Fallstudie 11

Versuchsbeschreibung
Martina Brenner, UHOH, Fachgebiet 220b (Parasitologie)
Ziel der Studie ist eine Virulenzanalyse des Parasiten Sarcocystis singaporensis in
seriellen Passagen, um die Interaktion von Wirt und Parasit zu untersuchen.
Dazu wurden 3 Rattenrassen verwendet, BN, LEW und WAG, welche sich durch
unterschiedliche MHC-I-Komplexe auszeichnen. Bei anderen Protozoen wurde bereits
festgestellt, dass sich der MHC-I-Komplex, der eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr
spielt, auf die Virulenz des Parasiten auswirkt.
Dies sollte nun auch bei Sarcocystis singaporensis untersucht werden. Andere
Faktoren, die neben dem Immunsystem des Wirts einen Einfluss auf die Parasitendichte
nehmen könnten, wie z.B. Infektionsweg, Infektionsdosis, Geschlecht und Alter des
Tieres, wurden konstant gehalten.
Parasit: Sarcocystis singaporensis
Zwischenwirt: Ratten (3 verschiedene Rattenrassen wurden in dieser Studie
untersucht)
Endwirt: Schlangen (für den Zyklus wurde jeder Rattenrasse eine eigene Schlange
zugeteilt, die immer nur mit den Cysten aus einer bestimmten Rattenrasse infiziert
wurde)
Eine Passage lief dann folgendermaßen ab:
Die Ratten wurden oral mit Sporozoiten infiziert. Die Parasiten vermehren sich in den
Ratten und bilden Muskelcysten, diese Cysten sind wiederum infektiös für die Schlange,
in der sich der Parasit nach dem Verzehr von Ratten ebenfalls vermehren kann.
Anschließend wurden aus dem Kot der Schlange die Sporozoiten isoliert und zur
Durchführung einer weiteren Passage wieder oral in Ratten appliziert.
Pro Rattenrasse wurden 8 solche Passagen durchgeführt, wobei pro Passage und
Rattenrasse jeweils 9 weibliche Tiere infiziert wurden.
Nach 120 Tagen wurden diese Tiere getötet und die Zahl der Muskelcysten bestimmt,
sowie Blutproben entnommen. Je 2 Ratten wurden anschließend an die entsprechende
Schlange verfüttert, um neue Sporozoiten für die nächste Passage zu erhalten.
Die Blutseren sollen jetzt immunologisch untersucht werden, um zu überprüfen,
ob evtl. bestimmte Antikörper einen Einfluss auf die Cystendichte haben. Und ob
es Korrelationen zwischen den Antikörpern und der Cystendichte gibt.
Getestet wurden die Antikörper IgG1, IgG2a und IgG2b.
1
Bei den BN-Ratten konnten zudem keine 8 Passagen durchgeführt werden, da schon in
der 6. Passage keinerlei Cysten mehr gebildet wurden.
Bei den LEW- und den WAG-Ratten wurden dagegen immer 8 Passagen durchgeführt.
Es soll nun untersucht werden, ob tatsächlich eine Korrelation zwischen den
gemessenen Werten der Antikörper und der Cystendichte besteht.
Ich habe die gemessenen Werte als pdf-Datei angehängt.
In Spalte 1 stehen die Tiere z.B. WAG 3 VI bedeutet, dass es sich um eine WAG-Ratte
handelt, Tier Nr. 3 (von 9 infizierten Tieren) und die römische Zahl steht für die Passage,
also hier Passage 6.
OD bedeutet optische Dichte (hier habe ich jeweils eine 3fach Bestimmung gemacht),
diese Werte zeigen mir die Antikörperdichte.
Aus diesen 3 Werte habe ich den Mittelwert (MW) gebildet und zusätzlich einen relativen
Faktor.
Mit dem relativen Faktor kann ich alle Werte eines Antikörpers miteinander vergleichen.
(Für die Werte habe ich die höchste Positivkontrolle innerhalb eines gemessenen
Antikörpers =1 gesetzt und den niedrigsten blanc =0 und die Mittelwerte relativ dazu
umgerechnet).
Zusätzlich habe ich eine pdf-Datei beigefügt (Subklassen), die die Ergebnisse des
Versuchs im Vergleich mit der Cystendichte zeigen (Balkendiagramme).
Jede Rattenrasse wurde auf die Antikörper: Gesamt-IgG, IgG1, IgG2a und IgG2b
getestet.
Jeder Balken steht für ein Tier, jede Farbe steht für eine Passage (da ich nur Blutseren
ab Passage 4 habe, konnte ich auch erst ab dieser Passage testen).
Bei den BN-Ratten brach die Passage 6 zusammen, es wurden keine Cysten mehr
gebildet, deshalb wurden hier noch zusätzlich Ratten mit der doppelten und dreifachen
Infektionsdosis infiziert, aber auch hier wurden keine Cysten in der Ratte gebildet
(dargestellt als 2 rote Balken am Ende der 6. Passage bei den BN-Ratten).
Für mich interessant sind vor allem die WAG und LEW Ratten, da BN etwas aus dem
Rahmen fällt.
Kovarianzanalyse

