2% Hämophilie-A-Patienten ohne Mutation im FVIII-Gen

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Schattauer GmbH
2% Hämophilie-A-Patienten ohne Mutation
im FVIII-Gen
C. Uen1, J. Oldenburg2,3, J. Schröder2, H.-J. Brackmann4, W. Schramm5, R. Schwaab4,
R. Schneppenheim6, J. Graw1
1
GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Institut für Entwicklungsgenetik, Neuherberg,
2
Institut für Humangenetik, Universität Würzburg, 3Institut für Transfusionsmedizin und
Immunhämatologie, DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg/Hessen, Frankfurt am Main,
4
Institut für Transfusionsmedizin und Experimentelle Hämatologie, Universität Bonn,
5
Medizinische Klinik, Ludwig-Maximilians-Universität München, 6Universitäts-Kinderklinik
Hamburg-Eppendorf, Abteilung für pädiatrische Hämatologie und Onkolologie, Hamburg
Schlüsselwörter
Keywords
Hämophilie A
Haemophilia A
Zusammenfassung
Summary
In Deutschland leben rund 6000 Hämophilie-A-Patienten. Mit Screening-Methoden können ca. 97% der
Mutationen erfasst werden. Für die restlichen Patienten
werden alle kodierenden Regionen des FVIII-Gens
sequenziert.
Von 1350 Patienten wurde bei 80 Patienten zunächst
keine Mutation gefunden. In fünf Fällen war eine Inversion im Intron 1 verantwortlich, in 16 Patienten wurden
bekannte und bei 19 Patienten neue Mutationen identifiziert. Von den neuen Mutationen lagen 14 in kodierenden Bereichen, die restlichen fünf befanden sich in flankierenden Bereichen von Exons. Neben den als kausal
betrachteten Mutationen wurden fünf Polymorphismen
identifiziert. Weitere Untersuchungen müssen klären, ob
diese Polymorphismen Krankheitsbild und -verlauf beeinflussen.
Überraschenderweise wurde bei 23 der 80 Patienten
keine kausale Mutation in den untersuchten Regionen
identifiziert. Das bedeutet, dass in etwa 2% der Hämophilie-A-Patienten keine Mutation in der cDNA des FVIIIGens gefunden werden kann. Daher müssen auch Mutationen in nicht kodierenden Regionen oder sogar in anderen Genen in Betracht gezogen werden. Eines dieser
Gene kodiert für den von-Willebrand-Faktor (vWF). Wir
identifizieren in zwei Fällen eine Mutation im vWF-Gen.
In Germany, approximately 6000 patients are suffering
from haemophilia A. Screening methods cover 97% of
the mutations. For the other patients the coding sequences of the FVIII gene have to be sequenced in total.
Out of 1350 patients, no mutation was observed in
80 patients. In 5 patients, we observed an inversion in
intron 1. Known mutations were detected in 16 patients, and in 19 cases novel mutations were characterized (14 in coding regions and 5 in flanking introns).
The mutations are mainly base pair substitutions,
small deletions or insertions (max. 4 bp) and predicted
to cause amino acid exchanges or frameshifts leading
to premature stop codons. Moreover, 5 polymorphisms
were identified in exons 14 and 26 as well as in introns
7 and 19. Further studies are necessary to identify
their causative effects.
Surprisingly, in 23 patients out of this subgroup of 80,
no mutation was identified in the FVIII gene. Therefore,
mutations in non-coding areas or even in other genes
have to be considered responsible for the haemophilia A
like phenotype. One of them codes for the von Willebrand factor (vWF). We confirmed in two of our cases
mutations in the vWF gene.
2% Haemophilia A patients without mutation
in the FVIII gene
Hämostaseologie 2003; 23: 1–5
D
ie Hämophilie A ist eine X-chromosomal vererbte Krankheit
(Xp28), an der in Deutschland
etwa 6000 Menschen leiden. Die Häufigkeit beträgt in allen Populationen 1:10000.
