Validierung von Analysenverfahren

Validierung von Analysenverfahren
(von Christian Fieth & Claudia Müller)
SoSe 2004
1. Einleitung
Die Validierung ist der Nachweis, dass eine Analysenmethode innerhalb festgelegter
Grenzen zum erwartenden Ergebnis führt.
Ein wichtiger Bestandteil sind die GMP-Richtlinien (good manufacturing practice). Die
GMP- Richtlinien sind 1968 von der WHO veröffentlicht worden. Es sind Regeln zur
Herstellung von Arzneimitteln und umfassen Anforderungen an Personal, Gebäude,
technische Ausrüstung, Hygiene, Ausgangsmaterialien, Herstellungsvorgänge,
Etikettierung, Verpackung und Qualitätskontrolle.Sie verfolgen das Ziel, dass Kontrollen
von hergestellten Arzneimitteln lediglich die Anforderungen bestätigen.
Die Validierung ist somit ein wichtiges Element zur Gewährleistung der
Arzneimittelsicherheit. Nur so ist es möglich , dass pharmazeutische Produkte zuverlässig
und reproduzierbar in der gewünschten Qualität hergestellt werden können.
Im Rahmen eines Zulassungsverfahrens wird in den europäischen
Arzneimittelprüfrichtlinien gefordert: „Alle Prüfverfahren müssen (…) validierte
Verfahren sein.
Die Kalibrierung von Messgeräten ist bei instrumentellen Verfahren von besonderer
Bedeutung.
Zur Validierung von Analysenverfahren werden diese Qualitätsmerkmale betrachtet:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
Präzision
Richtigkeit
Nachweisgrenze
Bestimmungsgrenze
Selektivität, Spezifität
Linearität
Empfindlichkeit
Bestimmungsbereich
Robustheit
2. Fehler bei Analyseverfahren
Werte, die bei der Durchführung eines bestimmten Analysenverfahrens gemessen
werden weichen vom wahren Wert ab.
Man unterscheidet:
2.1 zufällige Fehler sind nicht ausschliessbare und nicht vorhersehbare , von
der genauen Arbeitsweise des Analytikers unabhängige Abweichungen der
Messwerte bei wiederholter Durchführung unter Wiederholbedingungen
(gleichen Bedingungen).
Die Präzision macht eine Aussage über die Reproduzierbarkeit der
Analysenergebnisse bei wiederholter Durchführung einer bestimmten
analytischen Methode unter Wiederholbedingungen und ist somit ein Maß
für die zufälligen Fehler.
Ausgedrückt wird die Präzision eines Verfahrens durch:
Standardabweichung (s)
S
 (x  x )
2
i
n 1
x : = Mittelwert
xi : = Messergebnisse
n := Anzahl der Messungen
Relative Standardabweichung srel
s  100
%
x
Die Messergebnisse sind normalerweise um den Mittelwert (arithmetisches
Mittel) in Form einer Gaußschen Glockenkurve (Normalverteilung)
verteilt.
S rel 
Bestimmung der Wiederholungsstandardabweichung
Wiederholpräzision engl. repeatability
Darunter versteht man, dass ein Analysenverfahren mit der gleichen
Substanz unter Wiederholbedingungen mit den gleichen Gerätschaften im
gleichen Labor vom gleichen Analytiker mehrmals wiederholt wird.
Bestimmung der Vergleichsstandardabweichung
Vergleichspräzision engl. reproducibility
Darunter versteht man die wiederholte Durchführung des
Analysenverfahrens mit der gleichen Substanz, in verschiedenen
Laboratorien durch verschiedene Analytiker mit verschiedenen
Geräteausführungen.
2.2 systematische Fehler sind Fehler, die sich aus Störungen im
Analysenverfahren ergeben. Ursachen können sein mangelhafte Geräte,
nicht genau eingestellte Normallösungen, Verunreinigungen von
Reagenzien, Zersetzungen, Einfluss von Begleitstoffen und sich
wiederholende falsche Arbeitsweisen des Analytikers.
Die Richtigkeit ist die durch systematische Fehler verursachte Abweichung
des Mittelwertes vom wahren Wert. Sehr häufig ist der wahre Wert einer
Analyse nicht bekannt und ein Näherungswert(richtiger Wert) muss zur
Beurteilung eines Verfahrens herangezogen werden.
Der richtige Wert kann durch 2 unterschiedliche Methoden ermittelt
werden:
Stöchiometrische Berechnung: Sie liefert den wahren Wert
Referenzmethode: Sie liefert den richtigen Wert
Hier werden mind. 3 Standardlösungen mit unterschiedlichem Gehalt der zu
bestimmenden Analysenmethode hergestellt und nach der entsprechenden
Analysenmethode bearbeitet. Aus dem errechneten Mittelwert der einzelnen
Bestimmungen erhält man den Gesamtfehler der Bestimmungsmethode.
Relative Abweichung
Aussage über die Richtigkeit einer Bestimmungsmethode durch
Berechnung der relativen Abweichung vom jeweils „richtigen Wert“.
Re lative Abweichung 
x     100 %

x = Mittelwert der Bestimmungen an einer Modellmischung
 = „richtiger Wert“ (zugesetzte Substanzmenge zur Modellmischung).
Wiederfindung
In der Analyse „wieder gefundene“ Substanzmenge wird berechnet
W
x  100

