T-Zell vermittelte Lyse Dendritischer Zellen in vivo und in vitro
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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Abteilung Immunologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau T-Zell vermittelte Lyse Dendritischer Zellen in vivo und in vitro INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt im Juni 2002 von Holger Oemus Geboren in Leipzig Dekan: Professor Dr. M. Schumacher 1. Gutachter: Professor Dr. sc. nat. H. Pircher 2. Gutachter: Professor Dr. med J. Simon Jahr der Promotion: 2003 Für meine Familie Inhaltsverzeichnis 4 Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung..........................................................................................7 2. Abkürzungen...................................................................................................8 3. Einleitung.......................................................................................................10 3.1 Das Immunsystem........................................................................................................10 3.2 Spezifisches Immunsystem..........................................................................................10 3.2.1 B-Zellen......................................................................................................................11 3.2.2 T-Zellen......................................................................................................................11 3.3 Beschreibung Dendritischer Zellen (DC)..................................................................13 3.4 Die Phasen der DC-Reifung........................................................................................14 3.4.1 Migration naiver DC in periphere Organe..................................................................14 3.4.2 Antigenaufnahme und Aktivierung............................................................................15 3.4.3 Migration reifender DC in die Lymphatischen Organe..............................................16 3.4.4 Antigenverarbeitung und -präsentation an T-Zellen..................................................17 3.4.4.1 MHC-Moleküle.......................................................................................................17 3.4.4.2 Kostimulatorische Signale.......................................................................................18 3.5 Lysemechanismen von Lymphozyten........................................................................19 3.6 DC in Tumorimmunologie..........................................................................................20 3.6.1 TAA-Beladung von DC..............................................................................................22 3.6.2 Immuntherapie mit DC...............................................................................................22 3.7 Entwicklung der Arbeitshypothese............................................................................23 3.7.1 Das LCMV Modell.....................................................................................................25 3.7.2 Fragestellung..............................................................................................................25 4. Materialien und Methoden..........................................................................26 4.1 Mäuse............................................................................................................................26 4.2 Produktion von GM-CSF- Überstand.......................................................................26 4.3 Kultivierung von DC aus Knochenmarksvorläuferzellen ......................................27 4.4 Antigenbeladung von DC und deren Transfer in Mäuse.........................................28 4.5 Aufreinigung der Zellen mit Hilfe von Metrizamid.................................................28 4.6 Einfrieren von Zellen...................................................................................................29 4.7 Herstellen einer Einzelzellsuspension........................................................................29 4.8 Ermittlung der Zellzahl einer Einzelzellsuspension.................................................29 4.9 Adoptiver Zelltransfer................................................................................................30 Inhaltsverzeichnis 5 4.10 Entnahme von peripheren Blut................................................................................30 4.11 Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie .......................................................30 4.11 Aufreinigen von Zellen mit MACS..........................................................................31 4.12 Chromfreisetzungstest...............................................................................................32 4.12.1 Generierung von Effektorzellen...............................................................................32 4.12.2 Präparation der Zielzellen.........................................................................................33 4.12.3 Ausplattierung der Zellen.........................................................................................34 4.13 Bestimmung der Proliferation durch Inkorporation von 3H- Thymidin.............34 4.14 Kultivierung der Zellinie B16.F10GP33..................................................................35 4.14 Subkutane Injektion von Tumoren in Mäuse.........................................................35 5. Ergebnisse......................................................................................................36 5.1 Gewinnung von Dendritischen Zellen mit verschiedenen Methoden.....................36 Die Figur 1 zeigt eine am 8.Tag geerntete DC Zellkultur, die mit Antikörpern gegen CD11c und MHC-Klasse II gefärbt und im Durchflusszytometer dargestellt wurde. .............................................................................................................................................37 5.2 Aufbereitung von DC..................................................................................................37 5.3 Funktionsprüfung der generierten DC......................................................................38 5.3.1 Tumorprotektion.........................................................................................................39 5.3.2 Stimulation von TCR-tg Zellen durch GP33-Peptid beladene DC in vitro................40 5.3.3 Stimulation von TCR-tg Zellen durch GP33-Peptid beladene DC in vivo................41 5.4 Kinetik der TCR-tg T-Zellen nach Stimulation und Restimulation.......................42 5.5 Lyse von DC durch TCR-tg T-Zellen in vitro...........................................................44 5.6 Lytische Aktivität isolierter Lymphozyten 4 und 6 Tage nach Stimulation..........45 5.7 T-Zell vermittelte Mechanismen zur Lyse von DC in vitro.....................................46 5.7.1 Veränderung des Lyseverhaltens der DC durch Kontakt mit LPS.............................49 5.8 Unterbindung der DC-Lyse in vivo...........................................................................51 6. Diskussion......................................................................................................53 6.1 Zusammenfassung der Ergebnisse.............................................................................53 6.2 Faktoren einer DC Kultur..........................................................................................53 6.3 Mechanismen der DC-Lyse.........................................................................................54 6.3.1 Kinetik der DC-Lyse..................................................................................................54 6.3.2 'Homingverhalten' von T-Zellen.................................................................................55 6.4 DC Lyseresistenz gegenüber aktivierten T-Zellen...................................................56 6.4.1 Induktionswege des Schutzes gegen den Fas-Lysemechanismus .............................56 Inhaltsverzeichnis 6 6.4.2 Wieviel T-Zellen braucht es zur Lyse einer DC?.......................................................58 6.4.3 Die Bedeutung des Perforin-Mechanismus für DC-Lyse...........................................59 6.4.4 DC-Lyseresistenz gegenüber des Perforinmechanismus............................................60 6.5 Kinetik der T-Zellexpansion.......................................................................................61 6.5.1 Charakterisierung des Transfermodells......................................................................61 6.5.2.1 Was geschieht mit den T-Zellen nach der maximalen Expansion?.........................61 6.5.2 Abhängigkeit der T-Zellexpansion vom Zeitpunkt einer zweiten Stimulation..........62 6.5.2.1 DC-Lysemechanismen in vivo................................................................................63 6.6 Sinn einer DC Elimination..........................................................................................65 7. Literaturverzeichnis.....................................................................................66 8. Lebenslauf.....................................................................................................76 9. Dank ..............................................................................................................77 1. Zusammenfassung 7 1. Zusammenfassung Die Bedeutung Dendritischer Zellen (DC) als die wichtigsten Initiatoren spezifischer Immunantworten wurde in den letzten Jahren zunehmend herausgearbeitet. DC liegen über den gesamten Körper verstreut, sammeln Antigene und transportieren diese entlang der Lymphbahnen zu den drainierenden Lymphknoten. Während dieser Migration durchlaufen sie einen Reifungsprozess von einer Antigen aufnehmenden zu einer Antigen präsentierenden Zelle (APC). Ihre Funktion besteht im Ausstellen eingefangener Antigene über MHCMoleküle und der Aktivierung spezifischer T-Lymphozyten, den Protagonisten des spezifischen, zellulären Immunsystems. Erkennen die T-Zellen ein präsentiertes Antigen auf den DC, proliferieren sie klonal und wandern fortan durch den Körper auf der Suche nach demselben Antigen in Form von Fremdproteinen und Erregern auf infizierten Zellen und Tumoren, um diese zu lysieren. Es stellte sich die Frage, ob die einmal aktivierten T-Zellen auch die das Antigen präsentierenden DC eliminieren. Dies könnte einerseits die zügige Entwicklung einer Immunantwort behindern, andererseits ein sehr kurz gekoppelter Regulationsmechanismus zur Steuerung einer Immunantwort darstellen. Unter Verwendung des CD8 T-Zell-restringierten Epitops GP33 des Glykoproteins aus dem Lymphozytären Choriomeningitis Virus als Modellantigen konnte in vivo und in vitro gezeigt werden, dass antigenpräsentierende DC von aktivierten spezifischen CD8+ T-Lymphozyten lysiert werden. Die klonal expandierenden, aktivierten T-Zellen verwendeten zur DC-Lyse während der ersten Zellzyklen vorwiegend den Fas-Mechanismus, der ab dem 2. Tag durch den sich langsamer herausbildenden Perforin-Mechansimus zunehmend abgelöst wurde. Die DC waren der Lyse durch T-Zellen aber nicht schutzlos ausgesetzt, sondern regulierten ihre Lysesensibilität gegenüber beiden Mechanismen in Reaktion auf Zytokine, Erregerstrukturen (LPS) und Zell-Zellsignalen (CD40). Die mit der Lyseresistenz einhergehende längere Überlebenszeit Dendritischer Zellen und ihr Vermögen, mehr Lymphozyten pro APC aktivieren zu können, stellt eine weitere Regulierungsebene einer beginnenden Immunantwort dar. Um die praktische Relevanz die DC-Lyse zu untersuchten, wurde die in klinischen Immunisierungsprotokollen zur Erlangung eines spezifischen T-ZellAntitumortiters verwendeten repetitiven Gaben peptidbeladener DC betrachtet. Die bei der ersten Applikation peptidbeladener DC aktivierten T-Zellen vermochten DC einer weiteren Stimulation spezifisch zu zerstören. Eine relevante Einschränkung der sekundären TZellexpansion durch DC-Lyse findet sich aber nur bei sehr hohen Zahlen aktivierter spezifischer T-Zellen und kann durch Gabe einer ausreichend hohen Anzahl peptidbeladener DC kompensiert werden. 2. Abkürzungen 8 2. Abkürzungen Ag Antigen Ak Antikörper APC Antigenpräsentierende Zelle AS Aminosäure ATP Adenosin-Tri-Phosphat B6 C57BL/6 Mäuse B16.F10 Melanomzellinie B16.F10GP33 GP33 exprimierende B16.F10 Linie BCR B-Zell-Rezeptor °C Grad Celsius CCL Chemokine Ligand CD cluster of differentiation CFSE 5,6-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidyl-Ester CTL Zytotoxischer T-Lymphozyt DC Dendritische Zelle DMEM Dulbecco`s Modified Essential Medium DMSO Dimethylsulfoxid FITC Fluoresceinisothiocyanat FKS fötales Kälberserum FSC forward scatter (Zellgröße) G418 Genticinsulfat GM-CSF Granulozyten-Makrophagen Kolonie stimulierender Faktor GP Glykoprotein GP33 Peptid KAVYYNFATM des Glykoproteins von LCMV H8 Mauslinie, die GP33 auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert IFN- Interferon gamma IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M IL Interleukin IMDM Iscove`s Modified Essential Medium i.v. intravenös 2. Abkürzungen 9 KM Knochenmark l Liter LC Langerhans-Zellen LCMV Lymphozytäres Choriomeningitis Virus M Molar m Milli µ Mikro MHC Major Histocompatibility Complex min Minute NK-Zelle Natürliche Killer-Zelle NaCl Natriumchlorid OVA Ovalbumin PBS Phosphat gepufferte Saline pfu plaque forming units pH negativer dekadischer Logarithmus der Protonenmolarität P/S Penicillin/Streptomycin PRR Mustererkennungsrezeptor rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur s.c. subcutan TAA Tumorassoziiertes Antigen TCR T-Zell Rezeptor TCR-tg transgener T-Zell Rezeptor tg transgen TNF Tumor-Nekrose-Faktor TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand TRIS 2-Amino-2-Hydroxymethyl-1,3-Propandiol U Unit 3. Einleitung 10 3. Einleitung 3.1 Das Immunsystem Ein Säugetierorganismus schafft für seine Zellen an jeglichem Ort optimale Lebensbedingungen mit ausreichend Nahrung, Sauerstoff, der Zufuhr von benötigten Stoffwechselsubstanzen und der Entsorgung von Stoffwechselendprodukten. Mikroorganismen trachten daher danach, an dem Reichtum des Vielzellers teilhaben zu können und Anschluss an diese Ressourcen zu bekommen. Unter einer massiven Invasion von Erregern würde ein Säugetierorganismus zugrundegehen. Der Vielzeller steht also sein Leben lang unter dem Druck, sich von seiner Umgebung abzugrenzen. Er hält die Mikroben an seinen inneren und äußeren Körperoberflächen mit verschiedenen Mechanismen in Schach und bekämpft sie im Falle des Durchbrechens dieser Barrieren. Aber auch körpereigene Zellen können dem Organismus schaden, sollten sie sich aufgrund von Schäden in ihren Regulationsmechanismen der Proliferationskontrolle des Organismus entziehen und zu Tumoren entarten. Das Immunsystem hat die Aufgabe, den Körper gegenüber seiner Umwelt abzugrenzen und entartete Zellen zu eliminieren. Zur Verteidigung dienen ihm unspezifische und spezifische, zelluläre und nichtzelluläre Abwehrmechanismen. Unspezifische sind angeborene, schnell verfügbare und auf viele verschiedene Angreifer wirkende Mechanismen. Sie sind der in der Evolution zuerst entstandene Teil, zu dem beispielsweise das Komplementsystem, die Magensäure, Granulozyten und Makrophagen, das Lysozym oder der Säuremantel der Haut gehören. Das spezifische Immunsystem baut auf die Leistungen des unspezifischen auf. Zur erstmaligen Mobilisierung gegen unbekannte Strukturen benötigt es einige Tage Anlaufzeit, wirkt dann aber maßgeschneidert und effektiver als das unspezifische System und hinterlässt lebenslange Immunität. 3.2 Spezifisches Immunsystem Die wichtigsten Leistungen des adaptiven Immunsystems bestehen in a) der Spezifität für Antigene, b) der Diversität für viele verschiedene Strukturen, c) der Erinnerungsfunktion an schon stattgefundene Immunantworten mit einer Anpassung an das Erregerspektrum eines Standortes, d) der Spezialisierung auf ein bestimmtes Abwehrmuster gegen jeweilige Erreger, e) der Selbstlimitierung einer Immunantwort und f) der Nichtreaktivität gegenüber 3. Einleitung 11 körpereigenen Strukturen. Die Protagonisten des spezifischen Immunsystems sind die Lymphozyten, Zellen, die in der Immunantwort mit Hilfe von aktiven zellulären und nichtzellulären Komponenten agieren. Sie entstammen Blutstammzellen im Knochenmark. Während sich die myeloische Zellinie zu Granulozyten, Makrophagen, Thrombozyten und Erythrozyten differenziert, gehen aus der lymphatischen Linie wachstumshormongesteuert die Lymphozyten hervor. Bei den Lymphozyten werden zwei Untergruppen- die B-Zellen und die T-Zellen- voneinander unterschieden, die sich wiederum aus verschiedenen Zelltypen mit unterschiedlichen Funktionen zusammensetzen. 3.2.1 B-Zellen Das unverwechselbare Merkmal der B-Lymphozyten ist der B-Zell-Rezeptor (BCR). Er entsteht bei ihrer Bildung durch somatische Umlagerung von Antigenrezeptorgensegmenten. Der BCR imponiert als auf der Zelloberfläche exprimiertes Immunglobulin-Molekül, gekoppelt an eine in Membran und Zytoplasma gelegene Signaltransduktionseinheit. Durch diese Rezeptorkomplexbildung, die der spezifischen Erkennung eines Antigens dient, erlangen die B-Zellen ihre Funktionalität und Spezifität. Die B-Zellen bilden den humoralen Arm der adaptiven Immunität und zeichnen sich durch die Fähigkeit der Bildung spezifischer Antikörper aus. Bis zum ersten BCR-vermittelten spezifischen Antigenkontakt und dem kostimulatorischen Signal einer ebenfalls für das Antigen spezifischen CD4+ T-Zelle bleiben sie in einem inaktiven Zustand, der das gesamte Leben andauern kann. Bei Antigenkontakt formen sich die B-Zellen in Plasma- oder Gedächtniszellen um und bilden fortan der Spezifität des BCR gleichende Antikörper. Die Antikörper wirken gegen extrazelluläre Erreger, neutralisieren Toxine, opsonieren Bakterien und aktivieren das Komplementsystem. 