Hochgeladen von Manuel Gundlach

Pöhlmann-Dissertation

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Interaktion von Trophoblast- und natürlichen Killerzellen
an der feto-maternalen Grenzfläche
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena
von Tobias Pöhlmann
geboren am 29.08.1978 in Zwickau
28.04.2005
Gutachter:
PD. Dr. Markert
Prof. Dr. Liebmann
Prof. Dr. Koldovsky
Datum der Verteidigung:
28.11.2005
“Die Mitte der Nacht ist auch schon der Anfang eines neuen Tages.”
Johannes Paul II. (1920-2005)
“Das Schönste, was wir entdecken können, ist das Geheimnisvolle.”
Albert Einstein (1879-1955)
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
CA
ECM
EGF
ELISA
GATA
GM-CSF
hCG
HLA
HGF
IDO
IFN-γ
IGF-II
IL
ITAM
ITIM
IVF
JAK
KIR
LECAM-1
LGL
LIF
MHC
NCAM
MIP
MMP
NCR
NK-Zellen
PBNK
p.c.
PIAS
PLC
SCID
SSW
STAT
TGF
TIMP
TNF-α
VCAM
VEGF
Cancer Antigen
Extracellular Matrix
Epidermal Growth Factor
Enzyme Linked Immusorband Assay
Transkriptionsfaktor u.a.
Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor
Human Chorionic Gonadotropin
Human Leucocyte Antigene
Hepatocyte Growth Factor
Indoleamin 2,3-Dioxygenase
Interferon-γ
Insulin-like Growth Factor II
Interleukin
Immunoreceptor-Tyrosin-based-Activation Motive
Immunoreceptor Tyrosine based Inhibitory Motifs
In vitro Fertilisation
Januskinase
Human Killer Immunoglobulin-like Receptor
Leukocyte Endothelial Cell Adhesion Molecule-1
Large Granular Lymphocytes
Leukhemia Inhibitory Factor
Major Histocompatibility Complex
Neural Cell Adhesion Molecule
Macrophage-Inflammatory Protein
Matrix-Metalloproteinase
Natural Cytotoxity Triggering Receptor
Natural Killercells
NK-Zellen des periphären Blutes
postcoitus
Protein Inhibitor of Activated STATs
Phospholipase C
Serve Combined Immunodeficiency
Schwangerschaftswoche
Signal Transducer and Activator of Transcription
Transforming Growth Factor
Tissue Inhibitor of Metalloproeinases
Tumor Nekrose Faktor-α
Vascular Cell Adhesion Molecule
Vascular Endothelial Growth Factor
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
................................................................................................ 1
Das Immunologie im Allgemeinen
1.1 Das Immunsystem
................................................................................ 2
1.2 Das MHC-System
................................................................................ 3
1.3 Natürliche Killerzellen
................................................................................. 4
1.4 NK-Zell Rezeptoren, Aktivierung und Inhibition
................................. 6
1.5 Bewegung, Homing und Migration von NK-Zellen
................................. 8
1.6 Intrazelluläre Jak/STAT Signaltransduktion in Lymphozyten ....................... 8
Die Reproduktionsimmunologie
1.7 Trophoblasten, Entwicklung der Placenta
............................................. 10
1.8 Steuerung des Trophoblastenwachstums, Invasion und Migration
1.9 MHC-Expression in der Placenta
.......... 11
......................................................... 14
1.10 Immunzellen, Hormone und Enzyme in der Placenta ................................. 15
1.11 Produktion immunregulatorischer Substanzen im präimplantativen Embryo 18
1.12 HLA-G und sHLA-G Expression von Tumoren
.................................. 19
1.13 Regulation der Signaltransduktion in Immunzellen während
der Schwangerschaft
.............................................................................. 19
1.14 STAT3 und STAT6 in Trophoblastzellen
............................................ 21
1.15 STATs und Apoptose in Tumorzellen
............................................ 22
1.16 Xenogene Schwangerschaften, Xenotransplantation ................................. 23
2. Ziele dieser Arbeit
..................................................................................... 25
3. Material und Methoden
............................................................... 27
3.1 Biologische Materialien ................................................................................ 27
3.2 Geräte und Reagenzien ................................................................................. 28
3.3 Übersicht der in vitro Versuche .................................................................... 31
3.4 Methoden
............................................................................................ 32
3.4.1 Isolierung von Primärzellen
......................................................... 32
Isolierung von Trophoblastzellen
Isolierung von NK-Zellen
..................... 32
................................. 33
3.4.2 Transfektion von Zellen mit “small interfering RNA” (siRNA) .... 34
Inhaltsverzeichnis
3.4.3 Funktionelle Analysemethoden ...................................................... 35
Proliferationsassay
.................................................................... 35
Invasionsassay ............................................................................. 36
