Versuch 2, Dialyse - Ihre Homepage bei Arcor

Blut
Sebastian Frechen, 3978613
Partner: Rojin James, 3976114
Dienstagsgruppe III, 6. Versuchstag
Versuch 1, Gelfiltration, quantitative Bestimmung und
Spektroskopie von verschiedenen Formen des Hämoglobin
Das Hämoglobin besitzt im Körper die entscheidende Aufgabe, O2 und Co2 zu
transportieren.
Hämoglobin ist ein Molekül mit 4 Untereinheiten; jede Untereinheit enthält als
prosthetische Gruppe das Häm, welches ständig an Globin gebunden ist.
Häm besteht aus einem Tetrapyrrol, welches im Zentrum über die 4 Stickstoffatome
(= 4 Liganden) ein Eisenatom als Komplex gebunden hat. Dieser Komplex ist mit 6
Liganden am stabilsten. Der fünfte Ligand kommt vom Imidazolstickstoff eines
Histidins aus der Polypeptidkette des Globins. Der sechste Bindungspartner kann
variieren, da hier verschiedene Substanzen gebunden werden können, die für die
unterschiedlichen Absorptionsspektren des Hämoglobins verantwortlich sind.
Es gibt verschiedene Hämoglobinarten: 1) Cyan-Methämoglobin ([CN-Hb (III)]),Fe2+
wurde mit Hilfe von Hexancyanoferrat zu Fe3+ oxidiert, es ist bräunlich gefärbt, es
besitzt eine Absorptionsbande bei 541 nm und dieser Komplex ist äußerst stabil,
kann aber keinen Sauerstoff transportieren. 2) Oxihämoglobin ([O2-Hb (II)] Der
sechste Ligand ist molekularer Sauerstoff, es ist scharlachrot und es besitzt zwei
Absorptionsbanden zwischen 576 und 540 nm. 3) Desoxihämoglobin ([Hb (II)]) wird
auch als reduziertes Hämoglobin bezeichnet, es ist purpurrot und hat eine
Absorptionsbande bei 555 nm. 4) Carboxihämoglobin ([Co-Hb (II)]) besitzt ein
Kohlenmonoxid-Molekül als sechsten Liganden,es ist kirschrot und hat 2
Absorptionsbanden bei 570 nm und 541 nm.
Im Muskel gibt es ebenfalls ein sauerstoffbindendes Protein, das Myoglobin. Es
erlaubt dem Muskel Sauerstoff zu speichern, um diesen bei akuter Belastung schnell
in den Stoffwechsel einfließen zu lassen. Myoglobin ist ein Monomer, es bindet ein
Sauerstoffmolekül, die Affinität ist höher als beim Hämoglobin.
Der Bohr Effekt: Grundlage des Effektes ist die pH-Wert-senkende Wirkungs des
CO2 welches als oxidatives Stoffwechsel-Endprodukt in tierischen Zellen entsteht
und im Blut mit Wasser zu Kohlensäure dissoziiert. Die Senkung des Blut-pH-Werts
verschlechtert die Affinität von Hämoglobin zu Sauerstoff, sodass dieser ins Blut
abgegeben wird. Dies bedeutet für ein stoffwechselaktives Gewebe, welches einen
sehr hohen CO2-Partialdruck hat, dass es immer bestmöglich mit Sauerstoff versorgt
wird, während ein passives Gewebe, welches gerade einen sehr geringen CO2Partialdruck hat, auch weniger Sauerstoff zugeführt bekommt. Der Bohr-Effekt wirkt
somit regulatorisch auf den Gasaustausch. Auch in der Lunge ist er - wenn auch
weniger - von Bedeutung. Dort kehrt sich der eben beschriebene Effekt um. Der CO2Partialdruck sinkt stark und zwar dadurch, dass CO2 in die Atemluft abdiffundiert,
1
wobei sich die Affinität des Hämoglobins zu Sauerstoff wieder auf das Maximum
steigert.
In der Lunge (Alveolen) herrscht ein Sauerstoffpartialdruck von 100 mmHG (13,3
kPa) und ein CO2-Partialdruck von 47 mmHG (6,3 kPa). Bei diesem
Sauerstoffpartialdruck ist Hämoglobin zu 97% gesättigt.