3.2.2 T-Zellen Die T-Lymphozyten bilden die zelluläre Komponente des erworbenen Immunsystems und zeichnen sich durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) aus. Die T-Lymphozyten erkennen mit Hilfe ihres TCR Peptide, die von MHC-Molekülen (Major Histocompatibility Complex) präsentiert werden und richten ihre Immunantwort vorwiegend gegen intrazelluläre Erreger und Tumore. Während B-Zellen bis zu ihrer vollen Ausreifung im Knochenmark verbleiben, wandern die T-Lymphozyten schon in einem frühen Entwicklungsstadium in den Thymus ein. Dort werden sie nach Erlangung der TCR-Spezifität für ein Peptid daraufhin selektiert, 3. Einleitung 12 körpereigene MHC-Moleküle zu erkennen und vom Körper selbst hergestellte Proteine zu tolerieren. Diese zwei Selektionsmechanismen, bei denen über 90% der Zellen zugrunde gehen, sichern einerseits die Funktionalität der Zellen und bilden andererseits die unterste Stufe der Selbsttoleranz der T-Zellen gegenüber körpereigenen Strukturen. Trotz dieser Selektion entsteht eine enorme Vielfalt an T-Lymphozyten mit verschiedenen TCR-Varianten unterschiedlicher Spezifität. Nach dieser Reifeperiode durchwandern sie auf der Suche nach dem zu ihrem TCR passenden Antigen die lymphatischen Organe des Körpers in einem ruhenden Zustand als naive T-Zellen. Betrachtet man die für den Organismus meist tödlich ausgehenden Immundefizienzen, bei denen ein Erreger oder ein Tumor die Oberhand über das Immunsystem gewinnt, so entsteht für den Organismus die Notwendigkeit, sich gegen jede mögliche pathogene Struktur sowohl in Form spezifischer erkennender Sequenzen als auch in ausreichender Anzahl spezifischer Abwehrmechanismen und -zellen zu wappnen. Im Laufe des Lebens wird aber nur ein äußerst geringer Anteil dieser spezifischen Zellen wirklich mit seinem Antigen in Kontakt kommen, während die nicht in Aktion getretenen Zellen verschwendete Ressourcen darstellen. Der Organismus hält diese Ressourcenverschwendung dadurch möglichst gering, dass er T-Zellen jeder einzelnen Spezifität in nur sehr begrenztem Umfange im Körper erhält, um sie im Fall einer Infektion expandieren zu lassen. Ob der Körper gerade mit einer Infektion kämpft, erfahren die T-Zellen in den sekundären Lymphatischen Organen. Dorthin bringen Antigenpräsentierende Zellen (APC) (Makrophagen, B-Zellen, Monozyten, Dendritische Zellen) fortwährend die in den Organen und an den Grenzflächen zur Außenwelt aufgenommenen Antigene und eingedrungenen Erreger. Die sekundären lymphatischen Organe zeigen ein durch die APC ständig erneuertes Abbild der im drainierten Gebiet produzierten Eiweiße und eingefangenen Erreger. Trifft eine T-Zelle auf ein für sie spezifisches Antigen, so wird sie aktiviert. Aktivierung bedeutet, dass sich die T-Zellen nach dem Kontakt mit dem für sie spezifischen Antigen durch eine antigenpräsentierende Zelle in weitere, für das gleiche Antigen spezifische Klone teilen und ihren Zellstoffwechsel auf die Produktion von löslichen Faktoren und die mögliche Lysierung pathogener Zellen umstellen. Weiterhin verändern die T-Zellen ihre Oberflächenproteinexpression und erhalten dadurch beispielsweise die Fähigkeit die Blutbahn an Orten von Entzündungen zu verlassen und in Gewebe immunologischer Aktivität auszuwandern. Die Aktivierung von T-Zellen erfordert sowohl die Präsentation des Antigens als auch einen Stimulus von den APC. Die wichtigsten APC sind die Dendritischen Zellen. 3. Einleitung 13 3.3 Beschreibung Dendritischer Zellen (DC) Die Immunologie hat sich lange Zeit auf Antigene und Lymphozyten konzentriert, aber die alleinige Präsenz beider Teile führt nicht immer zur Immunität. Eine dritte Komponente, das dendritische Zellsystem von antigenpräsentierenden Zellen ist der eigentliche Initiator und Regulator der Immunantwort. Erstmals wurden sie als Langerhans-Zellen (LC) in der Haut um 1868 gezeigt, ihre Charakterisierung begann 25 Jahre später. Der Name DC beinhaltet eigentlich eine ganze Zellfamilie verschiedener Zellen, die sich in ihrer Entstehung, ihrer Lokalisation und ihrer Funktion voneinander unterscheiden. So ist beschrieben, dass einige Mitglieder der DC-Familie von myeloiden, andere von lymphoiden Vorläuferzellen abstammen . Zur Familie gehören die epidermalen Langerhans-Zellen, (5, 120) die interstitiellen DC verschiedener Organe, die interdigitierenden DC in den T-Zell reichen Gebieten der Lymphgewebe, die DC im Thymus und die follikulären DC, wobei jedes Mitglied die Kontrolle über einen anderen Teil des Immunsystems besitzt. DC tragen vermutlich die alleinige Verantwortung für die Stimulation naiver T-Lymphozyten, sind essentielle Helfer bei der Erzeugung von primären Antikörperantworten, verstärken die Zelltoxizität von NK -Zellen und sind an der Erhaltung der Selbsttoleranz beteiligt. Im Lichtmikroskop erkennt man kleine kantige Zellen mit zahlreichen Fortsätzen, die sich weit aus dem Zellkörper hervorstrecken können. Damit gewinnen DC eine große Oberfläche, die es ihnen in den peripheren Geweben primär erlaubt, über ein großes Areal verteilte Antigene aufzunehmen und sie anschließend in den lymphatischen Organen einer großen Anzahl von Lymphozyten gleichzeitig zu präsentieren. Intrazellulär weisen sie hohe Konzentrationen, der Antigenverarbeitung zugehöriger Strukturen wie Endosomen, Lysosomen und die Birbeck Granula in den Langerhans-Zellen der Epidermis auf. Je nach Reifungszustand befinden sich zahlreiche MHC-Klasse II- Strukturen auf ihrer Oberfläche sowie verschiedene, der Antigenpräsentation dienende Adhäsions- und kostimulatorischen Moleküle (CD11a /LFA-3, CD11c (relativ spezifischer Marker für DC),CD54/ ICAM-1, CD50/ICAM-2, CD102/ICAM-3 und CD58 /LFA-3), die alle auch auf Monozyten und Makrophagen gefunden werden können (64). Die kostimulatorischen Moleküle CD80 (B7.1), CD86 (B7.2) sowie CD40, welches in der Stimulations- und Reiferegulation der DC eine Rolle spielt, finden sich auf reifen, myeloiden DC exprimiert (49, 111). Der DC Phänotyp variiert mit dem Reifestadium der Zellen. Humane DC Vorläuferzellen, die sich noch auf der Wanderung über das Blut zu den peripheren Organen befinden, weisen auf ihrer Oberfläche CD2, 4, 13, 16, 32 und 33 auf, verlieren diese aber wieder teilweise während 3. Einleitung 14 ihrer Ausreifung. Die Adhäsions- und Kostimulationsmoleküle dagegen nehmen mit der Ausreifung zu. Die folgenden Betrachtungen beziehen sich auf epidermale LC und interstitielle DC, die in einem Ruhezustand über den Körper verteilt, und verstärkt an häufigen Eintrittspforten von Erregern platziert sind. Auf Signale aus der extrazellulären Umgebung, die von umstehenden gestressten Zellen oder Erregern ausgehen, steigern DC ihr Phagozytosefähigkeit und reagieren mit einem Reifungsschritt, der mit einer Wanderung zu lymphatischen Organen, einer Erhöhung der stimulatorischen Eigenschaften und der Produktion von Zytokinen einhergeht. 3.4 Die Phasen der DC-Reifung Die Lebensspanne von myeloiden DC kann in verschiedene Stadien unterteilt werden. Sie beginnen als Knochenmarkstammzellen in den blutzellbildenden Knochen, ziehen als DC Vorläuferzellen durch Blut und lymphatische Organe und siedeln sich in den peripheren Organen als unreife gewebsständige DC an, um fortan Antigene zu sammeln. Stresshormone oder erkannte Erreger verleiten sie zur Umwandlung in Richtung einer reifen DC, die die aufgenommenen Antigene verarbeitet und präsentiert, sowie das Gewebe über die Lymphe verlässt. Als aktivierte DC gelangen sie in die sekundären Lymphorgane, in denen sie in hohem Grade kostimulatorische Moleküle exprimieren und die Antigene an TZellen präsentieren. 3.4.1 Migration naiver DC in periphere Organe Neu generierte DC migrieren auf dem Weg vom Knochenmark zu nichtlymphatischen Geweben durch den Blutstrom. Sie orientieren sich bei ihrer Wanderung in die peripheren Gewebe anhand von Oberflächenstrukturen auf ortsständigen Zellen und Chemokinreizen an Orten lokaler Infektionen, in die sie verstärkt einwandern (81, 82) . Wie verschiedene DC Untergruppen unterschiedliche Rezeptorenmuster aufweisen, so variiert auch deren Verhalten gegenüber den Chemokinen. Der Chemokinrezeptor 6 (CCR6), der auf unreifen LC exprimiert wird und dessen Gegenstück das in entzündlichen Gebieten von epithelialem Gewebe produzierte 'Makrophageninflammatorische Protein'3á (MIP3á) ist, scheint neben MIP1á und RANTES der am stärksten zur Migration in entzündliches epitheliales Gewebe aktivierende Faktor zu sein . Während ihrer Migration sind DC in eine Reihe von (34, 100) verschiedenen Adhäsionsereignissen involviert. So erlaubt das allein auf LC exprimierte Protein E-Cadherin die Ansiedelung der LC in der Epidermis (8, 54) . Das Aufsammeln von 3. Einleitung 15 Antigenen reduziert die Molekülexpression des E-Cadherin auf der Oberfläche wieder und ermöglicht den LC damit die Haut zu verlassen . In unreifen DC wurden zahlreiche (119) exprimierte Gene gefunden, die an der Zellmigration beteiligt sind. DC erleichtern sich beispielsweise durch die Abgabe von Kollagenase Typ IV die Überwindung der Basalmembran (61) und sie synthetisieren eine Metalloproteinase, die eine elastolytische Kapazität aufweist. 3.4.2 Antigenaufnahme und Aktivierung DC siedeln in den peripheren Geweben und nehmen in einer Art Ruhestadium Antigene aus ihrer Umgebung auf. Dafür stehen ihnen die folgenden Mechanismen zur Verfügung: – die rezeptorvermittelte Endozytose über C-Typ Lektin Rezeptoren (Mannoserezeptor) (35, , sowie die Aufnahme von opsonierten Partikeln und Immunkomplexen durch den Fc- 55, 107) y Rezeptor Typ 1 (CD64) und 2 (CD32) (37) und den C3bi Komplement-Rezeptor (CD11b), – die Phagozytose zur Inkorporation von Partikeln, apoptotischen und nekrotischen Zellfragmenten (CD36 und avß3 oder avß5 Integrinen) (2, 106), Viren und Bakterien (48, 85), Mikro- und Makropinozytose. Als Makropinozytose bezeichnet man die Aufnahme – extrazellulärer Flüssigkeit in Bläschen. Die in den Bläschen befindlichen Antigene werden danach beim Ausleiten der Flüssigkeit durch Wasserkanäle (Aquaporine) konzentriert. Unreife DC sind sehr effiziente Antigenfänger. DC nehmen nicht nur Antigene auf, sondern sie besitzen auch Rezeptoren, mit deren Hilfe sie charakteristische Merkmale von Mikroorganismengruppen (97, 128) erkennen können. Durch diese Erkennungsmechanismen fremder Antigene wird bei der Initiierung einer Immunantwort schon auf der Stufe der DC die Wichtigkeit einer aufgenommenen Struktur erkannt und die DC mit der Information einer Erregerinvasion in einen Alarmzustand versetzt. Aus den Zellwänden gramnegativer Bakterien stammendes LPS (Lipopolysacharid) (102) erkennen DC beispielsweise mit der Kombination aus den erst kürzlich entdeckten Toll- like Rezeptoren 2 und 4 und CD14. Obwohl viele Rezeptoren noch nicht identifiziert wurden, beobachtete man außerdem eine Reaktion der DC in Form eines Reifungsschrittes auf Kontakt a) mit Doppelstrang RNS aus Influenza Viren (24), b) mit bakterieller DNS (1, 41), aber auch c) mit vollständig intakten Mikroben wie Mykobakterien und Influenzaviren . (24, 43) Neben diesen von außen auf den Organismus einwirkenden Faktoren, können auch körpereigene immunologische Mechanismen wie d) die Änderungen in der Balance zwischen pro- und antiinflammatorischen Signalen, e) die lokale Produktion von Stresshormonen wie TNF oder IL1 , IL-6, IL-10, TGF- und Prostaglandine, f) sterbende Zellen sowie g) die (29) 3. Einleitung 16 Aufnahme von Immunkomplexen über Fc-Rezeptoren in den ruhenden DC einen Ausreifungsschritt induzieren. Dieser ist ein kontinuierlicher Prozess, der anfangs mit Chemokin- und Zytokinproduktion sowie der Sezernierung von Interferon-alpha/beta (IFN/ ) einhergeht. Diese Vorgänge dienen alle der Zellrekrutierung immunkompetenter Zellen ins inflammatorische Gebiet und der Steigerung der angeborenen Immunantwort. Parallel dazu durchlaufen die DC zahlreiche morphologische Veränderungen. Modifikationen in den Adhäsionsstrukturen und eine Zytoskelettreorganisation gewähren ihnen eine erhöhte zelluläre Motilität und leiten ihre Wanderung in die lymphatischen Organe ein . Die (126) Zellmembranmolekülexpression passt sich unter dem Verlust der Endozytose- und Phagozytoserezeptoren und einer vermehrten Expression von MHC-Molekülen und kostimulatorischen Liganden an ihre spätere Funktion als Antigenpräsentierende Zellen an. Der Reifungsprozess wird erst während der DC-T-Zell-Interaktion vervollständigt. Mit ihren beschriebenen Fähigkeiten bilden DC eine Brücke zwischen angeborenem und erworbenem Immunsystem. Sie vermögen sowohl beide Systeme zu stimulieren, als auch die Aktivierung des zuerst auf eine Immunreaktion aktivierten angeborenen Systems auf das adaptive zu übertragen. 3.4.3 Migration reifender DC in die Lymphatischen Organe Die sich an die Aktivierung der DC anschließende Migration erfolgt als eine koordinierte Reaktion auf verschiedene Chemokine. Nach der Antigenaufnahme schalten entzündliche Stimuli die Antwort immaturer DC auf CCL20 (Chemokine Ligand)(und andere für unreife DC spezifische Chemokine) durch Desensibilisierung oder Aufnahme der Rezeptoren ins Zellinnere ab . Maturierende DC entziehen sich damit dem lokalen Gradienten des (34, 110, 115) CCL20. Mit der Reifung regulieren sie den Chemokinrezeptor CCR7 hoch damit sensitiv gegenüber CCL19 und CCL21 (26, . 34) Wie (129) und werden an allogenen Hauttransplantationsmodellen gezeigt wurde, verlassen die DC das inflammatorische Gewebe über den Lymphstrom (62, 65, 75). Die neu erlangte Chemokinsensibilität gegenüber CCL19 und CCL21 leitet die DC in die parakortikale Zone der Lymphknoten (26, 34). Dort werden sie selbst zu einer Quelle von CCL19 und CCL21 und verstärken dieses chemotaktische Signal (34, 88, . CCL19 wirkt auch chemotaktisch auf ruhende T-Zellen und lockt mit den auch von DC 110) sezernierten Zytokinen CCL18 und CCL22 (88) naive und Gedächtnis- T-Zellen an. 3. Einleitung 17 3.4.4 Antigenverarbeitung und -präsentation an T-Zellen Die Translokation der DC in lymphatisches Gewebe dient der Präsentation der aufgenommenen Antigene an immunkompetente Zellen des adaptiven Immunsystems für die Induktion einer spezifischen Immunantwort. In den lymphatischen Organen interagieren DC mit T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen. DC und T-Zellen lagern sich vermittelt durch die Interaktion von Adhäsionsmolekülen wie 1 und 2 Integrinen und Mitgliedern der Immunglobulinfamilie (CD2, ICAM 1/CD54, ICAM3/CD50 und CD58) (9, 42) aneinander. Zusätzlich wird die Zell-Zellinteraktion durch das von den DC sekretierte CC-Chemokin (DC-CK1) unterstützt, welches selektiv T-Zellen anzieht. DC besitzen durch ihre Zellausläufer eine große Oberfläche, die es ihnen erlaubt , große Aggregate mit Lymphozyten zu bilden. Experimentell vermochte auf diese Weise eine einzige reife DC 100-3000 Lymphozyten zu stimulieren. 3.4.4.1 MHC-Moleküle Die Präsentation der von den DC eingefangenen Antigene an T-Zellen erfolgt über MHCMoleküle. Es existieren 2 Typen von T-Zellen, wie auch 2 verschiedene Sorten von MHCMolekülen. Diese beiden MHC-Molekülgruppen werden bei der Beladung mit Peptiden aus jeweils unterschiedlichen Zellkompartimenten bedient (dem Zytosol und dem vesikulären System) und präsentieren die Proteinfragmente an jene T-Zellen, die ihre Antwort gegen das jeweilige Kompartiment richten. Der TCR von CD8+ Zytotoxischen T-Zellen (CTL) interagiert mit dem MHC-Klasse I Molekül der DC. Um diesen mit Eiweißfragmenten zu beladen, existieren in den DC zwei verschiedene Wege. Der endogene wird durch Peptide aus dem Zytosol gespeist, während der exogene sich aufgenommener Peptide aus dem vesikulären System bedient (93). Der endogene Weg, der auch von allen anderen Körperzellen beschritten wird, führt über die Zerkleinerung zytosolischer Proteine in Octomere-Decamere und deren Bindung an MHC-Klasse I im endoplasmatischen Retikulum. Der exogene Weg findet seine Verwendung bei der Aufnahme von exogenen Proteinen, die von phagozytierten Partikeln oder aufgenommenen Immunkomplexen stammen. Die Peptide werden in Proteasomen generiert, ins endoplasmatische Retikulum transportiert und dort an die MHC-Klasse I Moleküle gekoppelt. Diese Variante der MHC-Klasse I Beladung wird als Crosspräsentation bezeichnet und ermöglicht den DC eine Stimulation von CD8+ T-Lymphozyten, ohne selbst infiziert oder beschädigt zu sein. Sie ist bisher nur bei DC beschrieben wurden. Dieser Vorgang macht DC zu den einzigen antigenpräsentierenden, nichtinfizierten Zellen, 3. Einleitung 18 die überhaupt in der Lage sind, CD8+ Zytotoxische T-Zellen aus naiven Vorläuferzellen zu generieren (76, 84, 86) , weil in allen anderen Zelltypen nur endogene Peptide auf das MHC- Klasse I Molekül gelangen können. CD4+ T-Helferzellen erkennen mit Hilfe ihres T-Zellrezeptors Proteinfragmente, die über MHC-Klasse II Moleküle präsentiert werden und aus dem vesikulären Kompartiment stammen. Die durch die DC aufgenommenen Antigene werden zur Zerkleinerung zuerst durch Endosomen geschleust, bevor sie dann in MHC-II reiche Kompartimente (MIIC) gelangen, die in unreifen DC ausgiebig vorkommen . Dies steht im Gegensatz zu (17, 35, 51, 118) Makrophagen, in denen der größte Teil der aufgenommenen Proteinsubstrate zu den Lysosomen befördert wird, Organellen, die nur wenig MHC-II aufweisen und das Antigen vollkommen in Aminosäuren verdauen. Während der Reifung der DC werden die MHCKlasse II Moleküle mit den Proteinfragmenten beladen und auf die Zelloberfläche gebracht. Dort verbleiben sie nur kurzzeitig und werden schnell wieder in das Zellinnere aufgenommen, sollten die DC nur einen unvollständigen Reifungsschritt durchlaufen. Bekommen die DC aber Kontakt mit Entzündungs- und Reifungsstimuli, so führt dies zu einer eklatanten Mehrproduktion von Klasse II Peptidkomplexen, die schnell auf die Zelloberfläche gebracht werden und dort tagelang stabil für die Erkennung durch CD4+ TLymphozyten erreichbar bleiben (23, 50, 94, 126). MHC-Klasse II befindet sich außer auf DC auch auf Makrophagen, Granulozyten, Monozyten und B-Zellen- den Antigenpräsentierenden Zellen. Während MHC-Moleküle darauf beschränkt sind, Peptide zu präsentieren, wurde vor einiger Zeit eine weitere Familie von Antigenpräsentierenden Molekülen entdeckt, die T-Zell Antworten gegen Lipid- und Glykolipid- enthaltene Antigene reguliert. Diese MHC-Klasse I ähnlichen CD1 Moleküle können Lipide aus endogenen und exogenen Wegen an CD8+ Lymphozyten präsentieren (20, 98). Auf den DC von Mäusen wurde bisher nur die Untergruppe CD1d identifiziert, die nur eine eingeschränkte Anzahl von Antigenen an T-Zellen und NKZellen präsentiert (59). 