Untersuchung des Apoptoseverhaltens von Zellen ..................... 36
PAGE und Western Blot
Zytotoxizitätsassay
......................................................... 36
.................................................................... 38
Durchflusszytometrie .................................................................... 38
Zytokin-Bestimmung .................................................................... 38
Nachweis von sHLA-G in Embryokulturüberständen ................. 39
3.4.4 Xenotransplantation von humanen Trophoblastzellen in
RAG-2null/γcnull und C57BL/6J Mäuse
Haltung der Versuchstiere
................................. 40
......................................................... 40
Genotypisierung der Versuchstiere ............................................. 40
Präparation des humanen Deciduagewebes zur Transplantation... 41
Transplantation
..................................................................... 41
Versuchsschema
..................................................................... 42
Gewebe- und Blutentnahme ......................................................... 42
Histologie
................................................................................. 42
Enzyme Linked Immunosorband Assay (ELISA)
3.5 Statistik
........................................................................................................ 43
3.6 Darstellung der Ergebnisse
4. Ergebnisse
..................... 43
..................................................................... 43
................................................................................................ 44
4.1 Einfluss der Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF auf die STAT3Phosphorylierung in Jeg-3 Zellen
...................................................... 44
4.2 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von HT-29 Zellen ..........
46
4.3 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von Jeg-3 Zellen ............
48
4.4 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von Trophoblastzellen ...
49
4.5 Einfluss von SOCS3 auf die Phosphorylierung von STAT3 in Jeg-3 Zellen
52
4.6 Einfluss von STAT3 und SOCS3 auf die Proliferation von Jeg-3 Zellen ..... 52
4.7 Einfluss von STAT3 auf das Apoptoseverhalten von Trophoblastzellen .....
53
4.8 Einfluss von STAT6 auf das Invasionsverhalten und die Proliferation
von Jeg-3 Zellen ........................................................................................ 54
4.9 “Knock Down” von HLA-G und HLA-G1 in Jeg-3 Zellen
.................... 56
Inhaltsverzeichnis
4.10 Einfluss von HLA-G und HLA-G1 in Jeg-3 Zellen bezüglich der
Zytotoxizität von NK-Zellen
................................................................... 57
4.11 Einfluss von STAT3 auf die Zytotoxizität von dezidualen NK-Zellen ...... 58
4.12 Zytokinproduktion humaner Embryonen
............................................ 59
4.13 In vivo Kultivierung humaner Trophoblastzellen; Xenotransplantation ..... 61
5. Diskussion
................................................................................................ 69
5.1 Untersuchung der Phosphorylierung von STAT3, induziert durch die
Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF
......................................................... 69
5.2 Einfluss von LIF, SOCS3 und STAT3 bezüglich der Proliferation von
Jeg-3 Zellen
............................................................................................ 72
5.3 Die Rolle von STAT3 bezüglich der Invasivität von Karzinom- und
Trophoblastzellen
................................................................................ 72
5.4 Einfuß von STAT3 auf die Induktion von Apoptose in Trophoblastzellen .... 73
5.5 Die Rolle von STAT6 bezüglich der Invasivität und Proliferation von
Jeg-3 und Trophoblastzellen
.................................................................... 74
5.6 Die Rolle von STAT3 bezüglich der Zytotoxizität von NK-Zellen
......... 75
5.7 Funktion und Regulation der Expression von HLA-G in Jeg-3 Zellen ........ 75
5.8 Produktion von Zytokinen durch Embryonen ............................................... 76
5.9 Xenotransplantation ……………………………......................................... 79
5.10. Ausblick
.................................................................................................. 82
6. Zusammenfassung
.................................................................................... 83
7. Literaturverzeichnis
.................................................................................... 85
Danksagung
Publikationsliste
Lebenslauf
Ehrenwörtliche Erklärung
Einleitung
1. Einleitung
Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit einem Teilgebiet der Immunologie - der
Reproduktionsimmunologie. Ziel dieses Zweiges ist die Untersuchung der Mechanismen
immunologischer Vorgänge zwischen Mutter und Kind während einer Schwangerschaft.
