Skript Phytopath-Praktikum 2006
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Studiengang Biologie - Hauptstudium SS 2006 Kurspraktikum "Phytopathologie" (Pflanzliche Schaderreger) Praktikumsanleitung Prof. Dr. Jutta Ludwig-Müller 1 2 1. Einleitung Krankheiten und Beschädigungen an Pflanzen gehören zu den normalen Erscheinungen im Werden und Vergehen der Natur. Die Ursachen dafür aufzuklären, um Erkrankungen verhüten oder bekämpfen zu können, ist seit Jahrhunderten das erklärte Ziel der Phytopathologie. Dabei wurde die Erforschung von Krankheiten bis ins 20. Jahrhundert hinein häufig von Spezialisten, z. B. von Entomologen, Mykologen und Bakteriologen isoliert im Hinblick auf Schadursachen bearbeitet. Erst in der 2. Hälfte des 20. Jahrhunderts reifte die Erkenntnis für ein einheitliches Wissensgebiet „Phytomedizin“ heran (Braun 1949), in dem die Spezialgebiete ihren eindeutigen und unanfechtbaren Platz haben. Unter Phytomedizin wird heute die Wissenschaft von kranken und beschädigten Pflanzen und die Fertigkeit, sie "gesund zu erhalten oder zu heilen", verstanden. (Hoffmann u.a. 1994). Sie wird sinnvollerweise in 3 Ebenen gegliedert: - Ätiologie (Ursachenforschung) - Pathologie (Erforschung des Zustandes der kranken Pflanze) - Hygiene und Therapie (Pflanzenschutzforschung). Im Praktikum "Phytopathologie" werden vorrangig Kenntnisse über Krankheiten, die durch Mikroorganismen (Viren, Bakterien und Pilze) verursacht werden, vermittelt. 2. Ziele des Praktikums Ziel dieses Praktikums ist der Erwerb von praktischen Fähigkeiten und Fertigkeiten zum Diagnostizieren, Bonitieren oder Bekämpfen von Pflanzenkrankheiten. Dazu gehören aber auch die Extraktion von Inhaltsstoffen, die etwas mit der Auslösung von Krankheiten zu tun haben. Neben dem Einarbeiten in allgemeine phytomedizinische Arbeitsmethoden, wie z. B. in die Isolierung und Kultivierung von Krankheitserregern sowie in die Infektion von Versuchspflanzen und in die Prüfung von Pflanzenschutzmitteln werden im Praktikum auch spezielle Methoden zur Diagnose von Pflanzenkrankheiten unter Freiland- und Laborbedingungen vermittelt. Dazu gehören auch spezielle Methoden der Virologie, Bakteriologie und Mykologie, beginnend bei Symptomanalysen bis hin zu modernen Diagnoseverfahren, wie z.B. Fluoreszenz- und ELISA-Test. 3 3. Organisation des Praktikums 3.1. Voraussetzungen - Vordiplom - Vorlesung "Phytomedizin" (Prof. Dr. Ludwig-Müller) 3.2.Termine und Ablaufplan Das Praktikum findet in der Zeit vom 3. April bis 13. April 2006 statt. Es wird von Mitarbeitern des Lehrstuhles für Pflanzenphysiologie der TU Dresden (Leitung Prof. Dr. Ludwig-Müller) durchgeführt. Den Abschluss des Praktikums bildet ein Seminar, an dem die Ergebnisse durch die Kursteilnehmer vorgestellt und diskutiert werden sollen. Ablaufplan siehe nächste Seite. Abweichungen von diesem Plan in einzelnen Punkten ist möglich. 4 Ablaufplan Praktikum Phytopathologie I Ort: Institut für Botanik, Neubau Zellescher Weg 20b, Raum 244 Zeit Mo Themenkomplexe 1. Woche 03. 4. 2006 9.20-12.40 Begrüßung, Einführung, Arbeitsschutzbelehrung 4.1. Isolierung von Erregern 4.2. Reinkulturen von Erregern 4.3.1. Umfallkrankheit 4.4. Prüfen von Pflanzenschutzmitteln Video 13.00-16.20 Di 04. 4. 2006 13.00-16.20 Mi Do 4.1.3. Punkt 4 (Teil 2) 4.5. Plasmodiophora-Infektion 05. 4. 2006 9.20-12.40 4.8. 4.8.3. 4.8.4. 4.8.5. 4.8.6. 4.8.7. Mykologie I: Weiß- und Braunfäule Lignin-Peroxidase-Nachweis Chitinnachweis Cellulase in Rhizoctonia Antagonismus zwischen 2 Pilzen 13.00-16.20 4.9. Gibberelline aus Fusarium 06. 4. 2006 13.00-16.20 Fr 4.3.2. Sporensuspension 4.3.3. Sporenkeimung 4.3.4. Infektion 4.8.2. Mykologie II (Fusarium) 07. 4. 2006 9.20-12.40 13.00-16.20 4.8.1. Mykologie III: Organisationsformen phytopathogener Pilze Seite 5 2. Woche Mo Di 10. 4. 2006 9.20-12.40 4.8.8. Mykologie IV: Bestimmung von Polygalacturonase-Aktivität 13.00-16.20 4.10. Mykorrhiza 4.11. pfl. Chitinase-Nachweis I 11. 4. 2006 13.00-16.20 Mi Do 4.11. pfl. Chitinase-Nachweis II 12. 4. 2006 9.20-12.40 4.10. Fortsetzung Mykorrhiza 13.00-16.20 4.11. pfl. Chitinase-Nachweis III Auswertungen 13. 4. 2006 Seminarvorträge 13.00-16.20 Bitte beachten Sie bei dem Versuchsplan, dass viele Versuchsansätze einer kontinuierlichen Auswertung bedürfen, die nicht im Detail im Skript steht und die Sie selbstständig vornehmen sollen. Seite 6 3.3. Laborordnung und Arbeitsschutz Die Teilnahme am Praktikum ist nur nach erfolgter Sicherheitsbelehrung gestattet. Für das Blockpraktikum "Phytopathologie" gilt neben der bereits bekannten "Praktikumsordnung" die "Allgemeine Laborordnung für das Institut für Botanik". Alle Praktikumsteilnehmer sind verpflichtet, sich anhand der in den Laborräumen ausliegenden Exemplare über den Umgang mit Gefahrstoffen, Abfallentsorgung, Lage von Erste-Hilfe-Kästen, Notduschen, Sicherheitsstromabschaltungen usw. zusätzlich zur Sicherheitsbelehrung zu informieren. - In Räumen, in denen mit Mikroorganismen gearbeitet wird, sind Essen, Trinken, Rauchen - sowie Kauen von Kaugummi verboten. - Beim Arbeiten mit Mikroorganismen sind saubere, weiße Arbeitsschutzkittel zu tragen. - Beim Betreten und Verlassen der Räume, in denen mit Mikroorganismen gearbeitet wird, sind die Hände mit Desinfektionslösung zu waschen. - Geräte, die mit Mikroorganismen Berührung hatten, sind nach Benutzung in Gefäße mit Desinfektionslösung zu bringen; niemals auf dem Arbeitsplatz abzulegen!! Impfnadeln werden stets ausgeglüht. - Nach eventuellem Verschütten oder Verspritzen von keimhaltigen Lösungen werden die verunreinigten Flächen oder Geräte mit desinfektionslösungsgetränktem Zellstoff abgedeckt und einige Minuten desinfiziert. 3. 4. Auswertung, Protokolle und Teilnahmebescheinigung Alle Versuche sind mit Protokollen, Zeichnungen, Grafiken oder Fotos auszuwerten. Diese Versuchsauswertungen stellen die Grundlage zum Erhalt der Teilnahmebescheinigung (Praktikumsbeleg) dar. Desweiteren sind für den Praktikumsbeleg erforderlich: - regelmäßige Teilnahme - ein selbst gefertigtes Merkblatt über notwendige Vorarbeiten und durchzuführende Untersuchungen für Krankheitsdiagnosen in der Phytomedizin. Alle genannten Materialien müssen spätestens 2 Wochen nach Praktikumsende abgegeben werden. Seite 7 4. Praktikumsversuche Allgemeine Methoden der Phytopathologie 4.1. 4.1.1. 4.1.2. 4.1.4. 4.2. 4.3. 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.3.4. 4.4. 4.5. Isolierung von Erregern aus frischen Pflanzenmaterial aus Holz aus Bodenproben Reinkulturen von Erregern Rhizoctonia, Fusarium, Alternaria, Botrytis Infektionsmethoden Umfallkrankheit Kiefernkeimlinge, Rhizoctonia, Netzbodengefässe Herstellen von Sporensuspensionen Botrytis, Zählen, Messen, Verdünnungsreihen Sporenkeimung Botrytis oder andere Pilzart Infektion von Tomaten- und Chrysanthemen - Jungpflanzen durch Botrytis (Grauschimmel) Prüfung von Pflanzenschutzmitteln Fungizid-Test (Wirkung von DISCUS) auf: Rhizoctonia, Fusarium, Alternaria, Botrytis, Cladosporium oder Pilz nach eigener Wahl dazu Video über Pflanzenschutzmittel Infektion von Chinakohl durch Plasmodiophora brassicae Spezielle Methoden der Phytopathologie (Diagnosemethoden) 4.8. 