Interaktion von Trophoblast- und natürlichen Killerzellen an der feto-maternalen Grenzfläche Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität Jena von Tobias Pöhlmann geboren am 29.08.1978 in Zwickau 28.04.2005 Gutachter: PD. Dr. Markert Prof. Dr. Liebmann Prof. Dr. Koldovsky Datum der Verteidigung: 28.11.2005 “Die Mitte der Nacht ist auch schon der Anfang eines neuen Tages.” Johannes Paul II. (1920-2005) “Das Schönste, was wir entdecken können, ist das Geheimnisvolle.” Albert Einstein (1879-1955) Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen CA ECM EGF ELISA GATA GM-CSF hCG HLA HGF IDO IFN-γ IGF-II IL ITAM ITIM IVF JAK KIR LECAM-1 LGL LIF MHC NCAM MIP MMP NCR NK-Zellen PBNK p.c. PIAS PLC SCID SSW STAT TGF TIMP TNF-α VCAM VEGF Cancer Antigen Extracellular Matrix Epidermal Growth Factor Enzyme Linked Immusorband Assay Transkriptionsfaktor u.a. Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor Human Chorionic Gonadotropin Human Leucocyte Antigene Hepatocyte Growth Factor Indoleamin 2,3-Dioxygenase Interferon-γ Insulin-like Growth Factor II Interleukin Immunoreceptor-Tyrosin-based-Activation Motive Immunoreceptor Tyrosine based Inhibitory Motifs In vitro Fertilisation Januskinase Human Killer Immunoglobulin-like Receptor Leukocyte Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Large Granular Lymphocytes Leukhemia Inhibitory Factor Major Histocompatibility Complex Neural Cell Adhesion Molecule Macrophage-Inflammatory Protein Matrix-Metalloproteinase Natural Cytotoxity Triggering Receptor Natural Killercells NK-Zellen des periphären Blutes postcoitus Protein Inhibitor of Activated STATs Phospholipase C Serve Combined Immunodeficiency Schwangerschaftswoche Signal Transducer and Activator of Transcription Transforming Growth Factor Tissue Inhibitor of Metalloproeinases Tumor Nekrose Faktor-α Vascular Cell Adhesion Molecule Vascular Endothelial Growth Factor Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ................................................................................................ 1 Das Immunologie im Allgemeinen 1.1 Das Immunsystem ................................................................................ 2 1.2 Das MHC-System ................................................................................ 3 1.3 Natürliche Killerzellen ................................................................................. 4 1.4 NK-Zell Rezeptoren, Aktivierung und Inhibition ................................. 6 1.5 Bewegung, Homing und Migration von NK-Zellen ................................. 8 1.6 Intrazelluläre Jak/STAT Signaltransduktion in Lymphozyten ....................... 8 Die Reproduktionsimmunologie 1.7 Trophoblasten, Entwicklung der Placenta ............................................. 10 1.8 Steuerung des Trophoblastenwachstums, Invasion und Migration 1.9 MHC-Expression in der Placenta .......... 11 ......................................................... 14 1.10 Immunzellen, Hormone und Enzyme in der Placenta ................................. 15 1.11 Produktion immunregulatorischer Substanzen im präimplantativen Embryo 18 1.12 HLA-G und sHLA-G Expression von Tumoren .................................. 19 1.13 Regulation der Signaltransduktion in Immunzellen während der Schwangerschaft .............................................................................. 19 1.14 STAT3 und STAT6 in Trophoblastzellen ............................................ 21 1.15 STATs und Apoptose in Tumorzellen ............................................ 22 1.16 Xenogene Schwangerschaften, Xenotransplantation ................................. 23 2. Ziele dieser Arbeit ..................................................................................... 25 3. Material und Methoden ............................................................... 27 3.1 Biologische Materialien ................................................................................ 27 3.2 Geräte und Reagenzien ................................................................................. 28 3.3 Übersicht der in vitro Versuche .................................................................... 31 3.4 Methoden ............................................................................................ 32 3.4.1 Isolierung von Primärzellen ......................................................... 32 Isolierung von Trophoblastzellen Isolierung von NK-Zellen ..................... 32 ................................. 33 3.4.2 Transfektion von Zellen mit “small interfering RNA” (siRNA) .... 34 Inhaltsverzeichnis 3.4.3 Funktionelle Analysemethoden ...................................................... 35 Proliferationsassay .................................................................... 35 Invasionsassay ............................................................................. 36 Untersuchung des Apoptoseverhaltens von Zellen ..................... 36 PAGE und Western Blot Zytotoxizitätsassay ......................................................... 36 .................................................................... 38 Durchflusszytometrie .................................................................... 38 Zytokin-Bestimmung .................................................................... 38 Nachweis von sHLA-G in Embryokulturüberständen ................. 39 3.4.4 Xenotransplantation von humanen Trophoblastzellen in RAG-2null/γcnull und C57BL/6J Mäuse Haltung der Versuchstiere ................................. 40 ......................................................... 40 Genotypisierung der Versuchstiere ............................................. 40 Präparation des humanen Deciduagewebes zur Transplantation... 41 Transplantation ..................................................................... 41 Versuchsschema ..................................................................... 42 Gewebe- und Blutentnahme ......................................................... 42 Histologie ................................................................................. 42 Enzyme Linked Immunosorband Assay (ELISA) 3.5 Statistik ........................................................................................................ 43 3.6 Darstellung der Ergebnisse 4. Ergebnisse ..................... 43 ..................................................................... 43 ................................................................................................ 44 4.1 Einfluss der Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF auf die STAT3Phosphorylierung in Jeg-3 Zellen ...................................................... 44 4.2 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von HT-29 Zellen .......... 46 4.3 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von Jeg-3 Zellen ............ 48 4.4 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von Trophoblastzellen ... 49 4.5 Einfluss von SOCS3 auf die Phosphorylierung von STAT3 in Jeg-3 Zellen 52 4.6 Einfluss von STAT3 und SOCS3 auf die Proliferation von Jeg-3 Zellen ..... 52 4.7 Einfluss von STAT3 auf das Apoptoseverhalten von Trophoblastzellen ..... 53 4.8 Einfluss von STAT6 auf das Invasionsverhalten und die Proliferation von Jeg-3 Zellen ........................................................................................ 54 4.9 “Knock Down” von HLA-G und HLA-G1 in Jeg-3 Zellen .................... 56 Inhaltsverzeichnis 4.10 Einfluss von HLA-G und HLA-G1 in Jeg-3 Zellen bezüglich der Zytotoxizität von NK-Zellen ................................................................... 57 4.11 Einfluss von STAT3 auf die Zytotoxizität von dezidualen NK-Zellen ...... 58 4.12 Zytokinproduktion humaner Embryonen ............................................ 59 4.13 In vivo Kultivierung humaner Trophoblastzellen; Xenotransplantation ..... 61 5. Diskussion ................................................................................................ 69 5.1 Untersuchung der Phosphorylierung von STAT3, induziert durch die Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF ......................................................... 69 5.2 Einfluss von LIF, SOCS3 und STAT3 bezüglich der Proliferation von Jeg-3 Zellen ............................................................................................ 72 5.3 Die Rolle von STAT3 bezüglich der Invasivität von Karzinom- und Trophoblastzellen ................................................................................ 72 5.4 Einfuß von STAT3 auf die Induktion von Apoptose in Trophoblastzellen .... 73 5.5 Die Rolle von STAT6 bezüglich der Invasivität und Proliferation von Jeg-3 und Trophoblastzellen .................................................................... 74 5.6 Die Rolle von STAT3 bezüglich der Zytotoxizität von NK-Zellen ......... 75 5.7 Funktion und Regulation der Expression von HLA-G in Jeg-3 Zellen ........ 75 5.8 Produktion von Zytokinen durch Embryonen ............................................... 76 5.9 Xenotransplantation ……………………………......................................... 79 5.10. Ausblick .................................................................................................. 82 6. Zusammenfassung .................................................................................... 83 7. Literaturverzeichnis .................................................................................... 85 Danksagung Publikationsliste Lebenslauf Ehrenwörtliche Erklärung Einleitung 1. Einleitung Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit einem Teilgebiet der Immunologie - der Reproduktionsimmunologie. Ziel dieses Zweiges ist die Untersuchung der Mechanismen immunologischer Vorgänge zwischen Mutter und Kind während einer Schwangerschaft. Desweiteren stehen klinische Fragen, wie die immunologisch bedingte Sterilität, die in vitro Fertilisation (IVF), Entwicklungsstörungen in der Placentation, sowie die Molenbildung und die Entstehung von Choriokarzinomen im Mittelpunkt. Mutter und Kind, die auf den ersten Blick nah verwandt sind, erscheinen aus immunologischer Sicht jedoch so verschieden, daß eine gegenseitige Organtransplantation nicht ohne begleitende immunsuppressive Therapie möglich ist. Da das Kind bzw. der sich entwickelnde Fetus zur Hälfte die genetische Information des Vaters trägt, wird er auch als halb- oder semiallogen gegenüber der Mutter bezeichnet. Aus dieser immunologischen Fremdartigkeit des Fetus ergibt sich die Frage, weshalb die Mutter den Fetus während der Schwangerschaft toleriert? Die Entwicklung eines Kindes von der Befruchtung der Eizelle, über die Implantation der Blastozyste, der intrauterinen Reifung, bis über den Zeitpunkt der Geburt hinaus ist ein besonderer immunologischer Vorgang. Bereits das Eindringen der, für die Mutter, allogenen Spermien durch die Vagina, den Uterus und die Tuben geschieht normalerweise problemlos, obwohl die Schleimhäute dieser Organe über ein hoch effizientes, lokales Immunsystem verfügen und ständig auf Keime reagieren. Nach der Befruchtung der Eizelle und dem Durchlaufen verschiedener Stadien (Morula, Blastula, u.a.) polarisieren sich eine innere Zellmasse, der Embryoblast und eine äußere Zellmasse, der Trophoblast heraus. Während sich aus dem Embryoblast alle zellulären Anteile für den Embryo bilden, entwickelt sich aus dem Trophoblast die Placenta. Kindliche, der Mutter semiallogene Trophoblastzellen proliferieren sehr stark, invadieren in mütterliches Gewebe ein und beginnen sich zu differenzieren, wobei aus Zytotrophoblasten durch Fusion Syncytiotrophoblasten entstehen. Diese Trophoblasten wachsen infiltrativ in das Uterusepithel ein, invadieren mütterliche Blutgefäße und kleiden sie aus. Aufgabe der Placenta ist der bidirektionale Stoffaustausch zwischen Fetus und Mutter, wobei allerdings die beiden Blutkreisläufe voneinander getrennt bleiben. Die fetalen Trophoblastzellen, die sowohl im Uterusgewebe, als auch in den invadierten Blutgefäßen in direkten Kontakt mit mütterlichen Immunzellen kommen, werden dabei durch das maternale Immunsystem nicht nur toleriert, sondern es findet eine enge immunologische Kommunikation zwischen der Mutter und dem sich entwickelnden Kind statt. Durch die Produktion von Zytokinen und Hormonen, durch mütterliche als auch fetale Zellen, wird die Trophoblasteninvasion kontrolliert und bei einer bestimmten Invasionstiefe -1- Einleitung gestoppt. Störungen in dieser Wachstumskontrolle können zu einer verminderten Placentation oder zu einer ungehinderten Invasion der Trophoblasten, einer sogenannten hydativen Mole führen. Bei einer ungehinderten Invasion von Trophoblastzellen besteht die Gefahr, daß sich diese Trophoblasten zu malignen Zellen, den Choriokarzinomzellen entwickeln und Metastasen bilden. Für die Entwicklung der Placenta und des Fetus ist es also essentiell, daß die Placentation streng reguliert wird und eine lokale Immunsuppression stattfindet. Zum besseren Verständnis der Immunologie der Placenta wird zunächst kurz auf die Immunologie im Allgemeinen und später speziell auf reproduktionsimmunologische Vorgänge und die Steuerung der Invasion von Trophoblasten eingegangen. 1.1 Das Immunsystem Das Immunsystem des Menschen besteht aus einem spezifischen, erworbenen Immunsystem und dem unspezifischen Komplementsystem. Während das Komplementsystem durch Enzyme und andere Proteine die Zerstörung der Membranen von Bakterien in der Blutbahn bewirkt, ist das spezifische Immunsystem für eine gezielte Reaktion auf das Eindringen von Bakterien und Viren verantwortlich. Antikörper, die von Schibasaburo Kitasato und Emil von Behring entdeckt wurden, heften sich an Krankheitserreger 1-4 , so dass diese entweder durch die Aktivierung von Enzymen des Komplementsystems bekämpft oder durch Makrophagen erkannt, phagozytiert und lysiert werden (antikörpervermittelte oder humorale Immunantwort). Antikörper kommen ebenfalls auf der Oberfläche von Immunzellen, den Lymphozyten 5 vor und dienen als Rezeptoren, die bei Kontakt mit einem Antigen die Produktion und Sekretion von spezifischen Antikörpern auf dieses Antigen induzieren 6. Die zwei genannten immunologischen Systeme bieten aber keinen ausreichenden Schutz vor Erregern, wie zum Beispiel denen der Tuberkulose oder Viren, die sehr schnell in das Innere von Wirtszellen eindringen. Die Komponenten der zellvermittelten Immunantwort, die Lymphozyten, erkennen infizierte oder dem Körper fremde Zellen und bekämpfen sie. Sie werden im Knochenmark und der Thymusdrüse gebildet und differenzieren sich in zwei unterschiedliche Arten, den B- und T-Zellen 7. Die B-Zellen spielen durch die Erkennung von Antigenen und der Produktion von Antikörpern die Hauptrolle in der humoralen Immunantwort; die T-Zellen stellen die zellvermittelte Immunität dar. Sie tragen Rezeptoren auf Ihrer Oberfläche und erkennen 8 bis 15 Aminosäuren kurze Teilstücke, die von dem Haupt-Histokompatibilitätskomplex (engl.: major histocompatibility complex, MHC) auf Körperzellen präsentiert werden. -2- Einleitung Wenn ein Virus in eine Zelle dringt und sich dort vermehrt, werden von der Wirtszelle virale Antigene über den MHC-Komplex präsentiert, T-Zellen töten die Wirtszelle ab und eine Vermehrung des Erregers wird verhindert. T-Zellen reagieren auch auf Zellen mit fremdartiger MHC-Struktur, was vor allem in der Transplantations-, Reproduktions- und Tumorimmunologie von Bedeutung ist. Bei einer Reaktion von T-Zellen werden Interleukine sezerniert, welche die Produktion von Antikörpern durch B-Zellen aktivieren oder hemmen können 8. Durch den Abbau dieser Interleukine und der Präsentation der Abbauprodukte auf B-Zellen wird eine Rückkopplung des Signals erreicht. T-Zellen differenzieren sich in zwei weitere Arten von Zellen; den CD4 positiven Helfer- und den CD8 positiven Killerzellen (Zytotoxische T-Zellen) 9. Als „Cluster of Differentiation“ (CD) bezeichnet man spezifische Oberflächenmoleküle auf Lymphozyten, durch die eine funktionelle Ordnung dieser Immunzellen geschaffen wird. Makrophagen phagozytieren fremde Antigene (virale, oder bei Krebszellen veränderte Eiweisstoffe), die von ihnen präsentiert und von T-Helferzellen erkannt werden. T-Helferzellen reagieren auf diesen Kontakt mit der Produktion von Interleukinen. Aktivierte CD8 positive Zellen produzieren nur sehr kleine Mengen an Zytokinen, allerdings sind diese Zellen in der Lage die Antigentragende Zelle zu lysieren. Ein weiteres Werkzeug der zellvermittelten Immunantwort sind NK-Zellen, auf deren Funktionsweise in einem eigenen Abschnitt eingegangen wird. 1.2 Das MHC-System Eine zentrale Rolle in der zellvermittelten Immunantwort spielen MHC-Moleküle. Durch die Expression von MHC-Molekülen können intrazelluläre Krankheitserreger, aber auch fremdartige Zellen beispielsweise nach Organtransplantationen erkannt und bekämpft werden. Die Wirkungsweise der zellvermittelten Immunität durch die Expression von MHCMolekülen zur Unterscheidung zwischen eigenen, Virus-infizierten, oder fremdartigen Zellen konnte in allen Säugetierspecies nachgewiesen werden. Beim Menschen gibt es zwei Arten von MHC-Molekülen (MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II), die die meisten strukturellen Eigenschaften gemeinsam haben und in ihrer extrazellulären Domäne eine Spalte besitzen, wo ein Peptidfragment gebunden wird. Diese Peptidfragmente stammen von Proteinen, die im Zellinneren abgebaut und an neue MHC-Moleküle gebunden werden. MHC-Klasse-I Moleküle binden Peptidreste von Proteinen, die im Zytosol hergestellt werden und übernehmen damit die Aufgabe, Fragmente von viralen Proteinen zu präsentieren. Vor allem CD8 positive T-Zellen benötigen für eine Reaktion die Präsentation von Antigenen auf MHC-Klasse-I Molekülen. MHC-Klasse-II Moleküle binden Peptide von Proteinen in intrazellulär membrangebundenen Vesikeln und präsentieren somit Peptide von -3- Einleitung Pathogenen. Die Präsentation von Peptiden pathogener Krankheitserreger auf MHC-KlasseII-Molekülen dient der Induktion CD4 positiver Zellen. Beim Menschen tragen MHC-Moleküle die Bezeichnung HLA (human leucocyte antigen) und umfassen mehr als 200 Gene. Es gibt drei sehr polymorphe Klasse-Iα-Ketten-Gene (HLA-A, -B und -C) und drei MHC-Klasse-II-Gen-Paare (HLA-DR, -DP, und -DQ). Zytokine (IFN-α, -β oder -γ) führen zu einer Erhöhung der Expression der MHC-Klasse-IαKette und des β2-Mikroglobulin-Anteils und regen somit die Präsentationen von Antigenen bei frühen Stadien von Infektionen an. HLA-Klasse-Ia-Moleküle (HLA-A, -B, -C) sind auf fast allen kernhaltigen Körperzellen in unterschiedlichem Maße exprimiert. T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen, sowie andere Antigen-präsentierende Zellen exprimieren diese Moleküle besonders stark 10 . Der Polymorphismus dieser HLA-Klasse-Ia-Moleküle ist dafür verantwortlich, daß eine Transplantation von Organen nicht ohne gleichzeitige Immunsuppression möglich ist. Wie schon erwähnt, ist selbst die Organtransplantation zwischen Mutter und Kind, bzw. zwischen Geschwistern ohne Immunsuppression meist mit heftigen Abstoßungsreaktionen verbunden. HLA-Klasse-Ib-Moleküle (HLA-G, -E, -F) sind dagegen oligomorph und werden nur auf Trophoblasten, verschiedenen Tumoren und einigen Lymphozyten exprimiert 11, 12 . Durch die fehlende Expression von HLA-Klasse-Ia-Molekülen und die gleichzeitige Expression von HLA-Ib-Moleküle schützen sich sowohl fetale Trophoblastzellen vor Immunreaktionen der Mutter, als auch oft Tumorzellen vor dem Wirtsimmunsystem. HLA-Klasse-II-Moleküle werden stark auf B-Zellen, Makrophagen, anderen Antigenpräsentierenden Zellen, epithelialen Zellen des Thymus und geringfügig auf aktivierten TZellen beim Menschen exprimiert. 1.3 Natürliche Killer Zellen Wie schon erwähnt, sind Natürliche Killer (NK)-Zellen ein weiterer Bestandteil der zellvermittelten Immunität. Während im Blut eines Erwachsenen etwa 15% der Gesamtlymphozyten NK-Zellen sind, steigt der Anteil an NK-Zellen während einer Schwangerschaft beachtlich an. NK-Zellen wandern dann aktiv in den Uterus ein, tolerieren aber die semi-allogenen fetalen Zellen in der Dezidua. Da diese feto-maternale Immuntoleranz einen Schwerpunkt dieser Arbeit darstellt, wird in den folgenden Abschnitten näher auf die NK-Zellen und später auf NK-Zellen in der Decidua eingegangen. Bildung von NK-Zellen: NK-Zellen entwickeln sich aus pluripotenten haematopoetischen Stammzellen gemeinsam mit T-Zellen. Allerdings erfolgt die Reifung der NK-Zellen nicht wie bei den T-Zellen im Thymus, sondern im Knochenmark 13. Dabei spielt Interleukin (IL)-4- Einleitung 15, produziert von Stromazellen, eine entscheidende Rolle. Colucci et. al. beschrieben ein Modell von drei Stufen der NK-Zell-Reifung: eine Initialphase, bei der sich Stammzellen in Richtung der lymphoiden Linie entwickeln und Vorläufer-NK-Zellen darstellen; einer zweiten Stufe, bei der sich diese Vorläufer zu phenotypisch und funktionell reifen NK-Zellen entwickeln; und einer dritten Stufe, bei der die reifen NK-Zellen in die Zielorgane und das periphere Blut transportiert werden 14. Arten von NK-Zellen: Natürliche Killer Zellen sind eine inhomogene Gruppe. Man unterscheidet zwischen den NK-Zellen des peripheren Blutes (PBNK) und den uterinen NKZellen (uNK) in der Schwangerschaft, früher als „large granular lymphocytes“ der Dezidua (DLGL) bezeichnet. PBNK exprimieren den Fc-γ-Rezeptor-III (CD16) sehr stark (CD16++) und CD56, das „Neuronal Cell Adhesion Molecule“, nur sehr schwach (CD56(+)), während uNKs schwach CD16- und stark CD56 positiv sind (CD16(+)/CD56++) 15 . Aber es gibt ebenfalls unter den PBNKs eine relativ kleine Gruppe die ebenfalls CD56++ ist. Darüber hinaus unterscheiden sich die uNKs von den PBNKs durch eine stärkere Expression von CD29 (β1-Integrin) und CD45RO. Weiterhin exprimieren sie CD15s, CD43 (Leukosialin), CD44 (H-CAM), CD45RA, CD62L (LECAM-1) und HLA-DR 15. Eigenschaften von NK-Zellen: Ein grundlegendes Merkmal dieser Zellen ist die Fähigkeit, verschiedene Tumorzellen ohne vorherige Sensibilisierung zu töten 16, 17 . Sie sind ein wichtiges Werkzeug in der Abwehr von Viren, Parasiten, intrazellulären Bakterien 18-20 und beginnen bei Infektionen sehr schnell mit der Produktion von Zytokinen und Chemokinen. Beispielsweise produzieren sie den Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α, Interferon (IFN)-γ, den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden-Faktor (GM-CSF), das MakrophagenInflammatorische Protein (MIP)-1α, MIP-1β und RANTES Regulator der Immunantwort 21, 22 21 und wirken somit als wichtiger . Durch RANTES werden unter anderem Migrations- vorgänge in T-Zellen aktiviert und somit eine Anhäufung immunaktiver Zellen in den Infektionsgebieten erreicht. Es wurde lange vermutet, dass NK-Zellen nach der „missing self“-Hypothese funktionieren. Diese Hypothese basiert auf der Erkenntnis, dass NK-Zellen in vitro transformierte Zellen töten, die keinen MHC-Komplex besitzen 23-25 . Die Identifizierung von inhibitorischen Rezeptoren für spezifische MHC Klasse-I Moleküle unterstützt diese Hypothese 25-27. Wirkungsweise von NK-Zellen: Für eine zytotoxische Reaktion benötigen NK-Zellen stimulierende Signale an den Rezeptoren, um an Zielzellen zu binden und ihre Effektorfunktion auszuüben 28 . Allerdings finden oft auch zytolytische Prozesse statt, wenn inhibierende Rezeptoren aktiviert werden. Offensichtlich entscheidet eine Balance zwischen -5- Einleitung stimulierenden und inhibierenden Rezeptorsignalen über die Art der Reaktion der NK-Zelle 29, 30 . Dabei muss sich die NK-Zelle an die Zielzelle anlagern und eine „immunologische Synapse“ bilden, in der über die Art der Reaktion entschieden wird und eventuell Effektorproteine von der NK-Zelle sezerniert werden können 31. 