Arbeitsblatt kompetente Zellen

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Arbeitsblatt
Herstellen von CaCl2 kompetenten Zellen
Vorbereitungen vor Beginn des Kurses: Am Tag vorher wurden von Starterplatten mit den
Bakterienstämme E.coli DH5 eine Einzelkolonie mit einer gelben Spitze abgenommen und
in 5 mL LB-Medium angeimpft. Anschießend wurde über Nacht bei 37°C gerollert bzw.
geschüttelt. Gegen 8 Uhr des Kurstages wurden diese Übernachtkulturen im Verhältnis 1 : 10
mit LB-Medium verdünnt (3 mL ÜNK in 27 mL frisches LB-Medium geben.) und jetzt 1 bis
2 Stunden bei 37 °C gerollert bzw. geschüttelt. Versuchsdurchführung: Es werden insgesamt
etwa 30 mal ca. 1 mL Bakterienkultur auf 1,5 mL Eppendorfgefäße verteilt. Dabei übernimmt
jede Gruppe 4 Eppendorfgefäße. Die Gruppen kontrollieren ihren Arbeitsplatz: Eis
vorhanden? 70 mM CaCl2-Lösung auf Eis? Eppendorfgefäße beschriftet?
Autoklavierbeutel vorhanden?
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Verteilung von je 1 mL Bakterienkultur. Eindeutig beschriften (Gruppennummer!)
dann 5 min auf Eis stellen
zentrifugieren bei 5000 rpm für 4 min
Überstand vorsichtig in die Autoklavierbeutel abkippen
100µL eiskalte 70 mM CaCl2-Lösung zugeben, Zellen vorsichtig durch Auf- und
Abziehen mit der Variopipette suspendieren
15 min auf Eis
4 min bei 5000 rpm
Überstand vorsichtig mit der Pipette abnehmen
100µL eiskalte 70 mM CaCl2-Lösung zugeben, Zellen vorsichtig suspendieren
20 min auf Eis
Verwendete Lösungen:
Transformationslösung (70 mM CaCl2):
10,3 g CaCl22 H2O werden in dest.Wasser gelöst, auf 1 l aufgefüllt und autoklaviert.
LB-Medium:
10 g Bacto-Trypton, 5 g Hefe-Extrakt und 10 g NaCl werden in 1 l Leitungswasser gelöst, mit
10 Tropfen 10 M NaOH aus einer Pasteurpipette auf pH 7,5 eingestellt, autoklaviert und bei
Raumtemperatur gelagert (oder 25 Kapseln pro Liter)
LB-AMP-Medium(Ampicillinkonzentration 100 µg/ml):
Es wird in obiger Lösung 100 mg Ampicillin gelöst und die Lösung bei 4 °C gelagert
(maximal 4 Wochen).
LB-bzw. LB AMP-Platten:
Ansatz wie oben durchführen, zusätzlich 15 g Bacto-Agar zufügen und autoklavieren. Für LB
amp-Platten den Ansatz für 2 h in ein 55 °C heißes Wasserbad geben und Antibiotikum (4 ml
der Stammlösung c = 25 mg/ml) zusetzen und das noch warme Medium in vorbereitete
Petrischalen gießen. Die Platten sind bei 4°C ca. 4 Wochen haltbar.
Bei Bedarf können auch Antibiotika auf die Platte gegeben und ausplattiert werden.
Vorsicht! Ampicillin ist wie alle Antibiotika sehr gegen Wärme empfindlich und wird bei
Temperaturen über 60°C schnell zerstört.
Ein Trick aus der Praxis:
Es hat sich bewährt, das IPTG und X-Gal erst kurz vor dem Ausstreichen der
Transformationsgemische auf die LB-Platten auszustreichen. Die Konzentration an der
Oberfläche ist so größer. Die Induktion ist schneller, die Farbintensitiät höher. Man kann auch
das Antibiotikum direkt ausstreichen, um so beim Plattengießen nur einen Arbeitsgang zu
haben. Im einzelnen wird wie folgt vorgegangen:
Herstellung von Selektionsplatten
Bei kleinen Platten d = 5,5 cm:
40 µL Ampicillinstammlösung 25mg/ml
16 µL X-Gal Stammlösung 40 mg/ml in DMSO
16 µL IPTG Stammlösung 20 mg/ml
Entsorgung:
Für den Umgang mit gentechnisch veränderten Bakterien gelten besondere Regeln. Alle
Lösungen und Geräte, die mit Bakterien in Kontakt gekommen sind, werden gesammelt und
20 Min. bei 121°C autoklaviert. Kleinteile wie Pipettenspitzen etc. alle Lösungen, die mit
Bakterien in Kontakt gekommen sind, werden z.B. in Autoklavierbeuteln gesammelt und
können anschließend nach dem Autoklavieren in den Hausmüll gegeben werden.
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