3.4.4.2 Kostimulatorische Signale Das alleinige Erkennen eines präsentierten Antigens durch einen TCR einer T-Zelle reicht aber noch nicht für eine Aktivierung aus. Zusätzlich ist das Signal eines Korezeptors vonnöten, um eine T-Zelle zu klonaler Proliferation und zur Differenzierung der Effektorfunktionen zu stimulieren. Die B7- Moleküle sind solche auf den APC befindliche Rezeptoren, die in Interaktion mit dem CD-28 Molekül auf den T-Zellen treten. CD80 (B.1) 3. Einleitung 19 und CD86 (B7.2) sind wichtige Korezeptoren für die Modulation einer T-Zell Antwort (22, 52). DC besitzen im Vergleich zu Monozyten und B-Zellen eine sehr hohe Dichte von diesen kostimulatorischen Molekülen und MHC-Molekülen, was ihnen die Fähigkeit verleiht, naive T-Zellen zu stimulieren, und sie zu den wichtigsten APC erhebt. DC stimulieren CD8+ T-Zellen direkt oder mit Hilfe von T-Helferzellen . Wurden (12, 18, 80, 130) DC durch inflammatorische Zytokine nicht ausreichend aktiviert oder ist das Antigen weniger immunogen, benötigen sie zur Generierung einer CTL Immunantwort die zusätzliche Stimulation durch CD4+ T-Helferzellen. Diese Interaktion ist an das Erkennen eines auf den DC an MHC-Klasse II gebundenen Peptides durch die Helferzelle gebunden und führt nach einem Signal über CD40/CD40L in den DC zu einer gesteigerten Expression von stabilen MHC-Molekülen und kostimulatorischen Signalen, sowie zu einer vermehrten Produktion von IL12, IL1, TNF und anderen Chemokinen. 3.5 Lysemechanismen von Lymphozyten Während sich die Immunantwort von aktivierten B-Zellen in Form produzierter Antikörper in erster Linie gegen lösliche, aber auch gegen zelluläre Ziele richtet, beschränkt sich das Tätigkeitsfeld der T-Zellen neben immunregulatorischen Aufgaben (v.a. der CD4+ T-Zellen) auf die Bekämpfung intrazellulärer Erreger und entarteter Zellen. Da sich sowohl Tumorzellen durch verstärkte Teilung auszeichnen, als auch intrazelluläre Erreger am Beispiel von Viren sich außerordentlich schnell replizieren können, ist die Lyse der infizierten oder entarteten Zelle die Methode der Wahl, um eine Ausbreitung und eine daraus entstehende Gefahr für den Gesamtorganismus zu verhindern. Neben den schon beschriebenen Erkennungsmechanismen naiver T-Zellen verfügen aktivierte CTL über verschiedene Effektormechanismen, die zum Zelltod der veränderten Zelle führen. Die beiden wichtigsten Mechanismen umfassen die Bereitstellung der Kombination aus Perforin und Granzymen in zytotoxischer Granula sowie die Expression des apoptoseinduzierenden Fas-Liganden (58) Die Perforin und Granzyme enthaltende zytotoxische Granula wird in den auf eine Aktivierung folgenden Stunden von den CTL synthetisiert und in Vesikeln gespeichert, bis sie bei der Erkennung einer veränderten Zelle über den MHC-TCR-Kontakt in den Zwischenzellraum ausgeschüttet wird. Perforin bildet eine Pore in der Zellmembran der erkannten Zelle, durch welche die kosezernierten Granzyme ins Zellinnere gelangen. Dort induzieren sie auf bisher noch ungeklärte Weise eine Zellapoptose. 3. Einleitung 20 Der Fas- Rezeptor (CD95) gehört zur Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Rezeptorfamilie und ist an eine intrazelluläre Todesdomäne gekoppelt. Der FasLigand findet sich unter anderem auf der Zellmembran von aktivierten T-Zellen exprimiert und induziert in der Zielzelle den programmierten Zelltod mit Fragmentierung der DNS und der Bildung apoptotischer Körperchen. TNF- und TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) sind zwei weitere auf T-Zellen nachgewiesene Rezeptorliganden der TNF-Familie, die auf die Zielzellen eine FasL-ähnliche Wirkung haben. Interferon- (IFN- ) ist ein von T-Zellen sezerniertes Zytokin mit antiviralen und zahlreichen anderen biologischen Wirkungen. Der IFN- Rezeptor auf den Zielzellen aktiviert nach einer Signalkaskade im Zelllinneren Transkriptionsfaktoren (13, . Die MHC-restringierte 14) Peptidpräsentation der Zielzelle wird dadurch gesteigert und führt zu einer damit einhergehenden leichteren Erkennung durch T-Zellen. Zum anderen aktiviert IFNMakrophagen, die dazu befähigt werden, sich intrazellulär vermehrende Erreger (z.B. Mykobakterien) unter Einsatz toxischer Moleküle abzutöten. Als eine Leistung des adaptiven Immunsystems wurde schon die Generierung unterschiedlicher und spezieller, auf jeweils unterschiedliche Erreger und Tumore maßgeschneiderter Immunantworten erwähnt, die unter Einsatz einer Kombination verschiedener zellulärer und humoraler Mittel stattfindet. In diesem Sinne ist auch die Verwendung eines oder mehrere Effektormechanismen durch aktivierte CTL in einer Immunantwort zielzellspezifisch und in ihrer Auswahl erst teilweise verstanden. 3.6 DC in Tumorimmunologie Ein Tumor ist ein Zellklon, dessen Zellwachstumsregulation außer Kontrolle geraten ist. Durch Mutationen in zellwachstumskontrollierenden Genen und den damit einhergehenden Struktur- und Funktionsveränderungen der kodierten Proteine kommt es in der Folge zu einer vermehrten Proliferation dieses Zellklones. Während beide Ebenen des Immunsystems- die humorale und die zelluläre- Tumorzellen zu lysieren vermögen, liegt es vor allem an der Aktivität von CD8+ Zytotoxischen TLymphozyten, Tumore zu erkennen und abzutöten. Um einen Tumor immunologisch angreifbar zu machen, muss er sich strukturell von normalem Gewebe unterscheiden. MHC-Klasse I Moleküle befinden sich auf allen Körperzellen. Durch deren Vermittlung zeigen Zellen auf ihrer Zelloberfläche die Proteine, die sie in ihrem Zellinneren produzieren. Tumorzellen präsentieren dabei auch die durch 3. Einleitung 21 Mutation oder Regression zu embryonalen Zelltypen entstandenen veränderten Eiweißetumorassoziierte Antigene- (TAA). Aktivierte CTL können diese Antigene mit Hilfe ihres TCR erkennen und in der Folge eine Zelllyse initiieren. Natürliche Killerzellen, eine Zellart des angeborenen Immunsystems, ergänzen dabei die Kontrolle der CTL, indem sie zytotoxisch gegen Zellen vorgehen, die sich dieser MHC-vermittelten Kontrolle durch verminderte Expression von MHC-Molekülen entziehen wollen. Die Voraussetzung für den Beginn einer solchen Antitumorantwort bildet das Vorhandensein von TAA zur Präsentation an T-Zellen in lymphatischem Gewebe . Denn nur dort besteht (89) die erhöhte Wahrscheinlichkeit, dass die das TAA erkennenden, spezifischen T-Zellen gefunden und aktiviert werden, um zahlenmäßig zu einer adäquaten Größe anzuwachsen und eine erfolgreiche Immunantwort beginnen zu können. Es sind verschiedene Wege beschrieben, wie dieser Antigentransfer im Körper vonstatten gehen kann. DC induzieren Apoptose mit Hilfe von TRAIL an TRAIL sensitiven Tumorzellen, nehmen deren apoptotische Körperchen auf und transportieren sie zur Präsentation in die LN (36). DC -Vorläuferzellen erkennen tumorassoziierte Molekularstrukturen durch ihren Mustererkennungsrezeptor (PRR). Sie aktivieren NK und NK T-Zellen über Zytokin vermittelte Interaktion (IFN- , später auch IL12, IL15 und IL18) oder über Zell-Zellkontakt, was zur vermehrten antiviralen und antitumoralen Aktivität der NK Zellen führt (23, 40, 66, 92, 114). Diese induzieren Apoptose in den Tumorzellen, wobei apoptotische Körperchen entstehen. Unreife DC nehmen diese Körperchen auf und aktivieren mit ihrer Hilfe in den LK T-Zellen. CD4 T-Zellen aktivieren NK-Zellen, Makrophagen und eosinophile Granulozyten, und stimulieren B-und T-Zellen über Zytokine, während T-Zellen die Tumorzellen direkt angreifen. Die Immuntherapie mit DC greift an diesem Punkt an, indem man durch Injektion von mit TAA-beladenen DC versucht, diese in den immunkompetenten Geweben verfügbar zu machen. In zahlreichen Tiermodellen konnte demonstriert werden, dass DC in der Lage sind, T-Zellen in einen Zustand zu überführen, der diese dazu befähigt, Tumorzellen spezifisch zu erkennen und zu lysieren . Dennoch hat die Tumorimmuntherapie bisher nur (38, 79, 91, 131) bescheidene Erfolge gezeigt. Ursache dafür sind einerseits die nur teilweise zu erlangenden tumorassoziierten Antigene und die fehlende Möglichkeiten, diese in einer immunsystemaktivierenden Weise in den tumortragenden Patienten zu überführen, andererseits aber auch zahlreiche von den Tumorzellen verwendete Mechanismen, um einer beginnenden Antitumor-Immunantwort zu entwischen. Für die anfänglichen Experimente mit DC in der Immuntherapie stellte die nicht ausreichende Verfügbarkeit einer hohen Anzahl hochreiner DC einen limitierenden Faktor 3. Einleitung 22 dar. Inzwischen wurden aber schon zahlreiche Protokolle veröffentlicht, die es erlauben, DC aus peripheren Blutmonozyten oder Knochenmarkstammzellen unter Zugabe von GM-CSF und anderen Hormonen (IL4, TNF- ) in vitro in großen Stückzahlen zu kultivieren (11, 21, 49, 77, 104, 108) und mit Hilfe von nicht immunogenen Dichtegradienten wie Percoll, Nycodenz oder Metrizamid aufzureinigen und anzureichern. Um eine gute DC-vermittelte Immunantwort zu erlangen, sind folgende Faktoren im Vaccinierungsprotokoll beachtenswert: a) die Quelle der TAA, b) die Methode der TAA Präparation und Beladung, c) die Auswahl der DC-Unterkasse und d) der Zeitpunkt der DC Injektion zur Generierung einer möglichst effizienten CTL Antwort. 3.6.1 TAA-Beladung von DC Wie schon in den letzten Kapiteln beschrieben wurde, müssen die DC für die Induktion einer gegen Tumore gerichteten CD8 T-Zellantwort die spezifischen TAA über ihre MHCMoleküle an T-Zellen präsentieren. Handelt es sich bei den TAA um bekannte, definierte und in löslicher Form vorliegende Peptidsequenzen (MART-1, MAGE-1, CEA, prostata spezifischhes Membranantigen-PSMA) (3, 87, 121) , so können die DC diese bei gemeinsamer Inkubation direkt an ihre MHC binden. Bei der Gabe von rekombinanten Proteinen in voller Länge, müssen die DC die Proteine selbst zerschneiden, um die zu präsentierenden Peptide zu generieren. Auf diese Weise können verschiedene Epitope entstehen, gegen die TZellantworten generiert werden. Sind die Peptidsequenzen der TAA unbekannt, besteht die Möglichkeit die DC mit undefinierten säuregelösten Peptiden von autologen Tumoren oder ganzen Tumorlysaten zu inkubieren. In diesem Fall präsentierten nur einige wenige der von den DC beladenen MHC-Moleküle Antitumorantworten auslösende TAA. Dabei besteht aber die Gefahr, dass die DC Selbstantigene in einer hohen Stückzahl präsentieren, was zur Induktion einer Autoimmunreaktion führen könnte. Andere Wege der DC Beladung mittels bekannter TAA verlaufen über die Einschleusung von aus Tumorzellen stammender RNA, retroviraler oder adenoviraler Vektoren, über das Einbringen von Peptiden durch Gentransfer, sowie die Fusion von DC mit Tumorzellen. 3.6.2 Immuntherapie mit DC Die immunologische Forschung ist auf dem Gebiet der Tumorbekämpfung mit Hilfe stimulierender DC bisher so weit gediehen, dass schon vor Jahren klinische Studien mit teilweise erfreulichen, häufig aber auch keinen Resultaten durchgeführt wurden. So berichtete 3. Einleitung 23 Hsu(45) über die Vaccinierung mit beladenen DC gegen B-Zell Lymphome, Nestle Lotze (67) über DC vermittelte Bekämpfung von Melanomen und Murphy (121) (87) und impfte mit peptidbeladenen DC gegen Prostatakarzinome. Die Erfolge waren zum Teil überraschend, so dass beispielsweise bei B-Zell-Lymphom-Patienten komplette Remissionen über mehrere Jahre erreicht werden konnten. Wiederum zeigten andere Patienten auf die Behandlungen keine oder nur geringe Reaktionen, so dass die Kombination von DC Dosis, Applikationsweg, Antigenauswahl und Antigenbeladungsmethode vermutlich nicht optimal waren. Es werden noch viele Jahre der Forschung und Studien vonnöten sein, um die Tumorbekämpfung durch Immuntherapie als Standardtherapie in den klinischen Alltag aufzunehmen zu können. In Zukunft wird neben der Frage um die beste DC Quelle die Wahl des Antigens und des sinnvollsten Beladungsweges von DC im Mittelpunkt des Interesses stehen, wie auch die zur Immuntherapie durch DC parallele Gabe immunregulatorischer Zytokine. 3.7 Entwicklung der Arbeitshypothese In den vergangenen Kapiteln wurde versucht darzustellen, welche zentrale Rolle DC bei der Initiierung und der Kontrolle einer Immunantwort haben. Neben der allgemeinen Zusammenfügung des Puzzles 'Immunsystem',könnte die genaue Kenntnis um die immunologischen Mechanismen der DC der Behandlung zahlreicher Krankheiten zugute kommen, zu denen Autoimmunkrankheiten, Allergien, Immundefizienzen, Transplantatabstoßungen, persistierende Virusinfektionen und Krebs gehören. In den letzten Jahren wuchs deshalb auch das Interesse an der Frage, was mit den DC nach der erfolgreichen Induktion einer Immunantwort passiert. Ihr Schicksal blieb lange Zeit unbekannt. Nachdem keine Zellen mit DC ähnlicher Morphologie in den efferenten Lymphgefäßen gefunden wurden (101), sie aber trotzdem aus der T-Zellzone der Lymphknoten verschwanden , wurde angenommen, dass DC in den Lymphknoten sterben. Über den (31) Todesmechanismus standen einerseits ein zellvermitteltes Ableben oder ein von anderen Zellen unabhängiger, programmierter Zelltod zur Diskussion. Ließ man DC unter der Einwirkung von LPS ausreifen, so konnte die Apoptose als terminales Zellstadium nachgewiesen werden . Weiterhin führte die Beobachtung, dass der durch LPS induzierte (30) Zelltod von DC auch in SCID-Mäusen auftrat, zu dem Schluss, dass dieser Schritt weder Tnoch B-Zellen benötigt (32) . Daraus resultierte die Hypothese, dass DC 24-30 Stunden nach einem LPS-induzierten Reifungsschritt durch programmierten Zelltod sterben (30). 3. Einleitung 24 Der genaue Zeitpunkt des Todes kann aber moduliert werden. So fand man, dass die Apoptose von DC, mit deren Hilfe spezifische T-Zellen stimuliert werden konnten, verzögert oder sogar aufgehoben wurde. Das dafür verantwortliche Überlebenssignal fand man in der zweiten Funktion der schon erwähnten CD40/CD40L Interaktion zwischen CD4+ T-Zellen und DC . Inzwischen wurden mit LPS, TRANCE (TNF-related activation induced (10, 103, 112) Cytokine) und TNF- weitere Liganden beschrieben, deren Signale die Apoptose der DC inhibieren. IL10 hingegen acceleriert sie (4, 71, 127). Diese Modulation des Todeszeitpunktes hat eine physiologische Relevanz in Bezug auf die Stärke einer generierten Immunantwort. So ist es nicht verwunderlich, dass gerade jene Faktoren, die als Alarmsignale und Zeichen der Invasion gelten, für die DC ein längeres Überleben erwirken, und es ihnen ermöglichen, mehr T-Lymphozyten zu stimulieren und eine effizientere Immunantwort zu generieren. Über die Reifungsstärke durch Aktivierung von Organismengruppenantigenen und inflammatorischen Proteinen werden DC somit zu Entscheidungsträgern über die Wichtigkeit der von ihnen gezeigten Antigene und präsentieren sie in der Konsequenz daraus über eine ihrer Bedeutung angepassten Zeitspanne. Naive CD8+ T-Zellen wandeln sich nach einer Stimulation durch APC zu Zytotoxischen TZellen um. Sie generieren Effektorfunktionen mit der Fähigkeit zur Lyse von Zellen und erlangen durch Veränderung ihrer Oberflächenmoleküle die Fähigkeit die Blutgefäße nicht mehr nur ausschließlich in lymphatischen Organen, sondern auch in peripheren Geweben und vor allem in Gebieten mit inflammatorischen Veränderungen zu verlassen. Dort tasten sie zellständige MHC-Klasse I Moleküle nach dem zu ihrem TCR passenden spezifischen Antigen ab, demselben Antigen, nach dessen Erkennung auf DC sie stimuliert wurden. Ihr Ziel ist die Lyse veränderter Zellen. Wir stellten uns die Frage, ob DC unter der von ihnen selbst generierten Immunantwort durch die aktivierten, spezifischen T-Zellen zugrunde gehen. Machen T-Zellen einen Unterschied zwischen den für ihre Aktivierung notwendigen DC und anderen Zellen? Denn würden die erregerpräsentierenden DC schnell durch aktivierte T-Zellen eliminiert, so könnte dies einen schleppenderen Beginn der Immunantwort nach sich ziehen. Werden die DC durch die Präsentation eines von außen aufgenommenen Antigens selbst als infiziert betrachtet und lysiert? Gibt es einen Mechanismus, durch den DC einer Lyse entgehen und der ihnen die Stimulierung weiterer naiver T-Zellen erlaubt? Werden DC schon von der ersten aktivierten CTL eliminiert oder dauert die Umwandlungszeit von einer naiven T-Zelle zu einer Effektorzelle mit der Ausbildung der Effektorfunktionen solange, dass die CTL schon längst die Lymphknoten verlassen haben bevor sie den DC gefährlich werden könnten? 3. Einleitung 25 3.7.1 Das LCMV Modell Die Durchführung der Experimente sollte mit Hilfe eines Tumormodells vonstatten gehen, dessen Modellantigen aus dem Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) stammt. LCMV ist ein behülltes einzelsträngiges RNA-Virus aus der Familie der Arenaviren. Es besteht aus einer Membran, dem Nukleoprotein, dem L- und Z-Protein. Auf der Oberfläche besitzt es spikes (28) , die durch die Glykoproteine GP1 (54kD) und GP2 (35kD) gebildet werden. Die Replikation des Virus findet hauptsächlich in Makrophagen und DC statt, aber auch Fibroblasten und Epithelien werden infiziert. Die natürlichen Wirtstiere des primär nicht humanpathogenen Virus sind Nagetiere. Dennoch kann eine Infektion beim Menschen zu grippeähnlichen Symptomen führen. Infiziert man Mäuse mit LCMV, dann besteht die spezifische Immunreaktion aus einer am 8. Tag das Maximum erreichenden CD8+ zytotoxischen T-Zell Antwort. Die spezifischen CD8+ CTL lysieren die virusinfizierten Zielzellen vorwiegend über den Perforin/Granzym- Effektormechanismus. Bei Mäusen vom H-2b MHC-Typ richtet sich die Antwort gegen das Glykoprotein 33 (AS 33-41) (60, 96) sowie gegen das Peptid NP396 (AS 396-408) (113). Im Vergleich zu CD8+ T-Zellen spielen CD4+ TZellen und Antikörper in der akuten Phase der LCMV Infektion eine nur untergeordnete Rolle. Das 9 Aminosäuren lange Peptid GP33 diente in unseren Versuchen als Modellantigen. Wurde es in löslicher Form mit DC und anderen Zellen inkubiert, präsentierten die Zellen es über die MHC-Klasse I Moleküle auf ihrer Oberfläche. Das Glykoprotein GP33 wurde in einem Konstrukt in die DNA der TumorZellinie B16.F10 eingebaut. Unter der Regulation des humanen -Aktin Promotors produzierten die Zellen GP33, welches an MHC-Klasse I Molekülen auf der Oberfläche der Zellen exprimiert wird. Als weitere Komponente diente neben dem Virus, dem Viruspeptid GP33 und der mit GP33 transfizierten Tumorlinie eine TCR-tg Mauslinie, bei der die Hälfte aller CD8+ T-Zellen einen spezifischen TCR für die Erkennung des GP33 Viruspeptids haben. 