Desweiteren stehen klinische Fragen, wie die immunologisch bedingte Sterilität, die in vitro
Fertilisation (IVF), Entwicklungsstörungen in der Placentation, sowie die Molenbildung und
die Entstehung von Choriokarzinomen im Mittelpunkt. Mutter und Kind, die auf den ersten
Blick nah verwandt sind, erscheinen aus immunologischer Sicht jedoch so verschieden, daß
eine gegenseitige Organtransplantation nicht ohne begleitende immunsuppressive Therapie
möglich ist. Da das Kind bzw. der sich entwickelnde Fetus zur Hälfte die genetische
Information des Vaters trägt, wird er auch als halb- oder semiallogen gegenüber der Mutter
bezeichnet. Aus dieser immunologischen Fremdartigkeit des Fetus ergibt sich die Frage,
weshalb die Mutter den Fetus während der Schwangerschaft toleriert?
Die Entwicklung eines Kindes von der Befruchtung der Eizelle, über die Implantation der
Blastozyste, der intrauterinen Reifung, bis über den Zeitpunkt der Geburt hinaus ist ein
besonderer immunologischer Vorgang. Bereits das Eindringen der, für die Mutter, allogenen
Spermien durch die Vagina, den Uterus und die Tuben geschieht normalerweise problemlos,
obwohl die Schleimhäute dieser Organe über ein hoch effizientes, lokales Immunsystem
verfügen und ständig auf Keime reagieren. Nach der Befruchtung der Eizelle und dem
Durchlaufen verschiedener Stadien (Morula, Blastula, u.a.) polarisieren sich eine innere
Zellmasse, der Embryoblast und eine äußere Zellmasse, der Trophoblast heraus. Während
sich aus dem Embryoblast alle zellulären Anteile für den Embryo bilden, entwickelt sich aus
dem Trophoblast die Placenta. Kindliche, der Mutter semiallogene Trophoblastzellen
proliferieren sehr stark, invadieren in mütterliches Gewebe ein und beginnen sich zu
differenzieren, wobei aus Zytotrophoblasten durch Fusion Syncytiotrophoblasten entstehen.
Diese Trophoblasten wachsen infiltrativ in das Uterusepithel ein, invadieren mütterliche
Blutgefäße und kleiden sie aus. Aufgabe der Placenta ist der bidirektionale Stoffaustausch
zwischen Fetus und Mutter, wobei allerdings die beiden Blutkreisläufe voneinander getrennt
bleiben. Die fetalen Trophoblastzellen, die sowohl im Uterusgewebe, als auch in den
invadierten Blutgefäßen in direkten Kontakt mit mütterlichen Immunzellen kommen, werden
dabei durch das maternale Immunsystem nicht nur toleriert, sondern es findet eine enge
immunologische Kommunikation zwischen der Mutter und dem sich entwickelnden Kind
statt. Durch die Produktion von Zytokinen und Hormonen, durch mütterliche als auch fetale
Zellen, wird die Trophoblasteninvasion kontrolliert und bei einer bestimmten Invasionstiefe
-1-
Einleitung
gestoppt. Störungen in dieser Wachstumskontrolle können zu einer verminderten Placentation
oder zu einer ungehinderten Invasion der Trophoblasten, einer sogenannten hydativen Mole
führen. Bei einer ungehinderten Invasion von Trophoblastzellen besteht die Gefahr, daß sich
diese Trophoblasten zu malignen Zellen, den Choriokarzinomzellen entwickeln und
Metastasen bilden. Für die Entwicklung der Placenta und des Fetus ist es also essentiell, daß
die Placentation streng reguliert wird und eine lokale Immunsuppression stattfindet. Zum
besseren Verständnis der Immunologie der Placenta wird zunächst kurz auf die Immunologie
im Allgemeinen und später speziell auf reproduktionsimmunologische Vorgänge und die
Steuerung der Invasion von Trophoblasten eingegangen.
