WORD-file

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ZUR ENZYMKINETIK ENTWICKELTE PROGRAMME
(TU Braunschweig, Blockpraktikum BB3 für Biologen; Auswahl)
Activity – berechnet Dehydrogenase-Aktivitäten (units, katal)
Composit - simuliert zusammengesetzte Hyperbeln u.v.m. (siehe Anhang)
G0 - Berechnung freier chemischer Reaktionsenthalpien aus Gleichgewichtskonstanten u.u.
Makafil – universelle Dateneingabe; Datenkonversion zwischen verschiedenen Formaten;
Verbinden von ´simple files´ (Einzel-Hyperbeln) zu ´composit files´ (Bindungskurven in Gegenwart
verschiedener Inhibitorkonzentrationen)
MMenten - graphische Darstellung (primär) für Michaelis-Menten Enzyme
V0 - enzymatische Anfangsgeschwindigkeit
Viewafil - Dateninspektion und graphische Ausgabe
0 – Vorab
Die Darstellung in diesem Programmen erfolgt entweder
auf klassische DOS-Weise (Vollbild) oder
als Fenster innerhalb des WINDOWS-Bildschirms
Zwischen diesen Darstellungsweisen kann mit <ALT><RETURN> gewechselt werden. Wo
dieser Wechsel automatisch erfolgt (Graphik) kann er durch die gleiche Tastenkombination
rückgängig gemacht werden.
Bei Zugang über das Internet werden die Programme auf der Festplatte in einem temporären
(unsichtbaren) Ordner zwischengespeichert. Links sind unter
C:\Dokumente und Einstellungen\ihr-name\Recent
zu finden. Gleiches geschieht mit den erzeugten Daten, es sei denn, es wird ein anderer
Zielordner angegeben (für einfachen Zugang empfohlen!).
1 - Messdaten
1.1 Eingeben und Abspeichern
Bequemster Weg: Texteditor wie Notepad
Traditioneller Weg: Eingaberoutine Makafil (umständlicher, da aus dem DOS-Zeitalter;
übernimmt aber die Formatierung und ist das Werkzeug, um mehrere ´simple files´ zum
´composit file´ zusammenzubinden (Option [L]ink).
Formatbeispiel ́simple file ´:
5
Zahl der (x, y) Messpunkte
1
1.1
Wertepaar (x, y), z.B. (Zeit, Extinktion)
2
1.9
4
2.9
8
4.1
16
4.9
1
Formatbeispiel ́composite file ´ (Inhibitionsmessungen):
2
Zahl der ́data sets ´ (Messreihen ohne/mit Inhibitor)
4
Zahl der Messpunkte in ́set 1 ´
0
́side conditions´ (Inhibitorkonzentration)
.02
10
.025 13.5
.03
17.5
.1
30
4
Zahl der Messpunkte in ́set 2 ´
5
́side conditions ´ (Inhibitorkonzentration)
.02
2.5
.025 3.3
.03
4
.1
5.3
1
22
etc.
1.2 Einlesen gespeicherter Messdaten
Eine typische Eingangsfrage der Programme lautet:
enter [D]ata, use the [E]xample or read a [F]ile
-
Das Einlesen eines files wird durch den Tastendruck F <RET> eingeleitet.
Tastendruck D <RET> : Aufrufen der mitgegebenen Dateneingaberoutine (wird nicht
empfohlen! Besser „Makafil“ verwenden, ´file´ abspeichern, dann aufrufen);
Tastendruck E <RET> : Aufrufen eines Arbeitsbeispiels. Mit Hilfe dieses Beispiels
wurde das jeweilige Programm entwickelt. Ein Probelauf mit dieser Option sollte eine
detaillierte Gebrauchsanweisung ersetzen.
1.3 Abspeichern angeglichener Messdaten
Die meisten Programme gleichen die Messdaten durch “nichtlineare Regression” an ein
mathematisches Modell an. Somit wird aus dem obigen Formatbeispiel ́simple file ´ z.B. ein
file
5
1
2
4
8
16
1.117694
1.902887
2.933184
4.022024
4.938678
Dieser ´file ´ wird nach der Abfrage
save fitted data on disk - [P]roceed or [S]kip
durch Tastendruck P <RET> gespeichert und steht dann für die weitere Bearbeitung in
anderen Programmen zur Verfügung. Bei diesen “anderen Programmen” ist z.B. an
graphische Routinen mit hoher Auflösung (GraphPad, Excel...) gedacht. In allen Programmen
2
wird eine vorgeschlagene Option durch P <RET> eingeleitet bzw. durch S <RET>
übersprungen. Wo vorhanden, erfolgt durch Q <RET> (für [Q]uit) ein Rücksprung an den
Programmanfang und durch M <RET> (für [M]ain menu) ein Sprung in das ProgrammMenu.