4.8.1. 4.8.2. 4.8.3. 4.8.4. 4.8.5. 4.8.6. 4.8.7. 4.8.8. 4.9. Mykologie (phytopathogene Pilze) Organisationsformen phytopathogener Pilze Bestimmung verschiedener Fusarien Nachweis von Braunfäule / Weißfäule Nachweis holzzerstörender Pilze in Kultur (Lignin-Peroxidase) Chitinnachweis in Pilzen Cellulaseaktivität von Rhizoctonia solani auf Nähragar Beobachtung der Wirkungsweise eines auf anderen Pilzen parasitierenden Pilzes Bestimmung von Polygalacturonase-Aktivität Symbiose vs. Parasitismus: Arbuskuläre Mykorrhiza Ausgewählte Versuche zur Phytopathologie 4.10. 4.11. Gibberelline aus Fusarium Pflanzliche Abwehr: Nachweis von Chitinase 8 4.1. Isolierung von Erregern Versuchsziel: - Isolierung von Erregern aus erkrankten Pflanzenmaterialien Pflanzenmaterial: - 4.1.1. unverholzte (weiche) Pflanzenteile mit Befallssymptom - 4.1.2. verholzte Organe mit Pilzbefall Erreger: - zu isolieren Geräte/Reagenzien: - Petrischalen mit Malz-Agar, 3% - Ethanol, 70% - Bunsenbrenner - Pinzette - Drigalski-Spatel Durchführung: 4.1.1. Blätter mit braunen Nekrosen z.B. Rhododendron Mahonia beali syn., oder Berberis japonica var. beali, Hedera helix (gewöhnlicher Efeu) werden 10 bis 15 min mit 0,1% Chinolin geschwenkt und ein bis 3 mal mit autoklavierten Wasser gespült. Die sterilisierten Pflanzenteile werden in sterile 3% Malz-Agar-Platten überführt. 4.1.2. Ein beliebiges Holzstückchen mit visuell erkennbarer Tracheomykose wird kurz über der Flamme eines Bunsenbrenners abgeflammt und in sterile 3% Malz-Agar-Platten überführt. Die Platten von 4.1.1. und 4.1.2.: - mit Parafilm umwickeln, um Austrocknen zu verhindern und Sterilität zu Gewähr leisten - einige Tage bei Zimmertemperatur oder im Brutschrank bebrüten, damit der Erreger aus dem Planzenmaterial herauswachsen kann. Auswertung: - Makroskopische Charakterisierung der isolierten Mikroorganismen - Mikroskopische Untersuchung und Bestimmung einzelner, typischer „Keime“ - Zeichnung (Skizze) charakterisischer Bestimmungs- (Erkennungs-) merkmale - vom vermutlichem Erreger Reinkultur anlegen (ebenfalls auf 3% Malz-Agar-Platten 4.1.3. aus Bodenproben Vorbereitung 14 Tage vor Übung: - - Pythium debaryanum auf Kartoffel-Dextrose-Agar 14 Tage kultivieren, mit Mixer in Wasser suspendieren, Anzuchtkästen a mit gedämpfter, b mit ungedämpfter Erde füllen, Suspensionen getrennt mit Erde (a und b) vermischen. außerdem sollten 2 Anzuchtkästen ohne Infektion hergestellte werden 9 - Agarplatten vorbereiten: Kartoffel-Dextrose-Agar (KDA), Wasseragar + 100 ppm Streptomycinsulfat, wässrige Lösung von 100 ppm Streptomycinsultat Tabaksamen vorbereiten Durchführung: für Pythium: 1. Tabaksamen in verseuchte Anzuchtkästen aussäen, mit Glasscheiben abdecken, bei 25 oC und hoher Luftfeuchtigkeit kultivieren, infizierte Pflänzchen (Umfallkrankheit) in Wasser reinigen, 2 min in Chlorox behandeln und anschließend 3-mal in sterilem Wasser waschen. Erkranktes Gewebe auf KDA und Wasseragar in Petrischalen, erkrankte Pflänzchen in steriles Wasser übertragen. 2. Bodenkrümel aus verseuchten Anzuchtkästen (a und b) sofort auf KDA und Wasseragar übertragen. 3. 25 g Bodenproben in sterile Messzylinder füllen, mit sterilem Wasser auf 250 ml auffüllen, rühren und in sterile 1-l-Erlenmeyerkolben schütten, Proben 30 min schütteln, 1 ml Suspension in 9 ml steriles Wasser pipettieren, schütteln, 1 ml davon in 9 ml steriles Wasser pipettieren (1: 100) und Verdünnungen in derselben Weise bis 1 : 1 000 000 fortsetzen. Jeweils 1 ml der Verdünnungen in 2 sterile Petrischalen pipettieren, mit Wasseragar bzw. KDA (42 oC) beschicken und mit einem Drigalski-Spatel verteilen. Kulturen bei 24-28 oC 5 Tage aufbewahren (Abb. 1). Abbildung 1. Isolierung von Mikroorganismen aus dem Boden mit Verdünnungsmethode Nach ECKERT und TSAO (1962): Teil 1: Frische Kartoffelwürfel (3 mm) 1 h (evt. kürzer inkubieren) lang in wässriger Streptomycinsulfat-Pimaricin-Lösung legen, Bodenproben aus verseuchten Anzuchtkästen in Petrischalen auslegen, mit sterilem Wasser befeuchten, darin Kartoffelwürfel 5-15 h bei 31 oC inkubieren. Teil 2: Kartoffelwürfel in sterilem Wasser waschen, in Wasseragar auslegen und 24 h bei 24 bis 28 oC aufbewahren (Abb. 2). 10 Abbildung 2. Isolierung von Mikroorganismen aus dem Boden mit Kartoffelwürfeln nach ECKERT und TSAO Die in den verschiedenen Isolierungsmethoden auf Nährböden auswachsenden Organismenkolonien auszählen, Prozentsatz von Pythiumkolonien bestimmen. 4.2. Reinkulturen von Erregern Versuchsziel: - Reinkultur eines vermutlichen Krankheitserregers aus einer Mischkultur Erreger: - zu isolieren Geräte/Reagenzien: - Petrischalen mit Malz-Agar, 3% - Malz-Agar-Röhrchen - Ethanol, 70% - Bunsenbrenner - Impfnadel Durchführung: Ein aus dem Pflanzenmaterial (vom Versuch 5.1.) herauswachsender Erreger wird auf MalzAgar-Platten überimpft. Der Pilz muss nach dem Wachsen solange in Agarröhrchen umgeimpft werden bis er in Reinkultur vorliegt. Auswertung - Reinkultur eines phytopathogenen Erregers - Protokoll * Pilzart * Wildpflanze * Nährmedium * Herkunftsort * Isolierdatum * Name des Präparators * Name des Sammlers 11 4.3. Infektionsmethoden 4.3.1. Umfallkrankheit Krankheit: - Umfallkrankheit Versuchsziel: - Beobachtung der Umfallkrankheit bei Pinus sylvestrisKeimlingen, die mit Rhizoctonia infiziert wurden Wirtspflanze: - Gemeine Kiefer (Pinus sylvestris L.) Erreger: - Rhizoctonia sp. Geräte/Reagenzien: - Erlenmeyerkolben, 100 ml - Malzextrakt-Nährlösung, 3% - Homogenisator - Netzbodengefäße - Stereomikroskop Durchführung: 3% Malzextrakt-Nährlösung in 100 ml Erlenmeyerkolben mit Rhizoctonia sp. beimpfen, 3 Tage bei 27°C bebrüten. Das heranwachsende Pilzmyzel wird in der Nährlösung homogenisiert und das Homogenat in Netzbodengefäße gegeben. Die Netzbodengefäße werden mit Pinus sylvestris-Keimlingen (Stadium 7) bepflanzt. Ein Netzbodengefäß ohne Rhizoctonia dient als Kontrolle. Auswertung: - Beobachtung der Kiefernkeimlinge - Bonitur der Schadsymptome - mikroskopische Untersuchungen der Wurzeln und/oder Hypokotyle - Protokoll 4.3.2. Herstellen von Sporensuspensionen Versuchsziel: - Herstellung von Sporensuspension mit definierter Sporendichte Erreger: - Botrytis sp. oder ander Erregerart Geräte/Reagenzien: - Petrischalen oder Röhrchen mit Malz-Agar - Zählkammer nach Neubauer - Erlenmeyerkolben - Pipetten, 1ml u. 10ml - physiologische Kochsalzlösung, 0,9% - Malznährlösung, 3% Durchführung: - 3% Malz-Agar-Platten oder -Röhrchen mit Erregerart beimpfen - bis zur intensiven Sporulierung bei 27°C kultivieren 12 - Sporen mit 10 ml physiol. Kochsalzlösung abspülen - die 10 ml in 1 Reagenzglas füllen (für alle Gruppen) - Ermittlung der Zellzahl dieser Ausgangssuspension - weitere Durchführung siehe 4.3.4. Auswertung: - Sporendichte der Ausgangssuspension mit Neubauer-Zählkammer ermitteln - Herstellung von 2 Verdünnungsstufen mit definierter Sporendichte aus der Sporensuspension - weitere Durchführung siehe 4.3.4. Abbildung 3. Die Neubauer-Kammer A. Zählnetz der NEUBAUER-Kammer: 1 mm2; Tiefe: 0,1 mm 1 cm3 = 1ml Zellen in einem Großquadrat (GQ) = Zellen /0,0001 cm3 (0,1 mm3) Zellzahl Z = Zellen/ml Zellen/GQ * 10000 = Z B. Zählweise: 13 4.3.3. Sporenkeimung Versuchsziel: - Beobachtung der Sporenkeimung auf * Agar-Objektträgern und * im hängenden Tropfen Erreger: - Botrytis sp. oder andere Mikroorganismenart Geräte/Reagenzien: - Petrischalen - Objektträger - Malz-Agar, 3%ig - Malznährlösung, 3%ig - Sprühflaschen - Pipetten Durchführung: Zur Sporenkeimung stellt man sich aus einer Petrischale von 90 mm Durchmesser eine feuchte Kammer durch Einlegen von feuchten Filterpapier und zwei Glasstäben her und sterilisiert sie. Dann legt man auf die Glasstäbe einen Objektträger mit einem dünnen Film von 3% Malz-Agar. a) Darauf werden die Sporen (in 0,9 % Kochsalzlösung) mit einer Pipette aufgetropft. b) Manche Sporen keimen im hängenden Tropfen besser: Ein Tropfen Nährlösung mit Sporen wird mit einer Pipette auf ein Deckgläschen gebracht. Vor dem Aufbringen des Deckgläschen auf einen Objektträger mit Hohlschliff wird es durch einen Gummiring gestützt. Auswertung: - Petrischalen sind bei 27°C aufzustellen - in regelmäßigen Zeitabständen überprüfen (manche Pilze keimen nach 1 Stunde, manche erst nach längerer Zeit) - Anzahl gekeimter Sporen ermitteln - Sporenkeimung im Zeitverlauf protokollieren - Keimverlauf grafisch darstellen - Anzahl gekeimter zu ungekeimten Sporen ins Verhältnis setzen 4.3.4. Infektion Krankheit: - Grauschimmel (Botrytis cinerea Pers.ex Nocca Balbis) Versuchsziel: - Beobachtung des Verlaufs von Grauschimmel-Erkrankungen Wirtspflanze: - Tomaten (Lycopersicon esculentum Mill.) und ChrysanthemenJungpflanzen (Chrysanthemum sp.) Erreger: - Botrytis cinerea oder Erreger nach Wahl - 2 Sporensuspensionen unterschiedlicher Dichte 14 Geräte/Reagenzien: - dest. Wasser - Sprühflaschen Durchführung: Sporensuspension aus Versuch 4.3.2. auf Testpflanzen mit einer feinen Spritzflasche aufsprühen. Vor der Ausbringung der Sporensuspension werden die Pflanzen mit dest. Wasser besprüht. Die Pflanzen werden unter definierten Luftfeuchtigkeitsverhältnissen, Licht und Temperatur in der Phytokammer kultiviert. Kontrollpflanzen nur mit dest. Wasser besprühen. Auswertung: Die Pflanzen werden auf Grauschimmel bonitiert (Protokoll). 0 = kein Schaden 0,5 = vereinzelt graue oder braune Blattspitzen, Farbtonänderung 1 = Schaden verstärkt sich auf 20% der Pflanze 2 = Schaden verstärkt sich auf 40% der Pflanze 3 = über die Hälfte der Pflanze ist geschädigt 4 = vereinzelt noch grüne Blätter 5 = Pflanze braun, stirbt ab 4.4. Prüfung von Pflanzenschutzmitteln Versuchsziel: - Erkennung der Hemmwirkung unterschiedlicher Konzentration eines Pflanzenschutzmittels Erreger: - Botrytis sp. oder Erreger nach Wahl Geräte/Reagenzien: - Petrischalen - Impfnadel - Bunsenbrenner - Malz-Agar - Fungizid „Discus“ (von BASF) Wirkstoff: Indikation gegen: Wirkungsweise: Kresoxim-methyl Blatt- u. Fruchtschorf, Mehltau wirkt vorbeugend durch Hemmung der Sporenkeimung Durchführung: Es werden 6 Petrischalen mit 3% Malz-Agar gegossen. Zu dem Malz-Agar für je 2 Petrischalen werden vor dem Gießen 0,025% und 0,05% „Discus“ gegeben. 2 Petrischalen ohne Discus werden als Kontrolle verwendet. 15 Versuchsanordnung: Kontrolle Botrytis BK Erreger nach Wahl EK 0,025% Discus Botrytis B 25 Erreger nach Wahl E 25 0,05% Discus Botrytis B 50 Erreger nach Wahl E 50 Die Malz-Agar-(Fungizid) Platten werden punktförmig mit einem Mycelstück in der Mitte der Petrischale beimpft. Bebrütung der Platten bei 28°C im Brutschrank. Auswertung: - makroskopische Beschreibung der Kolonien (Aussehen, Form, Farbe) - Messung des Durchmessers der Kolonien zu verschiedenen Zeiten - Berechnung der Hemmwirkung 16 4.5. Infektion von Chinakohl mit Plasmodiophora brassicae (Kohlhernie) Die als Kohlhernie (deutsch: Kropfkrankheit) bezeichnete Krankheit, in deren Verlauf sich die Wurzeln von befallenen Pflanzen tumorartig verändern, wird durch ein im Boden lebendes Pathogen, Plasmodiophora brassicae verursacht. Diese Pflanzenkrankheit findet sich speziell in der Familie der Kreuzblütengewächse (Brassicaceae). In Europa besonders geschätzte Kulturgemüse wie Chinakohl, Brokkoli, Blumenkohl, Rettich, Weißkohl, Rotkohl und Kohlrabi, aber auch Raps und Senf, gehören zu dieser Pflanzenfamilie. Der Befall durch diesen Parasiten ist eine der häufigsten Krankheitsursachen in der Familie der Kreuzblütengewächse. Schätzungsweise 10 Prozent der Anbauflächen in Nordwest-Europa, Japan, Nord-Amerika und Australien sind mit dem Erreger verseucht, wodurch bis zu 100 Prozent Ernteausfall auf diesen Flächen eintreten kann. Ist die Wirtswurzel vom Pathogen befallen, wird der gesamte Stoffwechsel der Pflanze umgesteuert, und der Parasit kann sich ungehindert in der Wurzel vermehren. Dabei bilden sich große Wurzelgallen, die die Nährstoff- und Wasserversorgung empfindlich stören, was die Blätter an der betroffenen Pflanze verwelken und vergilben lässt. Im Praktikum sollen verschiedene Stadien von P. brassicae mikroskopisch erkannt und skizziert werden. Der Lebenszyklus des Pathogens ist in Abb. 4 dargestellt. Objekt: infizierte Wurzeln von Brassica rapa ssp. pekinensis (Chinakohl) Präparation: Wurzelquerschnitt von Frischmaterial, evtl. Anfärben mit Safranin oder Methylenblau/Azur II Auswertung/Aufgabe: Zeichnung verschiedener Entwicklungsstadien des Pathogens (Plasmodien, Sporangien mit Dauersporen) Abbildung 4. Plasmodien und Sporangien von P. brassicae (links) sowie der Lebenszyklus des obligat biotrophen Parasiten (rechts). PL SP 17 4.8. Mykologie (phytopathogene Pilze) Die Objekte stehen über den gesamten Kurs zur Verfügung. Zu den Beobachtungen im Kurs gehören auch Habituszeichnungen von befallenen Pflanzen, wenn sie zur Verfügung stehen. Alternativ oder ergänzend dazu kann bei der Beobachtung von Schaderregern das Krankheitsbild beschrieben werden. Die Objekte werden fallweise mikroskopiert und/oder unter dem Binokular betrachtet. Von jedem Präparat sollen Zeichnungen angefertigt werden. Zur Beschriftung der Zeichnungen gehört auch die systematische Einordnung der Pilze. Darüber hinaus ist es häufig sinnvoll, auch eine kurze Skizze oder Beschreibung des Lebenszyklus unter Angabe von Ploidiestufen, Karyogamie, Meiose (soweit bekannt) zu protokollieren und die beobachteten Stadien in diesen einzuordnen. 4.8.1. Organisationsformen phytopathogener Pilze Kursobjekte: Pathogener Pilz Pflanzenkrankheit Systematische Objekt Einteilung Kartoffelkrebs Zygomycetes Chytridiales auf Pflanze Schimmel Mucorales Platte Pythium irregulare Wurzelbrand Oomycetes* Peronosporales Platte Phytophthora nicotianae Peronospora parasitica Kraut- und Knollenfäule Falscher Mehltau Peronosporales Platte Peronosporales Platte, auf Pflanze Albugo candida Weißrost Peronosporales auf Pflanze Synchytrium endobioticum Rhizopus stolonifer *keine ‘echten’ Pilze!!! 