3.7.2 Fragestellung Mit Hilfe dieser Werkzeuge galt es herauszufinden, ob DC für eine T-Zell vermittelte Lyse sensibel sind. Es sollten die dabei verwendeten Effektormechanismen untersucht und der durch die Lyse von DC sich ergebende Einfluss auf Immunisierungsprotokolle mit repetitiven DC-Gaben bei der DC vermittelten Tumorbekämpfung ergründet werden. 4. Materialien und Methoden 26 4. Materialien und Methoden 4.1 Mäuse Die in den Experimenten verwendeten Mäuse wurden in den Stallungen des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene sowie des Neurozentrums in Freiburg gehalten. Die Mäuse der Linie C57BL/6 (B6) stammten aus den Haltungen der Firmen Charles River und Harlan. Für die Untersuchung der Lysemechanismen Dendritischer Zellen wurden Mäuse folgender hauseigener Zuchten verwandt: -P14 T-Zell-Rezeptor transgene (TCR-tg) Linie 318 (H-2b) Bei Mäusen dieser Linie exprimieren 40-60% der T-Lymphozyten den transgenen TZellrezeptor (TCR) des Klons P14 V2/V 8.1, der eine Spezifität für die Aminosäuren 33-41 des LCMV Glykoproteins 1 in Verbindung mit dem MHC-Klasse I-Molekül H-2Db besitzt (63, 95) -TCR-tg Thy1.1 Die Mauslinie B6.PL-Thy-1a erhielt unser Labor von Dr. H. Mossmann (Max-Plank-Institut für Immunbiologie, Freiburg). Um TCR-tg Thy1.1 Mäuse zu generieren, wurden P14 TCR 318 Mäuse auf die Linie B6.PL-Thy1a zurückgekreuzt. -TCR-tg lpr/lpr Die Mäuse TCR tg lpr/lpr entstanden aus einer Kreuzung zwischen den Linien P14 TCR 318 und C57BL/6-lpr/lpr. Die Linie C57BL/6-lpr/lpr weist eine durch Spontanmutation entstandene Defizienz des auf der Zellmembran situierten Oberflächenmoleküls CD95 auf. Ursprünglich stammen diese Tiere von der Firma BRL (Füllungsdorf, Schweiz) -TCR-tg.gld Aus Kreuzung zwischen den Mauslinien P14 TCR 318 und B6.gld (Charles River) entstand die Linie TCR-tg.gld. Sie zeichnet sich durch das Fehlen des Membranmoleküls Fas-Ligand (CD95L) aus, dem Gegenstück des Fas Rezeptors. 4.2 Produktion von GM-CSF- Überstand Die mit mGM-CSF cDNA transfizierten Myelomzellen der Linie Ag8653 (39) wurden in Abständen in Kultur genommen, um aus ihrem Überstand das für die Entwicklung von DC aus Stammzellen benötigte GM-CSF zu gewinnen. Die GM-CSF produzierenden Zellen werden im Gefriermedium (20% FKS, 10% DMSO) in 4. Materialien und Methoden 27 flüssigem Stickstoff bei -196°C aufbewahrt. Ein Kryoröhrchen wird aufgetaut, in einem Volumen von 15 ml GM-CSF Medium (bestehend aus DMEM, 10% FKS, 1% P/S, 1% Glutamin, 1% nicht essentiellen Aminosäuren und 1% Na-Pyruvat) aufgenommen und vermischt. Das Ziel ist das Entfernen des Dimethylsulfoxides (DMSO), einer Flüssigkeit, die zelltoxisch wirkt, beim Einfrieren aber die Kristallisation verhindert und damit 50% der Zellen das Überleben sichert. Die verdünnte Zellsuspension wird zentrifugiert, der Überstand verworfen und durch 15 ml frisches GM-CSF Medium ersetzt. Das Pellet wird resuspendiert und mit 1mg/ml G418 versetzt, um ein selektives Wachstum der Zellen zu gewährleisten (Wirkstoff Neomycin, Life Technologies). In kleinen Kulturflaschen (Corning Incorporated, costar, 75cm2) expandieren die Zellen 4 Tage lang im Feuchtinkubator (bei 37°C, 5% CO2 Gehalt in der Luft – Konditionen, die auch denen im Säugetierorganismus entsprechen) bis sie so dicht gewachsen sind, dass sie ausverdünnt werden müssen. Durch Schlagen mit der flachen Hand auf den Boden der Zellkulturflasche werden die dort zum Teil leicht adhärenten Zellen abgelöst, bevor 4ml der Zelllösung zusammen mit 16ml frischem GM-CSF Medium mit 1mg/ml G418 in eine neue Flasche umgesetzt werden. Die zuletzt beschriebene Prozedur wird alle 3-4 Tage wiederholt. Zur Produktion des GM-CSF Überstandes setzt man am Tage des Ausverdünnens je 4ml der Zelllösung mit 26ml GM-CSF Medium ohne G418 in eine große Kulturflasche (Corning Incorporatad, costar, 162 cm2) um. Nach ca. 6 Tagen, wenn 30-50% der Zellen abgestorben sind, entnimmt man den Überstand, zentrifugiert ihn zuerst 20 Minuten bei 2000 Umdrehungen, dann 20 Minuten bei 4000 Umdrehungen und entfernt jeweils die im Pellet befindlichen Zellen. Der Überstand wird steril filtriert (Schleicher & Schuell, EinmalFilterhalter FP 030/2) und bei -40°C eingefroren. Für das Wachstum Dendritischer Zellen in Zellkulturen wurde dem DC-Medium 10% dieses Überstandes beigegeben. Bei einer einmaligen Messung der GM-CSF Aktivität im durch unsere Methode produzierten Überstand ergab sich die 10-fache Aktivität des häufig in der Literatur zur Zucht von DC empfohlenen Wertes von 200U/ml. 4.3 Kultivierung von DC aus Knochenmarksvorläuferzellen Die Mäuse werden betäubt und getötet, ihre Ober- und Unterschenkel von Fell und Muskeln befreit und vom Körper abgetrennt. Unter sterilen Bedingungen werden die Knochen an ihren oberen und unteren Enden eröffnet und das Knochenmark unter Zuhilfenahme einer mit DCMedium (RPMI, 10% FKS, 50µM 2-Mercaptoethanol, 1% Glutamin, 1% P/S, 10% des Überstandes GM-CSF produzierender Zellen) gefüllten Spritze und einer feinen Kanüle 4. Materialien und Methoden 28 herausgespritzt. Das wurmähnliche Knochenmark wird resuspendiert und die Zellzahl bestimmt. 5×106 Knochenmarkszellen werden in 10ml DC-Medium auf eine Petrischale bakterieller Qualität (Falcon, Becton Dickinson) ausplattiert. Nach 3 Tagen werden den Zellen 10ml DC-Nährmedium hinzugegeben. Am 6. Tag entnimmt man jeder Zuchtplatte die Hälfte des Mediums, zentrifugiert die darin befindlichen Zellen herunter und ersetzt die im Überstand befindliche Flüssigkeit durch frisches Medium. Die Zellen werden resuspendiert der Platte wieder hinzugegeben. Am 8. Tage der Zellkultur werden die DC aufgeschwemmt, durch Abnahme des Überstandes geerntet, gewaschen und entweder eingefroren oder in den Versuchen verwendet. Ist für die weitere Nutzung der DC eine Population verstärkter Reife erwünscht, so können sie unter Erneuerung des Mediums bis zum Tag 14 in Zellkultur gehalten werden oder 12 Stunden vor weiterer Verwendung mit 10µg/ml LPS versetzt werden. 4.4 Antigenbeladung von DC und deren Transfer in Mäuse Am 8. Tage der DC-Kultur wird 10-4 molares GP33-Peptid (Endkonzentration 5x10-5) auf die Kulturplatten gegeben. Das GP33-Peptid ist ein CTL-Epitop, das von TCR-tg T-Zellen erkannt wird. Nach fünfstündiger Inkubation werden die Zellen geerntet, dreimal mit FKSfreiem Medium gewaschen und auf 1x107 Zellen/ml eingestellt. 300µl dieser Zellösung werden den Mäusen in eine Schwanzvene injiziert, nachdem sie kurzzeitig unter Rotlicht erwärmt wurden. 4.5 Aufreinigung der Zellen mit Hilfe von Metrizamid Erntet man die DC am 8. Tag ihrer Kulturperiode, so machen sie einen Anteil von 40-60% aller auf den Platten befindlichen Zellen aus. Für die in vitro Versuche strebten wir aber eine Reinheit von mehr als 85% an. Aus disem Grund reinigten wir die Kulturen mit Hilfe von Metrizamid auf. Metrizamid liegt in Form eines Pulvers vor, welches in RPMI- Medium gelöst (6,5g Metrizamid auf 45 ml RPMI) und steril filtriert wird. Die DC bereitet man vor, indem man die zu trennende Zellsuspension (ca. 20ml einer DC-Kulturplatte) in ein 50ml Probenröhrchen (Falcon) gibt und mit PBS (8g NaCl, 0,2g KCl, 1,44g Na2HPO4, 0,24gKH2 PO4 ad 1000ml H2O ph7,4) auf 40ml auffüllt. Die Lösung wird auf fünf 15ml Plastikröhrchen (Falcon) verteilt und mit je 2 ml Metrizamid-Lösung unterlegt. Es entstehen zwei Phasen, die durch die unterschiedlichen Dichtewerte der beiden Flüssigkeiten aufrechterhalten wird, mit 4. Materialien und Methoden 29 einer dazwischenliegenden scharfen Trennlinie. Ohne diese beiden Phasen zu vermischen, zentrifugiert man die Röhrchen 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 600g und lässt die Zentrifuge ohne Bremse auslaufen. Die DC Population bleibt nach der Zentrifugation zwischen den beiden Phasen erhalten, wird aus dieser Interphase herauspipettiert und dreimal mit PBS gewaschen. 4.6 Einfrieren von Zellen Um Zellen in einem bestimmten Stadium zu bewahren, kann man sie einfrieren. Gelagert werden sie entweder bei -80°C im Tiefkühlschrank oder bei -196°C in flüssigem Stickstoff. Die Zellen werden zentrifugiert. Das Pellet wird in dem für die jeweiligen Zellen eigenen Medium mit 20% FKS und 10% DMSO (Dimethylsulfoxide) aufgelöst und zellschonend in einer mit Isopropanol gefüllten Kühlbox eingefroren, was ein langsames Abkühlen der Zellen ohne Kristallbildung erlaubt. Das Medium wird vorgekühlt verwendet, da DMSO bei Raumtemperatur zelltoxisch wirkt. 4.7 Herstellen einer Einzelzellsuspension Der Maus wird die Milz entnommen und in 5 ml Medium (IMDM mit 10% FKS, 1% P/S und 1% Glutamin) unter sterilen Bedingungen durch ein in einer Petrischale liegendes, grobes Metallsieb gedrückt. Die aus dem Stroma herausgelösten Zellen werden in dem Medium aufgesammelt. Das Sieb spült man ein weiteres Mal mit 5 ml Medium aus und transferiert die Zellen in ein 15 ml Plastikröhrchen (Falcon). Nach Zentrifugation der Zellen wird der Überstand verworfen und das Pellet in frischen Medium resuspendiert. Die groben Bestandteile lässt man 3 Minuten lang absetzen und überführt die im Überstand enthaltenen Zellen in ein neues Röhrchen. Sie werden gezählt und auf die gewünschte Konzentration eingestellt. 4.8 Ermittlung der Zellzahl einer Einzelzellsuspension Ein Lichtmikroskop und eine Neubauer-Zählkammer sind die Arbeitsmaterialien zur Bestimmung der Zellkonzentration einer Lösung. 20µl Zellsuspension werden mit einer geeigneten Menge (zwischen 20-180 µl) 2%iger Trypanblaulösung (Merk, Darmstadt) verdünnt und in die Zählkammer gegeben. Tote Zellen reichern die bläuliche Lösung in ihrem Zellinneren an, so dass man die Anzahl der farblosen, lebenden Zellen von ihnen gut abgrenzen und in dem auf der Kammer eingravierten Rahmen auszählen kann. Die Zellzahl 4. Materialien und Methoden 30 errechnet sich aus dem mit der Trypanblauverdünnung entstandenen Faktor und dem durch das Volumen der Kammer vorgegebenen „Zählkammerfaktor“. Gezählte Zellen (16 große Quadrate) x Verdünnungsfaktor x 104 (Zählkammerfaktor) entspricht der Zellzahl pro ml. 4.9 Adoptiver Zelltransfer Die Spendermaus der zu transferierenden Zellen wird betäubt und getötet. Die Milz wird entnommen und eine FKS freie Einzelzellsuspension hergestellt. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wird der Anteil TCR-tg Zellen in der Lösung bestimmt (T-ZellRezeptor Färbung- siehe Kapitel Immunfluoreszenz und Durchflusszyotmetrie) und diese mit FKS-freiem Medium auf eine Konzentration von 1,5x106 TCR-tg Zellen/ml verdünnt. Anschließend injiziert man 300µl der Zellsuspension (IMDM, 1% Glutamin, 1% P/S) in die laterale Schwanzvene der Empfängermäuse. 4.10 Entnahme von peripheren Blut Um in den Transferversuchen eine Aussage über den prozentualen Anteil der übertragenen transgenen Zellen in den Empfängermäusen machen zu können, wird den Tieren Blut entnommen und unter Verwendung der Durchflusszytometrie analysiert. Die Mäuse werden zur Erweiterung ihrer Blutgefäße kurzzeitig unter Rotlicht gesetzt. Mit einer Rasierklinge ritzt man eine laterale Schwanzvene an und nimmt 3-5 Tropfen Blut in 4ml Blutpuffer (PBS ohne Ca2+ und Mg2+, 0,1 %NaN3, 2% FCS, 10U/ml Liquemin (Roche)) auf. Das in der Lösung enthaltene Liquemin verhindert die Agglutination der Erythrozyten. Die Probe wird zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Wie im folgenden Abschnitt beschrieben, wird die Probe mit Antikörpern angefärbt und analysiert. 4.11 Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie Mit der extrazellulären Immunfluoreszenz hat man die Möglichkeit, auf der Zelloberfläche gelegene Strukturen über eine Antigen-Antikörper-Bindung spezifisch zu markieren und mittels der Durchflusszytometrie sichtbar zu machen. Den Antikörpern ist an ihrem nichtbindenen Fc-Ende ein fluoreszierender Farbstoff kovalent angelagert, der von dem Durchflusszytometer nachgewiesen wird. Da verschiedene Zelltypen unterschiedliche Funktionseinheiten in ihrer Zellmembran exprimieren, kann man anhand charakteristischer Strukturen Zelltypen erkennen, voneinander unterscheiden und ihr Verhältnis in einer Lösung 4. Materialien und Methoden 31 bestimmen. Mit Hilfe des Durchflusszytometer vermag man die Zellen nach Größe, Granularität und Quantität der gebundenen Antikörper zu unterscheiden und die Summe der Messungen an einem angeschlossenen Rechner in Form eines Graphen darzustellen. Dazu werden die Zellen mit hoher Geschwindigkeit durch eine Kapillare gesaugt und einzeln durch Laserstrahlen verschiedener Frequenzen geführt, aus deren Ablenkung und Sekundärfluoreszenzen das Gerät seine Informationen gewinnt. 106 Zellen werden in ein 5ml Reagenzglas überführt und zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes gibt man 100µl einer Antikörperlösung, bestehend aus Zellpuffer (PBS ohne Ca2+ und Mg2+, 0,1% NaN3, 2% FCS) und einer zuvor austitrierten Menge Antikörper, auf das Pellet. Die Suspension wird mit einem Vortex gut durchmischt und für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Im Anschluss flutet man zur Entfernung der nicht gebundenen Antikörper das Röhrchen mit Zell-Puffer, schüttelt die Lösung und zentrifugiert sie 5 Minuten mit 1100rpm. Der Überstand wird bis auf ein Restvolumen von 500µl abgesaugt. Handelt es sich bei der Zellprobe um Blut, lysiert man die roten Blutkörperchen durch Veränderung des osmotischen Drucks der Umgebungsflüssigkeit. Eine Lösung 1:10 verdünnt in ddH2O aus 9 Einheiten destilliertem Wasser und 1 Einheit Lysepuffer (Becton-Dickinson) gibt man für 2 Minuten nach dem Färben und Waschen auf das Pellet . Ein weiterer Waschgang schließt sich vor der Analyse mit dem Durchflusszytometer an. Folgende Antikörperkonstellationen fanden ihre Anwendung: -Färbung für DC: anti-Maus CD11c -PE und anti-Maus I-Ab -FITC -3-fach T-Zell-Rezeptor Färbung: anti-Maus CD8-Cychrome, anti-Maus Vα2-PE und antiMaus Vβ8-FITC -Nachweis transferierter CD8+ T- Lymphozyten: anti-Maus Thy1.1-PE, anti-Maus CD8αFITC Alle Antikörper stammen von PharMingen, Hamburg. 4.11 Aufreinigen von Zellen mit MACS Hinter dem Begriff MACS (Magnetic Cell Sorting) verbirgt sich ein System, bei dem mit Magnetkügelchen behaftete Antikörper an spezifische Oberflächenstrukturen von Zellen binden. Bringt man die so präparierten Zellen in ein Magnetfeld, werden sie darin zurückgehalten, während nicht mit Antikörpern markierte Zellen durchlaufen. Auf diese Weise können Gemische von verschiedenen Zellpopulationen spezifisch aufgetrennt und Zellen mit gleichen spezifischen Oberflächenstrukturen angereichert werden. 4. Materialien und Methoden 32 Die Zellen werden gewaschen, zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Das Pellet wird für 15 Minuten bei 4°C mit 100µl einer Lösung inkubiert, die einer Mischung von Zellmedium und spezifischen gegen CD8 gerichteten Microbeads -10µl pro 10 Millionen Zellen-(Miltenyi Biotech) besteht. Die Antikörper werden durch Waschen aus dem Überstand entfernt und die Zellen in 1ml PBS mit 3% FKS aufgenommen. Eine Positivselektions-Säule (MiniMACS, Miltenyi) wird in einer entsprechenden Apparatur (OctoMACS, Miltenyi) einem Magnetfeld ausgesetzt und mit 500µl PBS vorgewaschen. Die mit den Dynabeads bestückten Zellen werden auf die Säule gegeben und die durchlaufende Zelllösung wird in einem Proberöhrchen als Negativdurchlauf aufgefangen. Nach zweimaligem Spülen mit PBS (3%FKS) entnimmt man die Säule aus dem Magnetfeld und die darin zurückgehaltenen Zellen können herausgespült werden. Die Zellen werden gewaschen, in ihrem Zellmedium aufgenommen und gezählt. Damit stehen sie zur weiteren Verwendung bereit. 4.12 Chromfreisetzungstest Mit einem Chromfreisetzungstest möchte man mit den verschiedensten experimentellen Fragestellungen feststellen, ob eine Zellpopulation ( Effektorzellen) befähigt ist eine andere Zellart (Zielzellen) zu lysieren. Dahinter verbirgt sich die Fähigkeit von Zellen, Ionen aus ihrer Umgebung aufzunehmen. Versetzt man ihr Medium mit einem radioaktiven Ion (in unserem Ansatz radioaktives Chrom), nehmen die Zielzellen dieses auf. Entfernt man die radioaktiven Teilchen wieder aus dem Medium, so befinden sich nur noch einzelne Ionen in den Zellen selbst. Lysiert man sie nun, wird pro Zelle eine geringe Menge Radioaktivität in den Zellüberstand abgegeben, die man im Verhältnis zu einer nicht lysierten und einer vollständig lysierten Kontrolle quantifizieren kann. Als Effektorzellen dienten in unserem Fall aktivierte CD8+ T-Zellen, die spezifisch für das GP33 Peptid des Glykoprotein vom LCMV sind. Als Zielzellen wurden die EL-4 Zellinie und DC verwandt, die jeweils nach einer 2 stündigen Inkubationszeit mit radioaktivem Chrom und dem GP33-Peptid dieses über die MHC-Klasse I Komplexe auf ihrer Oberfläche präsentierten. 4.12.1 Generierung von Effektorzellen In vivo werden für GP33 spezifische T-Lymphozyten durch Injektion des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) in die laterale Schwanzvene von B6 Mäusen stimuliert. 4. Materialien und Methoden 33 Dabei werden jeweils 200pfu (plaque forming units) des Stammes LCMV-WE (R.Zinkernagel, Zürich) in einem Volumen von 200ml DMEM mit 2% FKS gespritzt. Nach 8 Tagen erreichen sowohl die Zahl als auch die Aktivität der spezifischen Effektorzellen in der Milz und im peripheren Blut ihr Maximum. Zu diesem Zeitpunkt werden die Mäuse getötet, die Milzen entnommen und eine Einzelzellsuspension hergestellt. Die Zellen werden gewaschen und auf eine Konzentration von 1x107 Zellen pro ml eingestellt. Für eine in vitro Stimulation entnimmt man die Milz einer naiven TCR-tg Maus, stellt eine Einzelzellsuspension her, plattiert je 5x106 Zellen in einem Milliliter Medium (IMDM, 10% FKS, 1% P/S, 1% Glutamin) auf einer 24-Loch Platte aus und addiert jeweils 100µl 10-6 molare GP33 Peptidlösung. Die Zellen werden 2 bis 3 Tage im Feuchtinkubator bei 37°C aufbewahrt, durch Resuspension geerntet und auf eine Endkonzentration von 1x107 Zellen pro ml verdünnt. 