Für jede Rasse und jede Antikörper kann man eine Regression der Zystenzahl auf
die Menge an Antikörper durchführen:
2
yi =  + xi + ei
(1)
wobei yi = Zystenzahl,  = Achsenabschnitt,  = Steigung, xi = Antikörpermenge
(OD), ei = Fehler.

Es sind zusätzlich die unterschiedliche Durchgänge zu beachten: Es kann sein, dass
die Regressionsgeraden je nach Durchgang jeweils einen anderen Achsenabschnitt
und eine andere Steigung aufweisen. Um dies zu berücksichtigen, kann das Modell
erweitert werden:
yij = j + jxij + eij
(2)
wobei j ein Index für den Durchgang ist. Um nun die Hypothesen für Gleichheit der
Durchgänge zu prüfen, kann das Modell wie folgt reparametrisiert werden:
yij = ( + j) + ( + j)xij + eij
j
(3)
j
=  + j + xij + jxij + eij
Bei Gleichheit der Steigungen in den Durchgängen ist 1 = 2 = 3 = ...
Bei Gleichheit der Achsenabschnitte in den Durchgängen ist 1 = 2 = 3 = ...

Für die Anpassung des Modells (2) benötigt man eine Variable DURCHGANG,
welche die Durchgänge kodiert. Außerdem muss der Datensatz die Variablen
ZYSTEN (Zystenzahl) und MW (Mittelwert der OD-Werte des Antikörpers) haben.