%
3. Bestimmungsgrenze
Bei der quantitativen Bestimmung gibt sie an, bei welcher niedrigsten
Masse bzw. niedrigsten Gehalt die entsprechende Analysenmethode noch
den Anspruch nach Präzision und Richtigkeit erfüllt.
Bei instrumentellen Methoden erfolgt die Bestimmung nur mit k=10
S m  S r  10  S r
Sm: Messsignal der Substanz
Sr: Mittelwert der Rausch-Signale ohne Substanz
K: Faktor
4.Empfindlichkeit
Die Empfindlichkeit beurteilt den Einfluss einer Konzentrationsänderung
auf das Messergebnis . Ein Analysenverfahren ist umso empfindlicher,
je gröber die Änderung des Messwertes bei einer Konzentrationsänderung
ist.
Ausgedrückt wird sie durch die Angabe von Zuwachs der Messgröße je
Zuwachs der Konzentration:
E
M
C
∆M : Änderung der Messwerte
∆C : Änderung der Konzentration bzw. Masse
Bei linearer Abhängigkeit entspricht die Empfindlichkeit der Steigung der
Kalibriergeraden (Steigung sog. Regressionskoeffizient)
5. Selektivität/Spezifität
Die Selektivität, bzw. Spezifität gibt an, inwieweit ein Verfahren für eine bestimmte Substanz
in Gegenwart anderer Substanzen präzise und richtige Ergebnisse liefert. Die Summe der
Begleigtstoffe nennt man Matrix. Dies können sein: z.B. chemisch ähnliche Substanzen,
Verunreinigungen, Abbauprodukte, Hilfsstoffe.
Zur Bestimmung der Selektivität muss die Reinsubstanz verfügbar oder isolierbar sein und
das Messsignal sollte nur durch die Prüfsubstanz erzeugt werden. Dann führt man Analysen in
Gegenwart der Matrix und ohne Matrix durch und vergleicht die Ergebnisse.
Sind die Standartabweichungen der beiden Messreihen nicht signifikant unterschiedlich muss
man einen t-Test durchführen.
6. Linearität
Die Linearität beschreibt die Proportionalität zwischen den Messergebnissen und der
Stoffmenge bzw. Konzentration einer quantitativen Analysenmethode.
Es wird die Abhängigkeit der Messwerte von der Konzentration untersucht, indem man
Analysen mit Modellmischungen verschiedener Konzentrationen durchführt und die
Messergebnisse graphisch gegeneinander Aufträgt.
Bei direkter Proportionalität erhält man eine Grade; die Kalibriergrade. Zur Optimierung mit
Hilfe der Methode der kleinsten Fehlerquadrate sollte man mit mindestens 5 Messwerten den
Messbereich abdecken.
Erhält man eine Kurve, dann sollte man durch mathematische Transformation eine Grade
erhalten. (z.B. durch Logarithmieren)
Methode der kleinsten Fehlerquadrate
- zur Bestimmung des Verlaufs der Kalibriergrade
Y= a +bX
a= Achsenabschnitt auf der Y-Achse
b= Steigung
Die charakteristischen Größen erhält man aus:
Der lineare Korrelationskoeffizient gibt an ob und wie zwei Messreihen zusammenhängen:
Für r -1 oder +1 besteht ein grosser Zusammenhang, für r= 0 besteht kein Zusammenhang.
7. Robustheit
Die Robustheit ist die Widerstandsfähigkeit einer Analysenmethode gegen Störungen und
äussere Einflüsse auf Analysenbedingungen. Dies können sein:
-
Störanfälligkeit
Stabilität der Prüflösung
Durchführungszeiten
Temperatureinflüsse
Lichteinflüsse
Herkunft, Stabilität und Alter der Reagenzien
Schwankungen in der Konzentration der Reagenzien
Untersuchungslaboratorium
Man kann die Robustheit nicht zahlenmässig erfassen. Ein robustes Verfahren ist gegen diese
äusseren Einflüsse und Störungen weitestgehend immun.