Hämophilie A wird durch Mutationen im
FVIII-Gen verursacht, das für den Blutgerinnungsfaktor VIII kodiert. Das FVIIIGen umfasst 186 kb mit 26 Exons und
kodiert für ein reifes Protein aus 2332 Ami-
nosäureresten (4). Die mRNA umfasst
etwa 9 kb und wird hauptsächlich in der
Leber, Milz und in Lymphknoten, aber
nicht oder nur in geringer Konzentration
im Knochenmark, dem peripheren Blut, in
Lymphozyten oder in Endothelzellen nachgewiesen. Die drei Schweregrade bei
Hämophilie A korrelieren mit der Restaktivität des Faktors VIII. Je geringer sie ist,
desto schwerer und häufiger sind Blutungen:
● schwere
Form: FVIII-Restaktivität
<2%,
● mittel schwere Form: FVIII-Restaktivität 2-5%,
● milde Form: FVIII-Restaktivität 5-30%.
Die schweren Fälle betreffen etwa die
Hälfte der Hämophilie-A-Patienten (6).
Die Art der Mutation, die Hämophilie
A hervorrufen, ist vielfältig. Ungefähr 40%
aller schweren Hämophilie-A-Fälle werden von einer Inversion in Intron 22 verursacht (6), während 5-6% von einer Inversion im Intron 1 des FVIII-Gens verursacht
sind. Punkmutationen, die entweder zu
Stopp-Codons oder Aminosäurenaustausch führen, rufen 30 bis 35% der schweren Fälle hervor. Ein weiterer Anteil
ist durch kleine Deletionen/Insertionen
(10%) und große Deletionen (5%) verursacht (2, 7). Zur Analyse der Mutationen
werden
Gradienten-Gelelektrophorese
(DGGE), Einzelstrangkonformations-Polymorphismusanalyse (SSCP) und denaturierende Hochdruckflüssigkeitschromatographie (dHPLC) eingesetzt. Mit diesen
Methoden wurden ungefähr 650 unter-
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Uen et al.
Abb. 1 Identifizierung der Intron-1-Inversion im FVIII-Gen. Bei Intron-1-Inversion (Hämophilie-A-Patienten 3, 14 und
33) ist das PCR-Produkt um ca. 500 bp verkürzt (M: Längenstandard in bp).
Tab. 1 Identifizierte Mutationen in kodierenden Bereichen des FVIII-Gens bei 75 Hämophilie-A-Patienten
schiedliche Mutationen identifiziert. Alle
bisher publizierten Mutationen im FVIIIGen sind in einer Datenbank zusammengefasst und international zugänglich (HAMSTeRs; http://WWW/WebPages/main.dir/
main.htm).
In dieser Studie wurden 80 Patienten
und 30 mögliche Überträgerinnen untersucht, deren Mutation mittels denaturierender Gradientengelelektrophorese
(DGGE), Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP), konformationssensitiver Gelelektrophorese (CSGE) und
chemischer Spaltung von Fehlpaarungen
(CMC) nicht identifiziert werden konnten.
Das gesamte Kollektiv umfasste etwa 1350
Patienten (Oldenburg et al., Hämostaseologie 2003; 23: 6–12). Dafür wurden alle 26
Exons, deren flankierende intronische Bereiche und Promoter des FVIII-Gens komplett sequenziert. Bei 57 Patienten wurden
die kausalen Mutationen identifiziert, allerdings blieb bei 23 Patienten die molekulare
Ursache ihrer Erkrankung ungeklärt.
Patienten,
Material und Methoden
Patienten, DNA
Die Blutproben wurden von verschiedenen
Behandlungszentren an das Institut für
Humangenetik der Universität Würzburg
zur molekularen Diagnostik gesandt. Dort
wurde die DNA nach Standardmethoden
gewonnen (2). In der vorliegenden Studie
wurden 80 Patienten und 30 mögliche
Überträgerinnen analysiert, deren mögliche Mutation mit Methoden von SouthernBlot, CMC, DGGE oder dHPLC nicht
identifiziert werden konnte (2, 7).