1.) Gelfiltration
Einleitung:
Beim ersten Teil des ersten Versuchs soll eine Gelfiltration durchgeführt werden. Bei
der Gelfiltration kann man Substanzen nach ihrem Molekulargewicht auftrennen. Es
werden Gele verwendet, deren Partikel definierte Porengrößen aufweisen. Bei der
Passage einer Lösung aus kleinen und großen Molekülen, diffundieren die kleinen
Moleküle auch in die Hohlräume der Gelpartikel, während sich die großen Moleküle
nur im Lösungsmittel zwischen den Partikeln aufhalten. Aus diesem Grund
erscheinen große Moleküle früher im Eluat als kleine.
Durchführung:
siehe Skript
2.) Spektralphotometrie des Hämoglobins
Durchführung:
siehe Skript
Ergebnis:
Blätter mit Kurven der verschiedenen Hämoglobine im Skript von Sebastian Frechen
Auswertung / Diskussion:
1)Diagramm Oxihämoglobin:
Oxihämoglobin hat die niedrigste Absorption mit zwei ausgeprägten Maxima
(Absorptionsbanden). Das erste Maximum liegt bei 540 nm und das zweite liegt bei
575 nm. Unser Oxihämoglobin wies eine scharlachrote Farbe auf. Die gemessenen
Absorptionswerte und unsere Beobachtung stimmen mit den im Skript angegebenen
Literaturwerten annähernd überein.
2)Diagramm Methämoglobin:
Am Anfang der Kurve gibt es 2 Peaks (410nm und 420nm), welche aber sehr
ungenau sind, da das Lambert’sche Gesetzt erst bei Extinktionswerten unter 2 zum
Tragen kommt und somit für genaue Extinktionswerte sorgt. Aus diesem Grund
müssen diese Extinktionswerte nicht weiter berücksichtigt werden.
Es gibt zwei weitere Peaks: Peak 1 bildet ein deutliches Maximum, welches bei 540
nm liegt. Ein weiteres kleines Maximum liegt bei 570 nm. Die Farbe unserer Lösung
ist bräunlich, was ebenfalls den Angaben aus der Literatur entspricht. Allerdings wird
die zweite kleine Absorptionsbande bei 570 nm in der Literatur nicht erwähnt.
3)Diagramm Desoxihämoglobin:
Im Gegensatz zum Oxihämoglobin weist Desoxihämoglobin höhere Extinktionswerte
auf und besitzt das erste Maximum bei 565 nm und ein weniger deutliches, zweites
2
Maximum bei 575 nm. Diese Werte und auch die purpurrote Farbe stimmen ebenfalls
mit den Literaturangaben überein.
Mit Hilfe der Spektralanalyse und aufgrund dieser charakteristischen Absorptionsund Maximum-Eigenschaften kann man verschiedene Hämoglobine voneinander
unterscheiden.
3) Bestimmung von Carboxihämoglobin
Diesen Teilversuch mussten wir nicht durchführen.
Bei Rauchern ist der Carboxihämoglobin-Gehalt erhöht, dies ist warscheinlich auf die
unvollständige Verbrennung beim Rauchen zurückzuführen, wodurch der Raucher
vermehrt Kohlenstoffmonoxid einatmet. Kohlenstoffmonoxid hat eine höhere Affinität
zu Hb als Sauerstoff und bildet somit Carboxihämoglobin.
4) Quantitative Bestimmung des Hämoglobins als Hämoglobin-Cyanid-Prinzip:
Das Hämoglobin II aus dem Blut reagiert mit dem Eisencyanid Fe (CN6) zu
Hämoglobin III. Da HB III eine Absorptionsbande bei 541 nm zeigt, kann diese
Reaktion verfolgt werden.