1.1 Das Immunsystem
Das Immunsystem des Menschen besteht aus einem spezifischen, erworbenen Immunsystem
und dem unspezifischen Komplementsystem. Während das Komplementsystem durch
Enzyme und andere Proteine die Zerstörung der Membranen von Bakterien in der Blutbahn
bewirkt, ist das spezifische Immunsystem für eine gezielte Reaktion auf das Eindringen von
Bakterien und Viren verantwortlich. Antikörper, die von Schibasaburo Kitasato und Emil von
Behring entdeckt wurden, heften sich an Krankheitserreger
1-4
, so dass diese entweder durch
die Aktivierung von Enzymen des Komplementsystems bekämpft oder durch Makrophagen
erkannt,
phagozytiert
und
lysiert
werden
(antikörpervermittelte
oder
humorale
Immunantwort).
Antikörper kommen ebenfalls auf der Oberfläche von Immunzellen, den Lymphozyten 5 vor
und dienen als Rezeptoren, die bei Kontakt mit einem Antigen die Produktion und Sekretion
von spezifischen Antikörpern auf dieses Antigen induzieren 6.
Die zwei genannten immunologischen Systeme bieten aber keinen ausreichenden Schutz vor
Erregern, wie zum Beispiel denen der Tuberkulose oder Viren, die sehr schnell in das Innere
von Wirtszellen eindringen. Die Komponenten der zellvermittelten Immunantwort, die
Lymphozyten, erkennen infizierte oder dem Körper fremde Zellen und bekämpfen sie. Sie
werden im Knochenmark und der Thymusdrüse gebildet und differenzieren sich in zwei
unterschiedliche Arten, den B- und T-Zellen 7. Die B-Zellen spielen durch die Erkennung von
Antigenen und der Produktion von Antikörpern die Hauptrolle in der humoralen
Immunantwort; die T-Zellen stellen die zellvermittelte Immunität dar. Sie tragen Rezeptoren
auf Ihrer Oberfläche und erkennen 8 bis 15 Aminosäuren kurze Teilstücke, die von dem
Haupt-Histokompatibilitätskomplex (engl.: major histocompatibility complex, MHC) auf
Körperzellen präsentiert werden.
-2-
Einleitung
Wenn ein Virus in eine Zelle dringt und sich dort vermehrt, werden von der Wirtszelle virale
Antigene über den MHC-Komplex präsentiert, T-Zellen töten die Wirtszelle ab und eine
Vermehrung des Erregers wird verhindert. T-Zellen reagieren auch auf Zellen mit
fremdartiger MHC-Struktur, was vor allem in der Transplantations-, Reproduktions- und
Tumorimmunologie von Bedeutung ist. Bei einer Reaktion von T-Zellen werden Interleukine
sezerniert, welche die Produktion von Antikörpern durch B-Zellen aktivieren oder hemmen
können 8. Durch den Abbau dieser Interleukine und der Präsentation der Abbauprodukte auf
B-Zellen wird eine Rückkopplung des Signals erreicht.
T-Zellen differenzieren sich in zwei weitere Arten von Zellen; den CD4 positiven Helfer- und
den CD8 positiven Killerzellen (Zytotoxische T-Zellen) 9. Als „Cluster of Differentiation“
(CD) bezeichnet man spezifische Oberflächenmoleküle auf Lymphozyten, durch die eine
funktionelle Ordnung dieser Immunzellen geschaffen wird. Makrophagen phagozytieren
fremde Antigene (virale, oder bei Krebszellen veränderte Eiweisstoffe), die von ihnen
präsentiert und von T-Helferzellen erkannt werden. T-Helferzellen reagieren auf diesen
Kontakt mit der Produktion von Interleukinen. Aktivierte CD8 positive Zellen produzieren
nur sehr kleine Mengen an Zytokinen, allerdings sind diese Zellen in der Lage die Antigentragende Zelle zu lysieren. Ein weiteres Werkzeug der zellvermittelten Immunantwort sind
NK-Zellen, auf deren Funktionsweise in einem eigenen Abschnitt eingegangen wird.
1.2 Das MHC-System
Eine zentrale Rolle in der zellvermittelten Immunantwort spielen MHC-Moleküle. Durch die
Expression von MHC-Molekülen können intrazelluläre Krankheitserreger, aber auch
fremdartige Zellen beispielsweise nach Organtransplantationen erkannt und bekämpft werden.