1.4 NK-Zell-Rezeptoren, Inhibition und Aktivierung Obwohl NK-Zellen sowohl aktivierende als auch inhibierende Rezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimieren, vermitteln in einigen Fällen die gleichen Rezeptoren je nach Bindungsstärke des Signalmoleküls sowohl aktivierende als auch inhibierende Signale. Inhibitorische Rezeptoren binden an klassische und nicht-klassische HLA Klasse-I Moleküle. Bei einer ausreichend großen Bindungsaffinität wird eine zytolytische Reaktion verhindert und somit ist dieser Vorgang essentiell für die Selbsttoleranz. Der „human killer immunoglobulin-like receptor“ (KIR) gehört zu der Immunoglobulin-Superfamilie, während der Ly49 Rezeptor in Mäusen und der CD94/NKG2 Rezeptor (bei Maus und Mensch) der CTyp Lektin Rezeptorfamilie angehört 32 . Diesen genannten Rezeptoren ist gemeinsam, dass sie oft ähnliche Mechanismen verwenden um in der NK-Zelle inhibitorische Signale zu vermitteln. Inhibitorische Signale werden meist durch „immunoreceptor tyrosine based inhibitory motifs“ (ITIM) übertragen, welche sich an der zytoplasmatischen Seite des Rezeptors befinden. Bei einer Bindung an einen Liganden werden die ITIMs phosphoryliert, was mit einer Dephosphorylierung des Guanin-Nukleotid-Austausch-Faktor Vav1 einhergeht. Eine Phosphorylierung von Vav1 führt zu Umformierungen des Aktinskeletts, die für die Bildung einer immunologischen Synapse und schließlich für eine Zytolyse notwendig sind. Die Dephosphorylierung dieser Moleküle führt hingegen zur Auflösung der immunologischen Synapse 33-37 und somit zu einer Verhinderung der Zytotoxizität. Rezeptoren der KIR Familie haben entweder zwei oder drei Domänen und tragen deshalb den Suffix 2D oder 3D Inhibitorische KIR 38 . tragen meist lange zytoplasmatische Anhänge, an denen sich zwei ITIMs befinden. KIRs sind Abb 1.1 Rezeptoren für HLA-Moleküle auf NK-Zellen (http://www.niaid.nih.gov/dir/labs/lig/figure3.htm) somit wichtige Rezeptoren in der Selbsterkennung des Immunsystems, wobei KIR2Ds unter anderem spezifisch mit HLA-C Molekülen interagieren, während KIR3Ds auf HLA-A und HLA-B Moleküle reagieren 38. -6- Einleitung Die Rezeptorkomplex-CD94/NKG2-Heterodimere sind für die Erkennung von HLA-E verantwortlich. Das inhibitorische Signal wird, ähnlich wie bei den KIRs, durch zwei ITIMs an den zytoplasmatischen Domänen NKG2A oder NKG2B (eine Splice-variante von NKG2A) übertragen 39, 40. Aktivierende Rezeptoren auf NK-Zellen sind durch oft kurze zytoplasmatische Domänen, die keine Signaltransduktionsstrukturen besitzen, gekennzeichnet. Stattdessen findet die Signaltransduktion durch Adaptormoleküle wie DNAX-Aktivierungsprotein-12 (DAP-12), DAP-10, CD3ζ (welches das Immunrezeptor-Tyrosin-basierende Aktivierungs-motiv [ITAM] enthält) oder FcRγ statt. In der weiteren Signaltransduktion sind oft GTPasen der RhoFamilie, Phospholipasen-C (PLC) und die schon beschriebenen Vav1-Moleküle beteiligt 41 , die die Bildung einer stabilen immunologischen Synapse begünstigen. Im Gegensatz zu anderen Rezeptoren, sind die NKG2D-Rezeptormoleküle (CD314) auf allen NK-Zellen zu finden und sehr gut charakterisiert 27, 29, 30, 42-44 . Sie sind auch auf anderen Zellen, wie zum Beispiel γδT-Zellen zu finden 30, 43 und die Expression kann in Makrophagen und CD8+ T-Zellen induziert werden. Dieser Rezeptor unterscheidet sich unter anderem von dem NKG2-Rezeptor dadurch, dass er als Homodimer vorkommt 37 und nicht mit HLA-E interagiert 29, 30. Der NKG2D Rezeptorkomplex ist essentiell für die Produktion von IFN-γ 45, wobei die Induktion der Zytokinproduktion in NK-Zellen ITAM- abhängig ist 41, 46. Doch auch KIRs haben aktivierende Isoformen. Wie auch die inhibitorischen KIRs, haben sie zwei oder drei extrazelluläre, allerdings nur sehr kurze intrazelluläre Domänen. Das aktivierende Signal wird deshalb auch bei diesen Rezeptoren durch ITAMs übertragen Auch CD94/NKG2C und CD94/NKG2E sind aktivierende Rezeptoren 47 32 . . Beide binden an HLA-E, jedoch hat CD94/NKG2A zu HLA-E eine wesentlich höhere Bindungsaffinität, so dass normalerweise eine Inhibierung von HLA-E ausgeht. Vielmehr scheint hinter diesem Mechanismus eine Aktivierung der NK-Zelle nach Stress zu stehen 48. Weiterhin gibt es in NK-Zellen drei so genannte natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren (NCR), die Rezeptoren NKp30 (CD337), NKp44 (CD336) und NKp46 (CD335) 49 . Auf allen NK- Zellen sind NKp46 und NKp30 zu finden, die ihr Signal durch den CD3ζ/FcεRIγ-Komplex weitergeben, während NKp44 nur auf aktivierten NK-Zellen exprimiert wird und die Signaltransduktion durch DAP12 erfolgt. Diese Rezeptoren interagieren nicht mit MHCMolekülen, aktivieren aber die NK-Zellen bei Bindung an Zielzellen, die virale Proteine präsentieren 50. Somit scheinen diese Rezeptoren essentiell für die primäre Immunantwort der NK-Zellen zu sein 51. -7- Einleitung 1.5 Bewegung, Homing, Migration von NK-Zellen Da NK-Zellen eine erste immunologische Barriere darstellen, ist es wichtig, dass sie zu dem Zielorgan transportiert werden, durch die Kapillarwand gelangen und aktiv in das Zielgewebe entlang der Matrixproteine zu den Tumor- oder infizierten Zellen migrieren 52 . Dazu sind zwei grundsätzliche, unabhängig von einander regulierte Vorgänge notwendig: die Adhäsion der Zellen an die Oberfläche des vaskulären Endotheliums und die transendotheliale Migration 53 . Beide Vorgänge werden durch eine Fülle von Regulationsmolekülen gesteuert. Selektine, Moleküle der Immunoglobulin-Superfamilie und Integrine sind für die Initiierung, die Anheftung der Zellen und die transendotheliale Migration von NK-Zellen notwendig. Hormone, Zytokine, andere pro-imflammatorische Stoffe, abgespaltene Rezeptorstücke u.v.m. beeinflussen diesen Prozess 54 . NK-Zellen produzieren und sezernieren Fibronektin, ein Protein der extrazellulären Matrix, welches bei vielen biologischen Vorgängen, wie Adhäsion, Zytoskelettaufbau, Migration und Invasivität beteiligt ist exprimieren uNK-Zellen stark CD56 56, 57 55 . Wie schon erwähnt, und sind dadurch in der Lage, während einer Schwangerschaft aktiv in die Decidua zu migrieren, wo eine außergewöhnlich hohe Konzentration von NK-Zellen beobachtet werden kann. Da diese Anhäufung von NK-Zellen in der Kontaktzone zwischen mütterlichem und kindlichem Gewebe eine Besonderheit und einen Schwerpunkt dieser Arbeit darstellt, wird darauf in einem eigenen Abschnitt eingegangen. Andere Zytokine, wie TGF-beta-1 und IL-6 wirken chemotaktisch auf NK-Zellen 58, genauso wie MIP-1, MIP-1beta und das „IFN-inducible Protein-10“ (IP-10) 59 . RANTES, das „Monocyte chemotactic protein-1“ (MCP-1), MCP-2 und MCP-3 lösen ebenfalls chemotaktische Reaktionen aus. Weiterhin benutzen NK-Zellen unter anderem das „Intracellular Adhesion Molecule-1“ (ICAM-1, CD54) und CD2, um an Tumorzellen zu binden und eine cytolytische Reaktion zu starten 60. Das „Leukocyte Endothelial Cell Adhesion Molecule-1“ (LECAM-1, CD62L) vermittelt die Bindung von Leukozyten an das Endothelium und fungiert damit als allgemeiner HomingReceptor, dessen Expression durch Zytokine, wie zum Beispiel Interleukin-4 (IL-4) gesteuert wird 61. 1.6 Intrazelluläre Jak/STAT Signaltransduktion in Lymphozyten Eine wichtige und schnelle Signalkaskade in Lymphozyten ist neben weiteren Signalwegen, auf die in dieser Arbeit nicht näher eingegangen wird, der JAK/STAT-Signaltransduktionsweg (Abb. 1.2: 1-3). Bei diesem Signalweg werden, induziert durch ein ZytokinRezeptorsignal, zunächst Tyrosinkinasen (z.B. Janus kinasen [Jak]) aktiviert. Die Vertreter -8- Einleitung der Tyrosinkinasen (Jak1, Jak2, Jak3 und Tyk2) sind bei der Signaltransduktion einer Vielzahl von Zytokinen beiteiligt exprimiert wird 67 62-66 , wobei Jak3 in Lymphozyten besonders stark . Die Aktivierung der Tyrosinkinasen führt zu einer Phosphorylierung des intrazellulären Anteils des Zytokinrezeptors, der Bindungsstellen für SH2-Signalproteine bietet, die wiederum phosphoryliert werden 68. Diese Phosphorylierung geht dann auf „Signal Transducer and Activator of Transcription“ Moleküle (STATs) über. Grundsätzlich gibt es 6 verschiedene STAT-Moleküle, die in der Reihenfolge ihrer Entdeckung benannt worden und wiederum in verschiedenen Isoformen vorkommen. Phosphorylierte STATs sind in der Lage, Dimere zu bilden und in dieser Form in den Zellkern zu wandern. Dort binden sie an spezifische DNA-Bindungsstellen und induzieren so die Expression von Zielgenen 69. 1 L-Ligand 2 M-Membran 3 R-Rezeptor Z-Zellkern Abb. 1.2: JAK/STAT Signaltransduktionsweg Dabei wird über Rückkopplungsschleifen („Feedback-loops“) eine negative Regulation erreicht 70. Aber auch positive Rückkopplungen existieren, denn zum Beispiel induziert IL-2 durch den JAK/STAT-Weg wiederum die Transkription und Produktion von IL-2. Allerdings nutzen Zytokine mehrere der bekannten drei JAK- und sieben STAT-Moleküle, aber auch jedes JAK- und STAT-Molekül kann durch verschiedene Zytokine genutzt werden 68 . Im Zellkern binden die STAT-Moleküle an die Promotorregionen der Zielgene auf der DNA und induzieren so die Transkriptionskaskade. Diese Signalkaskaden können durch Regulationsmoleküle, wie den „Protein Inhibitor of Activated STATs“ (PIAS) oder den „suppressors of cytokine signalling“ (SOCS), negativ beeinflusst werden 71, 72 . SOCS Moleküle wurden 1997 erstmalig beschrieben, hemmen spezifisch den JAK/STATSignalweg, wodurch sie wichtige Elemente Signalübertragung in Immunzellen darstellen 72. -9- der Regulation der intrazellulären Einleitung Die Placenta - ein immunprivilegiertes Organ? - Die Reproduktionsimmunologie - 1.7 Trophoblastzellen und die Entwicklung der Placenta Trophoblastzellen der Placenta haben in den verschiedenen Species viele Mechanismen entwickelt, in den Uterus zu invadieren und in die Blutgefäße einzudringen, um einen effizienten feto-maternalen Stoffaustausch zu gewährleisten. Das Invasionsverhalten ist streng räumlich und zeitlich kontrolliert, dauert beim Menschen bis zum Ende des ersten Trimesters der Schwangerschaft und ist begrenzt auf das Endometrium, bzw. das erste Drittel des Myometriums 73 . Bevor eine Invasion stattfindet, muss jedoch die Blastozyste an die Basalmembran-Matrix binden und durch die Sekretion von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und Serinproteasen die Basalmembran abbauen 74 . Anschließend beginnen Zytotrophoblastzellen MMPs zu sezernieren und invasiv in Uterusgewebe einzuwachsen, Abb 1.3: schematischer Querschnitt einer humanen Placenta (www.mhhe.com/socscience/devel/ibank/image/0038.jpg) kontrolliert durch antiinvasive Faktoren, die im Deciduagewebe und durch fetale Zellen produziert werden. Wie schon anfänglich erwähnt, stammen Zytotrophoblastzellen von trophektodermalen Zellen der Blastozyste ab und repräsentieren eine heterogene Population während der frühen Schwangerschaft. Nach dem ersten Kontakt der Blastozyste mit dem Uterusgewebe beginnen Zytotrophoblasten (Syncytiotrophoblasten) zu bilden 75 zu fusionieren und ein Syncytium . Somit sind für invasive Vorgänge, die mit der Verdrängung von mütterlichem Gewebe einhergehen, Zytotrophoblasten verantwortlich, während endokrine- und Transportfunktionen von den Syncytiotrophoblasten übernommen werden 76. - 10 - Einleitung 1.8 Steuerung des Trophoblastenwachstums, der Invasion und Migration Grundsätzlich kann das Invasionsverhalten von Trophoblastzellen durch Hormone, Zytokine, Enzyme u.a. positiv oder negativ beeinflußt werden. Dabei werden diese Stoffe sowohl von embryonalem als auch maternalem Gewebe produziert. Um dieses komplizierte Steuerungssystem näher zu beschreiben, wird im folgenden auf einzelne Faktoren eingegangen. Induktion der Invasion: Für eine gerichtete Invasion von Zellen ist die Realisierung der Umwelt von maßgeblicher Bedeutung, wobei die extrazelluläre Matrix (ECM) eine wichtige Rolle spielt 77. Collagen Typ-1, ein großer Bestandteil der ECM, stimuliert die Sekretion von Gelatinase in Zytotrophoblastzellen 78 . Laminin, das die Invasion von Melanomzellen und deren Sekretion von MMP-2 induziert und ähnliche Effekte auf Choriokarzinomzellen hat, beeinflusst Zytotrophoblasten dagegen nicht 78 . Zytotrophoblasten zeigen unterschiedliche Reaktionen auf verschiedene exogene Reize, abhängig von der Matrigeldichte, auf der sie kultiviert werden. Weiterhin kann auch durch Zell-Zell Kontakt die Sekretion von MMPs induziert werden. So wird zum Beispiel bei verschiedenen Tumoren, die keine MMPs produzieren, deren Sekretion durch die umliegenden Zellen bei direktem Zell-Zell Kontakt induziert. Auch transfizierte embryonale Zellen von Ratten sind in der Lage, die Produktion von MMP-9 in Fibroblasten durch Zell-Zell Kontakt zu induzieren 79 . Somit spielt dieser Mechanismus eine wichtige Rolle in der Kontrolle der Invasion von Trophoblastzellen. Interleukin-1 (IL-1) wird von Monozyten und Makrophagen, Zellen in der feto-maternalen Grenzfläche, sowie prä-implantativen Embryonen produziert. IL-1 Rezeptoren werden von endometrialen Endothelzellen während der sekretorischen Phase und während der Implantation exprimiert. IL-1-Antagonisten führen zu einer signifikant reduzierten Anzahl von implantierten Embryos bei Mäusen, was zu der Schlussfolgerung führt, dass IL-1 ein wichtiger Mediator während der Implantationsphase der Schwangerschaft ist 80 . Beim Mensch exprimieren endometriale Epithelzellen und extravillöse Zytotrophoblasten den IL-1Rezeptor, während IL-1 sowohl von extravillösen als auch von villösen Zytotrophoblasten, nicht aber von epithelialen Zellen exprimiert wird. Im Endometrium wird IL-1 in dezidualisierten und pseudo-dezidualisierten Zellen produziert. Es führt zu einer Stimulation der Aktivität von MMP-1, MMP-3 und des „Tissue Inhibitor of Metalloproteinase“ (TIMP) in Fibroblasten und MMP-9 in Zytotrophoblasten 81, 82. Interleukin-6 (IL-6) wirkt auf Zellen durch die Bindung an zwei Membranproteine; ein 80 kDa IL-6-Bindeprotein (IL-6R) und einem 130 kDa Signaltransduktionsprotein (gp130). Das Signaltransduktionsprotein gp130 ist ebenfalls mit dem Leukemia Inhibitory Factor (LIF)- 11 - Einleitung Rezeptor assoziiert. IL-6 wird vom Endometrium in der Mitte der sekretorischen Phase und von allen Trophoblasten (Cyto- und Syncytiotrophoblasten) des ersten Trimesters gebildet. Der IL-6 Rezeptorkomplex ist auf endometrialen Endothelzellen vorhanden, während nur der gp130-Anteil in der Decidua und Trophoblasten des ersten Trimesters sowie auf Blastozysten gefunden werden kann. IL-6 induziert die Aktivierung von MMP-2 und MMP-9 in Trophoblasten, allerdings nicht deren Synthese 81 . LIF wird im Mausendometrium ab dem vierten Schwangerschaftstag kurz vor der Implantation der Blastozyste produziert. Das Signal von LIF wird innerhalb der Trophoblastzellen via STAT3 übertragen. „Knock Out“ Versuche in Mäusen zeigten, daß dieses durch LIF induzierte STAT3-Signal essentiell für eine erfolgreiche Implantation des Embryo ist 83 . Der LIF-Rezeptor kann sowohl auf villösen als auch extravillösen Zytotrophoblasten gefunden werden. LIF führt zu einer TIMP-Stimulation in Fibroblasten 84 und inhibiert die gelatinolytische Aktivität von Zytotrophoblasten, die Laminin-Rezeptoren tragen, nicht aber die von Zytotrophoblasten, die FibronektinRezeptoren exprimieren 85 erfolgreiche Placentation 86 . Zusammengefaßt ist LIF ein wichtiges Zytokin für eine , sowie für die Invasion 87 , Migration und Proliferation 88 von Trophoblastzellen. Interleukin-15 (IL-15), was von Trophoblasten produziert wird, induziert die Invasion, Migration und MMP-1 Produktion von Trophoblast- und Jeg-3 Choriokarzinomzellen. IL-15 hat allerdings keinen Effekt auf die Produktion von MMP-2 und MMP-9 89 . Der „Tumor Nekrosis Factor“ (TNF)-α α wird vor allem von Makrophagen und endometrialen Zellen produziert. TNF-α induziert die Produktion von MMP-9 in Endothelzellen von Rindern 90, sowie MMP-1 und MMP-3 in Chorionzellen des Menschen 91. Außerdem verringert TNF-α im Gegensatz zu IL-10 die TIMP-Expression 92 . In Trophoblastzellen induziert TNF-α die Produktion von MMP-9, nicht aber von MMP-2 81 . Der „Epidermal Groth Factor“ (EGF) und der „Transforming Groth Factor“ (TGF)-α α besitzen gleiche Sequenzabschnitte und binden mit diesen Regionen an ein und den selben Rezeptor. EGF wird besonders von dezidualen Zellen produziert, kann aber auch in dem Endometrium während der proliferativen und sekretorischen Phase nachgewiesen werden. Der Nachweis von EGF in Trophoblastzellen ist allerdings auf die Überexpression von EGF/TGFα-Rezeptoren auf Zytotrophoblasten zurückzuführen 93. Die Stimulation von MMP1 und MMP-3 91 , sowie die synergistische Stimulation dieser Enzyme durch IL-1 und EGF führt zu einer gesteigerten Invasivität von Zytotrophoblast- und Sarkomzellen 93, 94 . Der „Insulin-like Growth Factor“ (IGF)-II wird sowohl von extravillösen als auch von villösen, proliferierenden Zytotrophoblasten nach der abgeschlossenen Implantation bis zum Ende der Schwangerschaft produziert 95-97 . IGF-II induziert eine Erhöhung der Invasion von - 12 - Einleitung Trophoblastzellen in Matrigel durch Bindung an den IGF Rezeptor Typ 2 98, 99 . Somit stellt IGF-II ein Schlüsselmolekül in der autokrinen Regulation der Trophoblastinvasion dar. Ein anderes Zytokin, was im Placentagewebe produziert wird und parakrin auf Trophoblasten wirkt ist der „Hepatocyte Growth Factor“ (HGF). HGF ist ein Regulationsmolekül, das die Proliferation, Invasion und Differenzierung von Trophoblasten 100, 101, sowie die Motilität von Tumorzellen 102 beeinflusst. Es wurde beobachtet, dass eine verminderte Expression des HGF-Rezeptors auf Trophoblastzellen mit Wachstumsretardierungen und Präeklampsie bzw. mit dem Tod des Embryo assoziiert ist 104 103 , . Somit ist HGF ein essentieller Mediator für Mesenchym-Trophoblastepithel-Interaktionen, sowie für die Organogenese der Placenta 105. Inhibition der Invasion: Eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Invasionsverhaltens invadierender Zellen spielen TIMP-Moleküle. TIMPs neutralisieren MMPs durch Bindung an die hoch konservierte Zink-Bindungsseite aktiver MMPs und beeinflussen somit die Trophoblasteninvasion negativ 74, 106 . Die TIMP-Expression wird durch den „Transforming Growth Factor“ (TGF)-β β in Trophoblastzellen induziert. Weiterhin steuert TGF-β die Differenzierung der invasiven Trophoblastzellen in vielkernige Riesenzellen ohne invasiven Charakter, wodurch TGF-β eine wichtige Bedeutung Trophoblastendifferenzierung der frühen Schwangerschaft zukommt 107 bezüglich der . TGF-β wird vom Endometrium und Zellen der Decidua, vor allem aber von villösen und extravillösen Zytotrophoblasten, sowie Syncytiotrophoblasten produziert. In Fibroblasten, Keratinozyten und cervikalen Zellen steigert TGF-β die MMP-2 und MMP-9 Aktivität, wobei es TIMP verringert 108-110 . Diese Effekte treffen allerdings nicht auf Zytotrophoblasten zu, bei denen TGF-β die Invasion und Migration inhibiert und, wie schon erwähnt, die Differenzierung der invasiven Trophoblastzellen in Syncytiotrophoblasten induziert 81, 111, 112 . Hormone, die das Invasionsverhalten von Trophoblasten beeinflußen, sind vor allem Progesteron und „Human Chorionic Gonadotropin“ (hCG). Diese Hormone werden durch Syncytiotrophoblasten in großen Mengen produziert und sind somit an der feto-maternalen Grenzfläche präsent. Progesteron verringert die Produktion von MMP-9 in Ersttrimester-Zytotrophoblasten 113 ebenso der bewirkt es mit fortschreitender Schwangerschaft eine Verringerung , Gelatinaseproduktion von Zytotrophoblasten. Ähnlich wie Progesteron, spielen auch hCG und das luteinisierende Hormon (LH) eine wichtige Rolle bezüglich der Trophoblasteninvasion und -transformation, denn hCG-Rezeptoren sind sowohl auf extravillösen und endovaskulären Trophoblasten, als auch auf Syncytiotrophoblasten vorhanden 114 . Es konnte gezeigt werden, dass hCG die Invasion von Zytotrophoblasten in vitro konzentrationsabhängig inhibiert, ohne die Bindung an die Basalmembran zu beeinflussen - 13 - 115 . Unter experimentellen Bedingungen Einleitung wurde die Collagenaseaktivität, nicht aber deren mRNA reduziert; ebenfalls blieb die TIMP-1 mRNA unbeeinflusst durch hCG. Die Sekretion anderer Proteasen, die als Induktoren von MMPs bekannt sind (z.B. Urokinase Type Plasminogen Aktivator), wird durch hCG reduziert 115 . Daraus kann geschlußfolgert werden, dass die Fähigkeit von hCG, die kollagenolytische Kaskade abzuwenden, zur Regulation der Invasion von Trophoblasten beiträgt. Interleukin10 (IL-10) wird in vitro von Zytotrophoblasten produziert und reduziert die Expression von MMP-9, sowie die Invasion dieser Zellen, steigert allerdings die Expression von HLA-G 116 . Die Bedeutung von IL-10 für die Entwicklung der Placenta wird auch durch die Beobachtung unterstützt, dass Krankheitsbilder mit gestörter Trophoblasteninvasion und verminderter HLA-G-Expression, wie z.B. Präeklampsie, oft mit einer verminderten IL-10-Expression einhergehen 117 . Da Zytotrophoblasten sowohl IL-10 als auch den IL-10-Rezeptor exprimieren, dient dieses Interleukin als wichtiges Werkzeug der autokrinen Regulation der Invasion 118 . Ein weiteres wichtiges Kriterium für eine Kontrolle der Proliferation und letztlich auch der Invasion dürfte die Aktivität des Telomeraseenzyms sein. Die Verkürzung der Telomere an den Enden der Chromosomen und die Aktivität der Telomerase stellen einen regulatorischen Mechanismus für eine Kontrolle der mitotischen Aktivität dar 119-122 . Immortalisierte Tumorzellen entgehen dem DNA-Abbau durch die Reaktivierung der normalerweise in ihrer Expression inhibierten Telomerase 120 . Durch sie werden die, durch jede Mitose immer kürzer werdenden Chromosomenenden wieder verlängert 123, 124 . Im Gegensatz zu den meisten somatischen Zellen, exprimierten Zellen der Placenta, ähnlich wie den meisten Tumoren, Telomerasen 125, 126. 