung (9 ml) oder 0,1%ige Peptonlösung
Methode: Plattengussverfahren; 2 Platten pro Verdünnungsstufe
Kulturmedium: Plate-Count-Agar mit Magermilchzusatz (12-15 ml)
Bebrütung: aerob bei 30°C +/- 1°C; 72+/- 2 Stunden
Nur Platten auswerten, die mit 10 - 300 Kolonien besetzt sind. Die Berechnung des
Ergebnisses erfolgt nach der Formel:
c
-------------------------- x d = KBE/ml bzw. g
(1 x n1 + 0,1 x n2)
c = Summe aller ausgezählten Kolonien
n1 = Zahl der Platten der 1. Verdünnungsstufe
n2 = Zahl der Platten der 2. Verdünnungsstufe
d = Verdünnungsstufe der ersten ausgezählten Platte(n)
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BESTIMMUNG DER PSYCHROTROPHEN MIKROORGANISMEN
Prinzip der Methode:
Durch Bebrütung der gegossenen Platten bei niedrigen Temperaturen können nur die
kältetoleranten Keime:
Pseudomonaden,
Aeromonaden,
einige Stämme coliformer Keime,
Achromobacter,
Flavobacterium
zu sichtbaren Kolonien anwachsen. Psychrotrophe Keime gehören zur Gruppe der
mesophilen Keime (Optimum bei 20 ° - 30 °C), bilden in dieser Gruppe aber eine Ausnahme,
da sie auch bei Temperaturen unter 6 °C noch leben können (=Kühlschranktemperatur).
Psychrotrophe Keime sind stark proteolytisch und lipolytisch, die Enzyme sind nach dem
Absterben der Keime, z.B. nach Pasteurisierung, noch immer aktiv.
Als Grenzwert bei guter Milchqualität sind max. 10.000 Keime/ml anzusetzen, wobei die
Keimzahl immer in Bezug zur GKZ zu sehen ist, da ein hoher Anteil psychrotropher Keime
ungünstig ist. So ist es z.B. besser 300.000 Keime mit 10.000 psychrotrophen Keimen, als
10.000 Keime mit 8.000 psychrotrophen Keimen nachzuweisen.
A) Koloniezählung bei 6,5°C
(FIL-IDF 101 A: 1991)
Anwendungsbereich: rohe und hitzebehandelte Milch
Durchführung:
Anlegen einer Verdünnungsreihe (1:10)
Verdünnungslösung: 1/4 starke Ringerlösung (9 ml) oder 0,1%ige Peptonlösung
Kulturmedium: Plate Count Magermilch-Agar (12-15 ml)
Methode: Plattengussverfahren; 2 Platten pro Verdünnungsstufe
Bebrütung: 10 Tage bei 6,5  0,5 °C
Die Auswertung erfolgt nach denselben Regeln wie bei der Gesamtkeimzahlbestimmung.
B) Koloniezählung bei 21°C
(FIL-IDF 132 A:1991)
Die hier beschriebene Schnellmethode erfasst den Keimgehalt nur ungefähr, da unter den
Bebrütungsbedingungen auch andere Keime anwachsen können. Vergleichsstudien haben
jedoch ergeben, dass eine gute Korrelation mit den Ergebnissen der Standardmethode
besteht.
Durchführung:
Anlegen einer Verdünnungsreihe (1:10)
Kulturmedium: Plate Count Magermilch-Agar (12-15 ml)
Verdünnungslösung: 1/4 starke Ringerlösung (9 ml) oder 0,1%ige Peptonlösung
Methode: Plattengussverfahren; 2 Platten pro Verdünnungsstufe
Bebrütung: 25 +1 Stunden bei 21  1 °C Die Bebrütungszeit ist genau einzuhalten, da bei
einer längeren Bebrütung auch andere Keime anwachsen können.
Die Auswertung erfolgt nach denselben Regeln wie bei der Gesamtkeimzahlbestimmung.
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BESTIMMUNG VON COLIFORMEN KEIMEN
A) Koloniezähltechnik bei 30°C ohne Wiederbelebung (FIL-IDF 73B:1998 Teil 1)
Verdünnungslösung: 1/4 starke Ringerlösung (9 ml) oder 0,1%ige Peptonlösung
Kulturmedium:
VRB-Agar (15ml)
Methode:
Plattengussverfahren mit Overlayer. Die erstarrten Agarplatten werden
mit ca. 4 ml VRB-Agar überschichtet, um anaerobe Bedingungen zu
erhalten.
Bebrütung:
24+/- 2 h bei 30 °C
Auswertung:
10 – 150 Kolonien/Platte, rote Kolonien mit/ohne rötl. Präzipitathof
B) MPN Technik bei 30 °C ohne Wiederbelebung (FIL-IDF 73B:1998 Teil 2)
1. Tag:
V0
V1
1 ml
V2
1 ml
V3
1 ml
Probe
1 ml
2-3. Tag:
V1
+++

V1
1 ml
V2
-+
V2
1 ml
V3
--
V3
(Verdünnungsstufe)
Verdünnungsreihe:
je 1 ml Probe bzw. Probenverdünnung in
9 ml Ringerlösung überimpfen.
MPN-Ansatz:
je 1 ml der Verdünnung in 3 Eprouvetten
mit 10 ml Laurylsulfat Trypton - Bouillon
mit Durhamröhrchen überimpfen.