PCR, Sequenzierung
Die 80 Patienten und 30 möglichen Überträgerinnen wurden zunächst auf eine Inversion im Intron 1 untersucht (1, 5). Alle
26 Exons des FVIII-Gens, deren flankierende Introns, darüber hinaus nicht kodierende Sequenzen des Promoters (1 kb)
und des 3’-Endes wurden amplifiziert und
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sequenziert. Primer und PCR-Bedingungen wurden der HAMsTERs-Datenbank
entnommen und für die Amplifikation der
Exons 3, 4, 14, 21 und 22 sowie der 3’-UTR
und des Promoters in unserem Labor optimiert (5). Ein Aliquot des gereinigten
PCR-Produkts wurde an einem ABI-3100
Sequenzer unter Benutzung des BigDye
Terminator Cycle Sequenzierungskits (beides Applied Biosystems, Weiterstadt,
Deutschland) sequenziert. Jede identifizierte Mutation oder Polymorphismus wurde durch Wiederholungssequenzierung
bestätigt.
Tab. 2 Mutationen in nicht kodierenden Bereichen des FVIII-Gens
Ergebnisse und Diskussion
Ergebnisse der männlichen Patienten
Unter 80 Hämophilie-A-Patienten wurden
fünf Patienten identifiziert, deren Erkrankung durch eine Intron-1-Inversion hervorgerufen wird (#3, 14, 33, 76 und 79). Diese
Inversion wurde zunächst von Brinke und
Mitarbeitern (3) und später von Bagnall
und Mitarbeitern (1) charakterisiert. Beispielhaft ist die Identifizierung der Intron1-Inversion der Patienten 3, 14 und 33 in
Abbildung 1 dargestellt. Bagnall und Mitarbeiter berichteten, dass diese Inversion
bei etwa 5% der Hämophilie-A-Patienten
vorkommt – unsere Zahlen sind wesentlich
geringer (5/1350 = 0,4%).
Für die restlichen 75 Patienten wurde
ein Protokoll für eine direkte Hochdurchsatzsequenzierung entwickelt, um alle kodierenden Regionen, deren flankierenden
intronische Bereiche und den Promoter des
FVIII-Gens zu sequenzieren. Es wurden
bei 16 Patienten Mutationen identifiziert,
die in HAMsTeRS bekannt waren. Darüber hinaus wurden 19 neue Mutationen
charakterisiert. Die in kodierenden Bereichen entdeckten Mutationen sind in
Tabelle 1 dargestellt.
Bei den hier beobachteten Mutationen
handelt es sich hauptsächlich um Basenaustausche, die entweder zu einem StoppCodon oder zu Aminosäurenaustausch
führen. Zwei Mutationen (R282C und
R2307Q) wurden jeweils in zwei Patienten
(25 und 29 bzw. 41 und 120) gefunden,
Hämostaseologie 1/2003
während die Insertion eines Adeninrests im
Codon 1441 bei drei Patienten (18, 80, 114)
beobachtet wurde. Alle anderen Mutationen wurden jeweils bei einem Patienten
nachgewiesen. In drei Patienten wurden
Mutationen identifiziert, deren Frequenz
insgesamt sehr hoch ist (R593C, R2159C,
R2307Q).
Alle Insertionen eines Adeninrests wurden in kurzen Poly-A-Bereichen gefunden.
Neben Insertionen einer einzigen Base
wurde auch eine Insertion (Patient 9) von
vier Basen identifiziert (insGGAG). Zu
Stopp-Codons führten acht neu identifizierte Mutationen und damit zur Verkürzung des FVIII-Proteins. Die Deletion im
Codon 2319 (delC) führte zum Verlust der
C-terminalen 14 Aminosäuren. Offenbar
spielen diese endständigen 14 Aminosäuren bei der Funktion des FVIII-Proteins
oder für dessen Stabilität im Blut eine
wichtige Rolle. Bei einer neu identifizierten
Deletion fehlten vier Basen (delAAAG;
Patient 72), die an der Position 423 den Verlust eines Lysinrests bedingen sowie eine
Leserasterverschiebung, die ihrerseits zum
Einbau von 21 neuen Aminosäuren führt.