2 - Ausdrucken von Grafiken
Bild mit <Alt/Return> verkleinern und in die Windows-Welt transferieren (Bild darf
nicht formatfüllend sein !)
Taste <Druck> drücken: der Bildschirminhalt wird in die Zwischenablage kopiert;
MS-Paint öffnen, Bildschirminhalt in das Fenster übertragen (Befehl EINFÜGEN
oder PASTE)
ggf. Farben invertieren:
-
” Klicken Sie im Menü "Bild" auf "Farben umkehren".
relevanten Bildteil ausschneiden und mit KOPIEREN/EINFÜGEN (bzw. COPY/PASTE) in
das gewünschte Textverarbeitungsprgramm (oder ein neues MS-Paint-Fenster) übertragen.
Jetzt kann gedruckt werden.
3 - Was mache ich wenn....
....ich den Sinn einer vom Computer vorgeschlagenen Option einfach nicht verstehe:
die nächstliegende Option/Abfrage befindet sich immer in Bildschirm-Mitte. Was
auch noch möglich ist, findet man am unteren Rand; falls auch dies nicht hilft:
einfach <Return> drücken. In den meisten Fällen gelingt es, den Computer eine
plausible Option ausführen zu lassen.
....ich aus einem Programm (z.B. aufgrund eines Fehlers) nicht mehr herauskomme:
- so lange <Return>
drücken, bis die nächste Frage gestellt wird. Dann
<Strg><Pause> bzw. <Ctrl><Break>) drücken, um in das Programm-Menu
zurückzuspringen.
4 - Wegweiser anhand des "Composit"-Programms in fünf einfachen Schritten
Programmaufruf (Option anclicken); im Programmfenster
[S] drücken
denn es soll der Einfluss der [S]ubstratkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit ermittelt
werden. Mit anderen Worten: aus der [H]yperbolen Abhängigkeit des v von [S] sollen die
Michaeliskonstante (Km) und die Sättigungsgeschwindigkeit (Vmax) durch nichlineare Regression abgeleitet
werden;
-
[H] drücken
Angleichung der Messwerte an eine [H]yperbel; alle Funktionen sind mit einem „fest-verdrahteten“ Beispiel
([E]xample) versehen, das an dieser Stelle aufgerufen werden kann;
-
[E] drücken
es folgt eine Reihe Optionen, die separat aufgerufen werden können. Für einen ersten Schnelldurchgang reicht
es hingegen, jede Frage durch Tastendruck <RET> zu quittieren. Der Computer trifft damit eine plausible
Auswahl und zeigt in dieser Reihenfolge:
eine Graphik mit den anzugleichenden Messdaten
Schätzwerte für Km und Vmax
automatische Übernahme der Schätzwerte (eine eigene Eingabe wäre möglich)
unbeschränkte Parametervariation (´maskieren ´, d.h. Festhalten eines Parameters und
Festlegen von Parametergrenzen, ́bounds´, ist möglich, siehe nächstes Kapitel);
Verbesserung der Schätzwerte (Minimierung der Summe der Fehlerquadrate, ́SSQ´ in zehn
Durchgängen; Angabe der optimierten Parameter);
3
-
-
Abweichungen zwischen Messwerten und optimierten Werten der Reaktionsgeschwindigkeit
´v´
die Möglichkeit, ´v´-Werte für nicht gemessene Substratkonzentrationen [S] zu interpolieren;
die Werte für die angeglichene (optimierte) Hyperbel abzuspeichern, z.B. um sie in einem
externen Graphikprogramm weiter zu verarbeiten oder für Klausuraufgaben verfügbar zu
haben ;-)
explizite Angabe der optimierten Werte für Km und Vmax (zum Notieren), sowie die
optimierten Messwerte (z.B. für eine Graphik per Hand);
eine Graphik, in die zuerst die Originalmesswerte, dann die angeglichenen Messwerte
eingezeichnet werden. Diese Graphik kann durch betätigen der ́Drucḱ-Taste ausgegeben
werden.
4.1 Möglichkeiten beim Gebrauch der Funktionen „mask“ und „bounds“
[C]omposit generiert zur Durchführung einer nichtlinearen Regressionsanalyse Schätzwerte
der anzugleichenden enzymkinetischen Parameter (´definitions and estimates´). Diese können
der Reihe nach durch <Return> übernommen werden und erscheinen dann unter ́enter
estimates of the parameters....´. Statt der Übernahme können an dieser Stelle auch eigene
Schätzwerte eingegeben werden. Anschließend gibt es die Möglichkeit, einzelne oder alle
dieser Schätzwerte zu maskieren (´[M]ask parameter´) oder Grenzen (´[B]ounds´)
vorzugeben, die bei der Variation eingehalten werden. Lassen Sie uns dies anhand des unter
[C]omposit/[S]ubstrate/c[O]operative
(Hill) eingestellten ´[E]xample´
demonstrieren:
[B]ounds: Die Option gibt Grenzen vor, innerhalb derer bei der nichtlinearen Regression variiert werden darf.