1.9 MHC-Expression in der Placenta Wie bereits erwähnt, invadieren während der Entwicklung der Placenta fetale Zellen in mütterliches Gewebe und kommen in direkten Kontakt mit dem Immunsystem der Mutter. Bei der Betrachtung der MHC-Molekülstruktur dieser Zellen fällt auf, dass polymorphe HLAA- und HLA-B-, sowie HLA-Klasse-II-Moleküle nicht auf ihrer Zelloberfläche exprimiert werden. Diese Nicht-Expression verhindert eine mögliche anti-paternale-allo-Immunantwort der Mutter gegenüber Antigenen paternalen Ursprungs auf Trophoblastzellen. Stattdessen exprimieren Trophoblastzellen oligomorphe HLA-G, -E, -F und HLA-C Moleküle. Während die Expression von HLA-C keine Besonderheit darstellt, ist die Expression von HLA-G, abgesehen von einigen Tumoren, auf Gewebe der Placenta beschränkt. Die selektive Expression dieses nicht-klassischen MHC-Klasse-1 Moleküls auf extravillösen Trophoblastzellen, die bis in maternale Blutgefäße invadieren, ließ früh die Vermutung zu, dass HLA-G eine besondere Rolle in der feto-maternalen Toleranz spielt. - 14 - Einleitung Eigenschaften von HLA-G: HLA-G wurde erstmalig von Ellis et. al. 1990 beschrieben und kommt in vier Membran-gebundenen (HLA-G1 bis -G4) und drei löslichen Isoformen (HLAG5 bis -G7, auch als sHLA-G1, sHLA-G2 und sHLA-G3 bezeichnet) vor . Bei der Expression von sHLA-G1 wird das Intron 4, in dem ein Stopkodon enthalten ist, nicht „gespliced“. Dadurch wird der transmembrane Anteil des HLA-G Moleküls nicht exprimiert, wodurch eine Verankerung in der Zellmembran nicht möglich ist und die Moleküle statt auf der Zelloberfläche fixiert, in das Medium abgegeben werden. Das Molekulargewicht von löslichem HLA-G beträgt ca 35 kDalton und es wird vorrangig von Hofbauerzellen, fetalen Makrophagen und dem Endothelium der Chorionzotten exprimiert. Die lösliche Form von HLA-G kann ebenfalls durch eine Abspaltung der membrangebundenen Form entstehen. sHLA-G kann in der gesamten Placenta, in fetalem, sowie in mütterlichem Blut nachgewiesen werden. Membrangebundenes HLA-G ist außer auf extravillösen Zytotrophoblastzellen im embryonalen Endothelium der Chorionzotten, im Amnionepithel, im Thymus und auf einigen Karzinomzellen (Lymphomen, Melanomen, uvm.) zu finden. HLA-G mit seinen 8 betaSchleifen, 2 Alphahelices und einem Molekulargewicht von 39-40 kDalton scheint dem HLAA sehr ähnlich zu sein. Das Genom enthält 8 Exons und 7 Introns. Die Transkription wird durch cis-Regulation (Methylierung und multiple CpG-Wiederholungen oberhalb des Initiationslocus) und Trans-Regulation (TATA-box, -50 bp RNA-Polymeraseinitiation, Upstreamelemente, u.a.) gesteuert. Im Gegensatz zu dem Polymorphismus von HLA-Klasse-IaMolekülen ist HLA-G oligomorph mit nur 10-20 Variationen. Diese Variationen sind meist synonyme Substitutionen, die niemals in einer Peptid-Bindebox vorkommen. In der Decidua, wo fetale, invadierende Trophoblastzellen und maternale Lymphozyten in direkten Kontakt treten, müssen für eine normale Placentation zytolytische Reaktionen der Immunzellen unterdrückt werden. Die Rolle von HLA-G in dieser lokalen Immunsuppression wird in den folgenden Abschnitten näher diskutiert. 1.10 Immunzellen, Hormone, Enzyme und Zytokine in der Placenta In der Dezidua des ersten Trimenons stellen die CD56++ uNK Zellen mit ca. 80% die größte Population immunaktiver Zellen dar 127-129 . Eine Aufgabe der uNK-Zellen könnte die Kontrolle der Zytotrophoblasteninvasion in mütterliches Gewebe in den ersten 18 Schwangerschaftswochen durch ihre zytotoxische Aktivität, sowie durch die Produktion von Zytokinen sein 130, 131 . NK-Zellen scheinen aktiv aus dem peripheren Blut in deziduales Gewebe einzuwandern und erreichen ihre Höchstzahl gegen Ende des ersten Trimenons. Sie exprimieren das „Vascular Cell Adhesion Molecule“ (VCAM)-1, was für die Adhäsion dieser Zellen an Blutgefäße notwendig ist 132, 133 , sowie CXCR-4 (CD184), einen Rezeptor der an - 15 - Einleitung der Migration beteiligt ist 134 und dessen Ligand CXCL12, von invadierenden extravillösen Trophoblasten exprimiert wird. Dabei ist die Migration von mütterlichen NK-Zellen in die Dezidua ein, von Trophoblasten unterstützter, streng kontrollierter Prozess. Dies scheint verwunderlich, wenn man bedenkt, dass diese NK-Zellen potentiell zytotoxisch gegenüber Trophoblasten sind. Doch uNK Zellen übernehmen in dem schwangeren Uterus durch die Sekretion von IFN-γ, was hauptsächlich von uNK-Zellen in der Dezidua sezerniert wird 135 , die Aufgabe der Umformung uterinen Gewebes. Dabei spielt IFN-γ eine entscheidende Rolle, denn ohne dessen Produktion kann keine erfolgreiche Schwangerschaft etabliert werden 136 . IFN-γ begünstigt die Bildung neuer Blutgefäße, genauso wie der „Vascular Endothelial Growth Factor“ (VEGF), der ebenfalls von uNK Zellen exprimiert wird 132 . Somit stellen diese Zellen eine Vorraussetzung für eine normale Schwangerschaft dar. Die Migration von NK-Zellen in die Dezidua wird durch HLA-G, was die Adhäsion von NKZellen an das Endothel reduziert von uNK-Zellen produziert Produktion führt. Der 138 137 , negativ beeinflußt. Interessanterweise wird auch IL-10 , was in Trophoblasten zu einer Erhöhung der HLA-G Kontakt Apoptosevorgänge auszulösen 139, 140 mit HLA-G scheint außerdem in uNK-Zellen , die auch bei isolierten uNK Zellen aus Mäusen in Kultur nicht abgewendet werden konnten 140 . Gegen Ende der Schwangerschaft gehen diese Apoptose- in Nekroseprozesse über 141. Eine weitere Gruppe von Immunzellen in der Decidua sind T-Helferzellen (CD4+). THelferzellen können sich in zwei verschiedene Subtypen (Th1 und Th2) differenzieren, die sich durch ihr Muster an sezernierten Zytokinen unterscheiden. CD4-Zellen, die Zytokine aus beiden Gruppen sezernieren, werden als Th0-Zellen bezeichnet. Zu den in der Schwangerschaft bedeutsamen Th1 Zytokinen gehören TNF-α und IFN-γ. Wie schon erwähnt, hemmt TNF-α die Trophoblastenmotilität, induziert die Expression von MMPs und scheint somit einen wichtigen Beitrag in der Kontrolle der Trophoblasteninvasion zu leisten 142 , während IFN-γ die Expression von MHC-I und MHC-II Molekülen auf verschiedenen Zellen verstärkt. Wichtige Th2 Zytokine in der Schwangerschaft sind IL-4, das die Wirkung von IFN-γ reguliert und IL-10. Ebenfalls von Bedeutung ist der „Granulocyte-macrophage colony-stimulatory Factor“ (GM-CSF), der sowohl von Trophoblastzellen als auch von uterinen Leukozyten produziert wird 143 . In Mäusen mit hohem Risiko für Spontanaborten führt die Applikation von GM-CSF zu einer starken Senkung der Abortrate 144. Eine weitere T-Zell-Population in der Dezidua stellen CD8+ zytotoxische T-Zellen dar. Diese Zellen erkennen nicht nur klassische MHC-Moleküle; sie sind auch in der Lage, HLAG zu erkennen und dadurch mit Trophoblastzellen zu interagieren - 16 - 145 . Der Kontakt mit HLA- Einleitung G führt zu einer Induktion des FAS-Liganden und steht im Verdacht Apoptose der CD8+ Zellen auszulösen 146, 147 . Obwohl zytotoxische T-Zellen, verglichen mit NK-Zellen nur in sehr geringer Anzahl in der Dezidua vorkommen CD8-Zellen aus dem mütterlichen 148, 149 , führt jedoch eine Depletion von Blutkreislauf zu einer Erhöhung von Schwangerschaftsaborten und einem verminderten fetalen und placentaren Wachstum in Mäusen 150. Auch wenn während der Schwangerschaft Veränderungen in der Anzahl immunkompetenter Zellen und dem Zytokinnetzwerk im Uterus auftreten, ist die Placenta keineswegs ein immunprivilegiertes Organ. Wie schon erwähnt, sind antigenspezifische T- und BLymphozyten in geringerer Anzahl während der Schwangerschaft im Uterus vorhanden und werden durch Elemente der natürlichen Immunität, Makrophagen und NK-Zellen, ersetzt. Im Allgemeinen kann man sagen, dass sich das TH1/TH2-Verhältnis während der Schwangerschaft in Richtung TH2 verschiebt 151 . Anti-inflammatorische Zytokine wie IL-10, die die zellvermittelte Immunität vermindern, werden stark exprimiert. Es wird angenommen, dass Th1-Zytokine die placentare Entwicklung hemmen, während Th2-Zytokine wie IL-4 und IL-10 einen positiven Einfluss auf die Entwicklung der Placenta haben 131 . Die erfolgreiche Schwangerschaft als so genanntes Th2-Phänomen wurde erstmals von Tom Wegmann als Hypothese formuliert mehr umstritten ist 152 und im Mausmodell bestätigt, während es beim Mensch mehr und 153, 154 Polypeptidhormonen 155 . Produkte von Zellen aus der Placenta, einschließlich Steroid- und , Arachidonsäure und spezielle Modulatoren wie HLA-G tragen zu den immunologischen Veränderungen bei (Abb. 1.5). Das Steroidhormon Progesteron wird in der Placenta synthetisiert und ist für den Erfolg einer Schwangerschaft essentiell. Es wirkt stark inhibierend auf die Produktion von inflammatorischen Zytokinen, wie zum Beispiel TNF-α; die Produktion von anti-inflammatorischen Zytokinen, wie Interleukin-10 (IL-10) wird dagegen stimuliert. Wie schon erwähnt, verstärkt IL-10 die Synthese von HLA-G in Trophoblastzellen, was zu Veränderungen in der Expression von Genen in maternalen Lymphozyten führt, die mit der Kommunikation, Proliferation und der Induktion von Apoptose in Verbindung stehen. Ein weiteres wichtiges Enzym bezüglich der Immunsupression in der Placenta ist das Enzym Indoleamin 2,3-Dioxygenase (IDO). IDO wandelt Tryptophan in Kynurenin um, was zu einem lokalen Tryptophanmangel und damit zu einer verminderten Lymphozytenproliferation und Zytotoxizität führt 156, 157 . Weiterhin führt eine Inhibition von IDO immer zum Abbruch der Schwangerschaft in Mäusen 157, 158 . IDO scheint aber auch vor und während der Implantation des Embryo für die Reproduktion wichtig zu sein, denn es wird schon mit dem - 17 - Einleitung Seminalplasma in den Vaginaltrakt gebracht und sorgt so Immunsuppression, was für die allogenen Spermatozyten essentiell ist Placentation wird IDO sehr stark von extravillösen für 159 eine regionale . Auch während der Zytotrophoblasten und Syncytiotrophoblasten exprimiert, wodurch vor allem T-Zellen an der feto-maternalen Grenzfläche gehemmt werden 160. Abb. 1.5 vereinfachte Darstellung der immunologischen Kommunikation zwischen Fetus und maternalen NK-Zellen 1.11 Produktion immunregulatorischer Substanzen im präimplantativen Embryo Bereits während der Wanderung des Embryo durch den Eileiter und vor der Implantation werden immunregulatorische Stoffe von dem Embryo produziert. Dabei sind vor allem Stoffe interessant, die Effektorzellen des maternalen Immunsystems hemmen, das Endometrium auf die bevorstehende Implantation vorbereiten und die beginnende Invasion der Trophoblasten positiv beeinflussen. Durch die Sekretion von IL-4 und IL-10 wird in maternalen T-Zellen eine Th2-Antwort induziert 131 , was zur Toleranz der Blastozyste führt. Des Weiteren trägt auch die Expression von sHLA-G zum Schutz des präimplantativen Embryo vor der zytotoxischen Reaktion von maternalen NK-Zellen bei 161 . Dabei wird durch IL-10 autokrin die Expression von sHLA-G in den sich differenzierenden Trophoblastzellen nach der Implantation verstärkt 116. Die Sekretion von IFN-γ begünstigt die Anlagerung der Blastozyste an das Endometrium, deren Implantation und die beginnende Proliferation von Trophoblastzellen 162, 163 . TNF-α, das die Invasion von Trophoblasten steigert 81 , wird ebenfalls von der Blastozyste produziert. Es beeinflusst den präimplantativen Embryo allerdings eher negativ 164, 165 . Alle genannten Substanzen sind im Kulturmedium von Embryonen nach erfolgter in vitro Fertilisation (IVF) nachweisbar, wobei es für eine - 18 - Einleitung erfolgreiche Implantation der Blastozyste nicht ausschlaggebend ist, ob die Substanzen in bestimmten Konzentrationen vorkommen 166 167 . Es scheint eher das Verhältnis der, von der Blastozyste produzierten Zytokine zueinander über den Erfolg der Implantation des Embryo entscheiden. Allerdings scheint die Expression von sHLA-G für eine erfolgreiche Implantation essentiell zu sein. Mehrere Studien zeigen, dass ein Implantationserfolg mit der Sekretion von sHLA-G korreliert 168-170. Im Gegensatz dazu könnte eine Mutation im HLA-G-Gen mit Infertilität und dem Auftreten von Spontanaborten assoziiert sein 171. 1.12 HLA-G und sHLA-G Expression von Tumoren Die schon beschriebene immunregulatorische Rolle von HLA-G und sHLA-G spielt nicht nur in der Schwangerschaft eine Rolle, sondern scheint auch bei der Entstehung von Tumoren entscheidend zu sein. Während Zellen in normalem Gewebe, außer Trophoblasten der fetomaternalen Grenzfläche, kein HLA-G produzieren 172-174 , wurde die Expression von HLA-G in verschiedenen Tumoren einschließlich Melanomen, Nierenzell-Karzinomen, Brusttumoren und Lungentumoren nachgewiesen 175-180. Dabei wurde, ähnlich wie bei der Schwangerschaft, gezeigt, dass die Expression von HLA-G in diesen Zellen essentiell für eine Unterdrückung der Immunantwort durch T-Lymphozyten und NK-Zellen ist 172, 175-177, 181, 182 . Choriokarzinomzellen, die außer ihrer sehr starken Invasivität, wesentliche Eigenschaften mit Trophoblastzellen gemeinsam haben, exprimieren ebenfalls oft HLA-G (z.B. Jeg-3). Die Messung von gelöstem HLA-G (HLA-G1s) im Serum von Patienten mittels „Enzyme Linked Iummunosorband Assay“ (ELISA) könnte somit einen guten Marker für die Tumordiagnostik darstellen, da im Gegensatz zu anderen löslichen Tumormarkern, die Messung von HLA-G eine hohe Sensitivität und Spezifität aufweist, während viele andere Marker ebenfalls von weiteren Geweben exprimiert werden 183-185. 1.13 Regulation der Signalübertragung in Immunzellen während der Schwangerschaft Wie schon erwähnt, bietet der JAK/STAT-Signaltransduktionsweg eine sehr schnelle Möglichkeit, Signale in Zellen weiterzuleiten. So stimuliert beispielsweise IL-2 in NK-Zellen STAT1, STAT3, STAT5 und führt so zu einer Erhöhung der Zytotoxizität und Proliferation 186 , während in manchen NK-Zellinien ebenfalls STAT4 aktiviert wird. Ein STAT4-Signal in NK-Zellen erhöht wiederum die Empfindlichkeit auf IL-12 Aktivierung und Perforin-Expression in diesen Zellen - 19 - 187 186 und führt zur Proliferation, . Für eine optimale NK-Zell- Einleitung Entwicklung und Aktivierung, sowie für die zytolytische Aktivität sind IL-2-Rezeptor-βSignale notwendig, die ebenfalls die Expression des Effektormoleküls Perforin verstärken. IL18 führt in der NK-Zellinie NK92 zu einer Aktivierung von STAT3 Erhöhung der Zytotoxizität gegenüber Zielzellen führt 188 188 , was zu einer . STAT3 scheint grundsätzlich in NK-Zellen ein wichtiges Regulationsmolekül für die Zytotoxizität und die Sekretion von Perforin zu sein. Uterine NK-Zellen aus dem Endometrium exprimieren außerdem ProlaktinRezeptoren, die potentielle Ziele für das Hormon Prolaktin darstellen könnten, welches zu Anfang der Schwangerschaft verstärkt und zum Ende verringert exprimiert wird 189 . Durch eine Prolaktinbindung wird eine Tyrosinphosphorylierung von JAK2, STAT1, sowie von STAT6 ausgelöst und der MAPK/ERK-Signaltransduktionsweg aktiviert. In der Differenzierung von Th0 zu Th2-Zellen, ist IL-4 ein essentielles Zytokin. IL-4 induziert eine Erhöhung der Expression von GATA, einem weiteren Signaltransduktor via STAT6, was zu einer verstärkten Produktion von Th2-Zytokinen führt und die Produktion von IFN-γ als Th1-Zytokin stoppt. Unterstützt wird diese These durch die Beobachtung, dass STAT6-„Knock Out“-Mäuse nur eine Th1-Antwort entwickeln 190 . Viele Faktoren können T- Zellen in ihrer Differenzierung beeinflussen, wobei Zytokine, wie IL-2, IL-4 und IL-12 u.a. die Hauptrolle spielen 191. IL-12, dessen Signal in T-Zellen via STAT4 übertragen wird, kann durch Antigen-präsentierende Zellen, dendritische Zellen, sowie durch Makrophagen produziert werden und fördert eine Th1-Antwort 46 . Deutlich wird dies dadurch, dass IL-12, bzw. STAT4 defiziente Mäuse keine Th1-Antwort erzeugen können 192, 193 . IL-2 wird durch Th1 Zellen selbst produziert und dient als autokrines Signal via IL-2 Rezeptoren auf der Oberfläche, deren Aktivierung auf STAT3-Moleküle übergeht, die wiederum die IL-2 Produktion fördern. Während in Th1-Zellen STAT4 und in Th2-Zellen STAT6 polarisiert aktiviert werden, werden STAT3 und STAT5 selektiv in Th1-Zellen nach ihrer Differenzierung aktiviert, was mit einer selektiven Induktion von SOCS-Molekülen assoziiert ist 132 . Damit kann vermutet werden, dass STAT3 und STAT5 die Expression von SOCS- Molekülen steuern und eine wichtige Rolle in der Differenzierung von Th-Zellen (Th1 und Th2) spielen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass STAT1-Signale eine Hauptrolle in der Induktion von SOCS-Molekülen in Th-Zellen spielen, und dass die SOCS-Expression durch IL-4, IL-12 oder IFN-γ in STAT1-defizienten Th-Zellen beeinträchtigt ist. IL-4 induziert eine STAT1Aktivierung in Th2-, nicht aber in Th1-Zellen. Durch „Knock Out“-Experimente in Th2Zellen konnte gezeigt werden, dass eine STAT1-Aktivierung mit der Expression von SOCS1 und SOCS3 korreliert ist 194 , während eine Überexpression von SOCS1 in Th2-Zellen die - 20 - Einleitung STAT6-Aktivierung und damit eine IL-4 induzierte Proliferation unterdrückt. Eine Depletion von SOCS1 durch „anti-sense“ cDNA führt dagegen zu einer konstitutiven Aktivierung von STAT6 in Th2-Zellen 194. 1.14 STAT3 und STAT6 in Trophoblast- und Karzinomzellen Wie schon im Abschnitt „Trophoblasteninvasion“ kurz erwähnt, sind bei Trophoblasten die verschiedensten Signaltransduktionsmoleküle bei der Reizaufnahme und der Wahrnehmung der Umwelt beteiligt. Eines dieser Moleküle ist STAT3, das viele verschiedene Funktionen in der Embryonalentwicklung und im ausgewachsenen Organismus übernimmt 195. Eine STAT3Aktivität kann schon ab dem Beginn der Implantation des Embryo nachgewiesen werden und spielt eine wichtige Rolle während der Embryogenese 196 . Ein STAT3-„Knock Out“ führt immer zum Abort des Embryo am Tag 7,5 post coitus (pc) bei Mäusen, wo hingegen eine Substitution von STAT3 den Schwangerschaftserfolg herbeiführt 197 . Aktiviertes STAT3 kommt in vielen stark invasiven Tumoren, wie Gehirntumoren, Mamma-, Prostata- und Ovarialkarzinomen vor und erhöht die Proliferation und Invasivität 198-201 . Weiterhin steht es mit der Metastasierung von Tumoren im Zusammenhang 202. Die DNA-Bindungsaktivität von STAT3, welche eine funktionelle Aussage über den Aktivierungsgrad gibt, kann durch LIF in verschiedenen stark invasiven Tumorzellen (z.B. Jeg-3 Choriokarzinomzellen) und in Zytotrophoblasten induziert werden 203 . Die Beobachtung, dass STAT3 defiziente Mäuse komplett resistent gegenüber karzinogenen Stoffen sind zeigt, dass STAT3 für eine Karzinogenese essentiell ist 204 . Somit stellt STAT3 ein Schlüsselmolekül sowohl für eine erfolgreiche Schwangerschaft als auch für die Tumorinvasion dar. Doch sowohl Tumor- als auch andere invadierende Zellen werden durch Hormone beeinflusst. So ist bei vielen Karzinomarten, allen voran dem Mammakarzinom, die Östrogen- und Testosteronabhängigkeit bekannt. 3beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase/ Isomerase (3betaHSD) Isoenzyme katalysieren wichtige Schritte in der Bildung dieser Sexualhormone. Die zwei Isoenzyme werden zum einen in der Placenta, zum anderen in den Gonaden und der Nebenniere exprimiert. Doch auch in Mammakarzinomzellen konnte die Expression dieser Enzyme durch IL-4 und IL-13 induziert werden, deren Signal durch STAT6 weitergeleitet wurde 205 . Die Induktion der Expression dieses Enzyms durch IL-4 und IL-13 via STAT6 konnte ebenfalls in Cervix- (ME-180), Colon- (HT-29), sowie in Mammakarzinomzellen (BT-20, ZR-75-1) beobachtet werden 27, 205 . Doch scheint das Signal von IL-4 nicht nur durch STAT6 weitergegeben zu werden, denn STAT6-Knock Out Experimente zeigten, dass ein IL-4-Signal in diesen Zellen auch via STAT1 übertragen - 21 - Einleitung werden kann 206 (Abb. 1.6). Obwohl in Mammakarzinomzellen die STAT6-Aktivierung mit einer Inhibition der Proliferation korreliert 207 , scheint jedoch die Signalübertragung von IL-4 via STAT6 in anderen Karzinomzellen für Vorgänge bedeutend zu sein, die mit Malignität, Proliferation und transkriptionellen Aktivierung von IL-6 und dem “Monocyte chemotactic protein-1”(MCP-1) in Verbindung stehen 208, 209. Abb: 1.6 Vereinfachtes Beispiel der Mechanismen von intrazellulären STATSignalen in Tumorzellen 1.15 STATs und Apoptose in Tumorzellen STATs spielen eine wichtige Rolle in der Steuerung von Apoptosevorgängen in Tumorzellen. Aktiviertes STAT3, dessen Rolle bezüglich der Invasivität erläutert wurde, scheint in einer Vielzahl von Tumorzellen (Prostata-, Lungen-, Gehirn-, Mammatumoren u.a.) Apoptosevorgänge zu unterdrücken 201, 210-213. „Knock Down“ Versuche von STAT3 mittels siRNA in Prostatakarzinomzellen zeigen ein vermindertes Wachstum und die Zellen wurden apoptodisch 214 . Doch auch die Unterdrückung der Signalweiterleitung durch eine IL-6 Rezeptor Blockade induziert Apoptose in multiplen Myelomzellen, wenn nicht weitere Signaltransduktoren (z.B. MEK1,2/ERK1,2) aktiviert werden 210 . STAT5 und STAT6 besitzen ebenfalls die Fähigkeit, Apoptosevorgänge in einigen Karzinomzellen zu - 22 - Einleitung unterdrücken 215, 216 . Im Gegensatz dazu sind durch STAT6 vermittelte IL-4-Signale in Mammakarzinomzellen essentiell für die Inhibition der Proliferation und die Induktion von Apoptose 207 . Bei der Regulation der Apoptose spielt auch STAT1 eine entscheidende Rolle in Tumorzellen, denn es kann sowohl pro- als auch anti-apoptotische Vorgänge, je nach Art der Aktivierung induzieren 217. 1.16 Xenogene Schwangerschaften, Xenotransplantation Wie schon einleitend erwähnt, stellt die maternale Toleranz gegenüber dem semiallogenen Fetus, der als physiologisches Transplantat angesehen werden kann, eine immunologische Besonderheit dar. Die Auswirkungen der feto-maternalen Immuntoleranz sind so weitreichend, dass Leihmutterschaften sogar artübergreifend, beispielsweise zwischen Esel und Pferd (xenogene Schwangerschaft), möglich sind. Auch zeigen extrauterine Schwangerschaften, daß für die Implantation einer Blastozyste und für eine Placentation nicht unbedingt Uterusgewebe nötig ist. Diese immunologischen Besonderheiten werden in Experimenten genutzt, in denen Gewebe oder Organe in andere Tierarten transplantiert werden (Xenotransplantation). Von besonders großer Bedeutung sind Xenotransplantationen von Organen aus Tieren in Menschen, denn die Zahl der auf ein Organ wartenden Patienten ist momentan fünfmal höher, als Organe zur Verfügung stehen als 40 Jahren Versuche unternommen, 218 . Deshalb werden seit mehr Transplantationen vorzunehmen, ohne Abstoßungsreaktionen auszulösen. Eine Xenotransplantation ist definiert als Transplantation von Organen oder Geweben zwischen verschiedenen Spezies. 1962 wurde erstmals eine Pavian-Niere auf einen Menschen transplantiert 219 . Ein Jahr darauf wurden Schimpansen- Nieren auf Menschen transplantiert und funktionierten mehrere Monate 220 . Bis 1969 wurde jedoch noch von keinem Fall berichtet, in dem das Transplantat oder der Empfänger länger als ein Jahr überlebten 221 , weshalb das Interesse an Xenotransplantationen stark abnahm. 