4.12.2 Präparation der Zielzellen Als Zielzellen dienen DC und die Zellinie EL4. Die Zellinie EL4 wächst nichtadhärierend in Zellkulturflaschen (Corning Incorporated, costar, 75cm2) mit IMDM Medium (10% FKS, 1% P/S, 1% Glutamin) bei 37°C und 5% CO2 im Feuchtinkubator. Nach 3 bis 4 Tagen sind die Zellen so dicht gewachsen, dass 500µl der Lösung in 20ml frischem Medium aufgenommen und in eine neue Flasche überführt werden. Die restlichen Zellen können im Zytotoxizitätstest verwendet oder verworfen werden. Die Zielzellen werden in einem 15ml Plastikröhrchen (Falcon) auf 5x106 Zellen eingestellt und zentrifugiert. Den Überstand verwirft man und fügt zu dem Pellet 250µl 10-6 molares GP33 Peptid und 300µl Zellmedium hinzu. Um die Spezifität einer Lyse für GP33 zu garantieren, wird bei jedem Experiment in einem Kontrollansatz anstelle des Antigens vom LCMV 250µl 10-6 molares E1A234-243 Peptid vom Adenovirus zu den Zellen gegeben. Da die aktivierten Effektorzellen spezifisch für das Antigen GP33 sind, sollten die mit Adenopeptid beladenen Zellen nicht zerstört werden. Damit bilden diese ein Maß für die unspezifische Lyse. Für 2 Stunden inkubiert man die Zellsuspensionen mit je 100µl 51 Cr-Lösung (250µCi Na251CrO4 in IMDM mit 10% FKS) schüttelnd in einem Inkubator bei 37°C. Danach wäscht man sie dreimal mit RPMI Medium, um jegliches Protein und Chrom aus dem Überstand zu entfernen, und stellt sie auf eine Konzentration von 1x105 Zellen pro ml ein. 4. Materialien und Methoden 34 4.12.3 Ausplattierung der Zellen Die Effektorzellen werden in einer 96-Loch-Rundbodenplatte über 6 Stufen (1:1, 1:3, 1:9, 1:27, 1:81, 1:243) in einem Volumen von 100µl, ausgehend von einer Anfangskonzentration von 1x107 Zellen pro ml, ausverdünnt. 100µl der Zielzellen (Konzentration 1x105 Zellen/ml) werden pro Loch hinzugegeben. Bei der maximalen Lysekontrolle wird anstelle der Effektorzellen 100µl 2N HCL (Merck) addiert, bei der spontanen Freisetzungskontrolle 100µl Medium (IMDM mit 10% FKS). Die vorbereitete 96-Loch-Platte wird 3 min zentrifugiert und je nach Ansatz für 3, 5 oder 15 Stunden in einem Feuchtinkubator belassen. Nach dieser Zeit werden 70µl des zellfreien Überstandes abpippetiert und die durch die Lyse von Zielzellen in den Überstand freigesetzte Radioaktivität im -Counter (Cobra, Packhard) ermittelt. Die Berechnung der spezifischen Lyse erfolgt nach der Geichung: Spezifische Lyse= (cpm E - cpm S) x100 cpm T - cpm S cpm E= Ereignisse pro Minute mit Effektorzellen; cpm S= radioaktive Spontanfreisetzung ohne Effektorzellen; cpm T= radioaktive Totalfreisetzung 4.13 Bestimmung der Proliferation durch Inkorporation von 3H- Thymidin Auf die Zellkulturplatte wird nach achttägigem Wachstum der DC GP33-Peptid (Endkonzentration 5x10-5molar) gegeben. Nach 5-stündiger Inkubation wäscht man die Zellösung dreimal, um letzte eventuell vorhandene ungebundene Reste des Peptides aus dem Überstand zu entfernen. 100µl der so zur Stimulation vorbereiteten DC werden in mit Dreierschritten absteigenden Zellzahlen von der Ausgangskonzentration 1x106 Zellen/ml in einer 96-Lochplatte austitriert. Zusätzlich fügt man jedem Loch 5x105 Zellen in 100µl einer naiven Milzzellsuspension einer 318 TCR-tg Maus hinzu. Die Negativkontrolle nimmt ausschließlich die Milzzellen in 200µl Medium auf. In der Positivkontrolle werden die Milzzellen anstelle von beladenen DC mit 100µl 10-6 molarem GP33 Peptid stimuliert. In einer dritten Kontrolle werden anstelle der Milzzellen 100µl Medium zu den austitrierten DC hinzugegeben, um die Eigenproliferation der Zellen zu messen. Nach 2 Tagen wird den Zellen in 50µl Medium aufgelöstes radioaktives Thymidin ([MethylH] Thymidin, 37mBq, Amersham Pharmacia Biotech) beigegeben (Endkonzentration 3 0,296mBq), dass für 8 Stunden auf der Stimulation belassen wird. Danach misst man die in 4. Materialien und Methoden 35 der DNA integrierte Radioaktivität in einem β-Zähler. 4.14 Kultivierung der Zellinie B16.F10GP33 Die mit GP33-transfizierte murine B16.F10GP33 Melanomzellinie wird in Zellkulturflaschen (Corning Incorporated, costar, 75cm2) im Feuchtinkubator bei 37°C und 5% CO2 gehalten. Sobald nach einer Wachstumsperiode von ca. 3-4 Tagen ein konfluenter Zellrasen vorliegt, werden die Zellen ausverdünnt. Ihr Medium wird dazu abgesaugt. Man gibt 2,5ml 2x Trypsin-EDTA Lösung (Life Technology) zu der Kultur, die in Kombination mit leichtem Schlagen auf den Flaschenboden die adhärenten Zellen ablöst. Die trypsinierte Zellsuspension wird mit 2,5ml DMEM verdünnt. 500µl dieser Lösung werden zusammen mit 15ml frischem Kulturmedium (DMEM, 10% hitzeinaktiviertes FKS (Life Technology, Wiesbaden), 100U/ml P/S (ICN Biochemicals), 2mM L-Gln (Life Technology)) und einem Zusatz von 1mg/ml G418 in eine neue Kulturflasche überführt, während die verbleibenden Zellen in einem Experiment verwendet oder verworfen werden. 4.14 Subkutane Injektion von Tumoren in Mäuse Die Tumorzellen werden wie im vorherigen Kapitel beschrieben mit Trypsin-EDTA Lösung geerntet, mit PBS gewaschen und auf eine Zellzahl von 107 Zellen /ml PBS eingestellt. Den betäubten Mäusen werden 100µl der Zellsuspension subkutan in die rechte hintere Flanke injiziert, nachdem die entsprechende Stelle rasiert wurde. 5. Ergebnisse 36 5. Ergebnisse 5.1 Gewinnung von Dendritischen Zellen mit verschiedenen Methoden Zuerst galt es eine Züchtungsmethode für DC im Labor zu etablieren. Zur Wahl standen drei verschiedene Protokolle. Eines basierte auf der Extraktion der DC aus den Milzen von Mäusen, denen 6 Tage vor der Entnahme Oligopeptide in den Bauchraum gespritzt wurden, um die Zahl zu erntender DC in der Milz zu erhöhen. Die beiden anderen Methoden fußten auf der Gewinnung von DC aus dem Knochenmark der langen Röhrenknochen von Mäuse. Der primären Extraktion der Vorläuferzellen aus Milz und Knochenmark schloss sich in allen Ansätzen eine in vitro Kultivierungsperiode unter Stimulierung der Zellen mit GM-CSF an. Die einflussreichsten Faktoren, die Auswirkungen auf das Wachstum der Zellen hatten und in den Protokollen variiert wurden, waren: – die Zellzahl der Vorläuferzellen, die am Tage Null ausgesät wurde und in den Größenordungen zwischen 2 Millionen und 15 Millionen pro Schale lagen, – das Material der Petrischalen, das bei Zellzuchtqualität die DC anheften ließ und bei bakterieller Qualität dies verhinderte, – die Art und Menge an Zelldifferenzierungshormonen (GM-CSF und IL4), die den Kulturen beigegeben wurden, – die Durchführung eines Plattenwechsels innerhalb der Zuchtperiode (mit alleiniger Abnahme der Zellen aus dem Überstand, was zusätzlich einem Reinigungsschritt von unerwünschten Zellen gleichkam), – der Zeitpunkt der Erneuerung des Mediums und der Wachstumshormone, – der Zeitpunkt der Zellernte, der zwischen dem 6. und dem 12. Tag der Zellkultur lag. Die Methoden der DC-Gewinnung aus dem Knochenmark erwiesen sich als weniger störanfällig, weshalb sie im weiteren Vorgehen ausschließlich verwendet wurden. In Anlehnung an das Protokoll von Lutz (74) wurden nach dem Herauslösen des roten Knochenmarks aus den langen Röhrenknochen der Beine die Vorläuferzellen resuspendiert und 5x106 Zellen in 10ml DC-Medium mit GM-CSF in Petrischalen bakterieller Qualität ausplattiert. Während der gesamten Wachstumsperiode verblieben die Zellen bei 37°C im Brutschrank. Am 3. Tag wurden weitere 10ml DC-Medium hinzugegeben, die am 6. Tage wieder abgenommen und durch frisches Medium ersetzt wurden. Der 8. Tag war in der Regel 5. Ergebnisse 37 der Erntezeitpunkt, an dem die DC für die Experimente verwendet oder weggefroren wurden. Die Figur 1 zeigt eine an diesem Tag geerntete Zellkultur. Bei den CD11c positiven Zellen konnten im Graphen zwei Populationen voneinander unterscheiden werden: eine MHCKlasse II reiche und eine arme. Ließ man die DC jenseits des 8. Tages weiter in der Zellkultur gedeihen, so erhöhte sich ihre Reinheit von ursprünglich 40-50 Prozent auf über 65 Prozent an der Gesamtzellzahl, und sie wandelten ihren Phänotyp zunehmend zu reifen DC. Dieser Schritt äußerte sich unter anderem in einer Heraufregulation von MHC-Klasse II Molekülen auf der Zelloberfläche. Diesen physiologisch auftretenden Reifeprozess konnte man auch ohne längere Kultivierungszeiten durch Zugabe von 10µg/ml LPS (Lipopolysacchariden) oder anti-CD40Antikörper 12-24 Stunden vor der Ernte der Zellen provozieren. 17,03 CD11c 37,74 40,26 4,97 MHC-Klasse II Die Figur 1 zeigt eine am 8.Tag geerntete DC Zellkultur, die mit Antikörpern gegen CD11c und MHC-Klasse II gefärbt und im Durchflusszytometer dargestellt wurde. 5.2 Aufbereitung von DC Für in vivo Versuche erwiesen sich 8 Tage in Kultur gehaltene DC als gute Stimulatoren und wurden in den weiteren Versuchen ohne Reifungsschritt als solche verwendet. Lediglich in den Chromfreisetzungstesten, bei denen eine hohe Reinheit eine Rolle spielte, ließen wir die DC länger in Kultur, bevor sie mit einem Metrizamiddichtegradienten noch weiter 5. Ergebnisse 38 aufgereinigt wurden. Die Figur 2 zeigt einen solchen Aufreinigungsprozess. Die geerntete Kultur wurde in einer Mischung aus PBS und Medium aufgenommen, in ein Proberöhrchen transferiert und mit einer 14,5% Metrizamidlösung unterlegt. Es entstand ein Dichtegradient, über den die Zellkultur 20 Minuten zentrifugiert wurden. DC wurden am Gradienten zurückgehalten, während ein Großteil der anderen Zellen durch die Metrizamidphase hindurch bis zum Boden des Röhrchens zentrifugiert wurden. Aus der Interphase pipettierte man die Zellen heraus, wusch sie und verwendete sie in den Experimenten. Mit Hilfe von Metrizamid konnte die Anzahl von DC in den Kulturen auf 85%-95% der Gesamtzellzahl CD11c gehoben werden. 18,87 35,12 17,37 40,86 5,16 6,76 74,59 1,27 MHC-Klasse II Figur 2. Dargestellt ist der Aufreinigungsprozess einer DC Kultur mit Hilfe eines Metrizamidgradienten. Gefärbt wurden die Zellen in beiden Graphen mit Antikörpern gegen MHCKlasse-II und CD11c. Das linke Bild zeigt die Ausgangssituation einer frisch geernteten Kultur. Das rechte Bild stellt das Ergebnis nach der Aufbereitung durch Metrizamid dar. In diesem Falle reicherte die Prozedur CD11c+ Zellen von 54 auf 92 Prozent an der Gesamtzellzahl an . 5.3 Funktionsprüfung der generierten DC Weil die Züchtungsmethode für DC in unserem Labor neu etabliert worden war, sollte mit den folgenden Experimenten die Arbeitsweise der gezüchteten DC kennengelernt, ausgetestet und ihre korrekte Funktionalität überprüft werden. 5. Ergebnisse 39 5.3.1 Tumorprotektion. Zu den Aufgaben Dendritischer Zellen gehört die Präsentation Tumorassoziierter Antigene und die Initiierung einer Antitumor-Immunantwort. Im ersten Experiment wurde mit Hilfe des B16.GP33 Melanommodells überprüft, ob die Gabe peptidbeladener DC eine Maus vor der Etablierung eines Tumors schützen könnte. DC wurden am 8. Tag Ihrer Kultur zunächst für 5 Stunden mit dem Viruspeptid GP33 inkubiert und anschließend in einer Zellzahl von je 2,5 x106 Zellen intravenös in die Schwanzvenen von 3 Mäusen injiziiert. % tumorbefallene Mäuse 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 Tage nach Tumorinjektion Figur 3. Zwei Gruppen von Mäusen wurden je 106 Zellen des B16.F10GP33 Melanoms subkutan in die hintere Flanke injiziert. Die eine Gruppe hatte zusätzlich 10 Tage vorher 1,5x106 mit GP33-Peptid beladene DC i.v. gespritzt bekommen, die gegen das Melanom immunisieren sollten. Die drei nicht mit DC behandelten Mäuse (Kreise) entwickelten bis zum 9.Tag einen Tumor. In den anderen Mäusen (Rechtecke) formierten sich ab dem 25.Tag Tumorklone, die das GP33-Peptid nicht mehr auf ihrer Oberfläche exprimierten. Sowohl den Mäusen dieser, als auch denen einer unbehandelten Gruppe von 3 Kontrollmäusen wurde nach 10 Tagen jeweils 106 Zellen des B16.F10GP33 Melanoms subkutan in die hintere Flanke injiziert. Die unbehandelten Kontrollmäuse entwickelten nach 8 Tagen einen zunächst fühlbaren und später dominant herauswachsenden Tumor, bis sie bei einem Tumordurchmesser von 1cm getötet wurden (Figur 3). Die erste der behandelten Mäuse entwickelte nach 25 Tagen einen Tumor, die beiden anderen einige Tage später. Ihre Tumore wurden entnommen und in einem Zytotoxizitätstest darauf getestet, ob sie das Epitop GP33 5. Ergebnisse 40 noch auf ihrer Zelloberfläche exprimierten (Daten nicht gezeigt). Bei allen drei Mäusen handelte es sich um eine „escape“- Situation. Der GP33-Peptid tragende Tumor wurde von der aktivierten Immunantwort der Maus eliminiert und ein Tumorklon, der die Expression des GP33-Peptides verloren hatte, konnte unter dem Selektionsdruck der induzierten TZellantwort heranwachsen. Die DC-vermittelte Immunisierung gegen das GP33-Epitop hatte die Mäuse vor dem GP33-Peptid tragenden Tumor geschützt. 5.3.2 Stimulation von TCR-tg Zellen durch GP33-Peptid beladene DC in vitro Die Stimulationsfähigkeit der gezüchteten DC wurde mit TCR-tg T-Zellen in vitro getestet. DC wurden nach achttägigem Wachstum in der Zellkultur für 5 Stunden mit GP33-Peptid beladen. 100µl der so zur Stimulation vorbereiteten DC wurden schließlich in verschiedenen Konzentrationen auf einer 96- Lochplatte ausplattiert und mit je 106 Zellen einer naiven Milzzellsuspension einer 318 TCR-tg Maus vermengt. 3 wells nahmen die Milzzellen ohne Zusätze auf und dienten als Negativkontrolle. In der Positivkontrolle wurden die Milzzellen anstelle von beladenen DC mit GP33 Peptid stimuliert. In einer dritten Kontrolle gab man anstatt der Milzzellen nur weitere 100µl Medium zu den austitrierten DC hinzu, um damit die Eigenproliferation der DC zu messen. 2 Tage wurden die Kulturen im Feuchtinkubator gehalten, in denen die peptidbeladenen DC die für sie spezifischen T-Lymphozyten aktivieren und stimulieren sollten. Nach 48 Stunden wurde den Zellen radioaktiv markiertes Thymidin in 50µl Medium gelöst beigegeben, welches für 8 Stunden auf den Zellkulturen belassen wurde, bevor die Zellen geerntet, gewaschen und die nun in ihrer DNA integrierte Radioaktivität gemessen wurde. Die Figur 4 zeigt das in einem Graphen dargestellte Ergebnis. Zu fast keiner messbaren Proliferation kam es in dem Kontrollansatz, in dem die DC ohne Milzzellen der TCR-tg Maus inkubiert wurden. Ebenso verhielt es sich mit der Negativkontrolle. Die Positivkontrolle, deren in der Milz enthaltene antigenpräsentierende Zellen mit Hilfe des hinzugegebenen GP33 Peptids die Antigenpräsentation und Stimulation übernahmen, zeigte nur eine Zusammenführung der mäßige Proliferation. Demgegenüber erreichte die peptidbeladenen DC mit den naiven Milzzellen hohe Zellproliferationsraten. Der Einbruch der Proliferationskurve bei Konzentration über 3x104 DC lässt sich vermutlich auf die Ansammlung hoher Konzentrationen toxischer Zellmetabolite zurückführen, die in zunehmendem Maße bei ansteigenden Zellkonzentrationen entstehen. Die gezüchteten DC erwiesen sich in diesem Versuch als potente antigenpräsentierende Zellen, die spezifische CD8+ T-Lymphozyten zu starker Proliferation zu stimulieren vermochten. 5. Ergebnisse 41 60000 Cpm 50000 40000 30000 20000 10000 0 105 3x104 104 3x103 103 3x102 102 Anzahl stimulierender DC pro Loch Figur 4. In verschiedenen Konzentrationen austitrierte, mit dem GP33-Peptid beladene DC stimulierten 56h lang in vitro in einem Thymidin-Assay je 106 naive Milzzellen einer TCR-tg Maus (Rechtecke). Die in der Positivkontrolle allein mit GP33-Peptid stimulierten Milzzellen (Kreis) proliferierten nur halb so viel, wie bei der Stimulation durch GP33-Peptid beladene DC. Die Eigenproliferationen der DC (Dreiecke) und der Milzzellen (Karo) waren nur minimal. 5.3.3 Stimulation von TCR-tg Zellen durch GP33-Peptid beladene DC in vivo Im dritten Versuch wurde die Funktionalität der DC in einem adoptiven Transfersystem überprüft, welches Thy1.1 TCR-tg T-Zellen spezifisch für das GP33 Epitop von LCMV benutzt. Thy1.1 ist ein für Lymphozyten spezifisches Oberflächenantigen. Thy1.1 tragende TCR-tg Zellen wurden in B6 Mäuse transferiert, welche auf ihren T-Zellen anstelle des Thy1.1 das strukturell verschiedene Thy1.2 Allel tragen. Beide Moleküle, und damit auch die dazugehörigen Zellen, sind mit Hilfe von Antikörpern voneinander zu unterscheiden, so dass man die übertragenen Thy1.1 T-Zellen in der B6.Thy1.2 Maus nachweisen und etwaige Zellexpansionen der transferierten Zellen spezifisch feststellen kann. Nach dem Zelltransfer transgener T-Zellen waren 0,3-0,5% der im peripherem Blut gefunden CD8+ T-Zellen Thy1.1 positiv, und damit der TCR-transgenen Spendermaus zuzuordnen. 42 % TCR-tg Zellen von CD8 5. Ergebnisse DC: day 0 40 20 0 0 4 8 Tage nach dem Transfer Figur 5. Der Verlauf des Graphen stellt die Expansion TCR-tg Zellen im peripheren Blut nach Transfer von 5x105 Thy1.1 TCR-tg T-Zellen und deren Stimulation durch 1,5x106 transferierte, peptidbeladene DC dar. Dafür wurde den Mäusen an den Tagen 3, 4 und 6 Blut entnommen, mit Antikörpern gegen CD8 und Thy1.1 angefärbt und im Durchflusszytometer analysiert. Stimulierte man die transferierten TCR-tg Zellen durch Injektion mit für sie spezifischen mit GP33-Peptid beladenen DC, konnte nach 4 Tagen (Figur 5) eine maximale Expansion dieser Zellen von 20-30% der Gesamtlymphozytenzahl im peripheren Blut nachgewiesen werden. Das entspricht einer ungefähr 100-fachen klonalen Expansion der transferierten Zellen. Mittels der Durchflusszytometrie wurde bestätigt, dass mehr als 95% der Thy1.1 positiven Zellen in den Empfängermäusen den GP33 spezifischen transgenen T-Zell-Rezeptor aufwiesen (Daten nicht gezeigt). Bis zum Tag 6 verschwanden die TCR-tg Zellen wieder aus dem peripheren Blut und reduzierten ihren Zahlenanteil auf nur 2-5%. In Milz, Leber, Lunge, und Lymphknoten wurden prozentual ähnlich rapide Abnahmen der transferierten Zellen an der Gesamtlymphozytenzahl gemessen (Daten nicht gezeigt). 