Diese neuen 21 Aminosäuren weisen keine
Homologien mit einem bekannten Protein
auf. Die Deletion zerstört neben der BDomäne auch die Bereiche A3, C1 und C2
des FVIII-Proteins und damit einen großen
Teil des Blutgerinnungsfaktors. Die Häu-
figkeit von Deletionen ist in diesem Bereich besonders hoch. In allen Fällen (1
oder 4 bp Insertion oder Deletion) wird
der reguläre Leserahmen zerstört, und
nach kurzer Zeit bricht die Translation
wegen eines neuen Stopp-Codons ab.
Zusätzlich zu den Mutationen, die in kodierenden Bereichen gefunden wurden,
wurden bei acht Patienten sechs Mutationen in nicht kodierenden Regionen gefunden (Tab. 2). Die Mutation im Intron 6 ist
eine bereits beschriebene Mutation,
während die anderen intronischen Mutationen in dieser Studie zum ersten Mal identifiziert wurden. Die Mutationen in den Introns 6 und 22 wurden in je zwei verschiedenen Patienten (69 und 70 bzw. 6 und 39)
beobachtet. In Patient 35 wurde in der
zweiten Base des Intron 22 ein Austausch
T→A beobachtet. Diese Position ist essenziell für ein korrektes Spleißen in allen Introns. Aus diesem Grund kann vermutet
werden, dass dieser Austausch einen neuen
offenen Leserahmen verursacht. Die Mutation von T→C in den Patienten 69 und 70
an der Position +3 im Intron 6 hat vermutlich den gleichen Effekt wie die Mutation
im Intron 22 und führt wahrscheinlich zu
einem alternativen, aber funktionsunfähigen Spleiß-Produkt. Die anderen intronischen Mutationen sind nicht an derart
konservierten Stellen wie die genannten
Mutationen im Intron 6 und 22. Die expe-
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Hämophilie ohne FVIII-Mutation
Tab. 3 Identifizierte Polymorphismen im FVIII-Gen
rimentelle Überprüfung der möglichen
Auswirkungen auf das Spleißmuster steht
in allen Fällen aus.
Neben funktionellen Mutationen wurden während der Sequenzierung auch Polymorphismen identifiziert (Tab. 3), die die
Funktion des FVIII-Proteins zunächst offensichtlich nicht beeinflussen. Ein erster
Polymorphismus (C→G) wurde in Codon
1241 identifiziert: Er führt zu einem Aminosäureaustausch Asp→Glu. Ein stiller
(bekannter) Polymorphismus wurde in
Exon 14 (Codon 1269 A→C: Ser→Ser)
identifiziert. Da dieser Austausch die Aminosäuresequenz nicht ändert, wirkt er sich
auf das FVIII-Protein nicht aus. Ein weiterer bekannter Polymorphismus wurde in
der 3’-UTR des Exons 26 (Position 8728
A→G) gefunden. Da dieser Bereich nicht
mehr translatiert wird, ist eine Wirkung auf
die Stabilität der mRNA nicht auszuschließen.
Neben den bekannten Polymorphismen
wurden im Rahmen dieser Studie zwei
neue Polymorphismen in den Introns 7
und 19 charakterisiert. Da die Polymorphismen zum Teil bei Patienten vorkommen, für die eine andere Mutation als
kausal betrachtet wird, ist der Effekt dieser
Polymorphismen auf die Funktion des
FVIII-Proteins noch unklar.Auch in diesen
Fällen muss die mRNA der Patienten
direkt untersucht werden, um funktionelle
Aussagen zu ermöglichen.
Analyse möglicher Konduktorinnen
Tab. 4 Mutationen bei Konduktorinnen
Außer den 80 Hämophilie-A-Patienten untersuchten wir auch 30 mögliche Überträgerinnen, bei deren Familien die Mutation
noch unklar ist. Beim Screening auf die Intron-1-Inversion wurde eine Überträgerin
(#90) mit dieser Inversion identifiziert. Bei
vier weiteren Überträgerinnen wurden die
kausalen Mutationen charakterisiert (Tab.