Durchführung:
siehe Skript
Ergebnisse:
Extinktion bei
546 nm
Extinktion 1
Probe 11
Probe 12
0,378
0,218
Legende für die Berechnung:
ε = 44 * 103 l * mol-1 * cm -1
d = 1 cm
V = 10,05 ml = 201
0,05 ml
MG = 68.000 Da
Probe 11:
Berechnung der Konzentration des HB in g/100 ml Blut:
E=c*€*d
c (mol/l) =
0,378
44 * 103 * l * mol-1 * cm -1 * 1cm
c = 8,591 * 10-6 mol / l
Verdünnungskoeffizient:
V = 201
c = 8,591 * 10-6 mol / l * 201 = 0,00172 mol /l
3
Berechnung c in g/l:
cg = 1,72 * 10–3 mol /l * 68.000 g/mol = 117,42 g/l : 10 = 11,7 g / 100 ml
Probe 12:
6,8 g/ 100ml
Auswertung:
Die Normalwerte für Hämoglobin liegen beim Mann bei 140 – 180 g/l und bei der
Frau bei 120 – 160 g/l. Bei Probe 11 und 12 liegt im Vergleich mit den
Literaturwerten eine Anämie vor.
Fehlerdiskussion:
Wir haben bemerkt, dass wir im Praktikum bei der Berechnung der Hb-Konzentration
einen Rechenfehler begangen haben, da wir den Verdünnungsfaktor in der Eile nicht
berücksichtigt haben. Daher müssten die dort angegeben Werte falsch sein. Wir
bitten Sie, den uns aufgefallenen Fehler nachträglich mit unseren neu berechneten
Werten zu korrigieren.
Versuch 2, Dialyse
Einleitung:
Bei der Dialyse werden niedermolekulare Stoffe anhand ihrer Größe an einer
semipermeablen Membran getrennt, die sie aufgrund des kolloidosmotischen
Druckes passieren. Die Geschwindigkeit wird abhängig von der Stärke des
kolloidosmotischen Druckes und durch das Verhältnis von Membranoberfläche zu
Flüssigkeitsvolumen reguliert.
Bei Patienten mit insuffizienter Nierentätigkeit findet dieses Verfahren Anwendung in
der Entgiftung außerhalb des Körpers („künstliche Niere“).
Durchführung:
siehe Skript
Beobachtung:
Bei Titration bis zum Farbumschlag von lachsrot nach violett wurden folgende
Volumina 0,001 N Hg(NO3)2 verbraucht:
Zeit t [min]
5
10
15
20
30
45
60
Gesamtvolumen
Dialysat vor Entnahme Vges
[ml]
250
245
240
235
230
225
220
4
Verbrauch
V (Hg (NO3)2) [ml]
3,8
7,4
10,3
12,5
14,9
18,6
20,5
Bei Versatz mit Jod-Jodkaliumlösung zeigte der Schlauchinhalt eine tiefblaue
Färbung, während das Dialysat nur eine gelbliche Färbung (verdünntes Jod) zeigte.
Auswertung:
Die Chloridionenkonzentration entspricht der Konzentration der einwertigen
Quecksilberkationen des Titranden. Somit errechnet sich die Anzahl der Chloridionen
in 5 ml nach der Formel:
N(Cl-) = V (Hg (NO3)2) * 0,001N
Die Menge der Chloridionen im gesamten Dialysat errechnet sich durch Multiplikation
mit dem Verdünnungsfaktor, der sich als Vges / 5 ml ausdrücken lässt.
Die Anzahl der Chloridionen, die sich zu Versuchsbeginn im Schlauch befanden,
beträgt 1 mMol, da sich im Ansatz 50 ml 1 M NaCl-Lösung befand, die dann mit
Stärke auf ein Volumen von 250 ml verdünnt wurde.
Im Ansatz befanden sich also 0,2 Mol NaCl pro Liter. In den daraus entnommenen 5
ml für den Schlauch befanden sich also noch 0,001 Mol. Durch die Subtraktion der
errechneten Chloridionen-Mengen für das gesamte Dialysat von diesem 1 mmol,
erhält man die Anzahl der noch im Schlauch befindlichen Chlorid-Anionen.
Beispielrechnung:
Nach 10 Minuten wurden 7,4 ml 0,001 N Hg(NO3)2 bis zum Farbumschlag titriert. Um
den Gehalt an Cl- in 5 ml Dialysat zu erhalten, gilt:
1 mMol = 10–3 Mol
0,001 mMol = 10–6 Mol
also: 7,4 ml * 10–6 Mol
Es befindet sich ein Restvolumen von 245 ml im Dialysebad. Davon werden 5 ml
entnommen und titriert. Dies ist also 1/49 des Gesamtvolumens.