5.4 Kinetik der TCR-tg T-Zellen nach Stimulation und Restimulation Unter dem Gesichtspunkt, dass eine höhere Anzahl GP33-spezifischer T-Zellen auch bessere Resultate bei der Tumorbekämpfung erzielen könnte, sollte der Einfluss einer mehrmaligen Stimulation mit GP33-Peptid beladener DC auf das Expansionsverhalten transferierter TCRtg T-Zellen untersucht werden. Applizierte man die zweite Injektion der DC vor dem maximalen Erscheinen der TCR-tg TZellen im peripheren Blut, also etwa am Tage 2 oder 3 nach erstmaligem Spritzen, erhöhte 5. Ergebnisse 43 sich der Maximalwert der Expansion. Bei Reinjektion von mit GP33-Peptid beladenen DC am dritten Tag pegelte sich die Expansion der TCR-tg Zellen am Tag 6 mit einem Spitzenwert zwischen 50 und 60% ein (Figur 6). % TCR-tg Zellen von CD8 DC Tage 0+3 60 DC Tage 0+4 B) A) 50 DC Tage 0+5 C) 40 30 20 10 0 0 5 10 0 5 10 0 5 10 15 Tage nach dem Transfer Figur 6. Nach Transfer von 5x105 TCR-tg T-Zellen und deren Stimulation durch 1,5x106 peptidbeladene DC am Tage 0, wurde an den Tagen 3 (Graph A), 4 (Graph B) und 5 (Graph C) nochmals dieselbe Anzahl peptidbeladener DC injiziert. An verschiedenen Tagen wurde den Mäusen Blut entnommen, die Zellen mit Antikörpern gegen Thy1.1 und CD8 angefärbt, im Durchflusszytometers analysiert und das Expansionsverhalten der transferierten T-Zellen im Graphen dargestellt. Injizierte man die beladenen DC am Tage 4, also dem Zeitpunkt des maximalen Auftretens TCR-tg T- Zellen im Blut, kam es zu einer nur mäßigen Expansion. Nach einem anfänglichen Abfall verblieben die transgenen T-Lymphozyten über einen Zeitraum von mehreren Tagen auf einem Level um die 10-15% an der Gesamtlymphozytenzahl. Erfolgte die 2. Stimulation erst nach der maximalen Expansion, also an den Tagen 5 oder 6, so verschwanden die TCR-tg T-Zellen am Folgetag bis zur Detektionsgrenze aus dem Blut, um 3 Tage später abermals mit einem Anteil von 30% der CD8+ Gesamtlymphozyten im Blut zu erscheinen. Diese Daten zeigen, dass die Kinetik der TCR-transgenen Zellexpansionen erheblich je nach dem Zeitpunkt der Restimulation mit DC variieren. 5. Ergebnisse 44 5.5 Lyse von DC durch TCR-tg T-Zellen in vitro Das Misslingen der „Boost“ Injektion am Tag der maximalen Expansion konnte seine Ursache in der schnellen Elimination der DC durch die von ihnen aktivierten transgenen, zytotoxischen Lymphozyten haben. Zur Untersuchung, ob mit GP33-Peptid beladene DC von aktivierten GP33 spezifischen TZellen lysiert werden können, wurden in vitro Zytotoxizitätsexperimente mit aus dem Knochenmark herangereiften DC als Zielzellen durchgeführt. Die DC wurden nach 8tägigem Wachstum in der Zellkultur mit Hilfe von einem Metrizamidgradient aufgereinigt und mit GP33-Peptid beladen. 100 % spezifische Lyse 80 60 40 20 0 100 33 10 3 1 0,3 Effektorzellen : Zielzellen Verhältnis Figur 7. In einem Zytotoxizitätstest wurden Milzzellen einer 8 Tage zuvor mit LCMV infizierten B6 Maus mit peptidbeladenen DC (ausgefüllte Symbole: GP33- Peptid; leere Symbole: Adenopeptid) kombiniert. Die Überstände der Zelllösungen wurden nach 5h abgenommen und die darin enthaltene Radioaktivität gemessen. Die Effektorzellen stammten aus der Milz einer 8 Tage zuvor mit LCMV infizierten B6 Maus. Die Figur 7 zeigt die graphisch dargestellten Ergebnisse einer Verdünnungsreihe der lysierenden Effektorzellen. 5. Ergebnisse 45 5.6 Lytische Aktivität isolierter Lymphozyten 4 und 6 Tage nach Stimulation Erstaunlich waren die Resultate des Expansionsverhaltens der TCR-tg Zellen nach Restimulation durch peptidbeladene DC, deren Kinetik sich je nach dem Zeitpunkt der zweiten DC-Gabe innerhalb von 48 Stunden veränderte. Das Ausbleiben einer zweiten Expansion der TCR-tg T-Zellen bei Restimulation am Tage des maximalen Auftretens transgener Zellen im Blut (Tag 4) konnte mit einer zeitigen Elimination der peptidbeladenen DC in Verbindung gebracht werden, durch deren Verschwinden der zweiten DC-Injektion das Stimulationspotential genommen wurde. Doch stellte sich die Frage, warum eine 2. Expansion der TCR-tg T-Zellen nach ihrem Abfall im peripheren Blut wieder möglich wurde. Die Antwort konnte in einer am 4. Tag veränderten Lysefähigkeit der transgenen T-Zellen oder in der Abnahme der Zellzahl spezifischer Effektorzellen in Milz und peripheren Blut liegen. Um auszuschließen, dass sich die Zytotoxizität der aktivierten T-Zellen innerhalb dieses kurzen Zeitraumes verändert hatte, wurden an den Tagen 4 und 6 einer einmaligen Stimulation TCR-tg Zellen durch peptidbeladene DC die Milzen der B6 Mäuse entfernt, aufgearbeitet und die TCR-tg Zellen als Effektorzellen in einem 18 Stunden Zytotoxizitätstest verwendet. Als Zielzellen dienten GP33-Peptid beladene EL4 Zellen. Die CD8+ TLymphozyten der Tag 6 Milz wurden zusätzlich aufgrund der geringen Zellzahl spezifischer TCR-tg T-Zellen mit gegen CD8 gerichteten Dynabead-Antikörpern in einem MACS System angereichert. Wertete man die Resultate des Experimentes nach der Lysekapazität pro TCRtg Effektorzelle aus, so ergaben sich keine Unterschiede zwischen den an Tag 4 und Tag 6 entnommenen Zellen (Figur 8). Die für GP33 spezifische lytische Aktivität pro Milzzelle aber war am Tag 6 im Vergleich zu Tag 4 bemerkbar vermindert, was an der geringeren Anzahl TCR-tg T-Zellen lag. Die verminderte Menge aktivierter TCR-tg Zellen in Milz und peripheren Blut einer Maus an den Tagen nach dem Gipfel der Expansionen mochte genügend DC vor einer Lyse verschont haben, um eine weitere starke Stimulation mit darauffolgendem massiven Erscheinen TCR-tg T-Zellen im Blut zu ermöglichen. Die Annahme, dass die Höhe aktivierter TCR-tg Zellen entscheidend für eine zweite Expansion nach Restimulation ist, wurde durch spätere Experimente unterstützt, bei denen primäre niedrigere Expansionsspitzen TCR-tg Zellen in der Größenordnung um 10% der Gesamtlymphozyten bei einer Reinjektion von peptidbeladenen DC am 4. Tag keinen Abfall der TCR-tg Zellen im Blut, sondern eine zweite Expansionskurve provozierten (Daten nicht gezeigt). 5. Ergebnisse 46 % spezifische Lyse 100 a) b) 50 0 10 10 1 0,1 TCR-tg Effektorzell : Zielzell Verhältnis 1 0,1 Milzzell : Zielzell Verhältnis Figur 8. Für die Generierung der Effektorzellen in diesem Zytotoxizitätstest wurden TCR-tg T-Zellen nach einem Transfer in B6 Mäuse in vivo mit peptidbeladenen DC stimuliert. An den Tagen 4 (Dreiecke) und 6 (Rechtecke) wurden die Milzen der Mäuse entnommen und Einzelzellsuspensionen hergestellt, deren Zellen als Effektorzellen dienten. Als Zielzellen dienten peptidbeladene EL4 Zellen (ausgefüllte Symbole: GP33-Peptid; leere Symbole: Adeno-Peptid). Gemessen wurde die spezifische Lyse bei verschiedenen Verhältnissen von TCR-tg Effektorzellen zu den Zielzellen (a) und von Milzzellen zu den Zielzellen (b). 5.7 T-Zell vermittelte Mechanismen zur Lyse von DC in vitro Als nächstes interessierte uns der Mechanismus, der aktivierte TCR-tg Zellen befähigt, DC zu eliminieren. Dazu verwendeten wir in einem Zytotoxizitätstest TCR-tg Effektorzellen aus Perforin defizienten Mäusen (TCR-tg.P°), FasL defizienten Mäusen (TCR-tg.gld) und Thy1.1 Mäusen (TCR-tg.Thy1.1). Diese wurden mit DC als Zielzellen aus dem Knochenmark von B6 und aus CD95-defizienten B6.lpr Mäusen stammend kombiniert. Die naiven TCR-tg TZellen wurden zunächst für zwei und drei Tage mit GP33-Peptid in vitro stimuliert, bevor sie als Effektorzellen auf 8 Tage in Kultur gehaltene, mit GP33-Peptid beladene B6 DC für 3 Stunden dauernde Assays gegeben wurden. Die GP33-Peptid beladenen DC wurden von den zwei Tage lang stimulierten TCR-tg.P° Effektorzellen uneingeschränkt lysiert, während die für den Fas-L (Fas-Ligand) defizienten, aktivierten Effektorzellen die DC nur teilweise lysieren konnten (Figur 9). 5. Ergebnisse 47 Effektorzellen TCR-tg TCR-tg. P° TCR-tg. gld Zielzellen 100 80 60 B6 DC Day 2 40 20 0 80 60 B6 DC Day 3 40 20 0 50 6 0,6 50 6 0,6 50 6 0,6 Effektorzellen : Zielzellen Verhältnis Figur 9. TCR-tg Milzzellen von Perforin defizienten Mäusen (TCR-tg.P°) (Kreise)), Fas defizienten Mäusen (TCR-tg.gld)(Dreiecke) und Thy1.1 Mäusen (TCR-tg.Thy1.1) (Rechtecke) wurden für 2 und 3 Tage in vitro stimuliert und in verschiedenen Konzentrationen als Effektorzellen in einem Chromfreisetzungstest eingesetzt. Als Zielzellen dienten 8 Tage in Kultur gehaltene B6 DC, die jeweils mit für die Effekltorzellen spezifischem GP33-Peptid (ausgefüllte Symbole) oder unspezifischem Peptid vom Adenovirus (leere Symbole) beladen wurden. Verwendete man 3 Tage in vitro stimulierte Effektorzellen, so vermochten die TCR-tg.P° die DC nur noch teilweise zu lysieren, während im Gegensatz zum Vortage die für den Fas-L defizienten Effektorzellen die DC uneingeschränkt eliminierten. Es reichte an beiden Tagen nicht aus, durch Blockade eines einzelnen Mechanismus die Lysierung der DC vollständig zu unterbinden, was darauf hindeutete, dass zwei Wege an der Eliminierung beteiligt waren, die sich zum Teil gegenseitig kompensierten. Wurden mit Hilfe von TCR-tg.P° Zellen und CD95 defizienten DC aus B6.lpr Mäusen der 5. Ergebnisse 48 Perforin-vermittelte und der Fas-vermittelte Mechanismus gleichzeitig ausgeschaltet, war den Lymhozyten die Fähigkeit genommen, DC zu lysieren (Figur 10). Effektorzellen TCR-tg TCR-tg. P° TCR-tg. gld Targetzellen 80 B6-DC 40 0 80 B6.lpr-DC 40 0 50 6 50 6 50 6 Effektorzellen : Zielzellen Verhältnis Figur 10. Für einen Zytotoxizitätstest wurden naive Milzzellen aus Perforin defizienten Mäusen (TCR-tg.P°) (Kreise), Fas defizienten Mäusen (TCR-tg.gld) (Dreiecke) und Thy1.1 Mäusen (TCRtg.Thy1.1) (Rechtecke) gewonnen und 2 Tage in vitro mit GP33-Peptid zu Effektorzellen stimuliert. Als Zielzellen dienten 8 Tage in Kultur gehaltene DC aus B6 (obere Graphen) und aus B6.lpr Mäusen (untere Graphen), die jeweils mit für die Effektorzellen spezifischem GP33-Peptid (ausgefüllte Symbole) oder unspezifischem Peptid vom Adenovirus (leere Symbole) beladen wurden. Zusammenfassend zeigten die Daten, dass TCR-tg T-Zellen, nachdem sie als naive Zellen von den mit GP33-Peptid beladenen DC über den MHC-Klasse I und costimulatorische Signale aktiviert wurden, nach einer Phase der Ausreifung diesselben stimulierenden DC antigenspezifisch erkannten und in der Folge lysierten. Dazu benutzten sie den Fas-L und Perforin, zwei Wege, die beim Ausfall des einen einander teilweise kompensieren konnten. In der Differenzierungsphase einer naiven T-Zelle zu einer Effektorzelle, war die Fasvermittelte Lyse der Anfangs schneller verfügbare und aktivere Mechanismus, der später durch den Perforin-vermittelte Lyse in seiner Bedeutung abgelöst wurde. 5. Ergebnisse 49 5.7.1 Veränderung des Lyseverhaltens der DC durch Kontakt mit LPS LPS ist ein Bestandteil der Wände gramnegativer Bakterien. DC können LPS über ihre Tolllike Rezeptoren erkennen und reagieren bei Kontakt mit einer verstärkten Ausreifung zu einer sehr kompetenten Antigenpräsentierenden Zelle. Da ein langes Leben einer stimulierenden APC von Vorteil für die Initiierung einer Immunantwort sein kann, interessierte uns, ob ein erhöhtes Reifeniveau der DC in deren Lyseverhalten eingreift. In den beiden folgenden Versuchen gaben wir 10µg/ml LPS 12 Stunden vor den Versuchen auf eine der Zellkulturen, um von unseren Normalpopulationen abweichende, reifere Populationen zu erhalten. Die Veränderung der Zellen konnte man im Durchflusszytometer durch eine Zunahme von MHCKlasse II Molekülen verfolgen (Daten nicht gezeigt). Beim Vergleich des Lyseverhaltens dieser beiden Populationen ergaben sich zwei Phänomene. 3h 5h % spezifische Lyse 100 80 60 40 20 0 100 30 10 3 1 0,3 100 30 10 3 1 0,3 Effektorzellen : Zielzellen Verhältnis Figur 11. 8 Tage in Zellkultur gehaltene peptidbeladene DC (ausgefüllte Symbole: GP33-Peptid Beladung; leere Symbole: Adeno-Peptid Beladung) wurden als Zielzellen in einem Zytotoxizitätstest mit GP33- spezifischen Effektorzellen aus 8 Tage mit LCMV infizierten Mäusen verwendet. Der mit Kreisen markierten Population wurde 12 Stunden vor dem Versuch 10µg/ml LPS zur Zellkultur beigegeben, was sie zusätzlich ausreifen ließ. Während des Experimentes wurde nach 3 Stunden (linke Seite) und nach 5 Stunden (rechte Seite) die durch Zelllyse in den Überstand abgegebene Radioaktivität gemessen. 5. Ergebnisse Die stärker 50 ausgereiften peptidbeladenen DC wurden in einem 5-stündigem Zytotoxizitätstest, unter der Verwendung von Effektorzellen aus 8 Tage mit LCMV infizierten Mäusen, nicht mehr zu 100% lysiert. Ein Teil der DC schien resistent gegenüber einer zu diesem Zeitpunkt von den Effektorzellen vorwiegend über den PerforinMechanismus vermittelten Lyse zu sein. Bei gleichem Lyseverhalten LPS-behandleter und nicht LPS-behandleter Zellen nach 3 Stunden wurden nach 5 Stunden nur noch 80% der DC lysiert (Figur 11. ) Im nächsten Experiment sollte ein eventuell von der Normalpopulation abweichendes Lyseverhalten verstärkt gereifter DC unter Verwendung des zweiten bei der Lyse von DC verwendeten Mechanismus, der Fas-vermittelten Lyse, untersucht werden. Dafür wurde unter Zuhilfenahme drei Tage in vitro stimulierter TCR-tg.P° T-Zellen als Effektorzellen der Perforin-Lysemechanismus in einem Zytotoxizitätstest unterbunden. Während eine DCKultur unbehandelt zu den Effektorzellen gegeben wurden, bekam die 2. Kultur 12 Stunden vor dem Experiment 10µg/ml LPS zum Medium gemischt. Nach 3 und nach 5 Stunden Inkubation wurde die Radioaktivität im Überstand gemessen (Figur 12.). + LPS - LPS % spezifische Lyse 100 80 60 40 20 0 200 22 2 200 22 2 Effektorzellen : Zielzellen Verhältnis Figur 12. 8 Tage in Kultur gereifte, peptidbeladene DC (ausgefüllte Figuren: GP33-Peptid Beladung; leere Symbole: Adeno-Peptid Beladung) wurden als Zielzellen in einem Zytotoxizitätstest verwendet. Den im linken Kasten dargestellten Populationen wurden im Gegensatz zu den rechten 12 Stunden vor dem Experiment 10µg/ml LPS zu den Zellkulturen gegeben. Als Effektorzellen dienten 3 Tage in vitro stimulierte TCR-tg.P° T-Zellen. Die durch die Zelllyse in den Überstand abgegebene Radioaktivität wurde nach 3 (Kreise) und 5 (Quadrate) Stunden abgenommen und gemessen. 5. Ergebnisse 51 Weder die mit LPS behandelte, noch die unbehandelte DC-Population wurde nach 5stündiger Inkubation mit den Effektorzellen zu 100 Prozent lysiert. In beiden Fällen wurden lediglich 65% der DC bei einem Verhältnis von 200 Effektorzellen pro DC eliminiert. 35% beider Zellkulturen mussten also eine schon sich in der ursprünglischen Kultur ausbildende und unabhängig von der LPS Behandlung auftretende Resistenz speziell gegen den Fas Lysemechansismus besitzen. Die maximale Lyse der unbehandelten DC trat schon nach 3stündiger Inkubation mit den Effektorzellen auf. Hingegen bewirkte die LPS Behandlung eine anfängliche Verzögerung der Lyse, die nach 5 Stunden wieder kompensiert war. 5.8 Unterbindung der DC-Lyse in vivo Im Kapitel 5.4 wurden TCR-tg Zellen in B6 Mäuse transferiert und durch peptidbeladene DC stimuliert. Injizierte man den Mäusen am Tage des maximalen Erscheinens der TCR-tg Zellen im Blut ein zweites Mal peptidbeladene DC, so konnte man die TCR-tg Zellen zwar noch mehrere Tage mit einem Prozentanteil von 10-15% der Gesamt-T-Lymphozyten im Blut verfolgen, es kam aber zu keiner zweiten massiven Expansion. Wir erklärten uns dieses Ergebnis mit der Annahme, dass die peptidbeladenen DC durch die aktivierten TCR-tg Zellen lysiert wurden, ehe sie die Möglichkeit zu einer weiteren Stimulation fanden. Sollte sich diese Hypothese bestätigen, so musste die Ausschaltung der in vitro gefundenen von TCR-tg Zellen zur Eliminierung von DC verwendeten Lysemechanismen, den verschonten DC eine zweite Stimulation der TCR-tg Zellen erlauben und eine zweite im Blut erkennbare Expansion nach sich ziehen. Adoptiv transferierte TCR-tg T-Zellen Perforin-defizienter Mäuse stimulierten wir mit peptidbeladenen DC aus B6.LPR Mäusen und verglichen sie mit Wildtyp TCR-tg Zellen, die durch DC aus B6 Mäusen stimuliert wurden. Die Primärantwort einer einmaligen DC Injektion beider Transfertypen offenbarte keine Unterschiede (Figur 13). Auch eine Restimulation am Tage 6, als die TCR-tg Zellen zum größten Teil schon wieder aus dem Blut verschwunden waren, zeigte keine Differenzen. Mit dem Injizieren der DC am Tage 4 nach Transfer, dem Zeitpunkt der maximalen Expansion der spezifischen Lymphozyten im Blut, waren im Gegensatz zu den B6 DC die B6.LPR DC fähig, TCR-tg.P° T-Zellen ein zweites Mal zu stimulieren und eine erneute starke Expansion der transgenen Zellen hervorzurufen. 5. Ergebnisse 52 60 TCR-tg + B6-DC DC: Tag 0+6 50 DC: Tag 0+4 40 30 % TCR-tg Zellen von CD8 20 10 60 DC: Tag 0+6 50 DC: Tag 0+4 40 30 20 TCR-tg.P° + B6.lpr-DC 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14 Tage nach dem Transfer Figur 13. Naive transgene T-Lymphozyten wurden in den Kombinationen TCR-tg T-Zellen + B6 DC (Rechtecke) und TCR-tg.P° + B6.lpr-DC (Kreise) in B6 Mäuse transferiert und mit peptidbeladenen DC stimuliert. Eine Restimulation der T-Lymphozyten durch peptidbeladene B6-DC (beide oberen Graphen) und durch peptidbeladene B6.lpr-DC (untere Graphen) wurde an den Tagen 6 und 4 nach Transfer durchgeführt. Die Kinetik der Expansion transgener Lymphozyten wurde im peripheren Blut verfolgt. Durch Abnahme von Blut und Färbung der Zellen gegen CD8 und Thy1.1 wurde der Anteil transgener T-Zellen an der Gesamtzahl CD8+ Lymphozyten bestimmt. Die Inhibierung der Lysewege, deren sich aktivierte CD8+ Lymphozyten in vitro bedienten, um DC zu eliminieren, hatte auch in vivo die Eliminierung der DC verhindert. Diesen wurde es dadurch möglich, trotz der hohen Anzahl aktivierter, gegen die GP33 Antigene auf ihrer Oberfläche gerichteten spezifischen TCR-tg T-Zellen im peripheren Blut ein zweites Mal die transgenen Lymphozyten zu stimulieren, was in einer erneuten Expansion seinen Ausdruck fand. 6. Diskussion 53 6. Diskussion 6.1 Zusammenfassung der Ergebnisse Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass von Knochenmarksvorläuferzellen abstammende Peptidantigen-beladene DC sensibel gegenüber einer Lyse durch spezifische CTL sind. Sowohl der Grad der DC-Sensibilität gegenüber einer Lyse, als auch der Lysemechanismus sind abhängig vom Reifezustand der DC und vom Aktivierungsgrad der spezifischen TZellen. In vitro und in vivo reagieren DC auf die Effektormechanismen Perforin und FasL mit einer Zellyse. Die durch die T-Zell-vermittelte Lyse reduzierte Zahl Peptidantigenpräsentierender DC kann bei der Induktion einer Immunantwort die Expansion spezifischer T-Zellen einschränken. 