SMN-(tudor)-Sip

SMN-(tudor-Domäne)-Sip
Expression
- Übernachtkultur mit 50µl aus dem Glycerolstock inokulieren
(pro liter der am nächsten Tag angefangen werden soll müssen 30 ml
Übernachtkultur gemacht werden)
WICHTIG: Ampicillin und Kanamycin zugeben!
- Animpfen der Schüttelkultur mit 1:33 aus der Übernachtkultur und
Inkubation bei 30°C
-Induktion der Kultur bei eine oD595 von 0,5 –0,7 mit 1mM IPTG
Endkonzentration (1ml Zellen entnehmen und abzentrifugieren, Pellet
aufheben.)
-Ernten der Zellen nach 5 Stunden, abzentrifugieren in 1l Bechern
(5000rpm 15 min), einmal in PBS waschen (d.h. in ca 50 ml pro 2 Liter
ausgangsvolumen resuspendieren und im Falcon – 50ml- bei 4200 rpm
für 10 min abzentrifugieren. Pellet wegfrieren oder wie folgt weiter
behandeln (1ml Zellen entnehmen und abzentrifugieren, Pellet
aufheben.).
- Gel der einzelnen Schritte (Gel 1)
Gel der Zellen vor und nach der Induktion, wobei immer 1ml Zellen
abzentrifugiert wird und in 0,2 Vol „oD“ gelöst wird (z.B.: 1ml Zellen mit
0,8 oD595 werden demnach in 160 µl Laemmli Puffer gelöst.)
Aufschluss der Zellen:
Zellpellet in Aufschlusspuffer resuspendieren.
Zugabe von Aprotinin (1:3000) und Leupeptin/Pepstatin (1:1000) aus
Stocks dazugeben, sowie Lysozym 1:1000 aus Stock (10mg/ml).
-Resuspendierte Zellen fuer 30 bis 90 min auf Roller bei 4°C inkubieren
-Ultraschallbehandlung (Branson Sonifier Dicke Spitze, Wert auf 7 und
das Pulsintervall auf 50%/50%. 3 mal für eine Minute behandeln mit
Pausen von ca. 3 Minuten. Die gesamte Behandlung erfolgt in EISWasser Gemisch.
- Aliquot des Lysats für Gel aufheben.
- Zelllysat für 10 minuten bei 10.000 xg abzentrifugieren.
-Aliquot von Supernatant und Pellet für Gel aufheben.
Aufreinigung von SMN-(tudor)-Sip
- Überstand der Zentrifugation auf prä-equlibrierte Talon beads geben
(10ml 50/50 Slurry Talon beads pro Zellpellet aus einem Liter
Schüttelkultur) und für 90 min bei 4°C inkubieren.
- Beads 3 mal mit Aufschlusspuffer waschen (Zentrifugation 2 min bei
1200 rpm in der Megafuge).
- Elution des Komplexes mit Aufschlusspuffer der 100mM Imidazol
enthält.
-Aliquot des Eluats für Gel aufheben.
- Gel der einzelnen Schritte (Gel 2)
- Eluat auf 10 ml (50/50 slurry) Glutathion beads pro Zellpellet von einem
Liter geben, die in Aufschlusspuffer äquilibriert wurden und für 90 min bei
4°C auf dem Roller binden lassen.
-Beads 2 mal mit Aufschlusspuffer waschen und dann 2 mal mit
PreScission buffer waschen. (1. Überstand, entspricht Eluat minus
gebundenem SMN-SIP aufheben und ein Aliquot für das Gel nehmen)
-Prescission-Protease zugeben und entweder für 3 h bei RT inkubieren
(HOT) oder bei 4°C ON , HOT)
-Beads auf eine Einmalsäule geben und Eluat auffangen. Je nach
Proteinmenge mit einem halben bis ganzem Volumen PreScission buffer
nacheluieren.
-Aliquot des Eluats für Gel aufheben, sowie ein Aliquot beads.
- Gel der einzelnen Schritte (Gel 3)
Aufschlusspuffer:
50 mM Tris/Cl
500 mM NaCl
5 mM MgCl2
Elutionspuffer:
pH 7,4
Aufschlusspuffer mit 100mM Imidazol
PreScissionpuffer:
50
150
1
1
mM
mM
mM
mM
Tris/Cl
NaCl
EDTA
DTT
pH 7,0
1 unit schneidet ungefähr 100µg im optimalen (=PreScission) Puffer