So lässt der Hill-Koeffizient nH für eine Variation zwischen [Z]ero und 2 freigegeben, z.B. da es sich um ein
dimeres Protein handelt, bei dem nH aus physikalischen Gründen einen Wert 2 nicht überschreiten kann. Eine
untere Grenze [Z]ero, hier 1E-27, verhindert, dass negative Hill-Koeffizienten (d.h. solche ohne reale
Bedeutung) ausgegeben werden.
Angabe einer ́lower bound´ [Z]ero und einer ´upper bound´ [I]nfinite erzwingt Variation des
Parameters im positiven Bereich. Solche Vorgaben können sinnvoll sein, wenn der Rechner z.B. eine
optimal Anpassung für negative Km-Werte findet. Bitte beachten: die Werte ´0´ oder ´∞´ selbst
würden den Rechner zum Absturz bringen, Stattdessen wird, wie erwähnt, automatisch ein sehr kleiner
(1E-28) bzw. ein sehr großer Wert (1E28) eingesetzt.
[M]ask: Mit großer Sicherheit bekannte Parameter lassen sich fixieren (maskieren) und werden dann von der
Variation ausgenommen.
Es gibt auch die Möglichkeit, sämtliche Parameter zu definieren und zu maskieren. Der Computer
nimmt dann keine Regression vor, sondern konstruiert eine Bindungskurve zu den vorgegebenen
Werten.
Wird (wo vorhanden) die Funktion [O]ffset freigegeben, so versucht der Rechner, durch
Parallelverschiebung der Null-linie eine bessere Anpassung zu erreichen (eine unrichtige
Null-linie kann die Folge systematischer Messfehler sein!).
4.2 Kommunikation mit Mmenten
Sättigungsfunktionen, die in Composit optimiert wurden, können in Mmenten linearisiert
werden, z.B., um ein Inhibitionsmuster auf bekannte Weise im Lineweaver-Burk Diagramm
darzustellen (dieses Verfahren ist legitim, da die Linearisierung nur zur Repräsentation, nicht
aber zur Evaluation benutzt wird). Dazu werden die idealisierten Werte unter [EX]
zwischengespeichert (vergl. Kap. 1.3 und Kursivtext unter 4), auf analoge Weise in
Mmenten eingelesen und einem der vorgesehenen Linearisierungsverfahren unterworfen.
Einstiegsoptionen:
4
-
diagnosis of inhibition
Ki - calculations after
Ki - calculation from
Kis - calculation from
(...only for
[T]ype
[D]ixon
[S]lope
[I]ntercept
mixed-type)
- [N]othing of these
[T] verschafft Zugang zum Lineweaver-Burk Plot. Danach folgt die Option
do you want...
to re[P]lot, re[C]alculate or [Q]uit
und über [P] der Zugang zu allen Linearisierungsoptionen.
5
Anhang:
Transformationen der Michaelis-Menten-Gleichung
(Komponeten in ´Composit´)
v
v
v
v
v
V max [ S ]
Km  [ S ]
Hyperbol (Michaelis-Menten)
V 1  [S] V 2  [S]

K1  [ S ] K 2  [ S ]
Doppelt-hyperbol (Isoenzyme)
V max [ S ]nH
Km  [ S ]nH
Kooperativ (Hill )
V max [ S ]
[ S ]2
Km  [ S ]  (1 
)
Kis
Substrat-Inhibition
Vmax [ A][ B]
KiA KmB  KmA [ B]  [ A][ B]
Mehrsubstratreaktionen
Allgemeine Inhibitionsgleichung (mixed type)
v
V max [ S ]
[I ]
[I ]
Km(1 
Ki )  [ S ](1 
Kis)
 Kis → ∞
 Ki → ∞
 Ki = Kis
: kompetitiv
: unkompetitiv
: nicht-kompetitiv
Kooperative Bindung nach Adair
(hier: allosterisches Protein mit zwei Bindungsplätzen)
v
V max(a  2b)
2(1  a  b)
a  1 K  [S]
1

b  1 K  1 K  [ S ]2
1
2

6
Demonstrations-Files zur Vorlesung vom 31. Januar 2005
A – File Ex4 (negative Kooperativität)
12
.5
2
5
10
15
20
30
40
50
70
90
110
17
38
52
64
70
75
81
86
90
95
99
100
B – File E1ox - Kompetitive Inhibition
4
5
0
.067
.133
.2
.333
.667
5
100
.067
.133
.2
.333
.667
5
250
.067
.133
.2
.333
.667
5
500
.067
.133
.2
.333
.667
.78
1.14
1.42
1.44
1.74
.3
.53
.63
.94
1.62
.07
.305
.43
.6
1.03
.15
.15
.18
.39
.68
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