6.2 Faktoren einer DC Kultur Für die Experimente wurden 8 Tage in Kultur gehaltene DC verwendet, deren Kulturbedingungen an dem Protokoll von Lutz (74) angelehnt sind. Ohne IL4 bei der Herausreifung zu verwenden, entstand eine Mischpopulation mit sehr guten stimulatorischen Eigenschaften, die aus mehr und weniger ausgereiften Zellen bestand. Die Erfahrungen mit den Zellkulturen zeigten, dass die Kultivierungsbedingungen der DC sehr viel positiver durch ein geeignetes fetales Kälberserum (FKS) beeinflusst werden konnten, als durch die Zugabe von IL4. Beim Testen von FKS Proben verschiedener Anbieter wuchsen DC heran, die in einem Experiment unter ansonsten gleichgehaltenen Bedingungen bei der Stimulation transferierter TCR-tg T-Zellen sehr unterschiedliche maximale Stimulationen von a) 5%, b) 15% und c) 30% TCR-tg Zellen zu den Gesamt CD8+ Zellen im Blut generierten. Diese Werte waren weder durch das Einsetzen größerer T-Zell Ausgangszahlen, noch unter der Applikation der dreifachen DC-Menge zu erhöhen (Daten nicht gezeigt). Die veränderten Kulturbedingungen unter der Verwendung eines ungeeigneten FKS ließen vermutlich eine DC-Population mit einer verminderten Halbwertszeit heranwachsen. Auf diese Weise standen trotz einer enormen Ausgangsanzahl stimulierender DC diese den T-Zellen nach einigen Zellteilungen nicht mehr für eine weitere Stimulation zur Verfügung, weil sie inzwischen durch spontane Apoptose zugrunde gegangen waren. Für die Generierung einer hohen T-Zell Antwort waren damit nicht nur hohe Zahlen stimulierender APC vonnöten, sondern auch deren Verfügbarkeit über einen Zeitraum von mindestens 3 Tagen. Die in den beschriebenen Experimenten verwendeten DC wurden sämtliche unter Verwendung desselben FKS kultiviert. 6. Diskussion Die 54 stimulatorischen Eigenschaften dieser DC-Populationen wurden in einem Tumorprotektionsexperiment, einem Proliferationsexperiment und durch Stimulation transferierter T-Zellen in vivo charakterisiert. 6.3 Mechanismen der DC-Lyse Als DC-Lysemechanismen durch in vitro aktivierte spezifische T-Zellen ergab sich bei den in vitro Zytotoxizitätstesten eine Kombination des Fas- und des Perforin-vermittelten Mechanismus. Nur als beide gleichzeitig unterbunden wurden, ließ sich keine DC-Lyse erkennen. In der Literatur findet man Indizien, die sowohl auf auf einen Perforin, als auch auf einen Fas- vermittelten Mechanismus schließen lassen. Weil DC Fas exprimieren, wurde deren Lyse über den Fas-Mechanismus schon längere Zeit diskutiert. Und dennoch zeigten sich reife DC in den Experimenten verschiedener Arbeitsgruppen wie derjenigen von Ashany (6) vollständig resistent gegenüber einer Lyse über Fas. Matsue (78) demonstrierte hingegen eine Sensibilität von DC gegenüber der Fas-vermittelten Lyse und vermutete zusätzlich das Vorhandensein eines zweiten Lyseweges. Als lyseinduzierende Effektoren verwendeten beide Gruppen sowohl gegen Fas gerichtete Antikörper als auch CD4+ T-Helferzellen. Ludewig (70) verwendete zytotoxische T-Zellen (CTL) aus LCMV-infizierten Mäusen als Effektoren und fand bei der in vitro Lyse von DC einen allein Perforin-vermittelten Mechanismus. 6.3.1 Kinetik der DC-Lyse Beim Auflösen des Lyseverhaltens in vitro stimulierter T-Zellen durch die Verwendung Perforin-defizienter und Fas-defizienter T-Zellen wurde erkennbar, dass die beiden Mechanismen zeitlich versetzt voneinander agierten. Während 24 Stunden in vitro aktivierte T-Zellen fast überhaupt keine DC lysierten, bildete sich in den nächsten Stimulationstagen die T-Zell-Toxizität weiter heraus, erreichte aber bis zum Tag 3 keine vollständige Eliminierung der DC. Der Fas-Mechanismus etablierte sich dabei zuerst und wurde zwischen der 48. und 72. Stunde bzw. zwischen der 5.-8. T-Zell-Teilung nach Aktivierungsbeginn durch den Perforin-Mechanismus abgelöst, welcher in der Folge den Hauptteil der DC-Lyse ausmachte. Zum Vergleich eliminierte dieselbe Anzahl Effektorzellen aus Milzen von Mäusen, die 8 Tage lang mit LCMV infiziert waren, Peptidantigen-beladene DC in einem 5stündigen Zytotoxizitätstest vollständig. Damit scheinen die DC gegenüber einer Lyseinduktion über den Fas-Mechanismus zum Beginn einer Immunantwort empfindlicher zu reagieren. Sollten sich zum Zeitpunkt der 6. Diskussion 55 herausgebildeten T-Zell Effektormechanismen T-Zellen und DC noch am selben Ort befinden, könnte durch eine Lyse der DC die schnelle Herausbildung einer Immunantwort verzögert werden. Da DC den Lymphknoten nach ihrer Einwanderung nicht mehr verlassen , ist für diese Frage vor allen Dingen das Verhalten der T-Zellen ausschlaggebend. (101) 6.3.2 'Homingverhalten' von T-Zellen Die für das 'homing' zu den Lymphknoten verantwortlichen Moleküle, sind CD62L und CCR7 (47, 99, 109). Naive T-Zellen tragen beide Moleküle auf ihrer Oberfläche und regulieren sie im Falle einer Aktivierung ab der 4. Zellteilung herunter (27). Der lyseinduzierende Fas-Ligand besitzt hingegen eine Kinetik ähnlich dem Aktivierungsmolekül CD69. Er wird bei der 1. Zellteilung nach Stimulation heraufreguliert und kehrt zum Expressionsniveau einer naiven T-Zelle nach 6 Zellteilungen wieder zurück . Rechnet man nach in vitro Ergebnissen für (90) die erste Zellteilung der T-Zellen 24 Stunden und für jede weitere 8h, so verlassen die stimulierten T-Zellen die Lymphknoten erst nach 48 Stunden, was sich auch in unseren Stimulationsexperimenten wiederspiegelt. Dies ist ein Zeitpunkt, zu dem nicht nur rechnerisch, sondern auch nach unseren experimentellen Ergebnissen die Lyseaktivität zytotoxischer T-Zellen mittels des Fas-Mechanismus etabliert ist. Abgesehen von dieser mechanischen Herleitung beobachteten wir in unseren Transferexperimenten, dass bei repetitiven Stimulationen schon kurze Zeit nach der zweiten Injektion peptidbeladener DC die TCR-tg Zellen abrupt aus dem Blut verschwanden und erst 1 bis 3 Tage später mit einer intensiven Expansion wieder im peripheren Blut erschienen. Wir erklärten uns dieses Phänomen damit, dass die stimulierenden DC die sich teilenden T-Zellen am Ort der Proliferation zurückhielten. Fasst man diese Beobachtungen und die Überlegungen aus der Aktivierungskinetik und dem "Homingverhalten" von T-Zellen zusammen, bleibt der Schluss, dass CTL und DC zum Zeitpunkt etablierter TZellzytotoxizität Kontakt zueinander haben und DC eine Lyse riskieren. Während diese Arbeit in Gange war, erschienen zahlreiche Veröffentlichungen zu diesem Themengebiet. So zeigte Hermans (44) durch histologische Schnitte von drainierenden Lymphknoten, dass in immunisierte Mäuse injizierte peptidbeladene DC nach 2 Tagen kaum noch in den drainierenden LN nachzuweisen waren. Wurden aber DC ohne Peptidbeladung injiziert, so konnten diese bis 7 Tage nach der Injektion in den LN nachgewiesen werden, was für eine spezifische Eliminierung durch die in den Mäusen im Zuge der Immunisierung generierten CTL sprach. 6. Diskussion 56 6.4 DC Lyseresistenz gegenüber aktivierten T-Zellen Die DC besitzen verschiedene Schutzmechanismen vor einer Lyse. In den Experimenten konnte unter Verwendung in vitro stimulierter TCR-tg Perforin-defizienter CTL die Lysesensibilität der DC – als das Verhältnis benötigter zytotoxischer T-Zellen pro lysierter DC - in einem 3 Stunden Zytotoxizitätstest um mehr als das Dreifache im Vergleich zu unbehandelten Kulturen gesteigert werden, indem der Kultur in der Nacht vor dem Zytotoxizitätstest LPS zugesetzt wurde. Nach einem 5-stündigen Zytotoxizitätstest glich sich die Lyse zusätzlich gereifter DC und der unbehandelten DC-Mischkultur wieder aus. Eine vollständige Lyse aller DC wurde durch die Effektoren jedoch nicht erreicht. Neben den ausgereiften Zellen, die in der Mischkultur am Tage der Ernte schon vorhanden waren und für die Lyse unsensibel blieben, kam durch die 12 stündige Applikation des LPS ein für noch unausgereifte Zellen temporärer Lyseschutz hinzu. Auch diese kleine Verzögerung einer DCLyse kann schon einen Effekt in Form eines zusätzlichen Stimulationspotential gegenüber TZellen bedeuten, da aktivierte Effektorzellen nur noch eine einstündige Kontaktzeit mit einer APC für eine weitere Zellteilung benötigen (46). Im Gegensatz dazu wurden in den Versuchen von Wilson (125) gereifte DC durch NK-Zellen lysiert, wobei die Ausreifung der DC durch eine 48 stündige Inkubation mit LPS erreicht wurde. Die auch bei ihm erkannte Lyseresistenz schien nicht temporär begrenzt zu sein. Eine Erklärung für diese beiden unterschiedlichen Ergebnisse könnte in der Funktionsweise des Mechanismus liegen. Das über die Interaktion zwischen Fas und FasL gegebene Todessignal wird intrazellulär in den DC über das Molekül caspase 8 weitergeleitet. Unter dem Kontakt mit LPS bilden DC das Molekül c-flip. Dieses ist ein dem caspase 8 ähnelndes, aber funktionsloses Molekül, welches das Todessignal nicht weiter in die Zelle leitet, sondern die intrazelluläre Signalweiterleitung kompetitiv inhibiert . Der Schluss liegt nahe, dass (124) sich bei den Experimenten von Wilson mit Hilfe einer um das Vierfache längeren Inkubationszeit von DC mit LPS durch die Bildung zahlreicher c-flip Moleküle ein vollständiger Lyseschutz etablierte, während die in unseren Experimenten verwendete Inkubationszeit den Zelltod lediglich verzögerte. 6.4.1 Induktionswege des Schutzes gegen den Fas-Lysemechanismus Sollten die DC einen Mechanismus zur Verhinderung ihrer Lyse besitzen, so sollte er eingangs gegen den sich zuerst in den aktivierten T-Zellen herausbildenden FasMechanismus gerichtet sein. 6. Diskussion 57 In den letzten Jahren häuften sich Berichte über Mechanismen, die in der Folge einer Induktion durch CD40L (105, , TNF- 123) (71) und TRANCE (127) die Expression anti- apoptotischer Proteine der Bcl Familie (Bcl-xL , Bcl-2 (15)) erhöhten. Diese Proteine blockieren Mitochondrienmembrankanäle und unterdrücken dadurch die gemeinsame Endstrecke des spontanen und des Fas-vermittelten Apoptoseweges. Dadurch verlängert sich die Überlebenszeitspanne der nicht von T-Zellen erkannten, antigentragenden DC vor einer spontanen Apoptose (72, 125) ebenso wie sich ihre Fas-vermittelte Lysesensibilität verringert. Die Wahrscheinlichkeit erhöht sich, dass Fremdantigene von den vor einer Immunreaktion nur äußerst geringen Anzahl spezifischer T-Zellen gefunden wird, und es zu einem zügigen Anstoßen einer Immunreaktion kommt. LPS geht in seiner Wirkung auf DC noch eine Stufe weiter als CD40L oder TNF- . Es greift durch die Bildung des c-Flip-Moleküls direkt in den T-Zell vermittelten Fas-Lysemechanismus nach der Antigenerkennung auf den DC ein und inhibiert die Signalweiterleitung vor der intrazellulären Aufsplittung in zwei getrennt verlaufende Transduktionswege. Durch die Inhibition der Lyse ermöglicht es den DC eine verlängerte Stimulation spezifischer T-Zellen. Die anti-apoptotischen und das DC-Leben verlängernden Moleküle wie LPS und TNFtreten während Immunreaktionen auf und bewirken in den DC eine verstärkte Ausreifung. Die durch sie erworbenen Überlebenssignale tragen der erhöhten Wahrscheinlichkeit Rechnung, dass aus einem Infektionsgebiet kommende DC wichtige Antigene präsentieren könnten. Betrachtet man die Vielzahl der Möglichkeiten, durch die DC zusätzliche Überlebenssignale erlangen können, scheint dem Organismus der zügige Beginn einer Immunreaktion in einer Phase, in dem der Erreger vor dem Organismus einen großen Vorsprung hat, wichtig. Offen bleibt die Frage, ob jegliche Ausreifung und damit verbundene Wanderung Dendritischer Zellen in lymphatische Organe mit einer Resistenzbildung gegen Lysemechanismen einhergehen, oder ob das zusätzliche Vorhandensein ausreifender Stimulantien beispielsweise im Rahmen einer Immunreaktion vonnöten sind. In unseren DCKulturen reiften die Zellen mit steigenden Kultivierungzeiträumen zunehmend aus. Auch rein mechanische Aktionen, wie beispielsweise ein Plattenwechsel der Zellkultur, führte zur zunehmenden Ausreifung. Möglicherweise handelt es sich um eine Basisresistenz, die durch zusätzliche Stimuli moduliert werden kann. An dieser Stelle ansetzende Experimente sollten in der Zukunft die quantitative Rolle der Resistenzmechanismen bei der Entstehung verschiedener Immunreaktionen untersuchen. Dass DC einen Lyseschutz während ihrer Ausreifungsphase erst entwickeln müssen scheint vernünftig. In ihrer als APC funktionslosen Phase der Antigenaufnahme in den Geweben 6. Diskussion 58 würden sie mit einem schon bestehendem Lyseschutz ein Versteck für pathogene Erreger bilden und deren Eliminierung behindern. 6.4.2 Wieviel T-Zellen braucht es zur Lyse einer DC? Ingulli (53) beschrieb in seinen Versuchen, dass antigenbeladene, in Lymphknoten migrierte DC nach 24 Stunden von einer großen Anzahl spezifischer T-Zellen umlagert wurden. Diese grobe "Clusterbildung" löste sich bis zur 48. Stunde wieder auf und ging in eine feinere "Clusterung" über, deren Substrat aus einer kleineren Anzahl spezifischer T-Zellen pro DC bestand. Diese Clusterung könnte eventuell auch die Voraussetzung für eine Lyse der DC sein. Möglicherweise reichen die über den Fas-Rezeptor übermittelten Signale einer einzelnen aktivierten T-Zelle nicht aus, um eine DC zu lysieren. Die Wirkung von LPS auf den Fas-Lysemechanismus besteht in der Abschwächung des vom Fas-Rezeptor überbrachten Signals in den DC. Mit Hilfe des c-Flip Moleküls wird die Quantität der über Fas in die Zelle weitergegebenen Todessignale moduliert und die Anzahl benötigter Fas-FasL-Interaktionen für die Erreichung eines Zelllyse-induzierenden Schwellenwertes festgelegt. Reichen die Fas-Liganden einer einzelnen spezifischen T-Zelle für die Lyse einer DC nicht aus, so kann die Zahl der Liganden durch die Rekrutierung spezifischer T-Zellen erhöht werden. Über diese Modulation der in die Zelle eingehenden Apoptosesignale durch c-Flip könnte indirekt die Anzahl der für eine Lyse der DC benötigten spezifischen T-Zellen eingestellt werden. Weil die geringe Anzahl vor einer Immunantwort vorhandener spezifischer T-Zellen lediglich durch Proliferation erhöht werden kann, ist auf diese Weise eine Zielzahl proliferierter T-Zellen programmierbar, bei deren Erreichen erst die DC eliminiert wird. TRANCE ist ein auf aktivierten T-Zellen exprimiertes Molekül, welches dem dazugehörigen TRANCE-Rezeptor auf DC über die Heraufregulation anti-apoptotischer Bcl-Moleküle Überlebenssignale vermittelt und eine spontane Apoptose verhindert wird . Über diesen (127) Mechanismus würde ein spontaner Tod der DC während des Zeitraums der T-Zellexpansion verhindert werden können. Existieren genügend T-Zellen für eine sofortige Lyse der DC, reicht der Zeitraum der Apoptose dennoch für eine weitere Stimulation. Ein einmaliger Stimulus reicht sowohl bei naiven, als auch bei Gedächtnis-Zellen aus, um eine klonale Teilung der Zellen über 7 Generationen hinweg anzustossen . Einmal aktivierte T-Zellen benötigen für diesen (57, 122) Stimulus nur noch eine Kontaktzeit von 1 Stunde, naive Zellen 2 Stunden . In unseren (46) Zytotoxizitätsexperimenten waren auch unter der Verwendung von in vivo generierten 6. Diskussion 59 Effektorzellen mit vollständiger Etablierung der Effektorfunktionen nach 3-stündiger Inkubation maximal 50% der Zellen lysiert. Dieser Zeitrahmen sollte ausreichen, dass es auch bei gleichzeitiger Stimulation und Lyse zwischen T-Zellen und DC zur Stimulation der T-Zellen kommt. Auf diese Weise würden sich DC-Lyse und T-Zellexpansion anhand folgender Faktoren orientieren: •der Menge schon vorhandener spezifischer T-Zellen, •der Anzahl neu in die Lymphknoten einwandernden DC, was zum Teil auch durch die Freisetzung von Antigen durch aktivierte T-Zellen in der Peripherie verstärkt wird, •der Wichtigkeit der Immunreaktion (größere Mengen an Zytokinen (z.B. TNF- ) lassen DC zusätzlich ausreifen), •der Wichtigkeit von Erregern (Erkennung anhand von Toll-like-Rezeptoren (LPS) oder über die Interaktion mit T-Helferzellen (CD40) und anschließend vermehrter Ausreifung der DC). Die T-Zellexpansion verliefe auf diese Weise rückgekoppelt an die Bedürfnisse und Verhältnisse der Immunantwort. Die einzelnen dargestellten Mechanismen wurden in den letzten Jahren auch von zahlreichen anderen Gruppen beschrieben. Ob das daraus entworfene Bild einer beginnenden Immunreaktion der Wirklichkeit entspricht, werden weitere Experimente zeigen müssen. 6.4.3 Die Bedeutung des Perforin-Mechanismus für DC-Lyse Über die Wichtigkeit des Lysemechanismus Perforin in Bezug auf DC existieren in der Literatur verschiedene Meinungen. In perforindefizienten Mäusen beschrieb man das Einhergehen bakterieller und viraler Infektionen mit einer erhöhten Akkumulation antigenspezifischer CD8+ T-Zellen (7, 116). Auch DC-Immunisierungen führten zu dieser Akkumulation. Ein dabei existierender Zusammenhang mit einer insuffizienten DC-Lyse ist aber nicht nachgewiesen und die Fehlregulation anderer Mechanismen bleibt möglich. In unseren in vitro Experimenten löste der Perforin/Granzym-Lysemechanismus den Fas-Mechanismus erst ab dem 3.Tag ab, und übernahm ab diesem Zeitpunkt den Hauptteil an der Lyse der DC. Loyer (68) fand ebenfalls eine perforinabhängige Lyse von DC in vivo. Ludewig (70) zeigt hingegen, dass CTL aus einer 8 Tage mit LCMV infizierten Maus DC in vitro allein über den Perforin Mechanismus lysierten. In vivo erbrachten seine Experimente das Ergebnis, dass die DC-Lyse sowohl von Perforin als auch von Fas unabhängig verläuft. 6. Diskussion 60 Perforin und Granzyme sind Moleküle, die nach der Aktivierung einer T-Zelle erst aktiv produziert und in zytotoxischer Granula angereichert werden müssen. Dieser Vorgang dauert 30 Stunden bei T-Zellen, die eine Zellteilung durchgemacht haben . Während dieses (90) Zeitraums agiert der frühe Lysemechanismus FasL, der nach einigen Teilungen der T-Zellen wieder von der Oberfläche herunterreguliert wird. In unseren Experimenten vermochten 48 Stunden in vitro stimulierte T-Zellen unter Ausschaltung des Fas-Mechansimus 40% der DC zu lysieren, nach 72 Stunden waren es 80%. Aber auch zu diesem Zeitpunkt war keine vollständige Lyse aller DC möglich. Im Vergleich dazu lysierten 8 Tage in vivo stimulierte T-Zellen 100% der DC mit dreifach geringerer Effektorenzahl. Betrachtet man diese temporär versetzte Aktivierungskinetik der Zytotoxizitätsmechanismen naiver T-Zellen, so scheint erklärbar, warum Ludewig (70) mit der Verwendung in vivo aktivierter T-Zellen keine Fas-abhängige DC Lyse erkennen konnte. Der FasL war nach den zahlreichen T-ZellTeilungen nach 8 tägiger Virusinfektion in den Mäusen schon wieder von der Oberfläche herunterreguliert und die Zielzellen wurden vorwiegend über den Perforin- Mechanismus lysiert. 