18 Ascomycetes Taphrinales Platte, auf Pflanze Erysiphales auf Pflanze Erysiphales auf Pflanze Taphrina wiesneri od. deformans Blumeria (ehem. Erysiphe) sp. Microsphaera Narrentasche, Hexenbesen Echter Mehltau Septoria Blattfleckenkrankheit Sphaeropsidales auf Pflanze Venturia Apfelschorf Pseudosphaeriales auf Pflanze Rhytisma Ahornrunzelschorf auf Pflanze Lophodermium Kiefernschütte Phacidiales (incl. Rhytismales) Phacidiales Claviceps purpurea Mutterkorn Clavicipitales auf Pflanze Nectria Rotpustelkrankheit Sphaeriales auf Pflanze Diplocarpon rosae Sternrußtau Basidiomycetes Helotiales auf Pflanze Coleosporium Rostkrankheit Uredinales auf Pflanze Puccinia graminis Weizenrost Uredinales auf Pflanze Tilletia Brandkrankheiten Ustilaginales auf Pflanze Ustilago maydis Maisbeulenbrand Ustilaginales Platte, auf Pflanze Eichenmehltau auf Pflanze Oomycetes Die Ordnung der Oomycetales enthält zahlreiche wichtige phytopathologische Krankheitserreger, die weitgehend alle zur Familie der Peronosporales gehören, z.B. falscher Mehltau. Die Unterschiede liegen in der Lebensweise und der Ausbildung der ungeschlechtlichen Sporenformen, charakteristisches Bestimmungsmerkmal ist die Form der Sporangienträger. Die eigenlichen "Falschen Mehltaupilze" gehören zu den Peronosporeae und werden durch die Gattungen Peronospora, Plasmopora und Bremia repräsentiert. Die Sporangienträger wachsen aus den Spaltöffnungen der Blattunterseite heraus und bilden einen dünnen weißen Belag. Die Sporangienträger haben ein begrenztes Wachstum (im Gegensatz zu Phytophthora) und die Sporangien werden immer apikal abgeschnürt. Die Träger sind bei diesen drei Gattungen immer gabelig verzweigt. 19 Ascomycetes Die Erysiphales umfaßt eine Gruppe obligater Parasiten, die ektoparasitisch ihre Wirtspflanzen mit einem dichtem weißen Mycel überziehen (echter Mehltau). Die Erysiphaceae bilden einzellige Konidien und kugelige geschlossene Fruchtkörper, sogenannte Kleistothecien. Taxonomisch sind die Anhänge an den Kleistothecien interessant und gliedern die Familie in mehrere Gattungen. Von verschiedenen Ascomyceten sollen sowohl das Erscheinungsbild der kranken Pflanze als auch unterschiedliche Stadien gezeichnet werden. Bsp.: Mycel und Konidien, Fruchtkörper Microsphaera alphitoides (Eichenmehltau) - Erkennen krankheitstypischer Merkmale des Eichenmehltaus - Erkennen der Fruchtkörper (Kleistothecien) mit den charakteristischen Anhängseln Venturia inaequalis (Apfelschorf) - Erkennen krankheitstypischer Merkmale des Apfelschorfs - Erkennen der Pseudothecien mit Asci und Ascosporen Rhytisma acerinum (Ahornrunzelschorf), auch als Teerfleckenkrankheit des Ahorns bezeichnet - Erkennen der Sklerotien mit reifen Apothecien - Erkennen der Apothecien mit Asci und Paraphysen Claviceps purpurea (Mutterkorn) - Erkennung krankheitstypischer Merkmale an Ähren mit Mutterkornbefall - Erkennen von Pseudoparenchym in Sklerotien Nectria cinnabarina (Rotpustelkrankheit) - Erkennung krankheitstypischer Merkmale der Rotpustelkrankheit - Erkennen der Sporodochien und Perithecien - Erkennen der Asci mit Ascosporen Lophodermium seditiosum (Kiefernschütte) - Erkennung krankheitstypischer Merkmale der Kiefernschütte - Erkennen der Hysterothecien mit Asci und Ascosporen Septoria nodorum (Blattfleckenkrankheit) - Zeichnung der Sporen - Auffinden von kugeligen bis linsenförmigen Pyknidien 20 Basidiomycetes a. Rostkrankheiten - Erkennen krankheitstypischer Merkmale - Erkennen der Sporen (Aecidosporen) b. Brandkrankheiten - Erkennen krankheitstypischer Merkmale - Erkennen der Sporen - Achtung: manche Pilze sehen auf Platten ganz anders aus! c. Wurzel- und Stammkrankheiten - Hallimasch (Armillaria mellea) - Erkennen von Rhizomorphen und ihre Unterscheidung von Wurzeln Durchführung: - Rhizomorphen und Feinwurzeln lupenmikroskopisch betrachten - Querschnitte mit der Rasierklinge per Hand anfertigen von a. Rhizomorphen b. Feinwurzeln und Anfertigung einer vergleichenden Skizze mit Beschriftung d. Hausschwamm (Serpula lacrimans) - Erkennen des gefährlichsten Braunfäule-Erregers an verbautem Holz Durchführung: - Fruchtkörper, Rhizomorphen und Mycelien mikrokopisch betrachten - ein Stück des Fruchtkörpers mit KOH beträufeln - Querschnitte mit Rasierklinge anfertigen - Querschnitte in Wasser oder Lactophenol mikroskopieren und Hyphenarten unterscheiden Skizzen von: - Grundhyphen - generative Hyphen - Bindehyphen - Skeletthyphen - Strukturen auf Zellwänden von Hyphen (Balken-, Ring- oder Warzenverdickungen) - Schnallen 4.8.2. Bestimmung verschiedener Fusarien - Makro- und Mikrosporen, Clamydosporen (Dauersporen) 21 4.8.3. Nachweis von Braun- und Weißfäule Versuchsziel: Nachweis von Cellulose und Lignin im gesunden, weißfaulen und braunfaulen Holz Wirtspflanze: Birke (Betula pendula Roth.) Holz, weißfaul, braunfaul, unverpilzt Erreger: Zunderschwamm (Fomes fomentarius), Birkenzungenporling (Piptoporus betulinus) Geräte und Reagenzien: Durchführung: * * * * Mikroskop Präpaprierbesteck Rasierklinge Astrablau – Safranin – Lösung (verholzter Teil wird mit Safranin angefärbt) (5% Astra-Blau in 0,5%iger Essigsäure gelöst) * Phloroglucin-Salzsäure (18%)(3%) - Längs- und Querschnitte (mit Rasierklinge) von: a: weißfaulem Holz b: braunfaulem Holz c: unverpilztem Holz. - Schnitte kurze Zeit in Astra-Blaulösung färben, danach kurz in Wasser auswaschen und anschließend in Wasser mikroskopieren. Auf Pilzhyphen und Zellwandfärbungen achten! Auswertung: - Beschreibung der Unterschiede zwischen gesundem, weißfaulen und braunfaulem Holz. 4.8.4. Nachweis holzzerstörender Pilze in Kultur (Lignin-Peroxidase) (n. SOURCEBOOK 1962) Vorbereitung 1 Woche vor Übung a. Folgende Vertreter der Polyporaceae und Agaricaceae (Braun- und Weißfäuleerreger) aus Malzextraktagar (1) bei 28 oC 7 Tage dunkel kultivieren: Gloeophyllum separium (Braunfäule) und Trametes abietina (Weissfäule) . 24 Petrischalen mit Malzextraktagar (1), 12 mit Tannin beschicken: 1. 15 g Malzextrakt, 20 g Agar, 1 l dest. Wasser. 2. 15 g Malzextrakt, 20 g Agar, 850 ml Wasser lösen, 5 g Tannin in 150 ml Wasser lösen, Lösung autoklavieren, abkühlen lassen, Tanninlösung zum flüssigen Malzextraktagar schütten (aseptisch), mischen, in Petrischalen ausgießen. Korkbohrer (6 mm Ø), sterile v-förmige Glasstäbe (Schenkellänge 5 cm), Waage, Trockenschrank (105 oC). 22 Durchführung a. Aus Pilzkulturen ausgestanzte Myzelstücke auf je 4 Malzagar und 2 Tanninplatten überimpfen, nach 7 Tagen bei 28 oC makroskopisch untersuchen und vergleichen: makroskopisch: Myzeldichte, Fruktifikation, Farbveränderung des Mediums, Oxidasereaktion, mikroskopisch: Septierung, ungeschlechtliche Sporen, spezielle Strukturen. 4.8.5. Chitinnachweis in Pilzen Chitin: Gewebeschnitte mit Pilzhyphen (nicht Oomyceten) in saturierter wässriger Lösung von KOH legen und 3 h auf 180 oC erhitzen (Autoklaven): Chitin wird in Chitosan verwandelt. Gewebeschnitte in 96%igem Alkohol mindestens ½ h härten, 5 min in Wasser waschen, in JKJ-Lösung (2 g Kaliumjodid + 1 g Jod + 300 ml Wasser) auf Objektträger übertragen, mit Deckglas bedecken und 5%ige Schwefelsäure durchziehen: violette Färbung, die besonders gut bei holzzerstörenden Pilzen zu demonstrieren ist. 4.8.6. Cellulaseaktivität von Rhizoctonia solani auf Nähragar (n. HUBER 1956) VORBEREITUNG Rhizoctonia solani auf Kartoffel-Dextrose-Agar bzw. auf Cellulose-haltigem Agar in Petrischalen kultivieren, DURCHFÜHRUNG Agarschalen mit und ohne Cellulose mit Rhizoctonia solani beimpfen, bei 20oC 2-3 Wochen kultivieren, Auflösung der Cellulose durch Cellulaseaktivität des Pilzes beobachten. Die Platte zum Cellulose-Nachweis mit Astrablau anfärben. 