Die Wirkungsweise der zellvermittelten Immunität durch die Expression von MHCMolekülen zur Unterscheidung zwischen eigenen, Virus-infizierten, oder fremdartigen Zellen
konnte in allen Säugetierspecies nachgewiesen werden. Beim Menschen gibt es zwei Arten
von MHC-Molekülen (MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II), die die meisten strukturellen
Eigenschaften gemeinsam haben und in ihrer extrazellulären Domäne eine Spalte besitzen, wo
ein Peptidfragment gebunden wird. Diese Peptidfragmente stammen von Proteinen, die im
Zellinneren abgebaut und an neue MHC-Moleküle gebunden werden.
MHC-Klasse-I Moleküle binden Peptidreste von Proteinen, die im Zytosol hergestellt
werden und übernehmen damit die Aufgabe, Fragmente von viralen Proteinen zu
präsentieren. Vor allem CD8 positive T-Zellen benötigen für eine Reaktion die Präsentation
von Antigenen auf MHC-Klasse-I Molekülen. MHC-Klasse-II Moleküle binden Peptide von
Proteinen in intrazellulär membrangebundenen Vesikeln und präsentieren somit Peptide von
-3-
Einleitung
Pathogenen. Die Präsentation von Peptiden pathogener Krankheitserreger auf MHC-KlasseII-Molekülen dient der Induktion CD4 positiver Zellen.
Beim Menschen tragen MHC-Moleküle die Bezeichnung HLA (human leucocyte antigen)
und umfassen mehr als 200 Gene. Es gibt drei sehr polymorphe Klasse-Iα-Ketten-Gene
(HLA-A, -B und -C) und drei MHC-Klasse-II-Gen-Paare (HLA-DR, -DP, und -DQ).
Zytokine (IFN-α, -β oder -γ) führen zu einer Erhöhung der Expression der MHC-Klasse-IαKette und des β2-Mikroglobulin-Anteils und regen somit die Präsentationen von Antigenen
bei frühen Stadien von Infektionen an.
HLA-Klasse-Ia-Moleküle (HLA-A, -B, -C) sind auf fast allen kernhaltigen Körperzellen in
unterschiedlichem Maße exprimiert. T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen, sowie andere
Antigen-präsentierende Zellen exprimieren diese Moleküle besonders stark
10
. Der
Polymorphismus dieser HLA-Klasse-Ia-Moleküle ist dafür verantwortlich, daß eine
Transplantation von Organen nicht ohne gleichzeitige Immunsuppression möglich ist. Wie
schon erwähnt, ist selbst die Organtransplantation zwischen Mutter und Kind, bzw. zwischen
Geschwistern ohne Immunsuppression meist mit heftigen Abstoßungsreaktionen verbunden.
HLA-Klasse-Ib-Moleküle (HLA-G, -E, -F) sind dagegen oligomorph und werden nur auf
Trophoblasten, verschiedenen Tumoren und einigen Lymphozyten exprimiert
11, 12
. Durch die
fehlende Expression von HLA-Klasse-Ia-Molekülen und die gleichzeitige Expression von
HLA-Ib-Moleküle schützen sich sowohl fetale Trophoblastzellen vor Immunreaktionen der
Mutter, als auch oft Tumorzellen vor dem Wirtsimmunsystem.
HLA-Klasse-II-Moleküle werden stark auf B-Zellen, Makrophagen, anderen Antigenpräsentierenden Zellen, epithelialen Zellen des Thymus und geringfügig auf aktivierten TZellen beim Menschen exprimiert.
1.3 Natürliche Killer Zellen
Wie schon erwähnt, sind Natürliche Killer (NK)-Zellen ein weiterer Bestandteil der
zellvermittelten Immunität. Während im Blut eines Erwachsenen etwa 15% der
Gesamtlymphozyten NK-Zellen sind, steigt der Anteil an NK-Zellen während einer
Schwangerschaft beachtlich an. NK-Zellen wandern dann aktiv in den Uterus ein, tolerieren
aber die semi-allogenen fetalen Zellen in der Dezidua. Da diese feto-maternale
Immuntoleranz einen Schwerpunkt dieser Arbeit darstellt, wird in den folgenden Abschnitten
näher auf die NK-Zellen und später auf NK-Zellen in der Decidua eingegangen.
