AUFGABENSAMMLUNG Restriktionsenzyme

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Aufgabensammlung
Restriktionsenzyme
© 2011 Schroedel, Braunschweig
Gentechnik
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Aufgabensammlung
PCR 1a
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Gentechnik
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Aufgabensammlung
PCR 1b
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Aufgabensammlung
PCR 1c
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Aufgabensammlung
PCR 1d
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Gentechnik
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Aufgabensammlung
Genetischer Fingerabdruck 1
Erklären Sie, warum für einen genetischen Fingerabdruck proteincodierende Bereiche
nicht geeignet sind.
Die proteincodierenden DNA-Bereiche weisen bei allen Menschen kaum Unterschiede auf. Sie
sind daher für die eindeutige Identifizierung einer Person ungeeignet.
Genetischer Fingerabdruck 2
Das genetische Material eines Verdächtigen kann sich zufällig am Tatort befinden.
•
Genetisches Material einer anderen Person (z. B. ein Haar) kann absichtlich vom Täter am
Tatort deponiert worden sein, um den Verdacht von sich abzulenken.
•
Eineiige Mehrlinge (z. B. eineiige Zwillinge) besitzen eine nahezu identische DNA, sodass
keine eindeutige Zuordnung möglich ist.
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•
Gentechnik
Nennen Sie zwei Gründe, warum der genetische Fingerabdruck nicht automatisch den
Beweis für die Schuld eines Verdächtigen liefert.
Aufgabensammlung
Klonierung 1
Um ein DNA-Fragment zu klonieren, wendet man grundsätzlich vier Verfahrensschritte an:
Selektion, Restriktionsverdau, Transformation, Ligation. Geben Sie diese in der richtigen
Reihenfolge an und erklären Sie kurz, was bei jedem Schritt geschieht.
1. Restriktionsverdau: Der ringförmige Vektor wird durch Restriktionsenzyme an der MCS geöffnet. Das DNA-Fragment wird analog geschnitten und weist Enden auf, die komplementär zu
den Enden des linearisierten Vektors sind.
2. Ligation: Das DNA-Fragment wird in den Vektor mittels Ligase integriert.
3. Transformation: Der rekombinante Vektor wird in Bakterien übertragen.
4. Selektion: Bakterien, die den rekombinanten Vektor aufgenommen haben, werden mithilfe
von Selektionsmarkern identifiziert.
Das Einfügen eines DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor kann mit nur einem Restriktionsenzym erfolgen, wenn das Enzym sowohl in der MCS als auch an beiden Enden des
DNA-Fragments schneidet. Nennen Sie zwei Nachteile, die dieses Vorgehen im Vergleich
zur Verwendung von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen hat.
•
Die Enden des geöffneten Vektors sind zueinander komplementär und können daher von der
Ligase verbunden werden. So kann der ringförmige Ausgangszustand des Vektors wieder
hergestellt werden (Re-Ligation), anstatt das gewünschte DNA-Fragment in den Vektor zu
integrieren.
•
Bei Verwendung von nur einem Restriktionsenzym kann das DNA-Fragment in zwei unterschiedlichen Orientierungen eingebaut werden. Dies ist unerheblich, wenn es lediglich darum
geht, eine Fremd-DNA in Bakterien zu vermehren. Bei der Expression eines Fremd-Gens ist
jedoch sein Einbau in der korrekten Orientierung von Bedeutung, damit die bakterielle RNAPolymerase den richtigen Einzelstrang zur Herstellung des gewünschten Proteins abliest.
Gentechnik
Klonierung 2
Klonierung 3
Sind Restriktionsenzyme und Ligase gleichzeitig vorhanden, wird das DNA-Fragment nach der
Ligation wieder aus dem Vektor geschnitten, sodass kaum rekombinante Vektoren für die Transformation entstehen können.
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Der Restriktionsverdau von Vektor und DNA-Fragment mit anschließender Ligation kann
im selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Warum müssen die Restriktionsenzyme
vor Zugabe der Ligase entfernt bzw. inaktiviert werden?
Aufgabensammlung
Klonierung 4
Welche Farbe haben bei der Blau-Weiß-Selektion Bakterien auf einem Nährboden mit
Ampicillin und X-Gal, die
a. einen Klonierungsvektor mit Insert aufgenommen haben?
b. einen Klonierungsvektor ohne Insert aufgenommen haben?
c. keinen Vektor aufgenommen haben?
Begründen Sie jeweils Ihre Antwort.
a. Weiß: Durch das Insert ist das β-Galactosidase-Gen unterbrochen, sodass X-Gal nicht umgesetzt werden kann.
b. Blau: Die Bakterien bilden β-Galactosidase, welche die Reaktion von X-Gal zu einem blauen
Produkt katalysiert.
c. keine Farbe: Bakterien ohne Vektor sind nicht resistent gegen Ampicillin und sterben in
Gegenwart dieses Antibiotikums ab.
•
Restriktionsverdau: Man schneidet den isolierten Vektor mit den gleichen Restriktions-enzymen, die für die Klonierung verwendet wurden. Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung
ist bei Vektoren ohne Insert nur eine Bande zu sehen. Die Länge ihrer DNA-Fragmente entspricht der des verwendeten Vektors. Wurde die Fremd-DNA jedoch erfolgreich integriert,
zeigt sich dies in Form einer zweiten Bande, deren Laufstrecke abhängig ist von der Länge
des klonierten Fragments.
•
PCR: Man setzt den isolierten Vektor als Ausgangs-DNA in einer PCR ein. Dabei benutzt man
Primer, deren Sequenzen komplementär zu den Enden des DNA-Fragments sind. (Alternativ
werden als Primer Vektorsequenzen verwendet, welche unmittelbar an die MCS angrenzen.)
Wurde das gewünschte DNA-Fragment in den Vektor integriert, ist im Elektropherogramm
eine Bande zu sehen. Die Länge dieses PCR-Amplifikats entspricht der des klonierten DNAFragments. Bei Vektoren ohne Fremd-DNA ist keine Bande zu sehen, da bei der PCR keine
DNA-Vervielfältigung stattfinden konnte.
Klonierung 6
In manchen Fällen stellt sich bei der Längenüberprüfung eines Inserts heraus, dass dieses
dreimal so lang ist wie das eigentlich zu klonierende DNA-Fragment. Geben Sie dafür eine
mögliche Erklärung.
Während der Ligation wurden zunächst drei DNA-Fragmente an ihren komplementären Enden
von der Ligase miteinander verbunden. Anschließend wurde dieses Konstrukt vom Enzym in den
geöffneten Vektor eingefügt.
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Um nachzuweisen, dass Bakterien tatsächlich einen Vektor mit Fremd-DNA in sich tragen,
führt man zunächst eine Plasmid-Isolierung durch. Anschließend kann man entweder per
Restriktionsverdau oder PCR (jeweils mit nachfolgender Gelelektrophorese) überprüfen,
ob ein DNA-Fragment der richtigen Größe in den Vektor integriert wurde. Erläutern Sie für
beide Methoden, wie der Nachweis des DNA-Fragments erfolgen kann.
Gentechnik
Klonierung 5
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