AUFGABENSAMMLUNG Restriktionsenzyme
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AUFGABENSAMMLUNG Restriktionsenzyme © 2011 Schroedel, Braunschweig Gentechnik Füllen Sie den Lückentext aus. AUFGABENSAMMLUNG PCR 1a © 2011 Schroedel, Braunschweig Gentechnik Mit dem folgenden Quiz können Sie Ihr Wissen zum Thema PCR überprüfen. Klicken Sie jeweils die richtige Antwort an. AUFGABENSAMMLUNG PCR 1b © 2011 Schroedel, Braunschweig Gentechnik Mit dem folgenden Quiz können Sie Ihr Wissen zum Thema PCR überprüfen. Klicken Sie jeweils die richtige Antwort an. AUFGABENSAMMLUNG PCR 1c © 2011 Schroedel, Braunschweig Gentechnik Mit dem folgenden Quiz können Sie Ihr Wissen zum Thema PCR überprüfen. Klicken Sie jeweils die richtige Antwort an. AUFGABENSAMMLUNG PCR 1d © 2011 Schroedel, Braunschweig Gentechnik Mit dem folgenden Quiz können Sie Ihr Wissen zum Thema PCR überprüfen. Klicken Sie jeweils die richtige Antwort an. AUFGABENSAMMLUNG Genetischer Fingerabdruck 1 Erklären Sie, warum für einen genetischen Fingerabdruck proteincodierende Bereiche nicht geeignet sind. Die proteincodierenden DNA-Bereiche weisen bei allen Menschen kaum Unterschiede auf. Sie sind daher für die eindeutige Identifizierung einer Person ungeeignet. Genetischer Fingerabdruck 2 Das genetische Material eines Verdächtigen kann sich zufällig am Tatort befinden. • Genetisches Material einer anderen Person (z. B. ein Haar) kann absichtlich vom Täter am Tatort deponiert worden sein, um den Verdacht von sich abzulenken. • Eineiige Mehrlinge (z. B. eineiige Zwillinge) besitzen eine nahezu identische DNA, sodass keine eindeutige Zuordnung möglich ist. © 2011 Schroedel, Braunschweig • Gentechnik Nennen Sie zwei Gründe, warum der genetische Fingerabdruck nicht automatisch den Beweis für die Schuld eines Verdächtigen liefert. AUFGABENSAMMLUNG Klonierung 1 Um ein DNA-Fragment zu klonieren, wendet man grundsätzlich vier Verfahrensschritte an: Selektion, Restriktionsverdau, Transformation, Ligation. Geben Sie diese in der richtigen Reihenfolge an und erklären Sie kurz, was bei jedem Schritt geschieht. 1. Restriktionsverdau: Der ringförmige Vektor wird durch Restriktionsenzyme an der MCS geöffnet. Das DNA-Fragment wird analog geschnitten und weist Enden auf, die komplementär zu den Enden des linearisierten Vektors sind. 2. Ligation: Das DNA-Fragment wird in den Vektor mittels Ligase integriert. 3. Transformation: Der rekombinante Vektor wird in Bakterien übertragen. 4. Selektion: Bakterien, die den rekombinanten Vektor aufgenommen haben, werden mithilfe von Selektionsmarkern identifiziert. Das Einfügen eines DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor kann mit nur einem Restriktionsenzym erfolgen, wenn das Enzym sowohl in der MCS als auch an beiden Enden des DNA-Fragments schneidet. Nennen Sie zwei Nachteile, die dieses Vorgehen im Vergleich zur Verwendung von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen hat. • Die Enden des geöffneten Vektors sind zueinander komplementär und können daher von der Ligase verbunden werden. So kann der ringförmige Ausgangszustand des Vektors wieder hergestellt werden (Re-Ligation), anstatt das gewünschte DNA-Fragment in den Vektor zu integrieren. • Bei Verwendung von nur einem Restriktionsenzym kann das DNA-Fragment in zwei unterschiedlichen Orientierungen eingebaut werden. Dies ist unerheblich, wenn es lediglich darum