4.8.7. Beobachtung der Wirkungsweise eines auf anderen Pilzen parasitierenden Pilzes (n. SOURCEBOOK) VORBEREITUNG 8 Tage vor Übung Rhizoctonia solani und Penicillium albicans kultivieren, Kartoffel-DextroseAgar mit 20 g Dextrose und 10 g Dextrose/l in Reagenzgläsern vorbereiten, sterile Petrischalen. DURCHFÜHRUNG 6 Petrischalen mit Kartoffel-Dextrose-Agar (2% Dextrose) und 6 Petrischalen mit 23 Kartoffel-Dextrose-Agar (1% Dextrose) beschicken, jeweils 5 Schalen am Rand mit Rhizoctonia solani beimpfen, bei 22-25oC 24 h aufbewahren. Danach jeweils 5 Schalen (4 mit Rhizoctoniabeimpfung, 1 ohne Beimpfung) mit Penicillium vermiculatum am gegenüberliegenden Schalenrand beimpfen, 3 Wochen bei 20-22oC aufbewahren. Myzel in Wasser suspendieren und zunächst Rhizoctonia und Penicillium der Reinkulturen, dann aus Mischkulturen mikroskopisch untersuchen, parasitierte Hyphen zeichnen, Dauerpräparate in Glyzeringelatine herstellen. 4.8.8. Bestimmung von Polygalacturonase-Aktivität Viele phytopathogene Organismen können zellwandaufweichende Enzyme synthetisieren, die es ihnen ermöglichen, den Wirt zu besiedeln. Pectine sind lange Polysaccharidmoleküle, die aus Ketten von vielen Hundert Galacturonsäureresten aufgebaut ist. Aus ihnen wird die Mittellamelle der Pflanzenzellen gebildet. Pectinasen sind Gemische von Enzymen, die in der Lage sind, solche Polymere zu spalten. Enzyme aus dieser Gruppe beinhalten Polygalacturonase, Pectinmethylesterase und Pectin-Lyase. Jedes dieser Enzyme arbeitet an einer bestimmten Stelle beim Abbau des Pectins. In diesem Versuch soll die Polygalacturonase-Aktivität aus phytopathogenen Organismen nachgewiesen werden. Herstellung der Extrakte: Das Prinzip des Testes beruht auf der Veränderung einer viskosen Lösung von Polygalacturonsäure, deren Viskosität proportional zur Enzymaktivität abnehmen sollte. Der Extrakt (z.B. von Phytophthora infestans) wird in einem 40 mM Natrium-Acetat-Puffer, pH 5.0(1) hergestellt. Als weitere Probe kann ein Extrakt aus einer reifen Tomate (hohe Polygalacturonase-Aktivität) hergestellt werden. Das Puffervolumen ist mindestens im Verhältnis 1:1 bezüglich des Frischgewichtes einzusetzen. Extrahiert wird entweder im Mörser oder in einem Küchenmixer. Der Extrakt wird anschließend zentrifugiert (20 min 10 000g) und der Überstand entsalzt. Der entsalzte Überstand wird dann für den Test eingesetzt. Entsalzen der Extrakte: 1 ml der Überstände (Rohextrakte) werden in Sephadex G 25 Minisäulen (Säulenvolumen 3 ml) entsalzt (pro Gruppe 2 Säulen); Elutionspuffer ist identisch mit dem Extraktionspuffer. Hestellen der Säulen: 2 g grobes Sephadex G 25 werden mit viel Elutionspuffer überschichtet und über Nacht quellen lassen (in Schnappdeckelglas). Für Säulenaufbau: Spritzen (10 ml Volumen) mit wenig Watte füllen (dient zum Auffangen des Sephadexes, nur ganz locker stopfen), am Ende einen dünnen Gummischlauch aufstecken und mit Klemme verschließen. Spritze in Stativ einstellen. Langsam Sephadex einfüllen und dabei die Klemme soweit öffnen, dass sich das Sephadex langsam als Säule aufbaut bis der Markierungsschritt erreicht ist. Bis zum Einsatz der Säule diese mit Elutionspuffer überschichtet stehen lassen. Die Säule wird mit 1 ml Dextranblau-Lösung geeicht. Dazu wird das Dextranblau auf die Säule aufgetragen. Durch langsames Öffnen der Klemme Probe in die Säule einziehen lassen bis kein Puffer über dem Säulenmaterial steht. Dann mit Elutionspuffer überschichten und blaugefärbte Probe abfangen. Vorher wird das Volumen bestimmt 24 (Messzylinder), das durch die Säule läuft bis der erste blaue Tropfen unten sichtbar wird. Anschließend wird die blaue Fraktion aufgefangen und ebenfalls das Volumen bestimmt. Mit der farblosen Probe wird anschließend ebenso verfahren und die entsprechenden Volumina abgesammelt. Die Proben auf Eis lagern. Polygalacturonase-Test: Anschließend wird das selbe Volumen Extrakt zu der vorbereiteten Polygalacturonsäure Lösung(2) pipettiert. Als Kontrolle dient das selbe Volumen Natrium-Acetat-Puffer. Die Lösungen werden bei 40°C im Wasserbad für 60 Minuten inkubiert. Die Viskosität der Lösung wird jeweils vor und nach der 1-stündigen Inkubationszeit bestimmt, indem 1 ml in eine Glaspipette (1 ml Volumen) hochgezogen wird und dann bei absolutem Senkrechthalten (evtl. mit Klemmen an einem Stativ fixieren) der Pipette wieder hinausläuft. Es wird die Zeit bestimmt, die es dauert, bis die Lösung die 0.9 ml Marke erreicht hat. Diese Messung wird 3 x durchgeführt. Daraus berechnet sich der Mittelwert vor und nach der Inkubation. Aus den Unterschieden zwischen Kontrolle und enzymhaltigen Extrakt kann eine Aussage über die Polygalacturonase-Aktivität getroffen werden. Eine reife Tomate enthält so viel Enzymaktivität, dass sich die Viskosität nach 1 Stunde um ca. 50% verringert hat. (1) (2) Natrium-Acetat-Puffer: 40 mM Lösung, dann mit 1 M HCl auf pH 5.0 einstellen. 3.2% (w/v) Polyglacturonsäure (Na-Salz), lösen in warmem H2O dest. Und anschließendem 10 minütigem Kochen in einem Wasserbad. Dabei gelegentlich umrühren. Die warme Lösung wird filtriert und es entsteht so eine klare viskose Lösung von Polygalacturonsäure. 4.9. Gibberelline aus Fusarium moniliforme 1) Literatur - Palag (1965): Ann.Rev.Plant Phys. 16, 291-295 - Lang (1970): Ann.Rev.Plant Phys. 21, 537-543 - Sponsel V.M. (1987) Gibberellin Biosynthesis and Metabolism; Plant Hormones and their Role in Plant Growth and Development (P.J. Davies ed). - Philips A. L. & Huttly A. K. /(1995) Gibberelline Regulated Plant Genes; Physiologia Plantarum 95: 310-317 - Chasan R. (1995) GA Biosynthesis: A Glimpse at the Genes; The Plant Cell 7: 141-143 2) Allgemeines Fusarium moniliforme (früher: Gibberella fujiukuroi) verursacht bei Reis die Bakanae-Krankheit. Bevor die infizierten Pflanzen absterben, erfolgt ein weitaus stärkeres Längenwachstum als bei nicht infizierten Reispflanzen. Diese Beobachtung war die Grundlage zur Isolierung verschiedener Wuchsstoffe (Gibberelline) aus der Nährlösung von Kulturen von F. moniliforme. Bisher wurden etwa 15 verschiedene Gibberelline auf diese Weise erhalten, die wichtigsten: GA1, GA3, GA7, GA9. 