1984 startete die zweite Welle an Xenotransplantationen mit der Pavian-Herz-Verpflanzung auf das berühmt gewordene Baby Fae. Seit dem wurden weitere Versuche unternommen, Pavian-Nieren und -Knochenmarkszellen, sowie Schweine-Lebern und Inselzellen zu transplantieren 222-224. Aktuelle klinische Studien betreffen die Übertragung von Nervenzellen vom Schwein auf Morbus Parkinson und Chorea Huntington Patienten, die teilweise nach 8 Monaten beim Empfänger noch nachweisbar waren 225 transplantierten von Organe auf Grund der Bildung Komplementaktivierung 226. - 23 - . Abgestoßen werden die Antikörpern und der Einleitung Ein weiterer Schwerpunkt von Xenotransplantationsexperimenten Verständnis der Tumor- grundsätzlichen und liegt in Reproduktionsimmunologie. dem Durch Xenotransplantationsstudien können Immunreaktionen in vivo analysiert werden. So wurde beispielsweise beobachtet, daß in Mäuse transplantierte humane Choriokarzinomzellen (Modellzellen für Trophoblasten), die HLA-G, sowie geringe Mengen HLA-C produzieren und NK-unsensitiv sind, nicht vom Immunsystem der Versuchstiere als fremd erkannt und bekämpft werden 227, 228 . Auch die Zellkulturüberstände dieser Zellen unterdrücken Immunreaktionen der Versuchstiere nach der Transplantation von Zellen, die normalerweise abgestoßen werden sollten 229 . Die Fähigkeit dieser Choriokarzinomzellen, eine Immunantwort in den Versuchstieren zu unterdrücken, könnte dem Mechanismus der Immunsuppression bezüglich des Fetus und der halballogenen Mutter ähneln und zum immunologischen Verständnis der Schwangerschaft beitragen. Weiterhin werden durch die Transplantation von Tumorgewebe in Mäuse seit den frühen 70er Jahren Homone, Wachstumsfaktoren und andere immunregulatorische Substanzen analysiert, die von dem transplantierten Gewebe produziert werden 230, 231 . Auf diese Weise können durch heterogene Transplantationsstudien die Morphologie, Angiogenese, Invasivität und Malignität von Tumoren in vivo untersucht und neue Therapieansätze erprobt werden 236 232- . Für diese Studien eignen sich besonders Mäuse, die weder B- noch T-Lymphozyten bilden (serve combined immunodeficiency, SCID) und eine Vielzahl von Transplantaten tolerieren 237-240. In dieser Arbeit wurden Xenotransplantationen menschlicher Trophoblasten in Mausnieren durchgeführt, um die morphologische Entwicklung zu analysieren und den Einfluss von Schwangerschafts-spezifischen Erkrankungen, wie untersuchen. - 24 - zum Beispiel Präeklampsie zu Ziele dieser Arbeit 2. Ziele dieser Arbeit In der Reproduktionsimmunologie sind viele Fragestellungen noch weitgehend ungeklärt. So ist der Prozess der Implantation des Embryo und der Invasion von fetalen, allogenen Trophoblastzellen in maternales Gewebe ein streng regulierter Vorgang, bei dem eine Fülle von Zellen, Zytokinen und Hormonen beteiligt sind. Vor allem NK-Zellen des mütterlichen Immunsystems in der sich bildenden Dezidua exprimieren Moleküle, deren Aufgabe die Kontrolle der Invasion und Migration von fetalen Zellen in mütterliches Gewebe darstellt, während fetale, invasiv wachsende Trophoblastzellen immunregulatorische Substanzen produzieren, die wiederum auf maternale Immunzellen wirken. So besteht ein dichtes Zusammenspiel und ein starker Informationsaustausch in Form von Signalmolekülen zwischen dem Fetus und der Mutter. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen Mechanismen und Faktoren der Interaktion von dezidualen NK-Zellen mit fetalen Trophoblastzellen. Dabei werden sowohl Primärzellen als auch Zellinien als Modelle betrachtet. In der vorliegenden Arbeit sollen folgende Fragestellungen betrachtet werden. - Welchen Einfluss haben die in der Decidua präsenten und für Tumorentwicklung bedeutsamen Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF auf die Phosphorylierung von STAT3 in Jeg-3 Choriokarzinomzellen? - Unterscheiden sich Trophoblasten verschiedener Entwicklungsstufen der Schwangerschaft in ihrem Invasionsverhalten in vitro und in vivo? - Welchen Einfluss hat STAT3 bezüglich des Proliferations- und Invasionsverhaltens invasiver Karzinom- und Trophoblastzellen? - Welchen Einfluss hat SOCS3 auf das Proliferationsverhalten und die Signaltransduktion von STAT3 in Jeg-3 Zellen? - Welchen Einfluss hat STAT3 bezüglich des Apoptoseverhaltens von Trophoblastzellen? - 25 - Ziele dieser Arbeit - Welchen Einfluss hat STAT6 auf das Invasions und Proliferationsverhalten von Jeg-3 Zellen? - Ist es möglich, die Gesamt-Expression von HLA-G, sowie selektiv die Expression der Isoform HLA-G1 in Jeg-3 Zellen mittels siRNA zu verringern? Welche immunologischen Effekte entstehen hierdurch? - Welchen Einfluss hat STAT3 auf die Zytotoxizität dezidualer NK-Zellen? - Werden die Zytokine IFN-γ, IL-10, IL-6, IL-4, TNF-α und sHLA-G, die zur Immunregulation im Uterus beitragen könnten, von humanen Blastozysten nach erfolgreicher IVF sezerniert? - Ist es möglich, durch Xenotransplantation in vivo eine stabile Kultur von humanen Trophoblastzellen zu erzeugen? Welche Unterschiede gibt es bei der in vivo Kultur von Trophoblastzellen unterschiedlicher Entwicklungsstufen? - Gibt es speziesübergreifende Mechanismen der Induktion einer fetomaternalen Immuntoleranz? - 26 - Material und Methoden 3. Material und Methoden 3.1 Biologische Materialien Zellinien Die Choriokarzinom-Zellinie Jeg-3 und die Kolonkarzinom-Zellinie HT29 wurden in DMEM-Medium (10% FKS, 2% AAS) unter Standardbedingungen kultiviert. Beide Zellinien wurden aller drei Tage trypsiniert und regelmäßig auf Kontamination durch Mycoplasmen getestet. Trophoblastzellen für in vitro Experimente Als Gewebe zur Isolation von Zytotrophoblastzellen dienten humane Placenten nach unauffälligem Schwangerschaftsverlauf und termingerechter Geburt bzw. nach Interruptio vor dem Ende des ersten Trimenons. Trophoblastzellen für die Xenotransplantation Für die Xenotransplantation von humanen Trophoblastzellen in immunkompetente und immundefiziente Mäuse wurde Deciduagewebe von Interruptiones der 5. SSW, der 10.SSW, sowie nach termingerechter Geburt als Transplantate verwendet. Die Gewebe wurden von Frau Dr. Isabella Cannigia, Mount Sinai Hospital Toronto, Ontario, Kanada bereitgestellt. Wirtsorganismen für die Xenotransplantation Als Wirte für Xenotransplantationsstudien wurden Mäuse der Stämme RAG-2-null/γc-null 241 und C57BL/6J 242 benutzt. RAG-2-null/γc-null-Mäuse werden auch als SCID-(serve combined immunodeficiency)-Mäuse bezeichnet und bilden weder B- noch T-Lymphozyten, während C57BL/6J ein normales Immunsysten besitzen. NK-Zellen Als Gewebe zur Isolation von NK-Zellen dienen humane Placenten nach unauffälligem Schwangerschaftsverlauf und termingerechter Geburt. Überstände von Embryokulturen Die Überstände von Embryokulturen wurden uns freundlicherweise von Frau Dr. Hoppe aus dem IVF Labor der Universitätsfrauenklinik Jena zur Verfügung gestellt. Darin wurden die humenen Embryonen für 72 Stunden einzeln kultiviert. - 27 - Material und Methoden 3.2 Geräte und Reagenzien Geräte Autoklav KSG-112-Olching Brutschrank Heraeus CO2 Inkubator Durchflußzytometer Flowmax Galaxy (DAKO) FACSCalibur (BD) Elektrophoresekammer Life Technology MACS Midi Multi Stand Miltenyi Biotech Micro Plate reader MPR A4 Dementitec Diagnostics Mikroskop Axiovert 25 Zeiss Pipetten Eppendorf Orbitalschüttler Polymax 1040 Heidolph Spektrophotometer Cary UV 50 Bio Varian Waagen Satorius Basic Owa Labor (VEB Wägetechnik Rapido) Zentrifugen Biofuge 13 (Heraeus) Labofuge T (Heraeus) Mikro 22R (Hettich) Mikrizentrifuge (Roth) Verbrauchsmittel Eppendorfgefäße Sarstedt UV Film, Skeletal/RA 18x24cm Kodak Filmkasette Kisker Zellkulturflaschen Greiner Küvetten Halb-Mikro Greiner MACS Separation Columns LS Miltenyi Biotech Membran PVDF Hybond-ECL Amersham Pharmacia Biotech PP-Testtubes Falcon Greiner Zellkulturplatten Greiner - 28 - Material und Methoden Reagenzien Acrylamid 40% Roth Ammoniumperoxodisulfat Roth Ammoniumsulfat Sigma Antibiotic Antimycotic Solution Sigma Bromphenolblau Roth Cell Proliferation Assay Promega Chemiluminescent detection reagent Cell Signaling Technology Coomassie Brillantblau G250 Roth Cytometric Bead Array Kit (-II) BD Dimethylsulfoxid Merck Essigsäure Baker Ethanol Roth Ethylendiamintetraacetat Sigma Fetales Kälberserum Bio Whittaker Glycerin Roth Human IL-2 Hölzel Diagnostika Human LIF Hölzel Diagnostika Human IL-6 Hölzel Diagnostika Human IGF-2 Hölzel Diagnostika HGF Hölzel Diagnostika Lymphozytenseperationsmedium PAA Laboratories β-Mercaptoethenol Roth Methanol Roth Molekulargewichtsmarker (Roti-Standard) Cell Signaling Technology Ponceau S Roth Protease Inhibitor Cocktail Sigma Tris-Hydrochlorid Roth Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Roth Zell-Lysepuffer Cell Signaling Technology - 29 - Material und Methoden Zellkulturmedien RPMI 1640 Bio Whittacker PBS Bio Whittacker DMEM Bio Whittacker Optimem Bio Whittacker verwendete Antikörper Rabbit anti human STAT3 Cell Signaling Technology Rabbit anti human Phospho-STAT3 Cell Signaling Technology Rabbit anti human STAT6 Cell Signaling Technology Rabbit anti human SOCS3 Cell Signaling Technology Rabbit anti human Aktin Cell Signaling Technology Anti Rabbit IgG HRP-linked Cell Signaling Technology Anti-CD3-Cy5 DAKO Anti-CD16-RPE DAKO Anti-CD56-FITC DAKO Anti-CD19-Cy5 DAKO Versuchsdurchführung Die Experimente in dieser Arbeit wurden in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Anne Croy und Herrn Dr. Chandrakant Tayade während eines Forschungsaufenthaltes an der University of Guelph, mit Frau Anja Meissner und Herrn PD. Dr. Karlheinz Friedrich in dem Institut für Biochemie der FSU Jena und mit Frau Susann Salzmann der Forschergruppe “Klinische Molekularbiologie” der Frauenklinik der FSU Jena durchgeführt. - 30 - Material und Methoden 3.3 Übersicht der in vitro Versuche (4.1) (4.2-4.4, 4.7) (4.5-4.6) (4.8) (4.9-4.10) (4.11) (4.12) Abb. 3.1: Übersicht der in vitro Versuchsansätze - 31 - Material und Methoden 3.4 Methoden 3.4.1 Isolierung von Primärzellen Isolierung von Trophoblastzellen Für die Isolierung von Trophoblastzellen wurden ca. 30g Gewebe der Decidua in eine Petrischale überführt und mit 10 ml HBSS überschichtet. Anschließend wurde das Gewebe grob von dem Bindegewebe befreit und es erfolgte die mechanische Zerkleinerung des Gewebes mittels Schere und Skalpell. Der gesamte Prozess erfolgte unter sterilen Bedingungen. Anschliessend wurden die Gewebsstücke in eine Gewebekulturflasche überführt und mit Verdauungspuffer 1 Stunde inkubiert. Die Zellsuspension konnte danach abgenommen und bei 100g für 10min zentrifugiert werden. Neuer Verdauungspuffer wurde in die Gewebekulturflasche gegeben und für weitere 30 min inkubiert. Dieser Schritt erfolgte zwei weitere Male. Während der Verdauungsschritte wurde ein Percoll-Stufen-Gradient, bestehend aus je 1ml eines 10%-60% -igem Percolls in 15 ml Reaktionsgefäßen, vorbereitet. Anschliessend wurde die aufkonzentrierte Zellsuspension auf den Percoll-Gradient geschichtet und bei 800g für 20 min zentrifugiert. In Abbildung 3.2 ist die entstandene Schichtung zu erkennen. Es wurden die gekennzeichneten Schichten, in denen die Trophoblasten enthalten waren abgenommen und mit Waschlösung gewaschen. Es folgte die Aufreinigung der Zytotrophoblasten mittels Abb.: 3.2: Percoll Gradient, Pfeile markieren Schichten, in denen Trophoblasten enthalten sind. Dynabeads. Dabei inkubierte man die Zellsuspension mit anti CD3, CD9, CD14, CD31 und CD45-Antikörpern (Maus, Firma DAKO) für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß, gefolgt von der Zugabe von Anti-Maus IgG-Antikörpern (Ziege, Firma Dynal). Durch diese Eisenpartikel-beladenen Antikörper konnten die Lymphozyten und Monozyten depletiert werden. Die Zytotrophoblastzellen wurden unter Standardbedingungen in DMEM-Medium (10% FKS, 2% AAS) kultiviert. Die Bestimmung der Reinheit der Trophoblastkulturen erfolgte durch FACS-Analysen. - 32 - Material und Methoden Verdauungspuffer: Waschlösung: Percoll-Gradient: HBSS 2% AAS Trypsin 1:250 Hepes (1M) 12,5ml in 500ml HBSS 2% AAS 60%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 10% in HBSS Isolierung von Lymphozyten und NK-Zellen aus der Placenta Bei der Isolierung von Lymphozyten und NK-Zellen aus der Placenta wurde das Gewebe in einer Perfusionsvorrichtung mit steriler NaCl-Lösung gespült und somit Blut aus dem Gewebe entfernt. Das blutleere Deciduagewebe (ca. 30 g) wurde in eine Petrischale überführt und mit 10 ml RPMI-Medium überschichtet. Anschließend erfolgte die Zerkleinerung des Placentagewebes mittels Schere und Skalpell und die Zugabe von 40 µl Kollagenase (100 U) pro 10 g Gewebe. Dabei war darauf zu achten, dass der gesamte Prozess unter sterilen Bedingungen zu erfolgen hatte. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37 °C wurde die Zellsuspension durch ein Sieb (250µm) gedrückt, somit von Gewebe befreit und mit 10 ml RPMI-Medium gespült. Abb 3.3: Ficoll Gradient, Pfeil markiert Schicht, in der Lymphozyten enthalten sind. Die gewebefreie Zellsuspension schichtete man auf 3 ml Ficoll (Biocoll Separating Solution, Biochrom AG, Germany) in ein 15 ml Reaktionsgefäß (Greiner) und zentrifugierte bei 800g für 20 min. Danach war die in Abbildung 3.3 gezeigte, charakteristische Auftrennung zu erkennen. In der untersten Schicht waren Erythrozyten, in der nächsten Schicht das Ficoll und darüber die Lymphozyten zusammen mit den Monozyten zu finden. Die oberste Schicht enthielt das Medium/Puffer/Plasma-Gemisch. Die markierte Lymphozytenschicht wurde abgenommen, mit 5 ml RPMI-Medium gespült und bei 600g zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde wiederholt, um das für Lymphozyten toxische Ficoll aus der Lösung zu entfernen. Anschließend erfolgte die Isolierung der NK-Zellen aus der Lymphozyten-MonozytenMischung. Dafür wurden die Zellen ein weiteres Mal zentrifugiert, der Überstand verworfen und dem Pellet (ca. 50 µl) 2.5 µl anti-CD3, CD14, CD19, CD36 und IgE-Antikörper zugegeben. Diese primären Antikörper waren Hapten-konjugiert, so dass man nach einer Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur 2,5µl die sekundären Anti-Hapten- 33 - Material und Methoden MicroBeads zugeben konnte. Während einer weiteren Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur wurde eine MACS-Magnetsäule (Miltenyi Biotec, Germany) mit 98%igem Ethanol und anschließend RPMI-Medium gespült. Die Säule wurde in einem homogenen Magnetfeld (Mini-Machs; Miltenyi Biotec, Germany) platziert, die Lymphozyten auf die Säule gegeben und mit weiteren 10 ml PBS gewaschen. In der, aus der Säule austretenden Flüssigkeit waren nun die NK-Zellen angereichert. Diese wurden durch Zentrifugation (600g, 5 min, RT) aufkonzentriert, konnten in einer Neubauer-Kammer gezählt und unter Standardbedingungen in RPMI-Medium (mit 10% FKS, 2% AAS) in Kulturflaschen (Cellstar 50 ml) oder in Assay-Kulturplatten (24 Loch) kultiviert werden. 3.4.2 Transfektion von Zellen mit „small interfering“ RNA (siRNA) Isolierte Zellen oder Zellinien dienten als Ausgangsmaterial für die Transfektion mit siRNA. Mit dieser Technik sollte die Expression von spezifischen Genen gehemmt und unterdrückt werden (Abb 3.4). Dazu wurden die Zellen mit Optimen-Medium (Firma GibcoTM) gewaschen. OligofectamineTM Reagent (Firma Invitrogen) wurde mit Optimem Medium verdünnt und die spezifischen RNA-Oligonukteotide in einer Endkonzentration von 60 nM zu den Zellen gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 4 Stunden wurde DMEM-Medium (Firma GibcoTM) mit 30% FCS zugegeben. Zielgene für die Transfektion waren HLA-G, HLA-G1, SOCS3, STAT3 und STAT6. Jedem „Knock Down“ wurde eine Negativkontrolle zugefügt, in der die selben Nukleotide in einer nicht-genomischen Reihenfolge angeordnet waren. Der erfolgreiche „Knock Down“ der Zielgene wurde mittels Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) und Western Blot nachgewiesen. Abb. 3.4: vereinfachte Übersicht des Mechanismus des siRNA-„Knock Down“ - 34 - Material und Methoden Sequenzen der Oligonukleotide 243, 244: STAT3-Inhibition Sense: 5´UGU UCU CUA UCA GCA CAA Utt 3´ Antisense: 5´AUU GUG CUG AUA GAG AAC Att 3´ STAT6-Inhibition Sense: 5´GCA GGA AGA ACU CAA GUU UUU 3´ Antisense: 5´AAA CUU GAG UUC UUC CUG CUU 3´ HLA-G-Inhibition Sense: 5´UGU GGC UGA ACA AAG GAG Att 3´ Antisense: 5´ACA CCG ACU UGU UUC CUC Utt 3´ HLA-G1-Inhibition Sense: 5´CAG UAU GCC UAC GAU GGC Att 3´ Antisense: 5´UGC CAU CGU AGG CAU ACU Gtt 3 SOCS3-Inhibition Sense : 5´GAC CUU CAG CUC CAA GAG Ctt 3´ Antisense : 5´GCU CUU GGA GCU GAA GGU Ctt 3´ HLA-G-Kontrolle Sense: 5´AGA GUG GUA ACG GAC AAG Utt 3´ Antisense: 5´ACU UGU CCG UUA CCA CUC Utt 3´ STAT3-Kontrolle Sense: 5´GCC ACU UAU AAA UUC GUU Ctt 3´ Antisense: 5´GAA CGA AUU UAU AAG UGG Ctt 3´ Diese Kontroll-Oligonukleotide wurden auch als nicht-genomische Kontrollen für SOCS3-, STAT6-, und HLA-G1-siRNA benutzt. 3.4.3 Fuktionelle Analysemethoden Proliferationsassay Die Proliferation von Zellen wurde mit CellTiter 96 One Solution Cell Proliferation Assay bestimmt. Dafür wurden die Trophoblast- oder NK-Zellen in einer Neubauer-Zählkammer gezählt, je 100000 Zellen in 100µl Medium in einer 96 Well-Zellkulturplatte für 72 Stunden inkubiert und anschließend 20µl der Assay-Lösung zugegeben. Nach einer weiteren Inkubationszeit von zwei bis drei Stunden konnte die Absorption der Proben bei 490nm Wellenlänge in einem ELISA-Reader gemessen werden. Bei diesem Assay, auch als MTT- 35 - Material und Methoden Test bezeichnet, wurde die Reduktion der MTS-Tetrazolium-Verbindung (Owen´s Reagenz) zu dem farbigen Formazanprodukt gemessen. Invasionsassay Zur Bestimmung der Invasivität von Zellen wurden 200µl eines 2% -igen Matrigels (BD MatrigelTM Matrix BD Bioscience, USA) auf Filter in einen Zellkultureinsatz für 6 Well Zellkulturplatten (8,0µm Polycarbonate Membrane NUNCTM Denmark) gegeben. Das Matrigel wurde 24 Stunden unter Standardbedingungen getrocknet und anschließend wurden 2 ml Medium unter den Filter und die zu analysierenden Zellen (200000 Zellen/ml) in 1 ml Medium über den Filter und das Gel aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden unter Standardbedingungen wurden die Zellen im unteren Kompartiment, sowie der Filter unter dem Gel trypsiniert (Trypsin EDTA, 200mg/l EDTA, 500mg/l Trypsin 1:250, Biowhittacker Europe) und die Zellen gezählt. Anschließend konnte das Verhältnis der aufgetragenen Zellen zu den, durch das Gel invadierten Zellen gebildet werden. Die Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Frau Anja Meissner im Institut für Biochemie der FSU-Jena durchgeführt. Untersuchung des Apoptoseverhaltens von Zellen durch Messung der gespaltenen PolyADP-ribose polymerase (PARP) Um zu untersuchen, ob Substanzen Apoptose in Zellen induzieren, wurden gespaltene PARPMoleküle gemessen. Dieses „cleaved“-PARP-Molekül wird von der Zelle in einem frühen Stadium der Apoptose gebildet und konnte somit als Apoptosemarker verwendet werden. Dazu benutzte man Anti-cleaved PARP-Antikörper, die nach der Fixation der Zellen mit 0,05% Formaldehydlösung (5 Minuten) und Inkubation mit Permäabilisierungspuffer (PBS, 0,1% Triton, 5 Minuten) zugegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß inkubiert wurden. Die intrazelluläre Färbung wurde anschließend im Durchflußzytometer gemessen. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western Blot Diese Technik diente dazu, die Expression von Proteinen in Zellysaten zu untersuchen. Dazu wurden die Zellen mit einem Zellschaber von der Kulturplatte gelöstund in Vorbereitung auf die PAGE in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäße überführt und zwei mal mit PBS (PBS, Proteinaseinhibitor) gewaschen. Die Zellen wurden abzentrifugiert (1075g, 5 min, RT), der Überstand wurde verworfen und 50µl Zell-Lyse Puffer zugegeben. Anschließend wurden die Zellen durch abwechselndes gefrieren, auftauen und durchmischen lysiert. Der Lyse folgte ein - 36 - Material und Methoden letzter Zentrifugationsschritt (34000g, 30 min, 4°C), bevor die Proteinkonzentration im Überstand mittels Bradford-Methode bestimmt werden konnte. Dazu wurden 5µl der Proteinlösungen, sowie der Standards mit 1 ml Bradford-Reagenz versetzt, für 10 min bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß inkubiert und die Absorption bei 595nm gemessen. Für die PAGE wurde ein 12,5 %-iges Gel verwendet, auf welches je 20 µg denaturiertes Protein aufgetragen wurde. Für die Denaturierung wurde die jeweils bestimmte Proteinmenge mit 10 µl Auftragspuffer versetzt und für 5 min bei 95°C inkubiert. Die Proteine wurden auf dem Gel bei 120V und 100mA aufgetrennt. Der Blot auf die Nitrozellulosemembran (HybondTM-ECLTM, Amersham Biosciences) erfolgte bei 150V und 150mA für 30 min. Als Auftragskontrolle wurde eine Ponceau S-Färbung durchgeführt, bzw. Aktin nachgewiesen. Das Blocken der unspezifischen Bindungen erfolgte mittels NET-G-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur. Der Primärantikörper wurde 1:1000 mit NET-G-Puffer verdünnt und für 48 Stunden mit der Membran bei 8°C inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit NET-G-Puffer wurde der Sekundärantikörper (1:10000 in NET-G) zu der Membran gegeben, die nach einer weiteren Stunde Inkubationszeit bei Raumtemperatur mit NET-G-Puffer gewaschen wurde. Anschließend erfolgte die Detektion mittels „ECL-Detektion Reagent“ (Cell Signaling). Auftragspuffer 62,5 mM Tris/HCl 25 % Glycerin 2 % SDS 0,01% Bromphenol Blau 2% beta-Mercaptoethanol -pH 6,8 Laufpuffer Ponceau S 1g/l Ponceau S 0,05% Essigsäure 10x Tris-Glycin-Puffer 24mM Tris Base 120mM Tris Base 190mM Glycin 960mM Glycin 0,1% SDS -pH 8,5 Transferpuffer 10x NET-G-Puffer 100ml Tris-Glycin-Puffer 1,5M NaCl 200ml Methanol 50mM EDTA 700ml H2O 500mM Tris Base 0,5% Triton X100 2% Gelatine -pH 7,5 - 37 - Material und Methoden Zytotoxizitäts-Assay Der Zytotoxizitäts-Assay diente als Funktionstest für NK-Zellen und somit zur quantitativen Bestimmung der zytotoxischen Aktivität. Dabei wurden Zielzellen der Linie K562 bzw. Jeg-3 mit dem Farbstoff „Carboxyfluorescein diacetate succinimidylester“ (CFSE) markiert (1 mM CFSE) und für 12 Stunden unter Standardbedingungen kultiviert. Anschließend wurde eine definierte Zellzahl (50000) zusammen mit den NK-Zellen (10000) für 4 Stunden erneut bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe der Propidiumjodid-Lösung (100µg/ml) zu den Proben, um die, durch die Lyseaktivität der NK-Zellen freigewordene DNA der Zielzellen anzufärben. Im Durchflußzytometer konnten durch die zwei Farbstoffe Propidiumjodit und CFSE die toten (Propidiumjodit-markierte) und lebenden (CFSEmarkierte) Zielzellen unterschieden werden. Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) Die Durchflußzytometrie dient der Analyse von Zellen und deren Eigenschaften. Dabei können durch die Antikörper-gekoppelte Färbung eine Vielzahl von Epitopen extrazellulär auf- und intrazellulär in den Zellen markiert und analysiert werden. Weiterhin können durch Fluoreszenzfarbstoffe Zellen direkt gefärbt werden (Zytotoxizitäts-Assay). Für die Durchflußzytometrie wurde ein 5-Kanal-Durchflußzytometer vom Typ DAKO Galaxy benutzt. Alle Messungen und Auswertungen wurden mit der Partec Flow Max-Software durchgeführt. Mit dem FACS wurden die Zytotoxizitäts-Assays, die Zytokin-Bestimmungen, sowie die Reinheitsbestimmungen der isolierten Primärzell-Populationen analysiert. Dafür wurden 104 Zellen pro Messung benötigt, die in einem Eppendorf-Gefäß (1,5 ml) abzentrifugiert (1500g, 10 min, RT) wurden. Anschließend wurde der Überstand verworfen. Die anschließende Markierung mit Fluoreszenz-Antikörpern diente der Reinheitsbestimmung isolierter Primärzellen. Dafür wurden je 2,5 µl Fluoreszenz-Antikörper (Firma DAKO, Germany) zu den Zellen gegeben und für 30 min bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß inkubiert. Anschließend konnten die Zellen im FACS analysiert werden. Zytokin-Bestimmung In dem BD Cytometric Bead Array (BD CBA) für Th1/Th2-Zytokine sind 6 Partikelpopulationen mit verschiedenen Fluoreszenzintensitäten enthalten, an denen Antikörper gegen IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α und IFN-γ gebunden sind (Abb. 3.5). Für die Untersuchung der Zytokinproduktion von Zellen wurden die zellfreien Kulturüberstände (50µl) zusammen mit der „Cytokine Capture Bead“-Lösung und 50µl PE-kunjugierten Detektionsantikörpern in einem FACS-Analysegefäß inkubiert. Nach drei Stunden Inkubation - 38 - Material und Methoden bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß wurden die Proben mit Waschpuffer versetzt, zentrifugiert (800g, 5 min) und im FACS zusammen mit den Standards analysiert (Abb. 3.6). Anhand der Fluoreszenzstärke der Beads konnten die einzelnen Zytokine unterschieden und durch die PE-kunjugierten Detektionsantikörper die Konzentration der Zytokine im FACS bestimmt werden. Zur Auswertung der Messdaten diente die FACS-Comp-Software (Firma BD Biosciences). Abb. 3.5 Funktionsweise des Cytometric Bead Array Abb. 3.6 Darstellung der Messergebnisse der Standards im FACS Nachweis von sHLA-G in den Embryokulturüberständen Für den Nachweis von sHLA-G in den Kulturüberständen humaner Embryonen wurde ein sHLA-G ELISA der Firma EXBIO (Czech Republic) verwendet. Dafür wurden ELISAPlatten mit MEM-G/9-Antikörpern (Anti sHLA-G) beschichtet und mit den Proben für 2 Stunden inkubiert. Nach zwei Waschschritten erfolgte die einstündige Inkubation mit Detektionsantikörpern (Anti-β2-Mikroglobulin), - 39 - die Horseradishperoxydase (HRP)- Material und Methoden konjugiert waren. Nach zwei weiteren Waschschritten wurde das Substrat (H2O2Tetramethylbenzidin) zugegeben und nach ausreichender Farbänderung die Reaktion durch die Änderung des pH-Wertes (durch Zugabe 0,2M Schwefelsäure) gestoppt. Detektiert wurde der ELISA durch Messung der Absorption bei 450nm. 3.4.4 Xenotransplantation von humanen Trophoblastzellen in RAG-20/γγc0 und C57BL/6J Mäuse In diesem Experiment sollten humane Trophoblastzellen unter die Nierenkapsel von Mäusen transplantiert werden. Danach sollte beobachtet werden, in wieweit die Mäuse auf das Transplantat reagieren und durch histologische Schnitte der Zielgewebe die Entwicklung und das Wachstum der Transplantate analysiert werden. Diese Arbeiten wurden am „Ontario Veterinary College“ an der „University of Guelph“, Kanada in der Arbeitsgruppe von Dr. Anne Croy in Zusammenarbeit mit Dr. Isabella Caniggia aus dem „Samuel Lunenfeld Resaerch Institute“ des „Mount Sinai Hospital“, Toronto dürchgeführt. In Abbildung 3.7 ist dieser Versuch als Überblick schematisch dargestellt. Haltung der Versuchstiere Die Versuchstiere wurden im Tierexperimentellen Zentrum der „University of Guelph“, Ontario, Kanada unter sterilen Bedingungen in Standardkäfigen gehalten (Lab Products Inc., Federalsburg, MD) und nach Standarddiäten gefüttert. Die Versuchstiere waren augenscheinlich gesund und ausgewachsen. Alle Protokolle wurden vom „Animal Care Commitee of the University of Guelph“ geprüft und beinhalteten die Richtlinien des „Canadian Council of Animal Care“. Genotypisierung der Versuchstiere (RAG-20/γc0) Um zu überprüfen, ob bei den Versuchstieren des Stammes (RAG-20/γc0) beide Gene (Rag-2 -/- und Zytokin-Rezeptor-Kette-γ -/-) nicht in dem Genom enthalten sind, wurde DNA aus einem kurzen Stück Gewebe des Schwanzes isoliert. Dazu wurde nach dem Anästhesieren der Mäuse ca. 0,5 cm Gewebe des Schwanzes entnommen. Dieses Gewebsstück wurde in 600µl TNES-Puffer und 35µl Proteinase K (10mg/ml) für 24 Stunden bei 57°C inkubiert. Anschließend gab man 166 µl NaCl (6M) zu und nach kurzem Schütteln zentrifugierte man die Lösung bei 12000g und Raumtemperatur für 5 min. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und es wurden 800µl kalter, 95% -iger Ethanol zugefügt. - 40 - Material und Methoden Danach erfolgte die Zugabe von 40µl Natriumacetat (3M) und die Zentrifugation bei 12000g für 30 min bei 4°C. Es folgten zwei Waschschritte mit 70% -igem Ethanol und das Lösen des Pellets in 100µl Tris-EDTA. Letztlich wurde die DNA-Lösung für 10 min bei 65°C erhitzt und spektrometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm quantifiziert. Für den Nachweis der Gene für Rag-2 und der Zytokin-Rezeptor-Kette-γ wurde eine „HotStart“-PCR (Thermocycler Firma Eppendorf) durchgeführt (92°C für 30s, 60°C für 90s, 72°C für 120s; 30 Zyklen - 72°C für 10 Minuten), die DNA in einem 2%-igen Agarosegel aufgetrennt und die Fragmente mittels Ethidiombromid und UV-Strahlung sichtbar gemacht. Für das Transplantatiosexperiment wurden anhand dieser Analyse die Tiere ausgewählt, die für die Rag-2-Gene und die Gene der Zytokin-Rezeptor-Kette-γ -/- negativ waren. TNES: Tris-EDTA: 10mM Tris, pH 7,5 PCR-Ansatz : Wasser 14,8µl 400mM NaCl 10x PCR Puffer 2,5µl 100mM EDTA Nukleotide 4,0µl 0,6% SDS Primer (10pmol/ml) je 1,25µl 10mM Tris, pH 8,0 Taq Polim. (0,31U) 4,0 µl 1mM EDTA DNA 1µl Präparation des humanen Deciduagewebes zur Transplantation Das Deciduagewebe wurde von Frau Dr. Isabella Cannigia isoliert und in DMEM-Medium (10% FKS, 2% AAS) kultiviert. Die Gewebsstücke waren je ca. 2 mm groß und wurden von Interruptio-Placenten der 5. und 10.SSW bzw von Placenten der 40.SSW isoliert. Als Transportgefäße von dem Mont Sinai Hospital, Toronto nach Guelph dienten 1,5ml Eppendorf-Reaktionsgefäße, die bei 4°C gelagert wurden. Transplantation Ziel dieses Experimentes war eine stabile Kultur von humanen Trophoblastzellen unter der Nierenkapsel von immundefizienten und -kompetenten Mäusen zu etablieren. Weiterhin sollte durch histologische und immunologische Analysen die Vitalität der Transplantate nachgewiesen und verglichen werden. Dazu wurde unter Allgemeinanästhesie (subkutane Injektion von 0,2-0,6ml Avertin 245 ) in Bauchlage die Oberhaut der Mäuse unter sterilen Bedingungen im Bereich der Wirbelsäule 1cm horizontal eröffnet und bis zum rechten Nierenlager abgeschoben. Es erfolgte die Eröffnung der Bauchhöhle durch einen Unterhautquerschnitt und die Niere wurde unter Erhaltung des Nierenstieles exponiert. Die Nierenkapsel wurde an dem unteren Pol inzidiert und das Transplantat mittels einer Glaspipette unter die Nierenkapsel eingeschoben und am - 41 - Material und Methoden oberen Pol fixiert. Anschließend wurde die Niere in den Eingeweidesack reponiert und die Wunde mit sterilen Wundverschlussklemmen verschlossen. Die Lagerung der Tiere bis zum Erwachen erfolgte unter einer Wärmelampe. Versuchsschema: Humanes Placentagewebe -Separation in Gewebsstücke (5mm2) -Isolation von Trophoblasten -Transplantation unter die rechte Nierenkapsel RAG-2º/ãcº n=140 C57Bl/6J n=40 (immundefizient) (immunkompetent) Intravenöse Injektion von 100µl Serum von Patienten mit Präeklampsie n=4 Euthanisierung nach 2 bis 68 Tagen Serum-Hormon-Analysen, Histologie Abb 3.7: Übersicht des Transplantationsexperimentes, Versuchsaufbau Gewebe und Blutentnahme Nach der Inkubationszeit (2-68 Tage) wurden die Versuchstiere in einer Kammer durch Zugabe von Kohlenstoffdioxid getötet und ca. 1 ml Blut für Hormonanalysen aus dem Herz entnommen. Anschließend wurden die Ovarien, der Uterus und die Nieren entnommen. Histologie Durch histologische Untersuchungen sollten die erfolgreiche Transplantation und die Invasion der Transplantate beobachtet werden. Die entnommenen Gewebe wurden in Formalin (5%) fixiert und über Nacht entwässert und mit Paraffin durchdrängt. Anschließend wurden die Gewebe in Paraffin-Blöcke eingegossen und ausgehärtet. Die Blöcke wurden durch ein Mikrotom geschnitten, auf Objektträgern fixiert und getrocknet. Die Objektträger wurden - 42 - Material und Methoden durch Xylen- und Ethanolbäder deparafinisiert und in Wasser gewaschen. Danach folgte der Färbeschritt mit Hematoxalin (Poly Scientific); anschließend wurden die Objektträger in Wasser gewaschen, mit Ethanol entfärbt und nach wiederholtem Wasserbad für den zweiten Färbeschritt kurz in Eosin (Poly Scientific) getaucht. Zum Abschluss der Färbung wurden die Objekte wieder durch Ethanolbäder entwässert und im Xylenbad für das Abdecken mit Deckgläschen vorbereitet. Dazu wurde ein Tropfen Permount (Firma Fisher Scientific) auf den Objektträger gegeben, das Deckgläschen blasenfrei aufgelegt und über Nacht getrocknet. Die Histologischen Schnitte wurden mikroskopisch ausgewertet (Axiowert 25, Firma Zeiss) und fotografiert. Enzyme Linked Immonusorband Assay (ELISA) Zur Analyse der Vitalität und zum Vergleich des Wachstums von humanen Trophoblastzellen in Mäusen wurde das Serum der Versuchstiere auf die Konzentration von β-HCG (Human Free β-HCG ELISA Kit, Alpha Diagnostic International, Inc., USA) untersucht. β-HCG wird von humanen Trophoblastzellen sezerniert und dient als Vitalitätsnachweis. Dafür wurden 25µl der Serumproben in die vorgefertigten ELISA-Platten gegeben, mit 100µl AntikörperEnzym Konjugat versetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit Waschpuffer gespült, man gab 100 µl des HRP-Substrates (Lösung A) und 100 µl des HRP-Substrates (Lösung B) zu und inkubierte es für weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zugabe von 50µl Stopp-Lösung wurde die Absorption bei 450 nm Wellenlänge gemessen und die Proben mit den Standards verglichen. 3.5 Statistik Für die statistische Analyse der Ergebnisse wurde der T-Test für gepaarte Stichproben verwendet. Für p<0,05 wurde das Ergebnis als statistisch signifikant betrachtet. Die Berechnungen erfolgten mittels SPSS 11.5S Software, die freundlicherweise von dem Universitätsrechenzentrum zur Verfügung gestellt wurde. 3.6 Darstellung der Ergebnisse Die Ergebnisse der numerischen Tests (Invasionsassays, ELISAs, Proliferationstests, Zytotoxizitätstests u.a.) sind in Balkendiagrammform dargestellt. Abgebildet werden die Mittelwerte, sowie der Standardfehler. Für die Western Blot Analysen wurden die relevanten Banden abgebildet und teilweise Intensitätsanalysen mittels Scion Image Software dargestellt. Für die histologischen Untersuchungen wurden repsäsentative Objektausschnitte im Anhang abgebildet. - 43 - Ergebnisse 4. Ergebnisse 4.1 Einfluss der Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF auf die STAT3Aktivierung in Choriokarzinom-Zellen In diesem Experiment sollten die Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF auf ihre Fähigkeit untersucht werden, in Jeg-3 Choriokarzinomzellen als Modell für Trophoblastzellen eine Phosphorylierung von STAT3 zu induzieren. Dafür wurden die Zellen kultiviert, Zytokine zugegeben und nach verschiedenen Zeitpunkten Proben für die PAGE und den Western Blot entnommen. Die abgebildeten Western Blots zeigen die Phosporylierung von STAT3 (Tyr 705) in den einzelnen Proben verglichen mit einer Positiv- und Negativkontrolle für die Phosphorylierung, sowie die Expression von STAT3 als Auftragskontrolle. 15 min 30 min 60 min ß Phospho-STAT3 (Tyr 705) ß STAT3 - 1 10 100 1 10 100 1 10 100 + LIF (ng/ml) Abb: 4.1 Western Blot für Phospho-STAT3 und STAT3 aus Jeg-3 Zellen nach Stimulation mit LIF Es ist zu erkennen, dass LIF in einer Konzentration von 10 ng/ml nach 15 min eine Phosphorylierung von STAT3 in Jeg-3 Zellen induziert, die bei höheren Konzentrationen verstärkt wird (Abb: 4.1). Nach einer Inkubationszeit von 30 min lässt sich auch bei einer Konzentration von 1 ng/ml eine leichte Phosphorylierung erkennen. Nach 60 min nimmt die Phosphorylierung bei einer Konzentration von 200 ng/ml leicht ab, während kein Unterschied in den anderen Konzentrationen zu beobachten ist. Bei der Betrachtung der Western Blots für Jeg-3 Zellen, die mit IL-6 stimuliert wurden, fällt auf, dass nach 15 min keine Phosphorylierung zu sehen ist (Abb: 4.2). Nach einer Inkubationszeit von 30 min ist eine leichte Phosphorylierung von STAT3 bei einer Konzentration von 20 ng/ml und 200 ng/ml, verglichen mit den Kontrollen zu erkennen. Nach einer Inkubationszeit von 60 min ist keine Phosphorylierung zu detektieren. - 44 - Ergebnisse 15 min 30 min 60 min ß Phospho-STAT3 (Tyr 705) ß STAT3 - 2 20 200 2 20 200 2 20 200 + IL-6 (ng/ml) Abb: 4.2 Western Blot für Phospho-STAT3 und STAT3 aus Jeg-3 Zellen nach Stimulation mit IL-6 Die Abbildung des Western Blots für Phospho-STAT3 aus Jeg-3 Zellen, stimuliert mit IGF-2 zeigt, dass dieses Zytokin eine sehr schwache Phosphorylierung von STAT3 bei 125 ng/ml und 1250 ng/ml nach 30 min induziert (Abb: 4.3). In den anderen Konzentrationen, bzw. nach anderen Zeitintervallen beeinflußt IGF-2 die Phosphorylierung von STAT3 nicht. 15 min 30 min 60 min ß Phospho-STAT3 (Tyr 705) ß STAT3 - 12,5 125 1250 12,5 125 1250 12,5 125 1250 + IGF-2 (ng/ml) Abb: 4.3 Western Blot für Phospho-STAT3 und STAT3 aus Jeg-3 Zellen nach Stimulation mit IGF-2 Die Western Blots von Jeg-3 Zellen stimuliert mit HGF zeigen, dass dieses Zytokin keinen Einfluss auf den Phosphorylierungszustand von STAT3 in Jeg-3 Zellen hat (Abb: 4.4). - 45 - Ergebnisse 15 min 30 min 60 min ß Phospho-STAT3 (Tyr 705) ß STAT3 - 1 10 100 1 10 100 1 10 100 + HGF (ng/ml) Abb: 4.4 Western Blot für Phospho-STAT3 und STAT3 aus Jeg-3 Zellen nach Stimulation mit HGF Es kann zusammengefasst werden, daß nur LIF in der Lage ist, eine starke Phosphorylierung von STAT3 in Jeg-3 Zellen zu induzieren; IL-6 und IGF-2 induzieren eine sehr geringe Phosphorylierung von STAT3. 4.2 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von HT-29 Zellen In diesem Experiment sollte die Rolle von STAT3 bezüglich der Invasivität von HT-29 Kolonkarzinimzellen untersucht werden. Da an diesen Zellen schon mehrfach erfolgreiche Transfektionen durchgeführt wurden, diente diese Versuchsreihe der Etablierung der Oligonukleotide zum „Knock Down“ von STAT3. Es wurden zum einen Transfektionen mit unterschiedlichen Konzentrationen von STAT3-siRNA-Oligonukleotiden und zum anderen eine Kontrolltransfektion durchgeführt, um die Spezifizität des STAT3 „Knock Down“ zu kontrollieren. Bei der Kontrolltransfektion wurden die selben Nukleotide verwendet, wie in den „Knock Down“-Oligonukleotiden, allerdings waren diese in einer nicht-genomischen Reihenfolge angeordnet. Die Abbildung 4.5 zeigt die Korrelation der STAT3-Expression auf das Invasionsverhalten von HT-29 Kolonkarzinomzellen; der abgebildete Western Blot zeigt die Expression von STAT3. Es ist zu sehen, dass die Kontrolltransfektion keinen Einfluss auf das Invasionsverhalten dieser Zellen hat, während eine Reduktion der STAT3-Expression die Invasion der Zellen signifikant reduziert. Diese Reduktion der Invasivität ist von der Konzentration der transfizierten siRNA und somit von der Konzentration der exprimierten STAT3-Moleküle abhängig. - 46 - Ergebnisse ß STAT3 35 % invadierte Zellen 30 25 * 20 * 15 * * 10 1- 2 Transfektion mit KontrollsiRNA 3 132nM 4 66nM 5 33nM 6 10mM Transfektion mit STAT3 siRNA Abb. 4.5: Western Blot für STAT3 aus HT-29 Kolon-Karzinom-Zellen nach STAT3„Knock Down“ mittels siRNA, Ergebnisse der Matrigel-Invasionsassays. Dargestellt sind die Standardfehler und Signifikanzen (p<0,05), n=3 Tabelle 4.1 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten der Werte aus Abbildung 4.5 Proben Irrtumswahrscheinlichkeit nativ – Kontroll-siRNA p=0,622 nativ – STAT3-siRNA (132nM) p=0,006 nativ – STAT3-siRNA (66nM) p=0,001 nativ – STAT3-siRNA (33nM) p=0,007 nativ – STAT3-siRNA (10nM) p=0,003 Es kann zusammengefasst werden, dass die designten Oligonucleotide spezifisch an die STAT3-mRNA gebunden haben und die Expression von STAT3 in HT-29 Zellen vermindert werden konnte. Die Invasivität korrelierte mit dem STAT3-Gehalt der HT-29 Zellen. - 47 - Ergebnisse 4.3 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von Jeg-3 Zellen In den folgenden Experimenten sollte der Zusammenhang zwischen den Beobachtungen aus den vorangegangenen Versuchen und der physiologischen Bedeutung in Jeg-3 Choriokarzinomzellen als Modell für Trophoblastzellen untersucht werden. Dazu wurden zum einen Jeg-3 Zellen mit IL-6 und LIF in Invasionsassays stimuliert und zum anderen durch die Transfektion mit siRNA die Expression von STAT3 unterdrückt. - LIF (10 ng/ml) Jeg3Zellen - LIF (10 ng/ml) Transfektion mit KontrollsiRNA - LIF (10 ng/ml) Transfektion mit STAT3 siRNA Abb. 4.6: Western Blot für STAT3 aus Jeg-3 Choriokarzinomzellen nach STAT3-Knock Down mittels siRNA, Stimulation mit LIF In dieser Abbildung ist zu erkennen, dass die Expression von STAT3 mittels siRNA (66nM) in Jeg-3 Zellen als Modellzellinie für Trophoblastzellen erfolgreich unterdrückt werden konnte. Weiterhin ist zu erkennen, dass durch LIF die Expression von STAT3 nicht beeinflusst wird. * 60 % invadierte Zellen 50 * * 40 Jeg-3 Zellen Jeg-3 Zellen + IL-6 (20 ng/ml) Jeg-3 Zellen + LIF (10 ng/ml) 30 20 10 0 1 Jeg-3 Zellen 2 Transfektion mit Kontroll siRNA 3 Transfektion mit STAT3siRNA (60 nM) Abb. 4.7: Ergebnisse der Matrigel-Invasionsassays von Jeg-3 Choriokarzinomzellen nach STAT3-„Knock Down“ mittels siRNA und Stimulation mit IL-6 und LIF, Dargestellt sind die Standardfehler und die relevanten Signifikanzen (p<0,05), n=3 - 48 - Ergebnisse Die Abbildung 4.7 zeigt den Einfluss der Zytokine IL-6 und LIF auf die Invasivität von Jeg-3 Zellen. Es ist zu erkennen, dass IL-6 die Invasion von Jeg-3 Zellen signifikant erhöht (p=0,02). LIF hat einen noch stärkeren Effekt bezüglich der Invasion in Jeg-3 Zellen (p=0,001). Diese Beobachtung korreliert mit den Ergebnissen aus den Western Blots, die eine Aktivierung von STAT3 durch diese Zytokine aufwiesen. Die Kontrolltransfektion zeigt kaum einen Unterschied zu den Ausgangszellen, während ein STAT3 „Knock Down“ die Invasion dieser Zellen signifikant reduziert (p=0,002). Die stimulatorischen Effekte von IL-6 und LIF bezüglich der Invasion waren in den STAT3 „Knock Down“ Zellen nicht zu beobachten (p>0,05). Tabelle 4.2 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten der Werte aus Abbildung 4.7 Proben Irrtumswahrscheinlichkeiten nativ – nativ+IL-6 p=0,02 nativ – nativ+LIF p=0,001 nativ – STAT3-siRNA p=0,002 STAT3-siRNA – STAT3-siRNA-IL-6 p=0,529 STAT3-siRNA – STAT3-siRNA-LIF p=0,069 4.4 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von Trophoblastzellen Jeg-3 Zellen dienen als Modell für Trophoblastzellen, da wesentliche Merkmale und Eigenschaften mit denen von Trophoblastzellen übereinstimmen. Während der Entwicklung der Placenta invadieren Trophoblastzellen unterschiedlich stark in mütterliches Gewebe ein. Die Rolle von STAT3 in diesem streng kontrollierten Prozess sollte in einem weiteren Experiment untersucht werden. Dazu wurden Trophoblastzellen aus Placenten der 12. und 40.SSW (nach termingerechter Geburt) isoliert und das Invasionsverhalten in Invasionsassays analysiert. Weiterhin wurde in diesen Primärzellen die Expression von STAT3 mittels siRNA unterdrückt. Die Abbildung 4.8 zeigt einen Western Blot für STAT3 von Trophoblasten der 12. und 40.SSW (reife Trophoblasten), sowie die Aktin-Ladekontrolle. Es ist zu erkennen, dass in den, mit STAT3-siRNA transfizierten Trophoblasten weniger STAT3 exprimiert wurde, als in den Kontrollen. - 49 - Ergebnisse Abb. 4.8: Western Blot für STAT3 und Aktin aus primären Trophoblastzellen nach STAT3-Knock Down mittels siRNA, graphische Darstellung der Intensität der Banden In der Abbildung 4.9 sind die Ergebnisse der Invasionsassays von Jeg-3 und Trophoblastzellen nach STAT3 „Knock Down“ abgebildet. Es ist zu erkennen, dass Trophoblastzellen aus Placenten nach der Geburt eine sehr geringe Invasivität aufweisen, die auch nur bedingt durch LIF gesteigert werden kann. Trophoblasten der 12.SSW weisen ein erhöhtes Invasionsverhalten auf, was durch LIF signifikant gesteigert werden konnte. Die Invasivität und der Einfluss von LIF war bei Jeg-3 Zellen am größten. Die Zellen, die mit Kontroll-siRNA transfiziert wurden, wiesen kaum Unterschiede zu den nativen Zellen auf, während in den STAT3-„Knock Down“-Zellen die Invasion in allen Zellpopulationen signifikant gesunken war (Abb: 4.9, Tab: 4.3). Der Einfluss von LIF auf die Invasivität dieser Zellen konnte nicht mehr beobachtet werden. Tabelle 4.3 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten der Werte aus Abbildung 4.9 Proben Irrtumswahrscheinlichkeiten Troph. 40.SSW – Troph. 40.SSW (Kontroll-siRNA) p=0,713 Troph. 40.SSW – Troph. 40.SSW (STAT3-siRNA) p<0,001 Troph. 40.SSW – Troph. 40.SSW (+LIF) p=0,001 Troph. 40.SSW (STAT3 siRNA) – Troph. 40.SSW (STAT3-siRNA) (+LIF) p=0,760 Troph. 12.SSW – Troph. 12.SSW (Kontroll-siRNA) p=0,424 Troph. 12.SSW – Troph. 12.SSW (STAT3-siRNA) p<0,001 Troph. 12.SSW – Troph. 12.SSW (+LIF) p<0,001 - 50 - Ergebnisse Fortsetzung Tabelle 4.3 Troph. 12.SSW (STAT3-siRNA) – Troph. 40.SSW (STAT3-siRNA) (+LIF) p=0,462 Jeg 3 – Jeg 3 (Kontroll-siRNA) p=0,385 Jeg 3 – Jeg 3 (STAT3-siRNA) p<0,001 Jeg 3 – Jeg 3 (+ LIF) p<0,001 Jeg 3 (STAT3-siRNA)– Jeg 3 (STAT3-siRNA) (+LIF) p=0,015 * * 60 * % invadierte Zellen 50 40 * * * 30 20 10 0 Zellen Zellen + LIF (10 ng/ml) Zellen Zellen + LIF (10 ng/ml) Zellen KontrollsiRNA Trophoblastzellen der 40.SSW Trophoblastzellen der 12.SSW Zellen + LIF (10 ng/ml) STAT3-siRNA Jeg-3 Zellen Abb. 4.9: Ergebnisse der Matrigel-Invasionsassays von erst-Trimester-Trophoblastzellen, reifen Trophoblasten und Jeg-3 Choriokarzinomzellen nach STAT3-„Knock Down“, Stimulation mit IL-6 und LIF. Dargestellt sind die Standardfehler und relevante Signifikanzen (p<0,05), n=3 - 51 - Ergebnisse 4.5 Einfluss von SOCS3 auf die Phosphorylierung von STAT3 in Jeg-3 Zellen Dieser Test sollte die Wirkung von SOCS3 auf die durch IL-6 induzierte Prosphorylierung von STAT3 in Jeg-3 Zellen zeigen. Dazu wurde die Expression von SOCS3 in Jeg-3 Zellen durch die Transfektion mit siRNA unterdrückt und die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion mit IL-6 (200ng/ml) für 30 min stimuliert. Anschließend wurde die Expression von Phospho-STAT3 und STAT3 mittels Western Blot analysiert. ß Phospho-STAT3 (Tyr 705) ß STAT3 - Transfektion mit KontrollsiRNA Transfektion mit SOCS3siRNA (66nM) Abb 4.10: Western Blot für Phospho-STAT3 und STAT3 in Jeg-3 Zellen nach Transfektion mit SOCS3-siRNA, Stimulation mit IL-6 In Abbildung 4.10 (siehe auch Abb 4.2) ist zu erkennen, dass die Stimulation mit IL-6 eine Phosphorylierung von STAT3 induziert. Der „Knock Down“ von SOCS3 verstärkt den Phosphorylierungsgrad von STAT3, verglichen mit den Kontrollen. Der Western Blot für STAT3 dient als Auftragskontrolle. 4.6 Einfluss von STAT3 und SOCS3 auf die Proliferation von Jeg3-Zellen Dieser Test sollte den Einfluss des STAT3- und SOCS3-„Knock Downs“, sowie die Wirkung von LIF auf die Proliferation von Jeg-3 Zellen zeigen. Dazu wurde die Expression von STAT3 und SOCS3 in Jeg-3 Zellen durch die Transfektion mit siRNA unterdrückt und die Zellen wurden mit LIF (10ng/ml) stimuliert. Nach 48 Stunden wurde die Proliferation der Zellen durch Messung der Absorption bei 495 nm nach Zugabe des „Cell Titer 96Aqueous One Solution Reagent“ ermittelt. In der Abbildung 4.11 ist die Steigerung der Proliferation von Jeg-3 Zellen induziert durch LIF dargestellt. Es ist zu beobachten, dass die Stimulaion mit LIF zu einer leichten Erhöhung in nativen Jeg-3 Zellen und Jeg-3 Zellen der Kontrolltransfektion führt. In STAT3-„Knock Down“ Zellen hat LIF keinen steigernden Effekt, während die LIF-Stimulation von Zellen, - 52 - Ergebnisse die mit SOCS3-siRNA transfiziert wurden, zu einer signifikanten Erhöhung der Proliferation führt. 