geht, eine Fremd-DNA in Bakterien zu vermehren. Bei der Expression eines Fremd-Gens ist jedoch sein Einbau in der korrekten Orientierung von Bedeutung, damit die bakterielle RNAPolymerase den richtigen Einzelstrang zur Herstellung des gewünschten Proteins abliest. Gentechnik Klonierung 2 Klonierung 3 Sind Restriktionsenzyme und Ligase gleichzeitig vorhanden, wird das DNA-Fragment nach der Ligation wieder aus dem Vektor geschnitten, sodass kaum rekombinante Vektoren für die Transformation entstehen können. © 2011 Schroedel, Braunschweig Der Restriktionsverdau von Vektor und DNA-Fragment mit anschließender Ligation kann im selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Warum müssen die Restriktions¬enzyme vor Zugabe der Ligase entfernt bzw. inaktiviert werden? AUFGABENSAMMLUNG Klonierung 4 Welche Farbe haben bei der Blau-Weiß-Selektion Bakterien auf einem Nährboden mit Ampicillin und X-Gal, die a. einen Klonierungsvektor mit Insert aufgenommen haben? b. einen Klonierungsvektor ohne Insert aufgenommen haben? c. keinen Vektor aufgenommen haben? Begründen Sie jeweils Ihre Antwort. a. Weiß: Durch das Insert ist das β-Galactosidase-Gen unterbrochen, sodass X-Gal nicht umgesetzt werden kann. b. Blau: Die Bakterien bilden β-Galactosidase, welche die Reaktion von X-Gal zu einem blauen Produkt katalysiert. c. keine Farbe: Bakterien ohne Vektor sind nicht resistent gegen Ampicillin und sterben in Gegenwart dieses Antibiotikums ab. • Restriktionsverdau: Man schneidet den isolierten Vektor mit den gleichen Restriktions-enzymen, die für die Klonierung verwendet wurden. Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung ist bei Vektoren ohne Insert nur eine Bande zu sehen. Die Länge ihrer DNA-Fragmente entspricht der des verwendeten Vektors. Wurde die Fremd-DNA jedoch erfolgreich integriert, zeigt sich dies in Form einer zweiten Bande, deren Laufstrecke abhängig ist von der Länge des klonierten Fragments. • PCR: Man setzt den isolierten Vektor als Ausgangs-DNA in einer PCR ein. Dabei benutzt man Primer, deren Sequenzen komplementär zu den Enden des DNA-Fragments sind. (Alternativ werden als Primer Vektorsequenzen verwendet, welche unmittelbar an die MCS angrenzen.) Wurde das gewünschte DNA-Fragment in den Vektor integriert, ist im Elektropherogramm eine Bande zu sehen. Die Länge dieses PCR-Amplifikats entspricht der des klonierten DNAFragments. Bei Vektoren ohne Fremd-DNA ist keine Bande zu sehen, da bei der PCR keine DNA-Vervielfältigung stattfinden konnte. Klonierung 6 In manchen Fällen stellt sich bei der Längenüberprüfung eines Inserts heraus, dass dieses dreimal so lang ist wie das eigentlich zu klonierende DNA-Fragment. Geben Sie dafür eine mögliche Erklärung. Während der Ligation wurden zunächst drei DNA-Fragmente an ihren komplementären Enden von der Ligase miteinander verbunden. Anschließend wurde dieses Konstrukt vom Enzym in den geöffneten Vektor eingefügt. © 2011 Schroedel, Braunschweig Um nachzuweisen, dass Bakterien tatsächlich einen Vektor mit Fremd-DNA in sich tragen, führt man zunächst eine Plasmid-Isolierung durch. Anschließend kann man entweder per Restriktionsverdau oder PCR (jeweils mit nachfolgender Gelelektrophorese) überprüfen, ob ein DNA-Fragment der richtigen Größe in den Vektor integriert wurde. Erläutern Sie für beide Methoden, wie der Nachweis des DNA-Fragments erfolgen kann. Gentechnik Klonierung 5