Bildung von NK-Zellen: NK-Zellen entwickeln sich aus pluripotenten haematopoetischen
Stammzellen gemeinsam mit T-Zellen. Allerdings erfolgt die Reifung der NK-Zellen nicht
wie bei den T-Zellen im Thymus, sondern im Knochenmark 13. Dabei spielt Interleukin (IL)-4-
Einleitung
15, produziert von Stromazellen, eine entscheidende Rolle. Colucci et. al. beschrieben ein
Modell von drei Stufen der NK-Zell-Reifung: eine Initialphase, bei der sich Stammzellen in
Richtung der lymphoiden Linie entwickeln und Vorläufer-NK-Zellen darstellen; einer
zweiten Stufe, bei der sich diese Vorläufer zu phenotypisch und funktionell reifen NK-Zellen
entwickeln; und einer dritten Stufe, bei der die reifen NK-Zellen in die Zielorgane und das
periphere Blut transportiert werden 14.
Arten von NK-Zellen: Natürliche Killer Zellen sind eine inhomogene Gruppe. Man
unterscheidet zwischen den NK-Zellen des peripheren Blutes (PBNK) und den uterinen NKZellen (uNK) in der Schwangerschaft, früher als „large granular lymphocytes“ der Dezidua
(DLGL) bezeichnet. PBNK exprimieren den Fc-γ-Rezeptor-III (CD16) sehr stark (CD16++)
und CD56, das „Neuronal Cell Adhesion Molecule“, nur sehr schwach (CD56(+)), während
uNKs schwach CD16- und stark CD56 positiv sind (CD16(+)/CD56++)
15
. Aber es gibt
ebenfalls unter den PBNKs eine relativ kleine Gruppe die ebenfalls CD56++ ist. Darüber
hinaus unterscheiden sich die uNKs von den PBNKs durch eine stärkere Expression von
CD29 (β1-Integrin) und CD45RO. Weiterhin exprimieren sie CD15s, CD43 (Leukosialin),
CD44 (H-CAM), CD45RA, CD62L (LECAM-1) und HLA-DR 15.
Eigenschaften von NK-Zellen: Ein grundlegendes Merkmal dieser Zellen ist die Fähigkeit,
verschiedene Tumorzellen ohne vorherige Sensibilisierung zu töten
16, 17
. Sie sind ein
wichtiges Werkzeug in der Abwehr von Viren, Parasiten, intrazellulären Bakterien
18-20
und
beginnen bei Infektionen sehr schnell mit der Produktion von Zytokinen und Chemokinen.
Beispielsweise produzieren sie den Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α, Interferon (IFN)-γ, den
Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden-Faktor (GM-CSF), das MakrophagenInflammatorische Protein (MIP)-1α, MIP-1β und RANTES
Regulator der Immunantwort
21, 22
21
und wirken somit als wichtiger
. Durch RANTES werden unter anderem Migrations-
vorgänge in T-Zellen aktiviert und somit eine Anhäufung immunaktiver Zellen in den
Infektionsgebieten erreicht. Es wurde lange vermutet, dass NK-Zellen nach der „missing
self“-Hypothese funktionieren. Diese Hypothese basiert auf der Erkenntnis, dass NK-Zellen
in vitro transformierte Zellen töten, die keinen MHC-Komplex besitzen
23-25
. Die
Identifizierung von inhibitorischen Rezeptoren für spezifische MHC Klasse-I Moleküle
unterstützt diese Hypothese 25-27.
Wirkungsweise von NK-Zellen: Für eine zytotoxische Reaktion benötigen NK-Zellen
stimulierende Signale an den Rezeptoren, um an Zielzellen zu binden und ihre
Effektorfunktion auszuüben
28
. Allerdings finden oft auch zytolytische Prozesse statt, wenn
inhibierende Rezeptoren aktiviert werden. Offensichtlich entscheidet eine Balance zwischen
-5-
Einleitung
stimulierenden und inhibierenden Rezeptorsignalen über die Art der Reaktion der NK-Zelle
29, 30
. Dabei muss sich die NK-Zelle an die Zielzelle anlagern und eine „immunologische
Synapse“ bilden, in der über die Art der Reaktion entschieden wird und eventuell
Effektorproteine von der NK-Zelle sezerniert werden können 31.
1.4 NK-Zell-Rezeptoren, Inhibition und Aktivierung
Obwohl NK-Zellen sowohl aktivierende als auch inhibierende Rezeptoren auf ihrer
Oberfläche exprimieren, vermitteln in einigen Fällen die gleichen Rezeptoren je nach
Bindungsstärke des Signalmoleküls sowohl aktivierende als auch inhibierende Signale.