50 *p=0,002 durch LIF in % Steigerung der Proliferation 40 30 20 10 0 -10 KontrollsiRNA - SOCS3Knock Down STAT3Knock Down Abb: 4.11 Ergebnisse der Proliferationstests von Jeg-3 Zellen, Stimulation mit LIF (10 ng/ml). Dargestellt sind die Differenzen der Proliferation zwischen stimulierten und unstimulierten Zellen, die Standardfehler und relevante Signifikanzen (p<0,05), n=5 Tabelle 4.4 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten der Werte aus Abbildung 4.10 Proben Irrtumswahrscheinlichkeiten nativ – Kontroll-siRNA p=0,514 nativ – STAT3-siRNA p=0,244 nativ – SOCS3-siRNA p=0,002 4.7 Einfluss von STAT3 auf das Apoptoseverhalten von Trophoblasten Um zu untersuchen, ob die beobachteten Effekte nach dem „Knock Down“ von STAT3 durch die Induktion der Apoptose entstanden, wurde die gespaltene Poly ADP-Ribose Polymerase in diesen Zellen gemessen. PARP ist ein Reparaturenzym, welches an DNAEinzelstrangbrücke bindet, die bei beginnender Apoptose entstehen. Durch verschiedene Enzyme werden diese Moleküle nach Induktion der Apoptose in zwei Teile gespalten und diese können durch Antikörper nachgewiesen werden. - 53 - Ergebnisse cleaved PARP + Zellen in % 10 8 6 4 2 0 - Kontroll siRNA Stat3-KO Abb. 4.12: Ergebnisse der intrazellulären cleaved PARPFärbung als Apoptosemarker in reifen Trophoblasten nach STAT3-Knock Down, dargestellt sind die Standardfehler. n=3 In der Abbildung 4.12 ist zu erkennen, dass der Knock Down von STAT3 keinen signifikanten Einluß auf das Apoptoseverhalten von Trophoblastzellen der 40.SSW hat. Somit kann ausgeschlossen werden, dass die entstandenen Effekte des STAT3-„Knock Down“ in den vorangegangenen Experimenten durch die Induktion der Apoptose in diesen Zellen entstanden sind. Tabelle 4.5 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten der Werte aus Abbildung 4.11 Proben Irrtumswahrscheinlichkeiten nativ – Kontroll-siRNA p=0,284 nativ – STAT3-siRNA p=0,328 4.8 Einfluss von STAT6 auf das Invasionsverhalten und die Proliferation von Jeg-3 Zellen STAT6 ist maßgeblich an der Entwicklung stark invadierender Zellen beteiligt, reguliert die Proliferation, Malignität und Produktion von Hormonen in Tumorzellen. In diesem Experiment sollte untersucht werden, ob die Stimulation von STAT6 durch IL-4, bzw. ein „Knock Down“ von STAT6 in Jeg3 Zellen deren Invasionsverhalten beeinflusst. Dazu wurden native Jeg-3 Zellen mit Kontroll-siRNA, sowie mit unterschiedlichen Konzentrationen von STAT6-siRNA transfiziert und in Matrigel-Invasionsassays analysiert. - 54 - Ergebnisse % invadierte Zellen 25 20 Jeg-3 Zellen Jeg-3 Zellen + IL-4 (50ng/ml) 15 10 5 0 KontrollsiRNA - 176nM 132nM 66nM Transfektion mit STAT6 siRNA Abb. 4.13: Ergebnisse der Matrigel-Invasionsassays von Jeg-3 Choriokarzinomzellen nach STAT6-„Knock Down“, Stimulation mit IL-4. Dargestellt sind die Standardfehler. n=3 In der Abb. 4.13 ist zu erkennen, dass weder die Stimulation mit IL-4, die Transfektion mit Kontroll-siRNA, noch der „Knock Down“ von STAT6 einen Einfluss auf die Invasivität von Jeg3 Zellen haben (p>0,05). Selbst bei sehr großen Konzentrationen der STAT6-siRNA (176 nM) konnte kein Effekt beobachtet werden. Weiterhin sollte untersucht werden, ob die durch IL-4 induzierte Stimulation der Proliferation von Jeg-3 Zellen, durch einen STAT6 „Knock Down“ beeinflusst werden kann. Die Ergebnisse der Proliferationstests 14 Erhöhung der Proliferation von 12 dass IL-4 zu Jeg-3 Zellen führt (Abb: 4.14). Eine ähnliche Reaktion zeigen Jeg-3 Zellen, die mit KontrollsiRNA transfiziert während in wurden, STAT6-„Knock Down“ Zellen die Steigerung der Proliferation, induziert durch Relative Erhöhung der Proliferation durch IL4 in % einer zeigen, 10 8 6 4 2 0 -2 - IL-4, stark abnahm. Auf Grund der Schwankungsbreite der Ergeb-nisse ergaben sich zwar keine Signifikanzen doch wiesen die (p>0,05), Transfektion mit KontrollsiRNA 176nM 132nM 66nM Transfektion mit STAT6 siRNA Abb: 4.14 Ergebnisse der Proliferationstests. Dargestellt ist die Differenz der Proliferation von Jeg-3 Zellen zwischen mit IL-4 stimulierten und unstimulierten Zellen. Dargestellt sind die Standardfehler. n=5 Ergebnisse eindeutige Tendenzen auf. - 55 - Ergebnisse 4.9 „Knock Down“ von HLA-G und HLA-G1 in Jeg3-Zellen Jeg-3 Zellen exprimieren, wie auch Trophoblastzellen und andere Tumorzellinien, HLA-G und werden so vor einer möglichen Immunantwort geschützt. In diesem Experiment sollte durch die Transfektion mit siRNA die Expression von HLA-G bzw. HLA-G1 unterdrückt werden. Da mittels siRNA nur die Neuexpression unterdrückt, nicht aber vorhandene HLAG-Moleküle abgebaut werden, sollte untersucht werden, ob 24 Stunden nach der Transfektion ein Effekt beobachtet werden kann. ß HLA-G ß Aktin Abb. 4.15: Western Blot für HLA-G und Aktin aus Jeg-3 Choriokarzinomzellen nach HLA-G und HLAG1 Knock Down mittels siRNA. In der Abbildung 4.15 ist ein repräsentativer Western Blot für HLA-G von Jeg-3 Choriokarzinomzellen nach dem „Knock Down“ von HLA-G und HLA-G1 mittels siRNA dargestellt. Der Nachweis von Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet. Es ist zu beobachten, dass durch die Transfektion mit siRNA die Expression von HLA-G verringert werden konnte. Dabei fällt auf, dass sich die Expression von HLA-G in Zellen, die mit HLAG siRNA bzw. mit HLA-G1 siRNA transfiziert wurden, kaum unterscheidet. Die geringste HLA-G Expression wurde in den Zellen gemessen, die mit der größten Konzentration (132nM) HLA-G1-siRNA transfiziert worden sind. - 56 - Ergebnisse 4.10 Einfluss von HLA-G und HLA-G1 in Jeg-3 Zellen auf die Zytotoxizität von NK-Zellen In diesem Versuch sollte untersucht werden, in wieweit der „Knock Down“ von HLA-G und HLA-G1 in Jeg-3 Zellen, die als Zielzellen dienen, die Zytotoxizität von NK-Zellen beeinflusst. Dazu wurden Jeg-3 Zellen nach der Transfektion mit HLA-G und HLA-G1 siRNA mit CFSE gefärbt und zusammen mit isolierten NK-Zellen aus dem peripheren Blut für 12 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Zellen im FACS analysiert, nachdem die toten Zellen mit Propidiumjodit angefärbt wurden. 140 rel. Zytotoxizität 130 120 110 100 90 80 Jeg-3 Zellen Jeg-3 Zellen, Transfektion mit Kontroll siRNA Jeg-3 Zellen, Transfektion mit HLA-GsiRNA Jeg-3 Zellen, Transfektion mit HLA-G1siRNA Abb. 4.16: Graphische Darstellung der Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber Jeg-3 Zellen nach HLA-G und HLA-G1-„Knock Down“. Dargestellt sind die Standardfehler. n=3 In der Abbildung 4.16 ist die relative Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber Jeg-3 Zellen dargestellt, wobei die Aktivität der NK-Zellen gegenüber nativen Jeg-3 Zellen als 100% betrachtet wurde. Es ist zu sehen, dass die Transfektion mit HLA-G1-siRNA zu einer starken, wenn auch nicht signifikanten Erhöhung der Zytotoxizität, verglichen mit den Kontrollen führt. Die Transfektion mit HLA-G-siRNA löste eine geringe Steigerung der Zytotoxizität aus. Tabelle 4.6 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten der Werte aus Abbildung 4.16 Proben Irrtumswahrscheinlichkeiten Jeg-3 nativ – Kontroll-siRNA (66nM) p=0,849 Jeg-3 nativ – HLA-G-siRNA (66nM) p=0,056 Jeg-3 nativ – HLA-G1-siRNA (66nM) p=0,119 - 57 - Ergebnisse 4.11 Einfluss von STAT3 auf die Zytotoxizität von dezidualen NK-Zellen In diesem Experiment sollte die Bedeutung des Signaltransduktors STAT3 bezüglich der Zytotoxizität von dezidualen NK-Zellen untersucht werden. Dazu wurde in NK-Zellen aus dem peripheren Blut die Expression von STAT3 mittels siRNA unterdrückt und nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden ein Zytotoxizitätstest durchgeführt. Als Zielzellen dienten K562-Zellen, die nach der Kultivierung zusammen mit den NK-Zellen im FACS analysiert wurden. In der Abbildung 4.17 ist die relative Zytotoxizität dargestellt, wobei die Aktivität der nativen NK-Zellen als 100% betrachtet wurden. Es ist zu sehen, dass die Transfektion mit Kontroll-siRNA nur eine sehr kleine, nicht signifikante Reaktion auslöst, während die Transfektion mit STAT3-siRNA die Zytotoxizität, abhängig von der Konzentration der Oligonukleotide, signifikant hemmt. 120 * * rel. Zytotoxizität in % 100 80 60 40 20 0 - Transfektion mit KontrollsiRNA 198 nM 132 nM 66 nM Transfektion mit STAT3 siRNA Abb. 4.17: Graphische Darstellung der Zytotoxizität von NKZellen nach STAT3-Knock Down gegenüber K562-Zellen. Dargestellt sind die Standardfehler und relevante Signifikanzen (p<0,05). n=3 Tabelle 4.7 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten der Werte aus Abbildung 4.17 Proben Irrtumswahrscheinlichkeiten nativ – STAT3-siRNA (198nM) p=0,035 nativ – STAT3-siRNA (132nM) p=0,043 nativ – STAT3-siRNA (66nM) p=0,63 - 58 - Ergebnisse 4.12 Zytokinproduktion humaner Embryonen In dieser Versuchsreihe sollte die Konzentration ausgewählter Zytokine und sHLA-G1 in den Überständen von Embryokulturen analysiert werden. Dabei wird dieses Experiment mit einer relativ geringen Probenanzahl als Vorversuch für folgende Projekte in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Hoppe des IVF-Labors der Universitätsfrauenklinik Jena dargestellt. Die Embryonen wurden in 500µl IVF-Medium für 72 Stunden unter Standard-bedingungen inkubiert, die Überstände wurden bei –20°C gelagert und freundlicherweise von Frau Dr. Hoppe zur Verfügung gestellt. Bei der Zytokinanalyse standen besonders die Zytokine IL-10, IL-6, IL-4, IFN-γ und TNF-α im Mittelpunkt. Konzentration in pg/ml 16,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 IFNg IFN-γ IL-10 IL-10 IL-6 IL-6 IL-4 IL-4 TNFa TNF-α Abb. 4.18: Graphische Darstellung der mittleren Zytokinkonzentration in Embryokulturüberständen nach 24 Stunden Kultivierung (n=7) In der Abbildung 4.18 ist zu erkennen, dass vor allem IL-4 konstant und in großen Mengen von humanen Embryonen in vitro sezerniert wird. Auch IFN-γ konnte in großen, allerdings stark schwankenden Konzentrationen detektiert werden. IL-10 und IL-6 wurden nur in sehr geringen Konzentrationen nachgewiesen und die Konzentration von TNF-α lag am unteren Rand der Nachweisgrenze. Alle hier betrachteten Embryonen wurden transferiert. Da allerdings meist zwei oder drei Embryonen übertragen wurden, ist es nicht möglich nachzuverfolgen, welche Embryonen zu einem Schwangerschaftserfolg führten. - 59 - Ergebnisse 350 300 * des * - außerhalb Meßbereichs 250 - erfolgte Einlingsschwangerschaft 200 150 100 50 0 Patient: 1 2 3 4 5 Abb. 4.19: Graphische Darstellung der sHLA-G Konzentration in Embryokulturüberständen nach 72 Stunden Kultivierung (n=3 Parallelbestimmungen aus einer Probe). Dargestellt sind sHLA-G Konzentrationen in einzelnen Embryokulturüberständen von 5 Patienten. In Abbildung 4.19 sind die Konzentrationen von sHLA-G in den Embryokulturüberständen einzeln dargestellt. Es ist zu sehen, dass die sHLA-G Konzentration in den Embryokulturüberständen von Patient 1 am größten ist. Dieser Embryo wurde bis zum Vierzellstadium kultiviert und augenscheinlich als sehr gut eingestuft. Allerdings waren die endometrialen und hormonellen Voraussetzungen der Frau sehr schlecht (nach Angaben des Klinikers). Es konnten Schwangerschaften mit einem implantierten Embryo nur bei den Patienten 3 und 4 nachgewiesen werden, obwohl alle dargestellten Embryonen tranferiert wurden. Der Embryo von Patientin 5 wurde bis zu Blastozystenstadium kultiviert. Es kann zusammengefasst werden, dass bei der Betrachtung dieser geringen Probenzahl keine eindeutige Korrelation zwischen der Zytokin- bzw. sHLA-G-Sekretion und der erfolgreichen Implantation eines Embryo nachgewiesen werden konnte. - 60 - Ergebnisse 4.13 In-vivo-Kultivierung von Trophoblastzellen – Xenotransplantation von humanen Trophoblastzellen in immundefiziente und immunkompetente Mäuse Bei dieser Versuchsreihe sollten humane Trophoblastzellen verschiedener Entwicklungsstufen (5.SSW, 10.SSW, 40.SSW) unter die Nierenkapsel immunkompetenter und immundefizienter Mäuse transplantiert werden (Xenotransplantation). Dabei sollte untersucht werden, ob die Trophoblasten in den Mäusen überleben, wenn ja proliferieren, sich differenzieren, invadieren und ob sie β-HCG produzieren. Das Experiment sollte dazu dienen, Einflüsse von verschiedenen Stoffen auf das Wachstums- und Differenzierungsverhalten von Trophoblasten in vivo zu untersuchen, um Vorgänge bei verschiedenen Erkrankungen (zB. Präeklampsie) zu verstehen. Diese Versuchsreihen stellen hierbei Vorversuche dar, um die Funktionalität der Experimente zu prüfen und die Möglichkeit der Beeinflussung des Wachstums der transplantierten Zellen zu untersuchen. Dafür wurde 4 Versuchstieren Serum von Patienten mit Symptomen einer Präeklampsie injiziert. Die in den folgenden Abschnitten erwähnten Abbildungen sind im Anschluß an 4.13.3 dargestellt. 4.13.1 Auswertung des ersten Teils des Experimentes – Transplantation von Trophoblastengewebe unter die Nierenkapsel immundefizienter Mäuse (RAG-2º/ cº) In der Abbildung 4.20 ist ein histologischer Schnitt durch das Zielorgan der Xenotransplantation, der Niere von Mäusen dargestellt. Dabei sind die typischen Nierenstrukturen und die Nierenkapsel zu erkennen. In allen Versuchstieren konnte nach der Transplantation eine stabile Kultur des Trophoblastengewebes von bis zu 84 Tagen nachgewiesen werden. Exemplarisch dafür sind in Abbildung 4.21 Trophoblasten (zwei Tage nach der Transplantation) dargestellt, die beginnen in angrenzendes Fettgewebe zu invadieren. Weiterhin konnte mit längeren Kultivierungszeiten eine zunehmende Invasion der Trophoblasten, abhängig von ihrer Entwicklungsstufe festgestellt und die Produktion von βHCG nachgewiesen werden. Allerdings unterschieden sich die Entwicklungen der Trophoblasten der 5.SSW erheblich von denen der 10.SSW. Trophoblasten der 5.SSW waren weniger invasiv als die der 10.SSW und wuchsen an der Peripherie der Niere entlang der Kapsel (Abb: 4.22). Bei den Trophoblasten der 5.SSW konnte jedoch am 16.Tag nach der Transplantation - 61 - eine Differenzierung der Ergebnisse Zytotrophoblasten in Syncytiotrophoblasten beobachtet werden (Abb: 4.23) und es waren Ansätze für die Bildung von Blutgefäßen zu erkennen (Abb: 4.23, 4.24). Im Gegensatz dazu waren die Trophoblasten der 10.SSW sofort nach der Transplantation stark invasiv (Abb: 4.25, 4.26) und drangen tief in das umliegende Gewebe ein, was mit der Zerstörung des Nierengewebes einher ging (Abb: 4.27). Auch diese Trophoblasten zeigten ab dem 12. Tag nach der Transplantation eine Differenzierung in Syncytiotrophoblasten (Abb: 4.28, 4.29). Bei vielen Versuchstieren fielen stark geschwollene Uteri und blutgefüllte Ovarien auf (Abb: 4.30). Diese Veränderungen sind wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die transplantierten Trophoblastzellen Zytokine und Hormone sezernieren, die in dem Wirtsorganismus aktiv sind. Deshalb wurde die Konzentration von β-hCG im Serum der Versuchstiere bestimmt, worauf im folgenden Abschnitt eingegangen wird. Trophoblasten der 40.SSW (nach termingerechter Geburt) waren weniger invasiv als die Konzentration von HCG in IU . Trophoblasten der 10.SSW (Abb: 4.32, 4.33), 250 bildeten aber ebenfalls große Syncytien und 200 eine Proliferation konnte über den gesamten 150 Beobachtungszeitraum (bis zu 68 Tage nach 100 der Transplantation) beobachtet werden. 50 Erhebliche Unterschiede in der Produktion von 0 Trophoblasten der 5.SSW Trophoblasten der 10.SSW Abb. 4.31: Graphische Darstellung der Konzentration von β-hCG im Serum von Mäusen, 30 Tage nach Xenotransplantation von Trophoblasten unter die Nierenkapsel. β-hCG wurden im Serum der Versuchstiere 30 Tage nach der Transplantation beobachtet. Die Seren der Versuchstiere, in die Trophoblasten der 5.SSW transplantiert wurden, enthielten erheblich weniger β-hCG als die Vergleichs- gruppe nach der Transplantation mit Trophoblastzellen der 10.SSW (Abbildung 4.31). 4.13.2 Auswertung des zweiten Teils des Experimentes – Transplantation von Trophoblastengewebe unter die Nierenkapsel immunkompetenter Mäuse (C57Bl/6J) Trophoblasten der 10.SSW wurden ebenfalls in immunkompetente Mäuse transplantiert. Es fiel auf, dass diese Transplantate nach geringer Inkubationszeit sehr viel größer waren als die Vergleichstransplantate in immundefizienten Mäusen. Die Trophoblastzellen invadierten ebenfalls tief in das Wirtsgewebe ein und bildeten Syncytien, so dass vergleichbare Bilder wie nach der Transplantation in immundefizinte Mäuse entstanden (Abb: 4.34, 4.35). Weder eine zellvermittelte Abstoßung durch das Immunsystem der Mäuse, noch Apoptose oder Nekrose - 62 - Ergebnisse der Trophoblasten konnte festgestellt werden, obwohl es Anzeichen für inflammatorische Vorgänge gab. 4.13.3 Auswertung des dritten Teils des Experimentes – Transplantation von Trophoblastengewebe unter die Nierenkapsel immundefizienter Mäuse (RAG-2º/ cº), Zugabe von Serum von Patienten mit Präeklamsie Die Seruminjektion von Patienten mit Präeklampsie nach der Transplantation von humanan Trophoblasten der 10.SSW unter die Nierenkapsel immundefizienter Mäuse führte zu starken Veränderungen im Wachstum und der Differenzierung der transplantierten Zellen (Abb: 4.36, 4.37). Innerhalb von 14 Tagen nach der Transplantation und Zugabe des Serums wurden Nekrosen des villösen Mesenchymkerns und der Zelltod der Trophoblasten festgestellt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sowohl in immundefizienten als auch in immunkompetenten Mäusen eine stabile Kultur von Trophoblasten aller Altersstufen gelang und Immunreaktionen der immunkompetenten Mäuse keinen Einfluss auf das Wachstum und die Differenzierung der Transplantate hatte. In vielen Versuchstieren konnten die Auswirkungen der, durch die Trophoblasten sezernierten Zytokine und Hormone auf die Uteri und Ovarien beobachtet werden. β-HCG wurde in den Ersttrimester Transplantaten detektiert. Die Seruminjektion von Patienten mit Präeklamspie in den Blutkreislauf der Mäuse nach der Transplantation führte zu Nekrosen und dem Tod der transplantierten Trophoblastzellen. F N CT Abb.: 4.20 Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc) bei 200-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung N-Nierengewebe CT-Cytotrophoblasten F-Fettgewebe Abb.: 4.21 Fett- und angrenzendes Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), sowie invadierende humane Trophoblasten der 10.SSW, 2 Tage nach Transplantation bei 400-facher Vergrößerung nach H&EFärbung - 63 - Ergebnisse N N CT CT ST Abb.: 4.22 Nierenkapsel und Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), sowie humane Trophoblasten der 5.SSW, 6 Tage nach Transplantation bei 200facher Vergrößerung nach H&E-Färbung ST Abb.: 4.23 Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), humane, stark invadierende Zytotrophoblasten, sowie differenzierte Syncytiotrophoblasten der 5.SSW, 16 Tage nach Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung F CT CT Abb.: 4.24 Ausschnitt aus 4.23 bei 400facher Vergrößerung N Abb.: 4.25 Nieren- und Fettgewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), sowie invadierende humane Trophoblasten der 10.SSW, 2 Tage nach Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung N-Nierengewebe CT-Cytotrophoblasten SC-Syncytiotrophoblasten F-Fettgewebe - 65 - Ergebnisse N CT CT N Abb.: 4.27 Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), sowie humane, stark invadierende Zytotrophoblasten der 10.SSW, 16 Tage nach Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung Abb.: 4.26 Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), sowie humane, stark invadierende Trophoblasten der 10.SSW, 6 Tage nach Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung CT ST ST N CT N Abb.: 4.28 Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), humane, stark invadierende Zytotrophoblasten, sowie differenzierte Syncytiotrophoblasten der 10.SSW, 12 Tage nach Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung Abb.: 4.29 Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), humane, stark invadierende Zytotrophoblasten, sowie differenzierte Syncytiotrophoblasten der 10.SSW, 16 Tage nach Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung N-Nierengewebe CT-Cytotrophoblasten SC-Syncytiotrophoblasten - 66 - Ergebnisse Abb.: 4.30 Ovargewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), 2 Tage nach der Transplantation von humanem Trophoblastengewebe der 10.SSW bei 100-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung. Die histologischen Veränderungen der Ovargewebe sind auf die Wirkung von β-HCG, produziert durch die transplantierten, humanen Trophoblasten, zurückzuführen. N ST CT ST N Abb.: 4.32 Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), humane Zytotrophoblasten, sowie differenzierte Syncytiotrophoblasten einer Placenta nach der Geburt, 14 Tage nach Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung Abb.: 4.33 Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), humane Zytotrophoblasten, sowie differenzierte Syncytiotrophoblasten einer Placenta nach der Geburt, 68 Tage nach Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung N-Nierengewebe CT-Cytotrophoblasten SC-Syncytiotrophoblasten - 67 - Ergebnisse N N ST CT CT Abb.: 4.35 Nierengewebe einer Maus (C57Bl/6J), transplantiertes, humanes Gewebe, einer Placenta der 10.SSW, 52 Tage nach Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung Abb.: 4.34 Nierengewebe einer Maus (C57Bl/6J), humane Zytotrophoblasten, sowie differenzierte Syncytiotrophoblasten der 10.SSW, 6 Tage nach Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung CT ST ST N N Abb.: 4.36 und 4.37 Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), humanes Trophoblastengewebe der 10.SSW, 14 Tage nach Transplantation und Zugabe von Serum von Patienten mit Präeklampsie bei 200-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung. N-Nierengewebe CT-Cytotrophoblasten SC-Syncytiotrophoblasten - 68 - Diskussion 5. Diskussion In dieser Arbeit sollten Mechanismen und Faktoren der Interaktion zwischen NK-Zellen und Trophoblastzellen untersucht werden. Besonderer Wert wurde dabei auf die Rolle von intrazellulären Signaltransduktoren bezüglich der Steuerung der Invasivität und Proliferation von Trophoblasten, sowie der Zytotoxizität dezidualer Lymphozyten, insbesondere von NKZellen gelegt. Weiterhin wurde durch „Knock Down“ Experimente mittels siRNA die Funktion von HLA-G auf Trophoblastzellen untersucht. 