Bebrütung: 24 - 48 h  2 h, 30 °C
Auswertung der Gasbildung (Beispiel)
pos. Ergebnisse (Gasbildung):
+++, -+-, --Indexziffer (Stichzahl): 310
MPN: 4,30
Keimzahl: 4,3 x 101 Coliforme/ml
Die Lactosevergärung kann entweder an Hand der Gasbildung in flüssigen oder an Hand der
Säurebildung auf festen Nährmedien bestimmt werden. Im Einzelfall können beide
Nachweismethoden stark abweichende Ergebnisse liefern. Dies wird immer dann eintreten,
wenn der Anteil gasnegativer coliformer Keime in der Flora hoch ist. In der Regel findet man
aber durchaus befriedigende Übereinstimmung der beiden Methoden.
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PAPIERSCHEIBCHENMETHODE NACH GALESLOOT ZUR FESTSTELLUNG VON
PENICILLIN IN MILCH (FIL-IDF 57: 1970)
Diese Methode ist für den qualitativen Nachweis von Penicillin bis zu 0,0025 IE/ml in
Rohmilch, bearbeiteter flüssiger Milch, Magermilch und Trockenmilch anwendbar.
Die Milch enthält Penicillin, wenn die Probe eine klare Hemmzone und eine Parallelprobe mit
Zusatz von Penicillinase keine oder eine Hemmzone von geringem Durchmesser ergibt,
wenn beide nach der folgenden Methode untersucht werden.
Das Verfahren beruht auf der Methode von TH. E. GALESLOOT und F. HASSING. Ein
Filterpapierscheibchen wird mit der zu untersuchenden Milch getränkt und auf die Oberfläche
eines Agarnährbodens aufgelegt, der mit dem besonders penicillinempfindlichen Bac.
stearothermophilus beimpft ist. Die Bebrütung des Testorganismus bewirkt eine Trübung des
Nährbodens. Das Vorhandensein von Hemmstoffen wird durch eine klare Zone rund um das
Filterpapierscheibchen angezeigt. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 0,0025
IE/ml.
1. Der Testkeim B. stearothermophilus var. calidolactis C 953 wird in St-I-Bouillon überimpft
(10 ml Medium in 100 ml Kölbchen) und über Nacht bei 55 °C bebrütet.
oder
Verwendung einer Ampulle mit Testkeim: 2ml Sporensuspension mit 38ml Ringerlösung
verdünnen
2. Standard-Penicillinlösung von 100 IE/ml durch Lösen von Na- oder K-Benzylpenicillin in
sterilem, dest. Wasser in einer sterilen Flasche herstellen. Diese Lösung soll nur am Tag
der Herstellung verwendet werden und im Kühlschrank bei 5 °C aufbewahrt werden.
3. Penicillinase (Penase)-Lösung von 1.000 Einheiten/ml durch Lösen von Penase in
sterilem dest. Wasser herstellen, im Kühlschrank bis längstens 2 Wochen aufbewahren.
4. Für die Herstellung der Platten wird 1 ml der gut gewachsenen Kultur oder der verdünnten
Sporensuspension mit 5 ml PC-Agar vermischt. Die Schichtdicke soll 0,8 - 1mm betragen.
Es dürfen nur Platten mit ebenem Boden verwendet werden.
5. Filterpapierscheibchen (Ø = 12-13 mm) werden in die Milchprobe getaucht bis sie
vollgesogen sind, dann werden sie an der Gefäßwand leicht abgestreift und auf die
vorbereiteten Agarplatten gelegt. Jede Probe ist zumindest doppelt aufzubringen.
Daneben ist auch eine Blindprobe, sowie eine Penicillinkontrollprobe aufzubringen. Die
Platten werden 2,5 Stunden bei 55 °C bebrütet. Nach der Bebrütung wird geprüft, ob sich
ein Hemmhof gebildet hat.
6. Die Gegenprobe mit Penase dient zur Prüfung, ob der festgestellte Hemmstoff Penicillin
ist.
Hiezu werden 0,4 ml einer Penaselösung (1000 E/ml) mit 10 ml der zu testenden Milch
vermischt und 30 Minuten bei 30 °C bebrütet. Anschließend wird der Test wie oben
beschrieben durchgeführt.
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1. Herstellung der Standard-Penicillin-Lösung mit 100 IE/ml
1663 U ....1mg
Einwaage von 1mg oder 10mg
100 U...........1ml
1663 U ..........x.............................16,63ml.........166,3ml
Einwaage von 1mg Penicillin und in 16,63ml sterilem dest.
Wasser lösen.
2. Verdünnen der Standard-Penicillin-Lösung
Verdünnungsreihe aus der Stammlösung 100 IU/ml
U/ml
0,1
0,01
0,005
0,0025
1: 1.000
1:10.000
1:20.000
1:40.000
Anzahl der
10er Schritte
2
3
4
4
Endverdünnung mit MM
1ml von V2 zu 9ml MM
1ml von V3 zu 9ml MM
5ml von V4 zu 5ml MM
3ml von V2 zu 9ml MM
3. Herstellung der Penase-Lösung mit 1000 IE/ml
Stamm-Lösung 1.000.000 IE/ml
3 x 1:10 mit steriler Ringerlösung verdünnen
4. Testkeim verdünnen
Ampulle mit Glasschneider einritzen, Ampulle aufbrechen
und die 2ml Sporensuspension zu 38 ml steriler
Ringerlösung hinzufügen
5. Herstellung der Agarplatten
1 ml der verdünnten Sporensuspension zu 5 ml
aufgeschmolzenem auf 49°C temperierten PC-Agar geben,
kurz schütteln und gleich in die Petrischalen gießen und
gleichmäßig verteilen
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Versuchsaufbau:
1. Platte: 2x Probe
1x Negativ-Kontrolle
1x Positiv-Kontrolle
1x mit Penase behandelte Probe
2. Platte: Negativ-Kontrolle
0,1 U
0,01 U
0,005 U
0,0025 U
Materialbedarf – und – Beschaffung:
Petrischalen
Material
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Firma
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