Nun muss man den Gehalt an Cl- im gesamten Dialysat errechnen:
7,4 ml * 0,001 N Hg(NO3)2 * 49 = 0,3626 mMol Cl- im Dialysat
Schließlich muss man noch die bereits verworfene NaCl - Menge subtrahieren, um
die NaCl - Menge im Dialyseschlauch zu errechnen:
1 mMol - 0,3626 mMol - 3,8 * 10-6 = 0,6374 mMol.
Zeit t [min]
5
10
15
20
30
45
60
Gehalt an Cl- in 5 ml
Dialysat
3,8 * 10–6
7,4 * 10–6
10,3 * 10–6
12,5 * 10–6
14,9 * 10–6
18,6 * 10–6
20,5 * 10–6
Gehalt an Cl- im Restgehalt an Cl- im
gesamt Dialysat
Schlauch
0,19
0,8100
0,3626
0,6374
0,4944
0,5056
0,5875
0,4125
0,6854
0,3146
0,837
0,1630
0,902
0,0980
Auf der nächsten Seite findet sich die Auftragung der Chloridionen-Konzentration im
Schlauch gegen die Zeit.
Es kann nachgewiesen werden, dass Chloridionen - dem kolloidosmotischen Druck
folgend - durch die semipermeable Membran diffundiert sind: Dementsprechend sinkt
5
(wie man am Graph erkennen kann) die Cl- - Konzentration im Schlauch. Der
Stärkenachweis durch Jod-Jodkalium zeigt, dass Stärkemoleküle die Membran nicht
passieren konnten, daher zeigt das Dialysat auch keine blaue Färbung. Bei dem
gewählten Material handelt es sich also offensichtlich um eine selektiv permeable
Membran, die von großen Molekülen wie Stärke nicht passiert werden kann.
Versuch 3, Enzymatische Bestimmung der wahren Glucose
Einleitung:
In diesem Versuch soll die Blutglucose im Serum bestimmt werden.
Durchführung:
siehe Skript
Ergebnisse:
Reagenzgläser
Leerwert
Serum 1
Serum 2
Glucose 1
Glucose 2
Extinktion bei
436 nm
0,000
0,361
0,328
0,122
0,134
Ergebnisberechnung:
Verdünnungsfaktor:
Mittelwert von Serum 1 &2:
Mittelwert von Glucose 1& 2:
MW von Glucose:
c Blut
=
E Blut
1,01 mg/ml
0,345
0,128
180,2 G/mol
* 1,01 * 100
E Standard
mg
100 ml
= 0,345 * 1,01 * 100
mg
0,128
100 ml
= 272,2 mg / 100ml
c Blut
= 272,2 mg /100ml = 1,51 mmol * 10 = 15,1 mmol/l
MG Glucose
180,2 g/mol
100 ml
Die Blutglucose im Serum beträgt 15,1 mmol / l.
Versuch 4, Polarimetrie
Einleitung:
Fast alle Monosacharide besitzen ein oder mehrere asymmetrische C-Atome.
Asymmetrische C-Atome können ihre Substituenten in zwei spiegelbildlichen
Anordnungen (Konfigurationen) tragen, die sich nicht zur Deckung bringen lassen.
6
Zucker mit asymmetrischen C-Atomen treten somit in verschiedenen Stereoisomeren
auf. Ein Stereoisomer ist optisch aktiv, d.h. es dreht die Schwingungsebene
polarisierten Lichtes entweder nach rechts oder nach links.
Durchführung:
siehe Skript
Ergebnisse:
Probe 6:
Probe 12:
rechtsdrehend
rechtsdrehend
4,5
5,6
Auswertung:
D 20 =
 (grad) * 100
1 (dm) * c (g/100ml)
Probe 6:
Probe 12:
 D = 4,5 * 100/9 = 50
 D = 5,6 * 100/9 = 62
Im direkten Vergleich mit den Literaturwerten (siehe Skript) können den errechneten
Werten, die Zugehörigkeit zu den verschiedenen Zuckern zugeordnet werden:
Probe 6:
Glucose
Probe 12: Saccharose
7