5.1 Untersuchung der Phosphorylierung von STAT3, induziert durch die Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Untersuchung des Einflusses von Zytokinen auf die Aktivierung von intrazellulären Signaltransduktionsmolekülen, insbesondere dem Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT)-3 in der Choriokarzinomzellinie Jeg-3. Dabei standen die Zytokine LIF, IL-6, HGF und IGF-2 im Mittelpunkt. Takeda et. al. beschrieb das STAT3-Signal als essentiell für eine erfolgreiche Schwangerschaft 197 , und deshalb ist es von besonders großem Interesse herauszufinden, welche Zytokine in der Lage sind, dieses Signal zu induzieren. Der Einfluss von LIF auf die Phosphorylierung von STAT3 Es konnte in dieser Arbeit beobachtet werden, dass LIF eine sehr starke Phosphorylierung der STAT3-Moleküle in Jeg-3 Choriokarzinomzellen induziert, während die anderen untersuchten Zytokine nur eine sehr schwache, bzw. keine Aktivierung auslösten 203, 243. Es ist bekannt, dass LIF eine bedeutende Rolle während der Schwangerschaft in verschiedenen Species spielt 246 und die Proliferation und Invasion von Trophoblastzellen steuert 247 . Dies wird durch STAT3-„Knock Down“-Versuche in Trophoblastzellen unterstützt, wo das Invasionsvermögen erheblich reduziert wurde 243 , sowie durch in-vivo-Versuche, die zeigen, dass sich in LIF-„Knock Out“-Mäusen keine erfolgreiche Schwangerschaft etablieren kann, wenn nicht LIF in den Uterus injiziert wird 86 . Embryonen von LIF-Rezeptor-„Knock Out“- Mäusen implantieren zwar, sterben allerdings innerhalb 24 Stunden auf Grund nicht ausreichender Placenta-Funktion 248. LIF wird durch Zellen des Endometriums produziert und der LIF-Rezeptor wird sowohl von villösen und extravillösen Zytotrophoblasten von verschiedenen Tumorzellen exprimiert Fibroblasten 84 250, 251 249 , als auch . Obwohl LIF zu einer TIMP-Stimulation in und zu einer Inhibition der gelatinolytischen Aktivität von MMP-9 252 in Zytotrophoblasten führt, die Laminin-Rezeptoren tragen 85, wird anscheinend in Jeg-3 Zellen, - 69 - Diskussion die als Modell für Zytotrophoblasten dienen, die Invasivität verstärkt. Die Frage, ob Zytotrophoblasten, die Fibronektin-Rezeptoren exprimieren, ebenfalls eine solche Reaktion zeigen, kann hier nicht eindeutig beantwortet werden, allerdings wird deren gelatinolytische Aktivität durch LIF zumindest nicht negativ beeinflusst 85 Erhöhung der MMP-9 Sekretion in Maus-Blastozysten 253 . Weiterhin induziert LIF eine und in Trophoblasten 87, 254 . Allerdings sollte erwähnt werden, dass eine Sekretion von MMPs nicht mit deren Aktivierung gleichzusetzen ist. Doch eine durch LIF induzierte Aktivierung von MMP-9 konnte ebenfalls gezeigt werden 255 . In einer anderen Studie wurde beobachtet, dass humane Endothelzellen, denen LIF zugegeben wurde, eine Aktivierung von MMP-2 in Stomazellen induzieren 256 . An dieser Stelle sollte erwähnt werden, dass die Rolle von MMPs bezüglich der Invasivität in der Literatur kontrovers diskutiert wird und dass einige MMPs (einschließlich MMP-9) die Invasivität von Zellen durch die Bildung von Angiostatin negativ beeinflussen 257 . Diese Erkenntnis deckt sich mit Studien die zu dem Schluss kommen, dass die Expression von MMP-2 und MMP-9 in Trophoblasten nicht zwangsläufig mit deren Invasivität korreliert 258 . Dies könnte eine erhöhte Aktivierung trotz geringerer Expression von MMP-9 durch einen verminderten Einfluss von TIMP-1 erklären. Eine Balance von TIMP-1, TIMP-2 und MMP-2, MMP-9-Molekülen scheint das entscheidende Steuerelement für die Kontrolle der Trophoblasteninvasion zu sein 259, 260 . Interessanterweise stimuliert LIF die Expression von HLA-G, welches in die feto-maternale Immuntoleranz involviert ist 261 und später diskutiert wird. Der Einfluss von IL-6 auf die Phosphorylierung von STAT3 IL-6, das vom Endometrium in der Mitte der sekretorischen Phase und von allen Trophoblasten (Cyto- und Syncytiotrophoblasten) des ersten Trimesters gebildet wird 81 , wirkt auf diese Zellen durch die Bindung an zwei Membranproteine. Dabei benutzt IL-6, wie alle Mitglieder der IL-6-Rezeptor-Familie, das gleiche Rezeptormolekül (gp130) für die Aktivierung von STAT3 wie LIF. Allerdings löst IL-6 eine sehr viel geringere Phosphorylierung von STAT3 als LIF in Jeg-3 Zellen aus, führt aber zur Aktivierung von MMP-2 und MMP-9 in Trophoblasten 243 81 und zu einer erhöhten Invasivität von Jeg-3 Zellen . IL-6 ist, ähnlich wie LIF, ein antiapoptotischer Faktor bei Ösophaguskarzinomzellen 262 und das durch IL-6 vermittelte Signal wird ebenfalls durch SOCS3 reguliert 263, 264. Insgesamt scheint IL-6 ähnliche, wenn auch sehr viel geringere Wirkungen auf Trophoblastzellen zu haben wie LIF. Allerdings führt ein IL-6 „Knock Out“ bei Mäusen zu einer normalen Schwangerschaft 265 und nicht wie bei LIF zu einem Schwangerschaftsabbruch. Doch auch eine IL-6 vermittelte STAT3 Aktivierung steht in Verbindung mit der Entstehung und der - 70 - Diskussion Erhöhung der Proliferation verschiedener Tumoren 266-268. Dabei wird bei einem IL-6 Signal sowohl der Ser727-Abschnitt, als auch der Tyr705-Abschnitt phosphoryliert, der eine Dimerisierung, den Transport durch die Kernmembran und die DNA-Bindung ermöglicht 269 . Allerdings führt die IL-6 Stimulierung einiger Tumoren auch zu einer Verminderung der Proliferation, immer jedoch zu einer erhöhten Migration 270. Der Einfluss von IGF-2 auf die Phosphorylierung von STAT3 IGF-2, das von extravillösen als auch von villösen, proliferierenden Zytotrophoblasten während der gesamten Schwangerschaft produziert wird 95-97 , induziert eine Erhöhung der Invasion von Trophoblastzellen in Matrigel durch Bindung an den IGF Rezeptor Typ 2 98, 99 und stellt somit ein autokrines Regulationsmolekül dar. Weiterhin führt ein IGF-2 „Knock Out“ zu einer verminderten Placentation, Migration und Invasion von Trophoblastzellen und endet in einer Wachstumsretardierung des Embryo 271, 272 . IGF-2 ist zweifellos ein wichtiges Zytokin für eine erfolgreiche Schwangerschaft, welches sein Signal anscheinend nicht über STAT3 weitergibt. Der Einfluss von HGF auf die Phosphorylierung von STAT3 HGF wird sowohl von Syncytio- als auch von Zytotrophoblasten, vom Amnionepithel und vom villösen Mesenchym produziert. HGF induziert eine erhöhte Proliferation von Hepatozyten, Trophoblasten und vielen Tumoren 273, 274 . Es dient als parakriner Wachstumsregulator bei Trophoblastzellen, obwohl es nicht zu einer Differenzierung beiträgt 275 . HGF ist allerdings an der Steuerung der Invasion von Trophoblastzellen beteiligt 103, denn eine verminderte Trophoblasteninvasion, wie sie zum Beispiel bei Präeklampsie vorkommt, ist oft mit einer verminderten HGF-Produktion in der Placenta assoziiert 100 . HGF induziert, ähnlich wie LIF in Choriokarzinomzellen, eine Erhöhung der STAT3-DNA-Bindungsaktivität in Bronchialkarzinomzellen 276 und wird von vielen Tumoren mit schlechter Prognose produziert. Eine starke HGF-Expression begünstigt die Tumorgenese und Metatasierung autound parakrin 277 . Obwohl HGF viele Gemeinsamkeiten mit LIF hat, induziert dieses Zytokin in Jeg-3 Zellen keine Phosphorylierung von STAT3. Ursächlich dafür könnten andere Signaltransduktionswege sein, die STAT3 erst später in der Reaktion auf HGF involvieren. Interessanterweise wird durch LIF die Expression von HGF in verschiedenen Melanomen verstärkt 278. - 71 - Diskussion 5.2 Einfluss von LIF, SOCS3 und STAT3 bezüglich der Proliferation von Jeg-3 Zellen In dieser Arbeit konnte eine gesteigerte Proliferation durch die LIF-induzierte STAT3Aktivierung beobachtet werden. Nach dem „Knock Down“ von STAT3 konnte die Wirkung von LIF weitgehend aufgehoben werden, während ein „Knock Down“ von SOCS3 zu einer übermäßig starken Erhöhung der Proliferation nach LIF-Stimulation führte. Diese Ergebnisse werden durch Arbeiten unterstützt, die über den Einfluss von STAT3 auf das Wachstumsverhalten von Zellen berichten 279 und die Rolle von SOCS3 als Regulationsmolekül für die Aktivierung von STAT3 zeigen 280. Weiterhin führt eine SOCS3Aktivierung zu einer Inhibition der Proliferation von Bronchialkarzinomzellen 281 und zu einer verminderten Sensitivität gegenüber Zytokinen bei Mammakarzinomzellen 282 . Interessanterweise führt eine Aktivierung von SOCS3 in Melanozyten und frühen Melanomzellen auch zu einer verminderten Sensitivität gegenüber Onkostatin M, einem wachstumsinhibierenden Faktor 283 . Viele dieser Effekte resultieren wahrscheinlich aus der Inhibition der Cytokinrezeptor-vermittelten Signalübertragung auf STAT3 durch SOCSMoleküle. Dabei können SOCS-Moleküle zum einen über die SH2-Domäne an das Phosphotyrosin des Zielproteins binden, was zu einer Inhibition der Signaltransduktion über die N-termiale Inaktivierung der JAKs führt, oder zum anderen die Bindung von STATs an die entsprechende Rezeptorstelle verhindern 284 . Weiterhin wird davon ausgegangen, dass die antiproliferativen Effekte von IFN-γ auf die Erhöhung der SOCS3-Expression zurückzuführen sind 285. Dagegen ist eine Aktivierung von STAT3 in verschiedenen Tumoren wahrscheinlich für die Hochregulation von Genen zum Unterdrücken der Apoptose (bcl-xL, mcl-1, Survivin) und den Zellzyklus (Cyclin D1, c-myc) verantwortlich 213, 286, 287, während ein STAT3 „Knock Down“ nicht zwangsläufig zu einer erhöhten Apoptoserate führt 243. 5.3 Die Rolle von STAT3 bezüglich der Invasivität von Karzinom- und Trophoblastzellen Eine weitere Frage in dieser Arbeit war, in wieweit STAT3 das Invasionsverhalten von Trophoblast- und Tumorzellen beeinflusst. Wie bereits erläutert, spielt STAT3 eine wichtige Rolle in der Migration und Tumorgenese verschiedener Typen von Tumor- und pluripotenten Zellen 102, 277, 288, 289 und es scheint die transkriptionale Regulation von verschiedenen Proteasen, die bei invasivem Wachstum benötigt werden, maßgeblich zu beeinflussen 290-292 . In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl in Tumor- als auch in Trophoblastzellen - 72 - Diskussion ein „Knock Down“ von STAT3 zu einer starken Inhibierung der Invasivität führt und der steigernde Effekt von LIF auf die Proliferation und Invasion dieser Zellen ausbleibt. Diese Ergebnisse lassen eine kausale Verbindung der durch LIF induzierten STAT3-Aktivität, der Invasivität und dem veränderten Expressionsmuster von Proteasen in Jeg-3 Choriokarzinomund Trophoblastzellen vermuten. In unserer Arbeitsgruppe konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Proteasen, deren mRNA-Levels durch eine LIF induzierte STAT3-Aktivierung beeinflusst werden, direkt mit dem Invasionsverhalten von Zellen und der Implantation in Verbindung stehen. Die Expression von TIMP-1 wird durch LIF herunterreguliert, was zu einer Inhibition der Metastasierung führt 247, 293, 294 . Vermutlich wird die TIMP-1-Expression in Trophoblast- und Jeg-3 Zellen direkt durch die STAT3-Aktivität beeinflusst, da dies unter anderem bei Hepatozyten und einigen anderen Zellen gezeigt werden konnte TIMP1-Promoter STAT3-Erkennungselemente besitzen 297 295, 296 und die . LIF steigerte die Invasion von Jeg-3 Zellen, Trophoblastzellen der 10., sowie der 40.SSW. In der Literatur wird beschrieben, dass alle Zellen der Trophoblasten-Linie den LIF-Rezeptor exprimieren, allerdings verändert sich der Ort der LIF-Expression. Zu Beginn einer Schwangerschaft wird LIF von dem glandulären Epithel produziert, während nach der Implantation diese Aufgabe deziduale NKZellen übernehmen. Dabei reguliert LIF durch Negativ-„Feed-Back“ Effekte seine eigene Produktion 197 . Dies könnte die Steuerung der Aktivierung von STAT3 in dem luminalen Epithel erklären, die mit der Embryo-Implantation beginnt 83 . Darüber hinaus induziert LIF zum Zeitpunkt der Implantation die Differenzierung von invasiven Riesenzellen aus epidermalen Trophektodermzellen in vivo und in vitro. Diese Differenzierung wird durch SOCS3 negativ reguliert, das die JAK/STAT-Signale unterdrückt und durch ein breites Spektrum von Zytokinen, inklusive LIF reguliert wird 72, 264. Daraus lässt sich vermuten, dass die durch LIF induzierte Aktivierung von STAT3 die Malignizität und Invasivität von Tumorzellen, sowie die Implantation des Embryo und die Invasion von embryonalen Trophoblastzellen steuert. 5.4 Einfluss von STAT3 auf die Induktion der Apoptose in Trophoblastzellen Die Induktion der Apoptose ist ein streng regulierter Prozess, an dem viele verschiedene Signaltransduktionsmoleküle beteiligt sind. STAT3 hat in der Kontrolle der Apoptose eine wichtige Funktion, da durch die aktivierte Form von STAT3 Apoptosevorgänge in Tumorzellen abgewendet werden 201, 213 . In vielen Karzinomen wird durch den „Knock Down“ von STAT3 die Apoptoserate jener Zellen verstärkt, die hohe Konzentrationen von - 73 - Diskussion aktiviertem STAT3 enthalten 214, 298 . Prostatakarzinomzellen, die kaum aktiviertes STAT3 enthielten, blieben vom STAT3-„Knock Down“ dagegen unbeeinflusst Trophoblastzellen der 40.SSW 243 214 , ähnlich wie . Auch andere Gruppen beobachteten, dass ein STAT3 „Knock Down“ nicht zwangsläufig zu einer Erhöhung der Apoptoserate führt 299 . Anscheinend spielt auch STAT1 eine große Rolle in der Steuerung der Apoptose. STAT1 kann durch die Art der Aktivierung sowohl pro- als auch anti-apoptotische Signale übertragen 217 . Doch werden in der Literatur STAT3 und STAT1 als Gegenspieler in der Steuerung von Apoptoseprozessen dargestellt 287 . Nebenbei führt IL-6, das über den IL-6-Rezeptor STAT3 aktiviert und somit Apoptosevorgänge unterdrückten würde, auch zu einer Aktivierung von STAT1 in Kolonkarzinomzellen 300. Somit stehen sich STAT1 und STAT3 weniger als Gegenspieler gegenüber, sondern stellen eher zwei synergetische Steuerelemente der Apoptose dar. 5.5 Die Rolle von STAT6 bezüglich der Invasivität und Proliferation von Jeg-3 und Trophoblastzellen IL-4 ist ein Aktivator von STAT6 und an einer Veilzahl von Reaktionen in der Immunabwehr beteiligt. In verschiedenen Tumoren induziert das IL-4 Signal das Zellwachstum und wendet Apoptosevorgänge ab 216. So scheint es nicht verwunderlich, dass aktiviertes STAT6 in vielen stark invasiven Tumoren vorkommt 27 , die hochaffine Rezeptoren für IL-4 haben 301 . Doch trifft dies anscheinend nicht für alle Tumorzellen zu, denn in der Literatur wird ebenfalls über Proliferations-inhibierende und Apoptose-auslösende Effekte von IL-4 berichtet, das sein Signal auch via STAT1 weitergeben kann 206, 207. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der „Knock Down“ von STAT6, sowie die Stimulierung mit IL-4 keinerlei Einfluß auf die Invasivität von Jeg-3 Choriokarzinomzellen haben. Die Proliferation dieser Modellzellen für Trophoblasten wurde allerdings durch IL-4 stark erhöht, dessen Wirkung durch einen „Knock Down“ von STAT6 dosisabhängig reduziert werden konnte. Diskutiert werden sollte hierbei die Rolle der Signalübertragung von IL-4 via STAT6 bezüglich der Malignität, Proliferation und transkriptionellen Aktivierung von IL-6 in Tumoren Tumorzellen 302, 303 208, 209 . IL-6 stimuliert die Invasivität und Proliferation verschiedener . Wenn die Expression und transkriptionelle Aktivierung von IL-6 durch ein IL-4 Signal via STAT6 induziert würde, wäre STAT6 ein wichtiges Molekül in der autokrinen Regulation der Invasivität von Tumorzellen. - 74 - Diskussion 5.6 Die Rolle von STAT3 bezüglich der Zytotoxizität von NK-Zellen NK-Zellen sind in der Lage, Tumorzellen mit einer verminderten MHC-Expression oder Zellen mit einer fremdartigen MHC-Struktur ohne vorherige Sensibilisierung abzutöten 27 23, 25- . Dabei wird durch stimulierende und inhibierende Rezeptoren über die Art der Reaktion entschieden 29, 30 . Sowohl stimulierende als auch inhibierende Signale werden unter anderem durch STATs weitergeleitet. Eines dieser Signaltransduktionsmoleküle, STAT3, ist an der Regulation der Expression des porenbildenden Proteins Perforin beteiligt 304, 305. Auch STAT4 und STAT5 sind in der Lage, die Perforinexpression in NK-Zellen zu induzieren 187 , jedoch ist der Einfluss all dieser Signaltransduktoren in NK-Zellen auf deren Zytotoxizität unklar. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der „Knock Down“ von STAT3 in NK-Zellen zu einer starken Verringerung der Zytotoxizität führt. Die Wirkung verschiedener Zytokine, wie z.B. IL-18, die unter anderem via STAT3 zu einer Erhöhung der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen führen 305 , dürfte durch einen STAT3-„Knock Down“ ebenfalls eingeschränkt werden. Allerdings konnte in den, mit STAT3 siRNA transfizierten NK-Zellen die Zytotoxizität nicht vollständig unterdrückt werden. Somit scheint der STAT3-Signalweg nicht vollständig unterdrückt worden zu sein oder präformiertes Perforin, bzw. weitere Zytotoxizitätsfaktoren könnten zu dieser Restzytotoxizität geführt haben. Weiterhin könnten andere Signaltransduktionswege ebenfalls die Zytotoxizität von NK-Zellen regulieren. STAT4 und STAT5 könnten dabei eine Rolle spielen 187 . Doch auch STAT1 alpha, das zusammen mit STAT3 durch die Zytokine IL-6 und IL-2 aktiviert werden kann, besitzt die Fähigkeit die Expression von Perforin zu modulieren 304 . Ein weiteres Signaltransduktionsmolekül, STAT6, wird durch IL-13 und IL-4 aktiviert und beeinflusst ebenfalls die Zytotoxizität von NK- und T-Zellen 306 . Allerdings sollte erwähnt werden, dass ein Einfluss von Signaltransduktionsmolekülen auf die Expression von Perforin nicht mit dem Einfuß auf die Zytotoxizität gleichzusetzen ist. Da aber die Zytotoxizität dieser NK-Zellen durch den „Knock Down“ von STAT3 inhibiert wurde, wird deutlich, dass STAT3 sowohl an der Steuerung der Perforinexpression 304, 305, als auch an der Regulation der Zytotoxizität beteiligt ist. 5.7 Funktion und Regulation der Expression von HLA-G in Jeg-3 Zellen HLA-G stellt ein zentrales Molekül der Immuntoleranz sowohl in der Tumor- als auch in der Reproduktionsimmunologie dar. Durch die Expression HLA-G sind fetale Zellen, als auch Tumorzellen in der Lage, sich vor einer Immunantwort, insbesondere vor der zytotoxischen Reaktion von NK-Zellen zu schützen. In dieser Arbeit wurde die Expression von HLA-G und - 75 - Diskussion selektiv von HLA-G1 in Jeg-3 Choriokarzinomzellen unterdrückt. Es wurde gezeigt, dass 24 Stunden nach der Transfektion dieser Zellen mit den siRNA-Oligonukleotiden, die HLA-G Expression geringer ist, als in den Kontrollen. Erwartet wurde, dass die HLA-GKonzentration in den Zellen am geringsten ist, in denen die gesamte HLA-G Expression unterdrückt werden sollte, was allerdings nicht beobachtet werden konnte. Die Western Blots zeigten, dass die Expression von HLA-G in gleichem Maße bzw. durch die HLA-G1 siRNA stärker inhibiert wurde, als durch die HLA-G siRNA. Ursache dafür könnte sein, dass die HLA-G siRNA eine geringere Wirkungsspezifität hat als die HLA-G1 siRNA. Weiterhin wäre es möglich, dass Jeg-3 Zellen verstärkt HLA-G1 exprimieren, so dass kaum Unterschiede in der HLA-G Expression zwischen den siRNA-Oligonukteotiden nach der Transfektion zu detektieren sind. Dem widerspricht, dass die Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber den, mit HLA-G1 siRNA transfizierten Zellen höher ist als gegenüber den mit HLA-G transfizierten Jeg-3 Zellen. Sicher scheint jedoch, dass die Expression von HLA-G Jeg-3 Zellen, als Modell für Trophoblasten, und andere Karzinomzellen vor zytotoxischen Reaktionen von Lymphocyten in vitro als auch in vivo schützt 228 und somit essentiell für eine Etablierung verschiedener Schwangerschaft ist 307, 308 Tumoren und ausschlaggebend für eine erfolgreiche . Interessanterweise wirkt IL-2 auf Trophoblasten, die kein HLA-G produzieren toxisch, während bei HLA-G produzierenden Trophoblasten diese Wirkung ausbleibt 309 . Die Expression von HLA-G kann durch IL-10 induziert werden 116 , was die selben intrazellulären Signaltransduktoren benutzt wie Zytokine der IL-6-Familie 310 . Weiterhin führen IL-6-Type Zytokine, wie LIF oder IL-6, die eine Steigerung der Invasivität von Tumoren und Trophoblasten induzieren, auch zu einer Steigerung der Expression von HLA-G und somit zu einem erhöhten Schutz vor dem Wirts-Immunsystem 261 . Entgegengesetzt betrachtet, kann vermutet werden, dass auch IL-10 die Invasivität von Trophoblasten positiv beeinflusst. Diese Überlegung geht mit der Beobachtung einher, dass Trophoblasten von Patienten mit gestörter Trophoblasteninvasion (Präeklampsie) kein IL-10 produzieren. Somit scheint HLA-G in dem komplexen Mechanismus der Etablierung von Tumorern und der Tumor-Immuntoleranz, sowie in der Reproduktion eine entscheidende Rolle zu spielen. 5.8 Produktion von Zytokinen durch Embryonen Die Implantation des Imbryo, sowie Proliferations- und Invasionsvorgänge von Trophoblasten und Tumorzellen werden unter anderem durch Zytokine gesteuert. Immunmodulierende Substanzen, die vom Embryo bereits während der Wanderung durch die Tuben und vor der - 76 - Diskussion Implantation produziert werden, bereiten das Endometrium und maternale Immunsystem auf die bevorstehende Implantation vor. Dabei sind vor allem Zytokine von Bedeutung, die in mütterlichen T-Zellen eine Th2-Antwort erzeugen, die Anheftung der Blastozyste an das Endometrium positiv beeinflussen, Differenzierungsvorgänge von Trophoblasten und die Expression von weiteren Mediatoren, wie z.B. LIF in umliegenden Geweben induzieren. Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen die Zytokine IL-4, IL-6, IL10, TNF-α und IFN-γ. IL-4, das besonders stark von Embryonen nach erfolgreicher IVF exprimiert wird, beeinflusst vor allem Adhäsionsvorgänge von Lymphozyten 311 , die Funktion von Monozyten 312 reduziert die Zytotoxizität und die Bindung von NK-Zellen an das vaskuläre Epithelium und 313 . In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass humane Embryonen dieses Zytokin relativ konstant exprimieren. Die geringen Abweichungen in der Sekretion von IL-4 lassen auf dessen konstitutive Expression im präimplantativen Embryo schließen. IL-4 induziert zusammen mit IL-6 die Freisetzung von β-hCG in Trophoblasten, was wiederum zu einer Produktion von Progesteron im Corpus Luteum während der Schwangerschaft führt 314, 315 . Dieser Anstieg der Progesteronkonzentration bewirkt synergetisch mit IL-4 die Induktion der Expression von LIF, was essentiell für eine erfolgreiche Implantation und Entwicklung des Embryo ist 316, 317 . Somit ist dieses Zytokin nicht nur für die Induktion einer Th2-Antwort in maternalem T-Zellen verantwortlich, sondern induziert zusammen mit IL-6 Veränderungen im Zytokin- und Hormongleichgewicht der Mutter. Abb 5.1: autokrine Regulation der LIF-Produktion - 77 - Diskussion Die durch IL-4 und IL-6 induzierte LIF-Sekretion des Endometriums beeinflusst jedoch, wie andere Zytokine der IL-6 Typ Familie, die frühen Phasen der Embryogenese nicht 318 . An dieser Stelle sollte erwähnt werden, dass die Infertilität von Frauen in einigen Fällen auf eine Mutation im LIF-Gen zurückgeführt werden kann 319 . Die Kontrolle der LIF Expression und gegebenenfalls eine LIF-Substitution könnte zu einer Erhöhung der Implantationsrate nach IVF führen 320 . IL-6 wurde in dieser Studie von den meisten Embryonen in nahezu gleicher Konzentration produziert. Schon intrafollikulär kann es während der Reifung der Eizelle detektiert werden, was eine wichtige parakrine und autokrine Funktion für das follikuläre „Microenvironment“ vermuten lässt 321 . In der Literatur sind widersprüchliche Angaben bezüglich einer Korrelation zwischen der Sekretion von IL-6 und der Implantationsrate nach dem Embryotransfer zu finden 322, 323 . Es wurde allerdings beobachtet, daß die Embryogröße beträchtlich sinkt, wenn wenig IL-6 vorhanden ist 323 . Bei Mäusen beeinflusst IL-6 die Blastulation und Entwicklung des Embryo positiv; ähnliche Effekte konnten auch bei der Studie von humanen triploiden Embryonen beobachtet werden 324. IL-10 induziert zusammen mit IL-4 als antiinflammatorische Zytokine eine Th2-Antwort in maternalen T-Zellen und erhöht die Resistenz von Trophoblasten gegenüber FAS-vermittelten Apoptosevorgängen 325 . Mit der fortschreitenden Schwangerschaft gewinnt IL-10 an Bedeutung, da es die Expression von HLA-G auf Trophoblasten und Monozyten induziert 116 und somit zur Immunmodulation an der fetomaternalen Grenzfläche beiträgt. Die Bedeutung von IL-10 wird dadurch deutlich, dass Schwangerschaften mit verminderter Trophoblasteninvasion (z.B. Präeklampsie) oft auch mit einer verminderten IL-10 Produktion einhergehen 117 . Auch bei IL-10 gibt es widersprüchliche Angaben über die Expression und den Fertilisierungsprozess 167, 326 . Sicher scheint jedoch, dass nach abgeschlossener Implantation die Expression von IL-10 in der sich bildenden Decidua essentiell für die Etablierung einer Schwangerschaft ist 167, 326 , was eventuell auf die Bedeutung bezüglich der HLA-G Expression zurückzuführen ist. Weiterhin trägt IL-10 zur Steuerung der Trophoblasteninvasion und Differenzierung bei 327 . In dieser Arbeit konnte IL-10, ähnlich wie IL-6, in geringen Mengen, allerdings sehr konstant detektiert werden. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass humane Embryonen große, aber stark schwankende Mengen IFN-γγ produzieren. Die Expression von IFN-γ durch die Blastozyste wirkt positiv auf Implantationsvorgänge 162 und trophektodermale Zellen interagieren durch die Expression dieses Zytokins mit dem Immunsystem der Mutter 328 . Zusammen mit weiteren Zytokinen, wie IL-1, TNF-α, GM-CSF oder CSF-1, scheinen sie die Anlagerung der Blastozyste, deren Implantation, das Auswachsen und die Proliferation der Trophoblasten zu beeinflussen 163 . Weiterhin spielt IFN-γ eine wichtige Rolle in der viralen - 78 - Diskussion Abwehr des Feten 329 . Nebenbei beeinflussen die Zytokine Interferon-α, -β und -γ, sowie TNF-α die Expression von HLA-G und tragen so zur Immunregulation in der Schwangerschaft bei 330, 331 . Es kann vermutet werden, dass die placentaren Interferone zur lokalen Immunmodulation und der Regulation von Zellproliferation und -Differenzierung beitragen 332 , sowie immunregulatorische Effekte auf das Endometrium haben 333 . TNF-α α wird nur in sehr geringen Mengen von der Blastozyste exprimiert und konnte in dieser Arbeit nur in so geringen Konzentrationen detektiert werden, die praktisch unter der Nachweisgrenze liegen. In einer Schwangerschaft ist TNF-α ein wichtiger Regulator des Placentation und Differenzierung, Trophoblasten sowie 333 ein Modulator der maternalen Immunreaktion gegenüber . Da TNF-α einen negativen Einfluss auf die Blastozyste und die Entwicklung der Decidua hat 164, 165 wurde vermutet, dass eine Überexpression dieses Zytokins im Embryo mit dem Ausbleiben der Implantation korreliert. Dies wurde allerdings nicht beobachtet 166 . Die Expression von sHLA-G durch den Embryo stellt ein wichtiges Kriterium für eine erfolgreiche Implantation dar 168-170 . Dabei könnte die sHLA-G-Sekretion einen wichtigen Marker für die Vitalität des Embryo darstellen 334. Eine Mutation im HLA-GGen könnte dabei mit Infertilität und dem Auftreten von Spontanaborten assoziiert sein 171 . In dieser Arbeit konnte retrospektiv kein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Implantationserfolg und der HLA-G-Expression des Embryo beobachtet werden. Dies ist wahrscheinlich auf die geringe Probenzahl und Diversität der Probanden zurückzuführen. So konnte beispielsweise bei einem Embryo, der augenscheinlich als „sehr gut“ eingestuft war, eine sehr hohe sHLA-G Konzentration im Kulturmedium festgestellt werden, obwohl keine Schwangerschaft erfolgte. Bei dieser Patientin scheinen allerdings die endometrialen und hormonellen Voraussetzungen für die ausbleibende Implantation des Embryo ausschlaggebend gewesen zu sein. Weiterhin wiesen drei Embryonen einer Patientin unterschiedlich große Mengen an sHLA-G im Kulturmedium auf. Alle drei Embryonen wurden transplantiert, wobei ein Embryo erfolgreich implantieren konnte. Leider kann hierbei nicht nachvollzogen werden, welcher der drei Embryonen implantierte. Ebenfalls ist es nicht möglich mittels ELISA Punktmutationen im HLA-G-Gen zu detektieren, die eventuell ausschlaggebend für die Wirkungsspezifität des sHLA-G Moleküls sein könnten. 5.9 Xenotransplantation Auf der Suche nach geeigneten Modellen, um reproduktions- und tumorimmunologische Vorgänge zu betrachten, haben sich in vitro Versuchsanordnungen (wie z.B. MatrigelInvasionsassays, Proliferationsassays, u.a.) nur als bedingt geeignet herausgestellt um in vivo - 79 - Diskussion Verhältnisse zu simulieren. Einzelne Mechanismen, wie beispielsweise das Invasionsvermögen von Zellen oder die Proliferation können zwar untersucht werden, jedoch kann eine komplexe immunologische Situation, wie die Implantation einer Blastozyste oder die Etablierung eines Tumors nur bedingt betrachtet werden. Deshalb werden seit den 70er Jahren xenogene Transplantationen von Zellen bzw. Zellverbänden als in-vivo-Modell durchgeführt 335-337 und somit beispielsweise Hormone, Wachstumsfaktoren und andere immunregulatorische Substanzen analysiert, die vom transplantierten Gewebe produziert werden 230, 231 . Auf diese Weise konnten Morphologie, Angiogenese, Invasivität und Malignität von Tumoren in vivo untersucht und neue Therapieansätze erprobt werden 232-236. In dieser Arbeit sollte das Wachstums- und Invasionsverhalten humaner Trophoblasten unterschiedlicher Schwangerschaftsstadien (5.SSW, 10.SSW, 40.SSW) untersucht werden. In vorangegangenen Studien wurde gezeigt, dass alymphoide (SCID-) Mäuse für die Transplantation humaner Trophoblasten 338 und weiterer xenogener Gewebe 239, 240, sowie für die Beantwortung anderer Fragestellungen der Reproduktionsbiologie 135, 339-341 geeignet sind. Ein experimenteller Teil dieser Arbeit beinhaltete die xenogene Transplantation von humanen Trophoblastzellen unter die Nierenkapsel von SCID-Mäusen, in denen eine Proliferation und oft eine Differenzierung der Trophoblasten beobachtet werden konnte. Ähnlich wie bei der subkutanen Xenotransplantation von Jeg-3 Zellen, konnte β-HCG im Mausserum nachgewiesen werden 227, wobei Trophoblastzellen der 10.SSW mehr β-hCG produzierten als jene der 5.SSW. Auch die hormonellen Auswirkungen dieser β-HCG Produktion (blutgefüllte Ovarien, geschwollene Uteri) konnten in ähnlicher Weise beobachtet werden, wie nach der Transplantation von Jeg-3 Zellen. Da die Invasivität 89 115 und Migration von Zytotrophoblasten , die Collagenaseaktivität und Induktoren für MMPs durch β-hCG inhibiert werden 115 , könnte eine mögliche Funktion dieser β-hCG Produktion die autokrine Wachstumskontrolle der Trophoblasten sein, bei der ab einem bestimmten β-HCG Level die Invasion gestoppt wird. Auf Grund der Beobachtung, dass Trophoblasten der 5.SSW erheblich weniger β-HCG produzierten als die der 10.SSW, könnte vermutet werden, dass die β-HCG-Expression erst nach einer gewissen Entwicklungszeit des Embryo und der Placenta beginnt bzw. verstärkt wird. Möglicherweise gibt es weitere Unterschiede in der Zytokinproduktion dieser Trophoblasten und autokrinen Regulationsmechanismen, die davon beeinflusst werden. Wahrscheinlich wird durch die hormonellen Veränderungen in den Versuchstieren, induziert durch die Transplantate, die Produktion von Zytokinen beeinflusst. So konnte beobachtet werden, dass in Schafen durch eine β-HCG-Stimulierung die LIF-Expression im Endometrium induziert werden konnte 342 . Dies würde auch erklären, warum Trophoblasten - 80 - Diskussion der 10.SSW bei einer sehr hohen β-HCG-Expression invasiver sind als die der 5.SSW. In diesem Experiment konnte ebenfalls die Differenzierung von Zytotrophoblasten in Syncytiotrophoblasten, sowie die Entwicklung von Blutgefäßen beobachtet werden. Die für diese Vorgänge nötigen Regulationsmoleküle und Zytokine könnten entweder durch die Trophoblasten selbst oder ebenfalls durch die Wirtstiere synthetisiert worden sein. Die Beobachtung fetaler Erythrozyten in den histologischen Schnitten ist wahrscheinlich auf die Verunreinigung der Trophoblastentransplantate mit pluripotenten Stammzellen oder anderen Erythrozyten-Vorläuferzellen zurückzuführen. Eine weitere Erkenntnis war, dass auch immunkompetente Mäuse (C57Bl/6J) für die Transplantation und Kultur von humanen Trophoblastzellen geeignet sind. Es scheint verwunderlich, dass nach der Transplantation in diese Mäuse keine erfolgreichen Immunreaktionen gegen die Transplantate beobachtet werden konnten, doch auch andere Studien zeigen, dass xenogene Zellen, die HLA-G produzieren, nicht vom Wirtsimmunsystem erkannt und abgestoßen werden 227, 228 . Interessanterweise führt auch die Injektion von Jeg-3 in vitro Kulturüberständen zu einer Unterdrückung der Immunantwort gegenüber xenotransplantierten, allogenen Zellen 229 . Wahrscheinlich führt unter anderem die lösliche Form von HLA-G (sHLA-G) in diesen Überständen zu den beobachteten Effekten. HLA-G, das von Burt et.al. als Grund für diese Beobachtungen und essentiell für die feto-maternale Immunsuppression beschrieben 228 wurde , bezeichnete Horuzsko et.al. als Transplantationsantigen 343. Tatsächlich ist HLA-G einer der ausschlaggebenden Faktoren für eine erfolgreiche Immunsuppression nach Organtransplantationen. Wie schon beschrieben, wird die Funktion von HLA-G als Transplantationsantigen auch von verschiedenen Tumoren 179 und semiallogenen Trophoblastzellen genutzt 174, 344. Dabei wird die Expression von HLA- G in stark invasiven Jeg-3 Choriokarzinomzellen durch LIF verstärkt, so dass durch die Hormonproduktion der Trophoblasten und die damit verbundene LIF-Produktion des Endometriums, der Schutz vor dem Immunsystem des Wirtstieres verstärkt wird. Dabei wurden die proliferierenden und sich differenzierenden Trophoblastzellen in immundefizienten Mäusen in ihrer Entwicklung maßgeblich durch die Injektion von Plasma aus Patienten mit Symptomen von Präeklampsie negativ beeinflusst. Diese Beobachtung wird durch Studien von Neale et.al. bestätigt, in denen die Proliferation in Trophoblastkulturen in vitro durch Zugabe von Serum aus Patienten mit Präeklampsie gehemmt wurde 345 . Eine weitere Wirkung der Serumzugabe war die Induktion der Apoptose in diesen Zellen 346 . Ursächlich dafür scheint allerdings weniger eine spezielle Substanz im Serum der Patienten, als ein verändertes Verhältnis vieler regulatorischer Substanzen und Zytokine zu sein. - 81 - Diskussion Dieses Experiment zeigt das Potenzial der Xenotransplantation, Zellen in vivo zu kultivieren und in ihrem Wachstum, Proliferation und Differenzierung zu beeinflussen. Durch diese in vivo Studien können weitere Erkenntnisse über die Ursachen von Krankheiten wie zum Beispiel Präeklampsie gewonnen, sowie Vorgänge der frühen Schwangerschaft simuliert werden. Weiterhin würden diese Experimente zum grundsätzlichen Verständnis der Tumorimmunologie und -entstehung beitragen. 5.10 Ausblick In weiterführenden Experimenten könnte durch den „Knock Down“ von Regulatormolekülen, die den JAK/STAT Signaltransduktionsweg beeinflußen, die Steuerung der Invasivität von Trophoblast- und Tumorzellen näher betrachtet werden. Auf diese Weise würden beispielsweise die Funktion und Wirkungsweise von ERK- oder mTOR- Molekülen in der Regulation dieses Prozesses näher erklärt. Im Mausmodell könnten Mechanismen beobachtet werden, die zur Induktion der Invasion von Trophoblastzellen zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Embryogenese und Tumorzellen führen. Diese Beobachtungen würden Aufschluss über die Entstehung von Tumoren und deren Behandlung geben. Weiterhin könnten nähere Kenntnisse über die Vorgänge in der frühen Schwangerschaft dazu beitragen, die Implantationsrate nach in vitro Fertilisationsn zu steigern und die Abortrate zu senken. In weiterführenden Xenotransplantationsstudien könnten die Funktionen von intrazellulären Signalübertragungsmolekülen und deren Regulatoren in Trophoblastzellen bezüglich der Invasivität, Placentation und Zytokin- bzw. Hormonproduktion untersucht werden. Außerdem wären diese in vivo Experimente dazu geeignet, Stoffe zu untersuchen, die einen Einfluss auf das Wachstum und die Differenzierung von Trophoblasten haben, um so Mechanismen und Vorgänge bei Krankheiten mit reduzierter Trophoblasteninvasion zu erklären. Dabei könnten in vivo ebenfalls die Wirkung von Medikamenten untersucht werden. Durch den selektiven „Knock Down“ verschiedener Isoformen von HLA-G, gefolgt von der Xenotransplantation in immunkompetente Mäuse könnte untersucht werden, ob Abstoßungsreaktionen der Transplantate auftreten, um so herauszufinden, ob die einzelnen Isoformen ähnliche immunsuppressive Wirkungen haben. Dadurch wäre es möglich herauszufinden, in wieweit eine Punktmutation in dem HLA-G-Gen den Schutz eines Embryo vor dem maternalen Immunsystem und somit die Etablierung einer Schwangerschaft beeinflusst. Durch diese Experimente könnten weitere Erkenntnisse zum Verständnis der besonderen immunologischen Situation der Schwangeschaft erlangt immunologische Therapien von Tumoren erprobt werden. - 82 - und neue Ansätze für Zusammenfassung 6. Zusammenfassung Hintergrund: Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Interaktion von NK-Zellen und Trophoblastzellen, die fetal und somit aus immunologischer Sicht der Mutter semiallogenen sind. Durch die Expression von HLA-G schützen sich Trophoblast-, aber auch Tumorzellen vor einer zytotoxischen Reaktion von NK-Zellen. Die Invasion von Trophoblastzellen wird durch Zytokine und Hormone räumlich und zeitlich reguliert und verringert sich mit fortschreitender Schwangerschaft. Bei der Regulation der Invasion von Trophoblast- und Tumorzellen spielen „Signal Transducer and Activator of Transcription“ (STATs) eine entscheidende Rolle. STAT3-Signale sind für eine erfolgreiche Schwangerschaft essentiell und korrelieren bei Tumoren mit deren Invasivität. STAT6-Signale stehen in Verbindung mit der Malignität, Proliferation und transkriptionellen Aktivierung von IL-6 in Tumoren. Von NK-Zellen und anderen Lymphozyten sezernierte Zytokine der IL-6 Familie steigern die Invasivität verschiedener Tumoren. „Suppressors of Cytokine Signalling“ (SOCS) regulieren STAT-Signale negativ und tragen somit zur Steuerung der genannten Vorgänge bei. Zielstellung: In dieser Arbeit soll die Regulation der Invasion von Trophoblast- und Karzinomzellen, sowie die Regulation der NK-Zell-Antwort an der feto-maternalen Grenzfläche näher betrachtet werden. Weiterhin soll eine in vivo Kulturmethode humaner Trophoblastzellen in der Maus etabliert werden. Methoden: Mittels PAGE und Western Blot wurde untersucht, welche Zytokine eine Phosphorylierung von STAT3 in Jeg-3 Choriokarzinomzellen induzieren. In Trophoblastzellen sowie in Zellinien ist mittels siRNA die Expression STAT3, STAT6, SOCS3 unterdrückt worden („Knock Down“). Die Funktionen dieser Moleküle wurde in Apoptose-, Invasions- und Proliferationsassays untersucht. Dem „Knock Down“ von HLA-G und HLA-G1 in Jeg-3 Zellen, sowie dem „Knock Down“ von STAT3 in dezidualen NKZellen folgten Zytotoxizitätsassays. Mittels ELISA und Cytometric Bead Arrays wurde die Konzentration von Zytokinen und löslichem HLA-G (sHLA-G) in humanen Embryokulturüberständen analysiert. Humane Trophoblastzellen wurden unter die Nierenkapsel immundefizienter und -kompetenter Mäuse transplantiert, gefolgt von histologischen Analysen. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass LIF eine starke Phosphorylierung von STAT3 in Jeg-3 Zellen induziert, während IL-6, IGF-2 und HGF nur einen geringen bzw. keinen Einfluss haben. LIF erhöht die Invasivität von Trophoblast- und Jeg-3 Zellen. Diese Wirkung bleibt nach dem „Knock Down“ von STAT3 aus. IL-6 führt ebenfalls zu einer leichten Erhöhung der Invasivität und Proliferation in Jeg-3 Zellen, was nach dem „Knock Down“ von - 83 - Zusammenfassung STAT3 nicht mehr beobachtet werden kann. Diese Beobachtungen sind nicht auf die Induktion von Apoptose zurückzuführen. Nach dem „Knock Down“ von SOCS3 induziert IL6 eine starke Phosphorylierung von STAT3. Die IL-4-Stimulierung von Jeg-3 Zellen sowie der „Knock Down“ von STAT6 haben keinen Einfluss auf deren Invasivität. Die durch IL-4 induzierte Proliferation dieser Zellen kann allerdings durch den STAT6 „Knock Down“ inhibiert werden. Humane Trophoblastzellen können erfolgreich unter die Nierenkapsel immundefizienter und -kompetenter Mäuse transplantiert und für bis zu 68 Tage kultiviert werden. Dabei können Differenzierungsvorgänge beobachtet werden. Die Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber Jeg-3 Zellen wird durch eine Verringerung der HLA-G bzw. HLA-G1 Expression erhöht. In dezidualen NK-Zellen wird die Zytotoxizität unter anderem durch STAT3 reguliert. Ein „Knock Down“ von STAT3 führt zu einer verminderten Zytotoxizität gegenüber Zielzellen. Humane Embryonen sezernieren in vitro die Zytokine IL-4, IL-6, IL10, IFN-γ und sHLA-G in unterschiedlichen Konzentrationen. Schlußfolgerung: LIF steuert via STAT3 die Proliferation und Invasion von Trophoblastzellen und ist für eine erfolgreiche Etablierung und den Erhalt einer Schwangerschaft essentiell. Es stimuliert die Expression von HLA-G, welches in die fetomaternale Immuntoleranz involviert ist. Trophoblast- und Jeg-3 Zellen schützen sich durch die Expression verschiedener Isoformen von HLA-G vor der zytotoxischen Reaktion von NKZellen. HLA-G wird dafür mitverantwortlich sein, dass Trophoblastzellen nach der Xenotransplantation in immunkompetente Mäuse nicht vom Wirtsimmunsystem erkannt und abgestoßen werden. Die durch die Zytokine LIF und IL-6, die das gleiche Rezeptormolekül (gp130) benutzen, induzierte Signalkaskade wird in Jeg-3 und Trophoblastzellen durch SOCS3 negativ reguliert. STAT6, das von IL-4 aktiviert wird und die Malignität verschiedener Karzinomzellen, sowie die transkriptionelle Aktivierung von IL-6 beeinflusst, ist ebenfalls an der Regulation der Proliferation von Jeg-3 Zellen beteiligt. Durch die Produktion eines speziellen Zytokinprofils und sHLA-G bereitet der Embryo das maternale Immunsystem auf die Implantation und Invasion vor. Die Implantation des Embryo und Placentation, verbunden mit der Invasion von Trophoblastzellen, sind streng regulierte Prozesse mit Parallelen zur Tumorgenese. Weitere Erkenntnisse über diese Mechanismen könnten helfen Frühgeburts- und Abortbestrebungen entgegen zu wirken und Tumore zu behandeln. - 84 - Literaturverzeichnis 7. Literaturverzeichnis 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. NOLTE D. [Physiological and pathological aspects of the immune reactions (author's transl)]. Prax Klin Pneumol 1979;33 Suppl 1:260-7. GOUDSWAARD J. [Immunology and interferons (author's transl)]. Tijdschr Diergeneeskd 1982;107:174-85. GAVILONDO JV, LARRICK JW. Antibody engineering at the millennium. Biotechniques 2000;29:128-32, 134-6, 138 passim. TAUBER AI. The birth of immunology. III. The fate of the phagocytosis theory. Cell Immunol 1992;139:505-30. LAFFERTY KJ, GILL RG. The maintenance of self-tolerance. Immunol Cell Biol 1993;71 ( Pt 3):209-14. 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Wolfgang Starker, Frau Dr. Ines Hoppe, Anja Keil, Susann Busch, Sandra Voigt, Justine Fitzgerald, Dr. Tobias Wengenmayer und Susann Salzmann genannt sein. - Bei dem Ärzte- und Schwesternteam des Kreissaals. - Bei Herrn Dr. Wolfgang Michels für die Unterstützung in statistischen Fragen. - Bei Frau Dr. Anne Croy und Herrn Dr. Chandrakant Tayade für die Zusammenarbeit und die Unterstützung während meines Forschungsaufenthaltes am Ontario Veterinary College der University of Guelph, Canada. - Der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, dem Boehringer Ingelheim Fonds, sowie der Aventis-Stiftung für die gewährten Reisekostenunterstützungen. - Bei meinen Eltern, Verwandten und Freunden für die vielseitige Unterstützung, Aufmunterungen und den Rückhalt in jeglicher Hinsicht. Publikationsliste Publikationsliste Wissenschaftliche Publikationen Poehlmann TG, Fitzgerald JS, Meissner A, Wengenmayer T, Schleussner E, Friedrich K, Markert UR Trophoblast invasion: Tuning through LIF, signalling via Stat3 Placenta (in press) Poehlmann TG, Busch S, Mussil B, Winzer H, Weinert J, Mebes I, Schaumann A, Fitzgerald JS, Markert UR. The Jak/Stat pathway in lymphocytes at the fetomaternal interface. Chem Immunol Allergy (in press). Fitzgerald JS, Wengenmayer T, Poehlmann TG, Markert UR. Intracellular signals in invading trophoblast cells. Chem Immunol Allergy (in press). Fitzgerald JS, Tsareva SA, Berod L, Poehlmann TG, Corvinus FM, Wiederanders B, Friedrich K, Markert UR Leukemia Inhibitory Factor (LIF) triggers STAT3 activation, proliferation and altered protease expression in Jeg-3 choriocarcinoma cells. Int J Biochem Cel Biol (in press) Wengenmayer T, Poehlmann TG, Markert UR. Inhibition of HLA-G production in JEG-3 choriocarcinoma cells by RNA interference (RNAi). Am J Reprod Immunol 2004; 51: 189-191. Poehlmann TG, Bashar S, Markert UR, Caniggia I, Croy BA, Tayade C. Human trophoblast allotransplants in alymphoid mice. Placenta 2004; 25: 357-358 Gutiérrez G, Fitzgerald JS, Poehlmann TG, Hoppe I, Markert UR Comparative effects of Tryptophan and Methyl-Tryptophan on immunoregulation induced by sperm, human preimplantation embryo and trophoblast supernatants. Am J Reprod Immunol. 2003; 50 (4): 309-315. Fitzgerald JS, Storl F, Busch S, Poehlmann TG, Markert UR. Th1-Th2 shift induced by trophoblast: Regulation at the Jak/Stat signal transduction level and dependency of tryptophan catabolism. Am J Reprod Immunol (revisions requested). Poehlmann TG, Schaumann A, Le Bouteiller P, Markert UR. Effects of HLA-G1s on decidual NK cells. (In preparation) Publikationsliste Reisekostenunterstützungen/Awards New Investigator Award Fitzgerald JS, Corvinus F, Berod L, Poehlmann TG, Friedrich K, Markert UR. Leukemia Inhibitory Factor Induces Stat3 DNA-Binding Activity in Jeg-3 Choriocarcinoma Cells 23rd Annual Meeting of the ASRI, June 18-21, 2003, Yale, USA Travel Award for Outstanding Presentation Pöhlmann TG, Schaumann A, Fitzgerald JS, Maryse Aguerre-Girr, Le Bouteiller P, Markert UR Effects of soluble HLA-G1 on human decidual natural killer cells 23rd Annual Meeting of the ASRI, June 18-21, 2003, Yale, USA Best Poster Award Poehlmann TG, Bashar S, Markert UR, Caniggia I, Croy BA, Tayade C. Human trophoblast allotransplants in alymphoid mice. Southern Ontario Reproductive Biology Meeting, April 2003, Kingston, Canada. Poster presentation. Best Abstract Award TG Poehlmann, A Schaumann, P Le Bouteiller, UR Markert HLA-G1s downregulates perforin mediated decidual NK cell killing activity via Stat3 suppression. 12th International Congress of Immunology, July 2004, Montreal, Canada Y.W. Loke New Investigator Travel Award T.G. Poehlmann, A. Meissner, T. Wengenmayer, E. Schleussner, K. Friedrich, U.R. Markert STAT3 regulates invasion of Jeg-3 choriocarcinoma and trophoblast cells Placenta Conference September, 2004 Asilomar, CA, USA Boehringer Ingelheim Stipendium Für dreimonatigen Studienaufenthalt am Ontario Veterinary College im Labor von Frau Dr. Anne Croy in Guelph, Ontario, Canada Aventis iLab Award Reisekostenunterstützung für Teilnahme an der “Placenta Conference”, September 2004 in Asilomar, CA, USA Deutschen Gesellschaft für Immunologie Reisekostenunterstützung für die Teilnahme an dem Workshop „Frontiers in Reproduction“ am Marine Biological Laboratory, May 2005 Lebenslauf Lebenslauf Name: Pöhlmann Vorname: Tobias Adresse: Gellertstraße 2a, 08065 Zwickau Geburtsdatum: 29.08.1978 Geburtsort: Zwickau Schulbildung: 1985-1991: Polytechnische Oberschule “Friedrich Engels” Zwickau 1991-1997: “Käthe Kollwitz” Gymnasium 1997 Abitur Grundwehrdienst: Oktober 1997- Juli 1998 Bundeswehr (Heeresmusikkorps 13, Erfurt) Studium: Biologie Diplom 1998-2003 an der Friedrich-Schiller-Universität Jena -Oktober 2000 Vordiplom -April 2003 Diplom Auslandsaufenthalte: -Februar 2003 bis Mai 2003 Arbeit im Ontario Veterinary College, Guelph, Ontario, Canada -Juni 2003 Immunology Workshop, Yale University, New Haven, USA derzeitige Tätigkeit: Wissenschaftlicher Mitarbeiter und Doktorand im Placentalabor des Klinikums der FSU Jena Jena, den 28.04.2005 _____________________ Ehrenwörtliche Erklährung Ehrenwörtliche Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Benutzung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe. Dies ist geschehen im Rahmen der Promotionsordnung der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der Friedrich-SchillerUniversität Jena. Die vorliegende Arbeit wurde noch nicht als Prüfungsarbeit, bzw. als Dissertation an einer anderen Hochschule eingereicht. ____________________ Jena, 28.04.2005