25 Auch in höheren Pflanzen treten einige dieser Gibberelline auf. Um das Wachstum und die Entwicklung mehrzelliger Pflanzen zu koordinieren, muss es eine Verständigung zwischen den einzelnen Zellen und Geweben eines Organismus geben. Die wichtigste Art dieser Signalübermittlung erfolgt auf chemischem Weg durch die sogenannten Phytohormone. Derzeit werden 6 Gruppen von Phytohormonen unterschieden: Auxine. Gibberelline (GAs), Cytokinine, Abscisinsäure, Ethylen und Brassinosteroide. Der Begriff Hormon wird ursprünglich auf Tierische Organismen angewendet und bezieht sich auf Wirkstoffe, die in sehr geringen Mengen eine spezifische Reaktion im Organismus hervorrufen, wobei Syntheseort und Wirkort voneinander getrennt sind. Dies trifft jedoch nicht immer für Phytohormone zu: oft sind ihre Wirkungen nicht spezifisch - ein Phytohormon kann viele, je nach Gewebe und Entwicklungszustand der Pflanze unterschiedliche Wirkungen haben, auch sind Synthese und Wirkort häufig nicht voneinander getrennt. Aus diesem Grund verwendet man auch den Begriff „Plant Growth Regulator“ (PGR). Dies sind organische Substanzen, die keine Nährstoffe sind und die in geringen Konzentrationen den physiologischen Wachstumsprozess beeinflussen. Man kann natürliche PGRs (Phytohormone) und synthetischen PGRs unterscheiden. Eine weitere Bezeichnung ist „Plant Growth Substance“, sie bezieht sich nur auf endogene Substanzen. Geschichte der Gibberellin-Entdeckung In den asiatischen Ländern wurden Reispflanzen schon seit Jahrhunderten von dem Ascomyceten Gibberella fujikuroi, dessen imperfekte Form Fusarium moniliforme genannt wird, befallen. Der Pilzbefall geht mit einem extremen Längenwachstum und hellgrüner Färbung der betroffenen Pflanzen einher. Infolge einer schwächeren Wurzelausbildung fallen die infizierten Pflanzen oft um und sterben ab. In Japan wurde dieses Symptom „bakanae“ (verrückte Keimlinge) genannt. 1926 gelang es Kurosawa mit einem von G. fujikuroi gewonnenem zellfreiem Kulturfiltrat die selben Symptome in gesunden Pflanzen auszulösen. Somit bestätigte sich die von Sawada schon 1912 aufgestellte Hypothese, dass die Krankheitssymptome durch eine vom Parasiten abgegebene chemische Verbindung ausgelöst werden. 1935 bezeichnete Yabuta den aktiven Faktor des G. fujikuroi Kulturfiltrats als „Gibberellin“. 1938 isolierten Yabuta & Sumiki zwei kristalline, biologisch aktive Substanzen die sie Gibberellin A und B nannten. Allerdings wurde später festgestellt, dass Gibberellin A aus drei Komponenten besteht, die Gibberellin A1, Gibberellin A2 und Gibberellin A3 genannt wurden. Letztere ist auch als Gibberellinsäure bekannt. In den 50’er Jahren wurden Gibberelline in höheren Pflanzen entdeckt. Die vollständige chemische Identifizierung eines Gibberellins aus einer höheren Pflanze gelang erstmals 1958 mit GA1 aus unreifen Samen von Phaseolus coccineus. Heute weiß man, dass Gibberelline in allen Angiospermen, Gymnospermen und in Pflanzen einiger anderer Abteilungen vorkommen. Sie sind chemisch, durch das Gibberellan-Skelett, und physiologisch, durch Stimulierung der Zellteilung und/oder der Zellstreckung oder andere spezifische Aktivitäten, charakterisiert. Derzeit sind mehr als 90 natürlich vorkommende Gibberelline bekannt. Um die Nomenklatur zu vereinfachen werden von MacMillan & Takashashie für vollständig charakterisierte Stoffe mit einem Gibberellan-Skelett und den angemessenen biologischen 26 Aktivitäten A-Nummern vergeben (GA1... GAn). Bis jetzt wurden 90 A-Nummer (GA90) vergeben. Chemische Eigenschaften der GAs: Gibberelline sind tetrazyklische Diterpenoidcarbonsäuren, die ihnen zu Grunde liegende Struktur ist das ent-Gibberellan-Gerüst (Abb. 1-2). GAs lassen sich in zwei Gruppen unterteilen: die C20 -GAs mit 20 C-Atomen und die C19-GAs mit 19 C-Atomen. C20-GAs stellen die Vorstufe der C19-GAs dar, auf letztere entfallen die meisten physiologisch aktiven GAs. GAs können als Mono-, Di- und Tricarbonsäuren vorkommen, weitere Unterschiede liegen in dem Auftreten eines Laktonrings in Ring A und der Anzahl und Position von Hydroxygruppen. (siehe Abb. 1) Nur ca. 1/3 der 90 bekannten GAs sind physiologisch aktiv. Fördernd auf die biologische Aktivität wirken: - ß-Hydroxylierung - die Ringe A und B - die Carboxylgruppe an C-7 - der Laktonring in Ring A (siehe Abb. 2) Physiologische Effekte der GAs GAs kommen in Pflanzen in geringsten Mengen vor. Nur in den Samen vieler Arten kommen sie in zum Teil hohen Konzentrationen vor (bis zu 18 mg/kg). Ihre auffälligste Wirkung ist die Steuerung des Längenwachstums der Internodien durch Stimulierung der Zellstreckung und in geringerem Umfang auch der Zellteilung. So reagieren Zwerg-Mutanten mit verkürzten Internodien, bei denen einzelne Schritte der GABiosynthesekette unterbrochen sind, auf externe GA-Gabe mit normalem Wachstum. Bei der Keimung von Gramieensamen löst GA (das aus dem Embryo stammt) die Bildung von -Amylase und anderen Hydrolasen in der Aleuronschicht aus, dies führt dann zur Mobilisierung der im Endosperm gespeicherten Reservestoffe. Auch in anderen Pflanzenarten können GAs die Samenkeimung fördern beziehungsweise die Dormanz aufheben. So wird z.B. die Stratifikation bei kältebedürftigen Samen der Haselnuss durch GAs ersetzt: Lichtkeimer können bei GA-Gabe auch im Dunkeln keimen. Auch bei der Blütenbildung spielen Gibberelline eine Rolle. In Langtagpflanzen können sie die fotoperiodische Blühinduktion ersetzen; in Rosettenpflanzen ersetzen GAs die Vernalisation (Blühinduktion durch Wirkung bestimmter Temperatur). Jedoch induzieren sie die Blütenbildung nicht direkt, sondern erfüllen vielmehr deren Voraussetzung. So induzieren sie in Rosettenpflanzen das Schossen, was bei diesen Pflanzen notwendig für die Blütenbildung ist. Bei Cucurbitaceanen-Gewächsen fördern GAs die Bildung männlicher Blüten, in anderen Pflanzen hingegen (Mais, Hopfen) werden weibliche Blüten durch einen höheren GA-Gehalt gefördert. Bei einigen Arten (Apfel, Aprikose, Erbse) wurde ein Einfluss von GAs auf die frühen Stadien der Fruchtentwicklung nachgewiesen. Die physiologische Aktivität von GAs wird mit Hilfe standardisierter Biotests bestimmt. Oft beruhen sie auf dem GA-geförderten Streckungswachstum. So gibt es neben dem schon von Kurosawa verwendeten Reiskeimlingstest auch Biotests mit Zwergmutanten von Mais oder Erbse und die Hypokotyltests mit Lactuva sativa (Salat) und 27 Cucumis sativa (Gurke). Auf der Messung GA-induzierter -Amylase (indirekt über Stärkeabbau) beruht der Gersten-Endospermtest. 3) VERSUCHSBESCHREIBUNG a) Kultur F. moniliforme wird in 200er Erlenmeyer Kolben mit 50ml einer 2,5%igen PotatoDextrose-Extrakt-Lösung angezogen. Die Kulturen werden 1 Woche im Hell/Dunkelwechsel geschüttelt. Die Hälfte der Kulturen erhalten 3 mg/l 2-Chloräthyl-trimethylammoniumchlorid (CCC). Es soll herausgefunden werden , welche Kolben CCC-behandelt wurden. b) Extraktion der Gibberelline Je 1 Kultur mit CCC und 1 ohne CCC werden über Membranfilter abfiltriert, mit 1 N HCl auf pH 2,5 eingestellt und 2 x mit dem gleichen Volumen Essigsäureäthylester ausgeschüttelt. Die organischen Phasen werden mit Na2SO4 getrocknet und nach Filtierung eingedampft. Der Rückstand wird 1 x mit 0,5 ml Essigsäureäthylester aufgenommen. Dichte (Essigsäureethylester): 0,899 g/cm3 Dichte (Wasser): 1 g/cm3 c) Dünnschichtchromatografische Trennung der Gibberelline Es werden verschiedene Mengen der beiden Gibberellinextrakte (z.B. 5, 10 u. 15 µl) punktuell auf eine DC-Platte aufgetragen, sowie als Vergleichssubstanzen GA3, GA4/GA7 (GA9 ) in einer Konz. von 10 mg/ml. Laufmittel: 150 ml Toluol/Essigsäureäthylester/Essigsäure (25:15:2), d.h. 89,28 : 53.57 : 7,14 ml Nach dem Trocknen wird die Platte unter der UV-Lampe nach fluoreszierenden Flecken untersucht, die zu markieren sind (verschiedene Farbstoffe). Gibberelline zeigen sich erst nach Besprühen mit einer Mischung von Äthanol/konz.H2SO4 (95:5). GA3 ist dann schon sichtbar, die Fluoreszenz der anderen