Anweisungen für LEW IgG1:
proc glm;
class durchgang;
model cysten=durchgang mw mw*durchgang;
run;
yij =  + j + xij + jxij + eij
Die Varianzanalyse zeigt einen Test für jeden Modelleffekt. Wenn ein Term nicht
signifikant ist, kann das Modell entsprechend reduziert werden.
Auswertungen LEW und WAG:
LEW IgG1
Source
durchgang
MW
MW*durchgang
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
4
1
4
1420806.506
3137.018
14367.672
355201.626
3137.018
3591.918
58.96
0.52
0.60
<.0001
0.4753
0.6677
3
Wechselwirkung jxij ist nicht signifikant. Ebenso ist die durchschnittliche Steigung xij
nicht signifkant. Es gibt also keinen Zusammenhang zwischen Antikörpertiter und Zahl
der Zysten. Dagegen sind die Achsenabschnitte signifikant verschieden. Es gibt also
zwischen den Durchgängen Unterschiede in der durchschnittlichen Zystenzahl.
Das selbe gilt für die folgenden Fälle:
LEW IgG2a:
Source
durchgang
MW
MW*durchgang
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
4
1
4
1420806.506
5.906
2227.434
355201.626
5.906
556.858
54.98
0.00
0.09
<.0001
0.9761
0.9862
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
4
1
4
1420806.506
3048.201
4333.075
355201.626
3048.201
1083.269
56.26
0.48
0.17
<.0001
0.4917
0.9515
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
4
1
4
571600.1724
822.4617
14045.1131
142900.0431
822.4617
3511.2783
18.71
0.11
0.46
<.0001
0.7447
0.7646
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
4
1
4
571600.1724
1147.2498
30185.2047
142900.0431
1147.2498
7546.3012
19.94
0.16
1.05
<.0001
0.6915
0.3941
LEW IgG2b:
Source
durchgang
MW
MW*durchgang
WAG IgG1:
Source
durchgang
MW
MW*durchgang
WAG IgG2b:
Source
durchgang
MW
MW*durchgang
Nur für WAG IgG2a sieht es anders aus:
Source
durchgang
MW
MW*durchgang
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
4
1
4
571600.1724
5791.7977
72645.7590
142900.0431
5791.7977
18161.4398
24.56
1.00
3.12
<.0001
0.3253
0.0269
Die Steigungen unterscheiden sich signifikant, aber die durchschnittliche Steigung ist
nicht signifikant. Daher geben wir die Steigungen der verschiedenen Durchgänge aus.
Hierzu wird wieder die Parametrisierung (1) gewählt. Die Option NOINT in der MODEAnweisung unterdrückt die Zerlegung des Achsenabschnittes nach j =  + j.
proc glm data=LEW_IgG2a;
class durchgang;
model cysten=durchgang mw*durchgang/solution noint;
run;
4
yij = j + jxij + eij
Estimate
Standard
Error
t Value
Pr > |t|
540.2880971
67.6625963
171.5063243
115.9906963
367.8643902
-379.3642464
-29.0307919
-40.4274057
162.6935511
-1.4818124
88.0133699
74.9768112
77.6075530
110.3933265
57.3228556
114.0532660
85.9693923
86.0716232
112.8148244
61.8386643
6.14
0.90
2.21
1.05
6.42
-3.33
-0.34
-0.47
1.44
-0.02
<.0001
0.3730
0.0337
0.3006
<.0001
0.0021
0.7376
0.6415
0.1582
0.9810
Parameter
durchgang
durchgang
durchgang
durchgang
durchgang
MW*durchgang
MW*durchgang
MW*durchgang
MW*durchgang
MW*durchgang
IV
V
VI
VII
VIII
IV
V
VI
VII
VIII
j
j
Nur im ersten Durchgang (IV) ist die Steigung signifikant (negativ!). Hierdurch wurde die
signifikante Wechselwirkung verursacht. Siehe auch Abb. 1.
Cysten
600
500
400
300
200
100
0
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
MW
durchgang
IV
V
VI
VII
Abb. 1: Kovarianzanalyse für WAG/IgG2a
Literatur
Biometrie-Skript, Kap. 12 (Kovarianzanalyse)
(http://www.uni-hohenheim.de/bioinformatik/lehre/module/biometrie.html)
5
VIII
1.4
1.5
Hans-Peter Piepho, im Juli 2004
Anhang: Komplette Anweisungen für WAG/IgG2a
data WAG_IgG2a;
input
Rasse$ ratte durchgang$
datalines;
WAG 1 IV
0.564 564.3
WAG 2 IV
1.068 170.6
WAG 3 IV
0.738 169
WAG 4 IV
0.625 285.2
WAG 5 IV
0.883 262.2
WAG 6 IV
0.670 110.6
WAG 7 IV
0.565 293.5
WAG 8 IV
1.113 114.8
WAG 9 IV
0.423 370
WAG 1 V
1.278 36.1
WAG 2 V
0.372 73.1
WAG 3 V
0.880 75
WAG 4 V
1.126 45.4
WAG 5 V
0.465 51.8
WAG 6 V
0.727 15.7
WAG 7 V
0.715 31.2
WAG 8 V
1.153 17.2
WAG 9 V
0.668 49.1
WAG 1 VI
0.944 107
WAG 2 VI
0.710 116
WAG 3 VI
1.017 195
WAG 4 VI
1.174 132
WAG 5 VI
1.403 101
WAG 6 VI
0.584 59.6
WAG 7 VI
0.799 122
WAG 8 VI
0.407 197
WAG 9 VI
0.629 204
WAG 1 VII
0.653 260
WAG 2 VII
0.887 371.9
WAG 3 VII
1.233 382.3
WAG 4 VII
1.231 283
WAG 5 VII
1.101 309.9
WAG 6 VII
0.985 281.5
WAG 7 VII
0.997 267.3
WAG 8 VII
0.526 182
WAG 9 VII
0.957 100.3
WAG 1 VIII
0.958
WAG 2 VIII
0.906
WAG 3 VIII
0.278
WAG 4 VIII
0.555
WAG 5 VIII
0.467
WAG 6 VIII
1.421
WAG 7 VIII
0.355
WAG 8 VIII
1.387
WAG 9 VIII
1.150
;
MW
Cysten;
444.2
323.6
296.9
341.4
456.2
323.5
354.3
321.8
437.8
6
symbol i=rl value=dot;
proc gplot data=WAG_IgG2a;
plot cysten*mw=durchgang;
run;
proc glm data=WAG_IgG2a;
class durchgang;
model cysten=durchgang mw mw*durchgang;
run;
proc glm data=WAG_IgG2a;
class durchgang;
model cysten=durchgang mw*durchgang/solution noint;
run;
7