4), die auch in der HAMsTERS Datenbank
beschrieben waren. Die Mutation C→T
(nt 6402), die bei der Überträgerin 32 zu
einem Stopp-Codon führte, war bereits
37-mal in schweren Fällen von Hämophilie
A identifiziert worden. Folge der anderen
drei Mutationen sind unterschiedliche Aminosäureaustausche. Außer kausalen MutaDownloaded from www.haemostaseologie-online.com on 2017-11-03 | IP: 88.99.70.242
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Hämostaseologie 1/2003
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Uen et al.
tionen wurden auch bei den möglichen
Überträgerinnen ebenfalls verschiedene
Polymorphismen gefunden (Tab. 5).
Überraschenderweise wurde in 39 von
80 männlichen Patienten und 25 von 30
möglichen Überträgerinnen keine kausale
Mutation gefunden. Die Patienten ohne
erkennbare Mutation litten an Hämophilie
A unterschiedlichen Schweregrads. Dass in
ca. 2% der Hämophilie-A-Patienten keine
Mutation im FVIII-Gen gefunden wird, beobachteten auch Vidal und Mitarbeiter (9)
an einer geringeren Gesamtzahl (n = 45).
In diesen Fällen kann die krankheitsverursachende Mutation entweder in den
großen Introns des FVIII-Gens oder in
anderen Genen lokalisiert sein, die für mit
dem FVIII-Protein in Wechselwirkung tretende Proteine kodieren. In diesem Zusammenhang ist der von-Willebrand-Faktor
(vWF) zu nennen, ein Protein, das FVIII
bindet. Die entsprechende Region wird
von den Exons 18 bis 24 des vWF-Gens
kodiert. Es ist bekannt, dass Mutationen in
diesem Bereich für die von-WillebrandErkrankung Typ 2N verantwortlich sind
(8). Obwohl die Untersuchungen noch
nicht abgeschlossen sind, wurde in einer
Untergruppe des hier beschriebenen Kollektivs bereits in zwei Fällen eine kausale
Mutation im vWF-Gen identifiziert (Patient #57; vermutliche Überträgerin #47).
Die vorliegenden Untersuchungen haben unser Wissen um die Mutationen im
FVIII-Gen vertieft, die für Hämophilie A
verantwortlich sind. Zusammen mit den
Untersuchungen der Gruppe von J. Oldenburg (Hämostaseologie 2003; 23: 6–12) sind
sie Voraussetzung für funktionelle Überlegungen, welche Bereich des FVIII-Proteins
für die Ausprägung einer schweren oder
leichten Form oder für die Entwicklung
von Hemmkörpern verantwortlich sind.
Außerdem rücken unsere Untersuchungen weitere Aspekte stärker in den Vordergrund: Neben Mutation in den kodierenden Abschnitten, den Exons, spielen sehr
wahrscheinlich auch Mutationen in den Introns eine wichtige Rolle. Dieser Aspekt
kann nur befriedigend geklärt werden,
wenn aus den Spuren der FVIII-mRNA in
Hämostaseologie 1/2003
Tab. 5
Polymorphismen bei
Konduktorinnen
den Blutzellen ausreichend Material für
Untersuchungen gewonnen werden kann.
4.
Schlussfolgerungen
5.
●
●
Es ist zu prüfen, in wie weit die beobachteten Polymorphismen die FVIII
Aktivität beeinflussen.
Etwa 1-2% der Hämophilie-A Patienten sind möglicherweise falsch diagnostiziert. Eine Therapie mit FVIII-Präparaten ohne vWF bleibt in diesen Fällen
möglicherweise ohne Wirkung.
Danksagung
Wir danken Klara Fizi für die technische Unterstützung. Die Untersuchungen wurden teilweise
mit Mitteln des Deutschen Human-Genom-Projekts gefördert (Kennzeichen 01KW9905/9).
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Korrespondenzanschrift:
Prof. Dr. Jochen Graw
GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit
Institut für Entwicklungsgenetik
85764 Neuherberg
Tel. 0 89/31 87 26 10
Fax: 0 89/31 87 22 10
E-Mail: [email protected]
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