tritt erst nach 10 Min. Erhitzen auf 120o auf. 28 4) Abbildungen Abbildung 8: Das entGibberellan-Skelett und seine Numerierung. Abbildung 9: verschiedene Gibberelline 4.10. Symbiose vs. Parasitismus: Arbuskuläre Mykorrhiza Über 80% aller Landpflanzen leben mit Bodenpilzen in einer Symbiose, die allgemein als Mykorrhiza bezeichnet wird. Bei der Mykorrhizierung besiedeln die Pilze das Wurzelgewebe und wachsen parallel mit ihren Hyphen weit über die Grenze der Rhizosphäre in den Boden hinein. Über dieses Hyphennetzwerk nimmt der Pilz Nährstoffe, Spurenelemente und Wasser auf, transportiert sie in die Wurzel und stellt diese der Pflanze zur Verfügung. Im Gegenzug versorgt die Pflanze den Pilz mit Fotosyntheseprodukten. Die meisten höheren Pflanzen können eine Symbiose mit Pilzen aus der Ordnung Glomales (z.B. Glomus, Gigaspora) eingehen. Diese arbuskuläre Mykorrhiza (AM) zeichnet sich durch die Bildung spezieller pilzlicher Strukturen aus, den Arbuskeln und/oder Vesikeln. Besonders hilfreich ist diese Symbiose bei der Akkumulation von Phosphat aus dem Boden (also bei einer P-Mangelsituation), obwohl auch die N-Versorgung durch den Pilz eine Rolle spielt. Die Ausbildung der AM-Symbiose hängt daher vom vorhandenen Nährstoffangebot ab. 29 Im Praktikum sollen frische Maiswurzeln, die mit Glomus intraradices inokuliert wurden, angefärbt und auf Mykorrhiza-Strukturen untersucht werden. Die Färbung ist spezifisch für pilzliche Strukturen. Da die Färbung einige Zeit in Anspruch nimmt, sind für die Mikroskopie bereits gefärbte Wurzeln verschiedener Wirtspflanzen vorhanden. Pflanzenmaterial: Zea mays Anzuchtbedingungen: Aussaat auf Filterpapier in Petrischalen; Anzucht in der Phytokammer (16 h bei 23°C u. 8 h bei 20°C, Luftfeuchte von 70%) Vesuchsbedingungen: Maiskeimlinge nach 6 Tagen eingetopft (je 3 Pflanzen pro Topf); (85,5% nicht inokuliertes Substrat; 9,5% inokuliertes Substrat; 5% durchgesiebte, autoklavierte Erde) Versuchsdurchführung: Färbung der Wurzeln mit Lactophenolblau: Zur Bestimmung des Mykorrhizierungsgrades ausgewählter Versuchspflanzen (z.B. Zea mays L.), die zunächst für ca. 4 Wochen in einem den VA-Mykorrhizapilz Glomus intraradices enthaltenden Substrat (Lecaton) kultiviert wurden, werden jeweils ca. 0,5 g an Wurzelmaterial aus den verschiedenen Wurzelabschnitten ( Mischproben) entnommen. Die gewonnenen Wurzelfragmente werden zunächst gründlich mit Wasser abgespült und anschließend in 5 ml FAA-Fixierlösung2 überführt; in dieser Lösung können die Wurzelproben bei Raumtemperatur bis zur späteren Anfärbung mit Lactophenolblau verbleiben. Die Methode nach SCHMITZ et al. (1991) zur Färbung AM-infizierter Pflanzenwurzeln mit Lactophenolblau dient der besseren Differenzierung von pflanzlichem Gewebe und pilzlichen Strukturen bei der Abschätzung des Mykorrhizierungsgrades. Nach einer anfänglichen Inkubation der vorbereiteten Wurzelstücke für 35 min bei 90°C in 10% KOH ( Aufhellung der Wurzeln) werden die Proben gründlich mit Wasser gespült und für 10 min bei Raumtemperatur in 3,7% HCl angesäuert. Danach wird das Wurzelmaterial für 90 min in einer Lactophenolblau-Lösung (C.I. Nr. 42780; 1g/l; pH 2,3; Merck) angefärbt und anschließend wiederholt in 50% Lactat gewaschen ( Entfärbung des Pflanzengewebes; Blaufärbung der Pilzstrukturen hingegen bleibt erhalten). Die Proben werden bis zur Bonitierung in 50% Lactat gelagert und auch zum Mikroskopieren in 50% Lactat belassen. Auszählen der Strukturen: Es werden jeweils 1 cm lange Wurzelabschnitte auf einem Objektträger angeordnet. Die Auszählung erfolgt nach Anleitung, wobei jeweils in extraradikale, intraradikale Hyphen, Arbuskel, Vesikel und Sporen unterschieden wird. Die Addition dieser Einzelwerte ergibt dann die Gesamtinfektionsrate. Das Prinzip des Auszählens wird vom Betreuer erläutert. 2 Zusammensetzung: 45,85% H2O; 45,85% (v/v) Ethanol; 6% (v/v) Formaldehyd; 2,3% (v/v) Eisessig 30 31 4.11. Pflanzliche Abwehr: Nachweis von Chitinase Grundsätzlich kann man bei der pflanzlichen Abwehr gegen Schaderreger präformierte von postinfektionellen Mechanismen unterscheiden. Präformierte Barrieren sind Faktoren, die bereits vor dem Angriff des Erregers vorhanden sind, z..B.: mechanische Hindernisse, antimikrobielle Abwehrstoffe wie Saponine, cyanogene Glycoside, Senföle und Phenole, Enzymhemmstoffe (Gerbsäuren), oder fehlende Erkennungsfaktoren bzw. Rezeptoren für den Erreger. Postinfektionelle Mechanismen sind z.B. Papillenbildung und hypersensitive Reaktion. Bei letzeren kommt es in lokalen Bereichen um die Nekrose zur Induktion von Phytoalexinen und Enzymen des Phenylpropan-Biosyntheseweges, Peroxidasen und PR (=pathogenesis related)Proteinen. Dazu gehören Chitinasen und ß-1,3-Glucanasen, die pilzliche Hyphen abbauen können. Außer durch Pathogene können diese Enzyme auch durch Verwundung oder Elicitoren wie z.B. Salicylsäure und Ethylen induziert werden. Chitin, das Substrat der Chitinase, ist ein unlösliches ß-1,4-glycosidisch gebundenes Polymer aus N-Acetylglucosamin-Einheiten. Es kommt in der Natur im Exoskelett von Insekten, Schalen von Krebsen und als Bestandteil der Zellwand vieler Pilze vor. Chitinasen sind definiert als Enzyme, die die Bindung zwischen C1 und C4 zweier N-Acetylglucosamin-Bausteine hydrolytisch spalten können. Sie werden je nach Art der entstehenden Produkte in Endochitinasen und Exochitinasen unterteilt. Durch Endochitinaseaktivität entstehen aus Chitin lösliche Multimere von NAcetylglucosamin, während Exochitinase immer vom nicht reduzierenden Ende her angreift und nur N-Acetylglucosamin-Monomere entlässt. Einige Chitinasen besitzen eine mehr oder weniger starke Lysozym-Aktivität und können so auch bakterielle Zellwände angreifen (siehe auch Abb. 5). Abbildung 10: A stellt Chitin dar mit zwei möglichen Spaltstellen für Endochitinasen. B zeigt das bakterielle Peptidoglucangerüst. Im Praktikum soll mittels Antikörpern gegen Bohnen-Chitinase bei Bohnen und Chinakohl im Vergleich die Induktion dieses Enzyms nach Behandlung mit Salicylsäure und ßAminobuttersäure (künstliche Substanz, die Abwehr hervorrufen kann) sowie Verwundung nachgewiesen werden. Man beachte, dass die Verwundung auch im natürlichen System beim Eindringen vieler Pathogene eine Rolle spielt. 32 Material Keimlinge von Bohnen (Phaseolus vulgaris L.) und Chinakohl (Brassica rapa ssp. pekinensis) Die Pflanzen werden vom Betreuer bereitgestellt und werden im Praktikum mit Salicylsäure (1 mM) und BABA (1 mM) besprüht. Außerdem werden Blätter mittels einer Feile oder Spritze verwundet. Nach einer Über-Nacht-Inkubation werden die Blätter am nächsten Versuchstag geerntet und ein Gesamtproteinextrakt hergestellt. Herstellung des Proteinextraktes und Nachweis von Chitinase: Mindestens 1 g Pflanzenmaterial oder 1 Blatt (Gewicht bestimmen!) wird im Mörser auf Eis mit 5 ml 25 mM Na-Citratpuffer, pH 5 homogenisiert (da das Pflanzenmaterial noch gefroren ist, kann es vorkommen, dass es nicht flüssig wird). Anschließend wird der Extrakt in Zentrifugengläser überführt und bei 4500 g zentrifugiert. Der Überstand wird abpipettiert und für eine weitere Konzentrierung einer Ammoniumsulfat-Fällung unterzogen. Dazu werden 561g/Liter (NH4)2SO4 langsam und unter ständigem Schütteln in das Eppendorf-Gefäß gegeben und gelöst. Anschließend wird wieder bei 13 000g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die präzipitierten Proteine können nun in einem kleinen Volumen (500µl) Puffer (s.o.) aufgenommen werden. Davon werden Verdünnungen von 1:10, 1:20 und 1: 50 hergestellt. Den Rest des Proteinextraktes für die Proteinbestimmung aufheben!!! Für den immunologischen Nachweis werden von den Verdünnungen 100 µl auf eine Nitrocellulose-Membran mit Hilfe einer Slot-Blot-Apparatur aufgebracht (Achtung: auch die leeren Taschen mit Flüssigkeit füllen!). Nachdem die Extrakte getrocknet sind, wird die Detektion mittels Anti-Chitinase-Antikörpern vorgenommen. Durchführung: 1. 