6.4.4 DC-Lyseresistenz gegenüber des Perforinmechanismus Auf der Suche nach einer gegen den Perforinmechanismus gerichteten DC-Lyseresistenz wurden aus virusinfizierten Mäusen entnommene CTL als Effektorzellen in einem Zytotoxizitätstest mit LPS stimulierten und unbehandelten DC als Zielzellen verwendet. Neben einer uneingeschränkten Lyse unbehandelter DC bildete ein Teil der mit Hilfe von LPS ausgereiften DC nach 12 stündiger gemeinsamer Inkubation eine Resistenz gegen die Lyse. Bedenkt man, dass die CTL aus virusinfizierten Mäusen vorwiegend unter Verwendung des Perforin-Mechanismus lysieren, so muss dieser Resistenzweg im Gegensatz zu dem schon beschriebenen Fas-Resistenzweg speziell gegen den Perforin-Mechanismus wirken, weil beide Wege innerhalb der Zielzellen auf unterschiedliche Weise weitergeleitet werden. Die Ausreifung der DC durch 36-stündige Inkubation mit anti-CD40 Antikörpern brachte in unseren Experimenten dagegen nur eine sehr geringe Resistenzentwickung (Daten nicht gezeigt). Medema (83) beschrieb jüngst die in vitro nachgewiesene Bildung einer LPS- oder CD40- induzierten Resistenz von DC gegenüber dem Perforin-Mechanismus. Durch die Expression eines Serin-Protein-Kinaseinhibitor (SPI)-6, der die Funktion einer kritischen Komponente in der zytotoxischen Granula -Granzym B- hemmt, wird die DNA-Fragmentation und eine Apoptose der Zielzelle unterbunden. Ob sich diese Ergebnisse in vivo reproduzieren lassen 6. Diskussion 61 und welche Bedeutung sie für die Entstehung einer Immunantwort haben werden weitere Experimente zeigen müssen. 6.5 Kinetik der T-Zellexpansion 6.5.1 Charakterisierung des Transfermodells Stimulierte man transferierte TCR-tg T-Zellen mit peptidbeladenen DC, so konnte sich in unserem Modell innerhalb von 6 Tagen sowohl eine Expansion der transgenen Zellen um den Faktor 100, als auch deren darauffolgender Abfall um den Faktor 10 im Blut verfolgen lassen. Am Tag 4, dem Zeitpunkt des maximalen Auftretens der TCR-tg Zellen im Blut machten sie einen Anteil von 20-30% der Gesamt CD8+ Zellen im Blut aus. Vergleicht man diese Kinetik mit den Transferexperimenten von Ludewig (70, 73) , so fällt in unserem Modell der extrem schnelle Wechsel zwischen dem Erscheinen und dem Verschwinden der TCR-tg Zellen im Blut auf. Diese Kinetik ist vermutlich abhängig von der hohen Anzahl der von uns eingesetzten spezifischen T-Zellen zu Beginn des Experimentes. Unsere und die von Ludewig (73) beschriebenen Experimente beruhen auf einem Transfer spezifischer T-Zellen und einer damit für normale Verhältnisse extrem hohen Ausgangszahl spezifischer T-Zellen. Während das naive Repertoire endogener GP33 spezifischer T-Zellen einer B6 Maus in einer Frequenz von 100-200 Zellen pro Milz entspricht , setzten wir zusätzlich 5x105 GP33 (16) spezifische TCR-tg T-Zellen pro Maus ein. Dieses war notwendig, um quantitative Veränderungen als Reaktionen auf die DC-Stimulationen im peripheren Blut überhaupt erkennen zu können und die Antwort möglichst unabhängig von den für uns unsichtbaren TZellen der Empfängermaus in Form der transferierten TCR-tg.Thy1.1 Zellen sichtbar zu machen. Mit der von Ludewig (70) verwendeten neuen Methode der Tetramere zur Erkennung spezifischer T-Zellen verzögerte sich die Kinetik einer solchen Expansion ohne Transfer in einem System mit physiologischer Ausgangsanzahl spezifischer T-Zellen. Das Expansionsmaximum spezifischer T-Zellen von 7% der Gesamtzellzahl CD8+ Zellen erschien erst am Tag 7 nach Transfer im Blut. 6.5.2.1 Was geschieht mit den T-Zellen nach der maximalen Expansion? Wohin die immense Zahl der expandierten T-Zellen an den Tagen 5 und 6 verschwand, konnte nicht nachgewiesen werden. Vermutlich begingen sie Apoptose. Die Kinetik der TCR-tg Zellen glich in den Organen Lunge, Leber, Milz und Lymphknoten der des Blutes und die Zellzahl der TCR-tg T-Zellen fiel im Verhältnis zu den restlichen CD8 Zellen überall 6. Diskussion 62 gleichmäßig ab (Daten nicht gezeigt). Es stellte sich die Frage, ob das schnelle Verschwinden der T-Zellen mit dem vollkommenen Verschwinden spezifischen Antigens im Zusammenhang stand. Betrachtet man die Kinetik eines T-Zell-Transfers nach einer Virusinfektion, so kommt es nach dem Anstieg der Zellexpansion bis zum 8.Tag zu einem langsamen Abfall der spezifischen Zellen über Wochen hinweg. Die Ursache dafür könnte in noch im Körper verbliebenem Antigen liegen und dem Umstand, dass die T-Zellen nach ihrer Stimulation im Gegensatz zu unseren Modellinfektionen noch ein weiteres Mal auf ihr spezifisches Antigen trafen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde ein Experiment durchgeführt, in dem der Maus 4 Tage vor der DC-vermittelten T-Zellexpansion Tumorzellen gespritzt wurden, die das GP33 Epitop exprimierten. Obwohl der Tumor von den TCR-tg TZellen abgestoßen wurde, unterschied sich die abfallende Expansionskinetik der T-Zellen im Blut nicht (Daten nicht gezeigt). Wahrscheinlich benötigt es für eine Aufrechterhaltung der T-Zellexpansion auf sehr hohen Niveau eine Virusinfektion mit großer Antigenproduktion. Das im Gegensatz dazu recht geringe Antigenaufkommen eines soliden, örtlich begrenzten Tumors reichte dafür nicht aus. 6.5.2 Abhängigkeit der T-Zellexpansion vom Zeitpunkt einer zweiten Stimulation Der 4. Tag unserer in vivo Stimulationsexperimente erwies sich in mehrfacher Hinsicht als "Knackpunkt". Der Grund war nicht allein die maximale Expansion der TCR-tg T-Zellen im Blut, sondern mit diesem Zeitpunkt veränderte sich auch abrupt die Reaktion der T-Zellen auf eine zweite Stimulation. Fanden die neu ankommenden, an die MHC-Moleküle der DC gebundenen Antigene die T-Zellen noch in der Teilungsphase in der Milz am Tage 3, so expandierten sie weiter und verdoppelten nochmals ihre Zellzahl, während sich die Stunde der maximalen Expansion im Blut bis zum 6. Tag des Experiments hinauszögerte. Wurden die Peptidantigen-präsentierenden DC an den Tagen 4 oder 6 appliziert, ergab die im Blut verfolgte Expansionskinetik der TCR-tg T-Zellen zwei völlig verschiedene Bilder. Die am Tag 4 injizierten DC stimulierten zwar die transgenen T-Zellen und zögerten das Verschwinden der transgenen Zellen aus dem Blut um einige Tage heraus, vermochten aber keine zweite starke Expansion hervorzurufen. Die am Tag 6 injizierten DC stimulierten, nach einem anfänglichen Verschwinden der spezifischen T-Zellen, diese erneut zu Gipfelwerten von 20-30% aller CD8+ Zellen im Blut. Auf der Suche nach einer Erklärung für dieses Phänomen analysierten wir zuerst, ob sich die Zytotoxizität der in den Milzen befindlichen TCR-tg T-Zellen an den Tagen 4 und 6 voneinander unterschieden. In Bezug auf die Zytotoxizität der einzelnen TCR-tg T-Zelle konnten keine Unterschiede zwischen den beiden 6. Diskussion 63 Tagen herausgearbeitet werden. Aus diesem Grund lässt sich trotz der starken Reduktion der Zellzahl nicht auf einen Übergang der am 6. Tag verbliebenen Zellen ins GedächtnisZellstadium schließen. Die in vitro Daten von Oehen (90) wiesen T-Zellen auf, die zwischen der 6.-10. Zellteilung nach 6-9 in vitro Kulturtagen das Gedächtniszellstadium erreichten, das mit der Heraufregulation der Marker CD44 und CD62L und dem Verlust der T-ZellEffektorfunktionen einhergeht. Setzt man unseren Expansionen einen durchschnittlichen Maximalwert von 25-30 % TCR-tg T-Zellen an den Gesamt CD8+ Zellen voraus, so mussten rein rechnerisch sämtliche T-Zellen 6-7 Zellzyklen durchlaufen, um eine solche Expansion zu generieren. Vermutlich beinhalteten die am Tag 6 aus den Mäusen extrahierte TZellpopulation eine Mischung aus Gedächtnis- und Effektorzellen mit noch ausreichenden Effektorfunktionen. Verglichen wir aber in einem Zytotoxizitätstest die Lysekapazität pro Milzzelle zwischen den Tagen 4 und 6 der Transferexperimente, so ergab sich durch die viel geringere Zellzahl spezifischer TCR-tg T-Zellen am Tag 6 eine zu diesem Zeitpunkt geringere spezifische Lysekapazität. Dass die 5-10% an der Gesamtzellzahl CD8+ T-Zellen am Tag 6 des Transferexperimentes noch verbliebenen CTL es mit Hilfe ihrer Zytotoxizität nicht verhindern konnten, eine weitere Expansion nach erneuter Stimulation durch peptidbeladene DC zu unterbinden, lag vermutlich an der außerordentlich hohen Zellzahl injizierter DC. Sie reichte aus, die T-Zellen nochmals vollständig zu stimulieren und eine zweite, uneingeschränkt hohe spezifische T-Zellexpansion zu generieren. Ludewig (70) immunisierte Mäuse in einem ähnlichen Ansatz ebenfalls durch mehrmalige Injektionen peptidbeladener DC und fand im Gegensatz zu unseren Ergebnissen eine auf die zweite Stimulation folgende eingeschränkte Expansion spezifischer T-Zellen. In seinen Stimulationen verwendete er GP33-Peptid produzierende DC von H8-tg Mäusen und injizierte den Transfertieren dreifach geringere DC-Mengen, die nicht ausreichten, die TZellen vollständig zu stimulieren. Da in unseren Experimenten unter Verwendung höherer DC-Zahlen dieser Effekt Tumorimmunisierungsprotokollen nicht erkennbar scheinbar durch war, kann ausreichend man große ihn in Zellzahlen stimulierender APC ausgleichen. 6.5.2.1 DC-Lysemechanismen in vivo Wurden die DC der 2. Stimulation in unseren Experimenten am 4. Tag injiziert kam es zu keinem zweiten Expansionsgipfel der TCR-tg Zellen im Blut. Als Zeichen einer 6. Diskussion 64 geringfügigen Expansion zeigte sich bei der Betrachtung der Gesamtproliferationskurve TCR-tg T-Zellen lediglich eine verlängertes Sistieren dieser Zellen im Blut. Die Vermutung wurde aufgestellt, dass die antigenpräsentierenden DC durch eine Lyse der für ihr präsentiertes Antigen spezifische T-Zellen eliminiert wurden und nur eine geringe DC Anzahl für eine T-Zell Stimulation bereitstand. Durch die Ausschaltung beider in vitro für die Lyse von DC gefundenen Lysemechanismen bei einer Restimulation am Tag der maximalen TCR-tg T-Zellexpansion entgingen die DC einer schnellen Lyse durch spezifische T-Zellen. Sie vermochten die spezifischen T-Zellen erneut zu stimulieren, was durch eine zweite uneingeschränkte Expansion TCR-tg T-Zellen im Blut sichtbar wurde. In unserem System spielten damit die beiden für die Lyse peptidbeladener DC in vitro gefundenen T-ZellMechanismen Fas und Perforin auch in vivo als Lysemechanismen für DC eine Rolle. Die verminderte zweite Expansion am Tag der maximalen Auftretens TCR-tg Zellen im Blut konnte nicht in jedem Experiment ausgelöst werden. Vielmehr expandierten die TCR-tg Zellen in einigen Stimulationsexperimenten bei der Applikation der DC am 4. Tag über die 20% Marke an der Gesamtzellzahl CD8+ Zellen im Blut hinaus (Daten nicht gezeigt). Es zeigte sich ein deutlicher Zusammenhang zwischen dem maximalen Niveau der Erstexpansion und dem darauffolgenden Ausgang einer zweiten Expansion. Die Höhe der ersten Expansion musste die Grenze von 20% an TCR-tg Zellen zur Gesamtzahl CD8+ Zellen überschritten haben, um bei der von uns injizierten Zellzahl, ausreichend viele DC für eine sichtbare Einschränkung der zweiten Expansion zu lysieren. Ob die in unserem System angestrebten sehr hohen T-Zellexpansionen für die Verwendung in einem Tumortherapieprotokoll erreichbar bzw. von Nutzen sind, bleibt fraglich. Vielmehr sprechen die schnelle Reduktion der Zahl TCR-tg Zellen auf ein Zehntel ihres Maximalen Wertes und die Effektivität auch geringer spezifischer T-Zellzahlen bei der Tumorbekämpfung gegen den Standpunkt: je mehr spezifische T-Zellen umso besser die Immunantwort. Somit relativiert sich auch die Erkenntnis, dass man die Verringerung der TZellexpansion aufgrund der Lyse von DC durch Applikation einer ausreichend hohen Zahl stimulierender APC ausgleichen kann. Denn ob bei einer geringen Ausgangszahl spezifischer T-Zellen die Lyse von DC überhaupt eine ernst zu nehmende Bedeutung hat, bleibt ungewiss. Auf der Suche nach den T-Zell Effektormechanismen in vivo fand Ludewig in seinen Experimenten eine von den Mechanismen Fas und Perforin unabhängige, spezifische Elimination von DC. Als Lysemechanismus postulierte er eine spontane Apoptose, die durch Zytokine, wie CD40L und TNF- verzögernd und durch IL-10 akzelerierend moduliert wird. 6. Diskussion 65 6.6 Sinn einer DC Elimination Die Abgrenzung des Organismus zu seiner Umgebung mit der damit verbundenen Elimination eindringender Erreger könnte man neben der Selbsttoleranz als das oberste Ziel des Immunsystems betrachten. Die Lyse von DC, deren Hauptaufgabe in der Initiierung einer schnellen Immunantwort besteht, würde der schnellen Entwicklung einer Immunantwort im Wege stehen und nur im Falle einer Virusinfektion der DC selbst einen Sinn bereiten. Doch ein Organismus muss mit seinen Ressourcen haushalten. Eine Immunreaktion sollte einerseits an die Dimension der Infektion angepasst sein, andererseits nach Eliminierung des Erregers ein schnelles Ende finden. Wie schon einige Mechanismen zur Beendigung einer Immunantwort durch Verringerung der Anzahl der spezifischen T-Zellen gefunden wurden , so sollte auch ein Mechanismus existieren, der eine Ebene tiefer verhindert, (19, 25, 33, 56, 69, 117) dass antigenbeladene DC fortwährend dieselben Antigene an T-Zellen präsentieren, was zu einer überschießenden Immunantwort führen würde. So könnte man die Lyse der DC als einen sehr kurz geschlossenen Rückkopplungsmechanismus betrachten, bei dem eine überschießende Immunantwort durch eine exzessive Weiterstimulation bei Akkumulation antigenbeladener DC in der Milz verhindern wird. Durch die Eliminierung der alten DC wird Platz für neue, in die LN einwandernde geschaffen, die ein aktuelles Antigenbild der in den drainierten Organe gefundenen Erreger entwerfen könnten. Die Lyse von antigentragenden DC könnte die Herausbildung einer Immunantwort gegen ein zweites T-Zellepitop des Erregers verhindern. Im Falle eines Antigens mit mehreren Epitopen würde das Immunogenste aufgrund der Herstellung der schnellsten Immunantwort begünstigt werden, was zur Verbesserung der Immunantwort gegenüber einem Erreger führt. Derselbe Mechanismus könnte aber auch fälschlicherweise die Herausbildung einer weiteren Immunantwort unterbinden, die unabhängig von der ersten besteht (44). 7. Literaturverzeichnis 66 7. Literaturverzeichnis 1. 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Lebenslauf 76 8. Lebenslauf Name: Oemus Vorname: Holger Eltern: Mutter: Dr. med. dent. S. Oemus-Rumpf, geb. Wehnert; Zahnärztin Vater: Dr. med. dent. R. Oemus; Kieferorthopäde Geburtsdatum: 20. Januar 1975 Geburtsort: Leipzig Schulbildung: 1981-1989 Polytechnische Oberschule „Walter Ulbricht“, Leipzig 1989-1993 Reclam-Gymnasium, Leipzig 1993-1995 Arbeiter-Samariter-Bund Zivildienst: Krankentransport, Rettungsdienst Ausbildung zum Rettungssanitäter Studium: WS 1995-SS1998 Studium der Medizinischen Humanmedizin an der Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität in Freiburg i.Br. WS 1998-SS 1999 Stipendium im Rahmen des Erasmus- Programmes an der Universita Catolica del Sacre Cuore in Rom WS 1999-SS 2001 Fortsetzung des Humanmedizinstudiums an der Albert-Ludwigs-Universität in Freiburg i.Br. WS 2001 Wechsel an die Rheinische Friedrich-WilhelmsUniversität in Bonn SS 2002 Beginn des Praktischen Jahres an der F.-W.Universität in Bonn Examina: 08/1997 Ärztliche Vorprüfung 08/1998 Erstes Staatsexamen 03/2002 Zweites Staatsexamen 9. Dank 77 9. Dank Diese Arbeit ist nicht durch mein alleiniges Zutun entstanden. Zu ihr trugen alle Mitarbeiter des Labors einen Teil mit bei, sei es durch die wissenschaftlichen Gespräche, Diskussionen und Hinweise, die der Arbeit zusätzliche Tiefe, Richtung und Form schenkten, ein nettes Lächeln im Gang oder das füreinander Einspringen in Zeiten, in denen einem die Zellen auf den Kopf fielen. Diese kleinen, oft aber auch sehr großen Zutaten schafften es, dass diese doch sehr zeitintensive Arbeit in einem familialen Rahmen an einem gern besuchten Ort mit Freude und Lust zustande kam. Professor Hanspeter Pircher betreute die Arbeit mit Begeisterung, Engagement, Flexibilität, Ideen und Anregungen so intensiv, als wäre ich sein einziger Doktorand, obwohl er sicherlich jeden Mitarbeiter des Labors in gleicher Weise bedachte. Ihm gilt mein herzlichster Dank mit dem Wunsch, dass Freude, Spaß, Glück und Erfolg seine Zukunft begleiten. Professor Simon stellte sich spontan und kooperativ der Bitte um Zweitkorrektur dieser Arbeit. Herzlichen Dank um die zeitliche und geistige Auseinandersetzung mit diesem Text. Aber ebenso machte ich Schulden bei allen anderen Angehörigen des Instituts, die mich nicht nur während der Doktorarbeit freundlich, offen und helfend in ihre Gruppe aufnahmen, mir das technische Handwerkszeug in die Arme legten und mir mit Wort und Tat beiseite standen, sondern die mich auch in der Freizeit begleiteten, an die ich gern zurückdenke und die mir zum Teil zu lieben Freunden erwachsen sind. Aus diesem Grund danke ich Stephen Batsford, Ulrike Blohm, Rainer Bronner, Stephan Ehl, Eva Häfner, Thomas Ihmhof, Marie Koschella, Tobias Ostler, Dan Potthoff, Armelle Prévost-Blondel, Marlies Rawiel, Evelyn Roth, Johannes Schwartzkopff, Heike Unsoeld, David Vöhringer, Christine Zimmermann und allen nicht namentlich erwähnten Mitarbeitern des Institutes. Ich wünsche Euch allen beruflich und privat eine glückliche Zukunft. Paloma war der liebe Geist, der im Hintergrund wirkte, mich verständnisvoll auch an den Wochenenden gewähren ließ und mir Kraft und Frohsinn schenkte. Meine Eltern sprangen neben den „technical supportings“ während des gesamten Studiums an entscheidender Stelle ein, um diesen Text in ein für unsere Sprache verständliches Gefüge zu setzen. Habt vielen herzlichen Dank.