Inhibitorische Rezeptoren binden an klassische und nicht-klassische HLA Klasse-I
Moleküle. Bei einer ausreichend großen Bindungsaffinität wird eine zytolytische Reaktion
verhindert und somit ist dieser Vorgang essentiell für die Selbsttoleranz. Der „human killer
immunoglobulin-like receptor“ (KIR) gehört zu der Immunoglobulin-Superfamilie, während
der Ly49 Rezeptor in Mäusen und der CD94/NKG2 Rezeptor (bei Maus und Mensch) der CTyp Lektin Rezeptorfamilie angehört
32
. Diesen genannten Rezeptoren ist gemeinsam, dass
sie oft ähnliche Mechanismen verwenden um in der NK-Zelle inhibitorische Signale zu
vermitteln. Inhibitorische Signale werden meist durch „immunoreceptor tyrosine based
inhibitory motifs“ (ITIM) übertragen, welche sich an der zytoplasmatischen Seite des
Rezeptors befinden. Bei einer Bindung an einen Liganden werden die ITIMs phosphoryliert,
was mit einer Dephosphorylierung des Guanin-Nukleotid-Austausch-Faktor Vav1 einhergeht.
Eine Phosphorylierung von Vav1 führt zu Umformierungen des Aktinskeletts, die für die
Bildung einer immunologischen Synapse und schließlich für eine Zytolyse notwendig sind.
Die Dephosphorylierung dieser Moleküle führt hingegen zur Auflösung der immunologischen
Synapse 33-37 und somit zu einer Verhinderung der Zytotoxizität.
Rezeptoren der KIR Familie
haben entweder zwei oder drei
Domänen und tragen deshalb
den Suffix 2D oder 3D
Inhibitorische
KIR
38
.
tragen
meist lange zytoplasmatische
Anhänge, an denen sich zwei
ITIMs befinden. KIRs sind
Abb 1.1 Rezeptoren für HLA-Moleküle auf NK-Zellen
(http://www.niaid.nih.gov/dir/labs/lig/figure3.htm)
somit wichtige Rezeptoren in der Selbsterkennung des Immunsystems, wobei KIR2Ds unter
anderem spezifisch mit HLA-C Molekülen interagieren, während KIR3Ds auf HLA-A und
HLA-B Moleküle reagieren 38.
-6-
Einleitung
Die Rezeptorkomplex-CD94/NKG2-Heterodimere sind für die Erkennung von HLA-E
verantwortlich. Das inhibitorische Signal wird, ähnlich wie bei den KIRs, durch zwei ITIMs
an den zytoplasmatischen Domänen NKG2A oder NKG2B (eine Splice-variante von
NKG2A) übertragen 39, 40.
Aktivierende Rezeptoren auf NK-Zellen sind durch oft kurze zytoplasmatische Domänen, die
keine Signaltransduktionsstrukturen besitzen, gekennzeichnet. Stattdessen findet die
Signaltransduktion durch Adaptormoleküle wie DNAX-Aktivierungsprotein-12 (DAP-12),
DAP-10, CD3ζ (welches das Immunrezeptor-Tyrosin-basierende Aktivierungs-motiv [ITAM]
enthält) oder FcRγ statt. In der weiteren Signaltransduktion sind oft GTPasen der RhoFamilie, Phospholipasen-C (PLC) und die schon beschriebenen Vav1-Moleküle beteiligt
41
,
die die Bildung einer stabilen immunologischen Synapse begünstigen.
Im Gegensatz zu anderen Rezeptoren, sind die NKG2D-Rezeptormoleküle (CD314) auf allen
NK-Zellen zu finden und sehr gut charakterisiert
27, 29, 30, 42-44
. Sie sind auch auf anderen
Zellen, wie zum Beispiel γδT-Zellen zu finden 30, 43 und die Expression kann in Makrophagen
und CD8+ T-Zellen induziert werden. Dieser Rezeptor unterscheidet sich unter anderem von
dem NKG2-Rezeptor dadurch, dass er als Homodimer vorkommt
37
und nicht mit HLA-E
interagiert 29, 30. Der NKG2D Rezeptorkomplex ist essentiell für die Produktion von IFN-γ 45,
wobei die Induktion der Zytokinproduktion in NK-Zellen ITAM- abhängig ist 41, 46.