3 x 5 Minuten Waschen der Membran mit *TBS/0.05% Tween 20 2. 2 Std. Blocken mit TBS/0.05% Tween 20/ 8 % Magermilchpulver 3. primäre Antikörperinkubation (Antikörperkonzentration 1 mg/ml davon eine 1:1000 Verdünnung in TBS/0.05% Tween 20/ 8 % Magermilchpulver) bei 4°C über Nacht 4. Waschen für 5 Minuten mit TBS/0.05% Tween 20 5. Waschen für 5 Minuten mit TBS/0.05% Tween 20/ 1 % Magermilchpulver 6. 2 Std. Inkubation mit sekundärem Antikörper (Anti-Rabbit IgG-Alkalische Phosphatase, Verdünnung 1:2000) in TBS/0.05% Tween 20/1% BSA 7. 3 x Waschen mit TBS/0.05% Tween 20 8. 1 x Waschen mit TBS 9. Detektion mit Farbstofflösung** im Dunkeln (!!!) bis eine gut sichtbare Färbung zu sehen ist, Abstoppen durch Waschen mit H2O 10. Trocknen der Membran *TBS: NaCl Tris-Base EDTA pH 7.5 100 mM 20 mM 1 mM 33 **Farbstofflösung : Substrat-Puffer 50 ml (Tris-Base 100 mM MgSO4 10 mM NaCl 100 mM pH 9.5) BCIP 2.5 mg NBT 15 mg (liegt schon gelöst in DMF vor) Dimethylformamid 150 µl BCIP wird in DMF gelöst, NBT wird in 0.3 ml H2O gelöst. Beide Ansätze werden vereinigt und in Substratpuffer gelöst. Diese Lösung wird erst direkt vor der Benutzung angesetzt, da sie lichtempfindlich ist. Auch die Entwicklung der Membran erfolgt im Dunkeln. Proteinbestimmung: Aus dem Rest des Proteinextraktes wird eine Proteinbestimmung mittels BCA-Reagenz (Fa. Pierce) durchgeführt. Dazu werden Lösung A und Lösung B des Kits im Verhältnis 50:1 gemischt und davon jeweils 1 ml zu 50 µl Proteinextrakt bzw. 50 µl Standard gegeben. Die Inkubation erfolgt bei 37°C für 30 Minuten. Danach werden die Gefäße auf Eis abgekühlt und sofort bei 562 nm gemessen (Farbumschlag von apfelgrün nach lila). Die Proteinkonzentration wird mit Hilfe einer mit Rinderserumalbumin (BSA) aufgestellten Eichkurve ermittelt: Standard A Standard B Standard C Standard D Standard E Standard F Standard G Standard H BSA 2 mg/ml 50 µl von Ausgangskonzentration 30 µl von Ausgangskonzentration 42 µl von Ausgangskonzentration 20 µl von Ausgangskonzentration 10 µl von Ausgangskonzentration 20 µl von E 10 µl von E 0 Wasser oder Puffer 0 µl 30 µl 70 µl 60 µl 70 µl 30 µl 40 µl 50 µl 4.12. Abkürzungen: KDA pv. TBS Tris BCIP NBT DMF Kartoffel-Dextrose-Agar = pathovar (Wirtspflanze) Tris-Base-Sodiumchloride Tris(hydroxymethyl)-aminomethan 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate Nitro-blau-Tetrazolium (oder Nitrotetrazolium blue chloride) Dimethylformamid 34 4.13. Literatur: Agrios, George N.: Plant Pathology, Academic Press San Diego 1997 Börner, Horst: „Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz„, 6. Auflage, Verlag Eugen Ulmer Stuttgart 1990 Braun, H.: Die Symptomatologie als vordringliche Aufgabe der Phytopathologie, NachrBl. Biol.ZentrAnst. Braunschweig 1, 40-41, 1949. Elstner, E.F.; Oßwald, W.; Schneider, I.: „Phytopathologie„ (Allgemeine und biochemische Grundlagen), Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg . Berlin . Oxford 1996 Esser, Karl: Kryptogamen (Cyanobakterien, Algen, Pilze, Flechten), 2. Auflage, SpringerVerlag Berlin . Heidelberg . New York . Tokyo 1985 Fröhlich, Gerd: Phytopathologie und Pflanzenschutz, Wörterbücher der Biologie, UTB, Gustav Fischer Verlag Stuttgart 1979 Goodmann, Robert, N.; Király, Zoltan; Wood, K.R.: „The Biochemistry and Physiology of Plant Disease„, University of Missouri Press Columbia 1986 Heitefuss, Rudolf; König, Klaus; Obst, Alfred; Reschke, Manfred: „Pflanzenkrankheiten und Schädlinge im Ackerbau„, 3. Auflage, DLG-Verlag Frankfurt (Main) 1993 Hock, Berthold; Elstner, Erich F.: „Schadwirkungen auf Pflanzen„, 3. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg . Berlin . Oxford 1995 Hoffman, Günter, M.; Nienhaus, Franz; Poehling, Hans-Michael; Schönbeck, Fritz; Weltzien, Heinrich C.; Wilbert, Hubert: „Lehrbuch der Phytomedizin„, Blackwell Wissenschafts-Verlag, Berlin, 3. Auflage 1994 Hoffmann, Günter, M.; Schmutterer, Heinrich: „Parasitäre Krankheiten und Schädlinge an landwirtschaftlichen Kulturpflanzen“, Verlag Eugen Ulmer Stuttgart 1983 Kleinhempel, H.; Naumann, K.; Spaar, D.: „Bakterielle Erkrankungen der Kulturpflanzen„, Gustav Fischer Verlag Jena 1989 Klinkowski, Maximilian; Mühle, Erich; Reinmuth, Ernst: 35 Phytopathologie und Pflanzenschutz, Bd. I „Grundlagen und Allgemeine Probleme der Phytopathologie und des Pflanzenschutzes„, Akademie Verlag Berlin 1965 Klinkowski, Maximilian; Mühle, Erich; Reinmuth, Ernst: Phytopathologie und Pflanzenschutz, Bd. II „Krankheiten und Schädlinge Landwirtschaftlicher Kulturpflanzen„, Akademie Verlag Berlin 1966 Klinkowski, Maximilian; Mühle, Erich; Reinmuth, Ernst; Bochow, Helmut: Phytopathologie und Pflanzenschutz, Bd. III „Krankheiten und Schädlinge der Gemüsepflanzen und der Obstgewächse„, Akademie Verlag Berlin 1976 Mühle, Erich; Wetzel, Theo: „Praktikum der Phytomedizin„, Verlag Harri Deutsch Frankfurt/Main 1990 Nienhaus, Franz; Butin, Heinz; Böhmer, Bernd: „Farbatlas Gehölzkrankheiten„, Verlag Eugen Ulmer Stuttgart 1992 Schlösser, Eckart: „Allgemeine Phytopathologie“, Georg Thieme Verlag Stuttgart 1983 36 Glossar: Acervulus: flaches Hyphenlager mit kurzen, dichtstehenden Konidienträgern; durchbricht die bedeckenden Schichten des Wirtes (z.B. Cuticula) Aecidium: Becherförmiges Sporenlager der Uredinales; paarkernige Hyphen bilden Ketten von Aecidiosporen, die ausgeschleudert werden Antheridium: männliches Gametangium Apothecium: scheiben- bis becherförmiger Fruchtkörper (Ascocarp Asci enthaltender Fruchtkörper); charakteristisch für Discomycetes Appressorium: Haftorgan von Pilzen auf der Wirtsoberfläche Ascus: sackähnliche Hyphe, in der nach Karyogamie und Meiose die Ascosporen entstehen Basidie: endständige, oft keulenförmige Hyphenzelle, an der Basidiosporen entstehen Haustorium: pilzliches Organ innerhalb einer Wirtszelle; dient der Nährstoffversorgung Kleistothecium: völlig geschlossener, kugeliger Fruchtkörper; Asci werden nach Aufreissen der Fruchtkörperwand (Peridie) freigesetzt Konidien: Asexuell entstandene Pilzsporen ; oft an besonderen hyphen (Konidienträgern) oder in Fruchtkörpern Oogonium: weibliches Gametangium Perithecium: geschlossener, flaschenförmiger Fruchtkörper mit scheitelständigem Porus Pseudothecium: einkammeriger Ascokarp im Ascostroma Sorus: Gruppe von Sporangien/Sporenmasse Sporangiophor: Sporangienträger Sporangium: Sporenbehälter 37