Doch auch KIRs haben aktivierende Isoformen. Wie auch die inhibitorischen KIRs, haben sie
zwei oder drei extrazelluläre, allerdings nur sehr kurze intrazelluläre Domänen. Das
aktivierende Signal wird deshalb auch bei diesen Rezeptoren durch ITAMs übertragen
Auch CD94/NKG2C und CD94/NKG2E sind aktivierende Rezeptoren
47
32
.
. Beide binden an
HLA-E, jedoch hat CD94/NKG2A zu HLA-E eine wesentlich höhere Bindungsaffinität, so
dass normalerweise eine Inhibierung von HLA-E ausgeht. Vielmehr scheint hinter diesem
Mechanismus eine Aktivierung der NK-Zelle nach Stress zu stehen 48.
Weiterhin gibt es in NK-Zellen drei so genannte natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren (NCR),
die Rezeptoren NKp30 (CD337), NKp44 (CD336) und NKp46 (CD335)
49
. Auf allen NK-
Zellen sind NKp46 und NKp30 zu finden, die ihr Signal durch den CD3ζ/FcεRIγ-Komplex
weitergeben, während NKp44 nur auf aktivierten NK-Zellen exprimiert wird und die
Signaltransduktion durch DAP12 erfolgt. Diese Rezeptoren interagieren nicht mit MHCMolekülen, aktivieren aber die NK-Zellen bei Bindung an Zielzellen, die virale Proteine
präsentieren 50. Somit scheinen diese Rezeptoren essentiell für die primäre Immunantwort der
NK-Zellen zu sein 51.
-7-
Einleitung
1.5 Bewegung, Homing, Migration von NK-Zellen
Da NK-Zellen eine erste immunologische Barriere darstellen, ist es wichtig, dass sie zu dem
Zielorgan transportiert werden, durch die Kapillarwand gelangen und aktiv in das Zielgewebe
entlang der Matrixproteine zu den Tumor- oder infizierten Zellen migrieren
52
. Dazu sind
zwei grundsätzliche, unabhängig von einander regulierte Vorgänge notwendig: die Adhäsion
der Zellen an die Oberfläche des vaskulären Endotheliums und die transendotheliale
Migration
53
. Beide Vorgänge werden durch eine Fülle von Regulationsmolekülen gesteuert.
Selektine, Moleküle der Immunoglobulin-Superfamilie und Integrine sind für die Initiierung,
die Anheftung der Zellen und die transendotheliale Migration von NK-Zellen notwendig.
Hormone, Zytokine, andere pro-imflammatorische Stoffe, abgespaltene Rezeptorstücke
u.v.m. beeinflussen diesen Prozess
54
. NK-Zellen produzieren und sezernieren Fibronektin,
ein Protein der extrazellulären Matrix, welches bei vielen biologischen Vorgängen, wie
Adhäsion, Zytoskelettaufbau, Migration und Invasivität beteiligt ist
exprimieren uNK-Zellen stark CD56
56, 57
55
. Wie schon erwähnt,
und sind dadurch in der Lage, während einer
Schwangerschaft aktiv in die Decidua zu migrieren, wo eine außergewöhnlich hohe
Konzentration von NK-Zellen beobachtet werden kann. Da diese Anhäufung von NK-Zellen
in der Kontaktzone zwischen mütterlichem und kindlichem Gewebe eine Besonderheit und
einen Schwerpunkt dieser Arbeit darstellt, wird darauf in einem eigenen Abschnitt
eingegangen.
Andere Zytokine, wie TGF-beta-1 und IL-6 wirken chemotaktisch auf NK-Zellen 58, genauso
wie MIP-1, MIP-1beta und das „IFN-inducible Protein-10“ (IP-10)
59
. RANTES, das
„Monocyte chemotactic protein-1“ (MCP-1), MCP-2 und MCP-3 lösen ebenfalls
chemotaktische Reaktionen aus. Weiterhin benutzen NK-Zellen unter anderem das
„Intracellular Adhesion Molecule-1“ (ICAM-1, CD54) und CD2, um an Tumorzellen zu
binden und eine cytolytische Reaktion zu starten 60.
Das „Leukocyte Endothelial Cell Adhesion Molecule-1“ (LECAM-1, CD62L) vermittelt die
Bindung von Leukozyten an das Endothelium und fungiert damit als allgemeiner HomingReceptor, dessen Expression durch Zytokine, wie zum Beispiel Interleukin-4 (IL-4) gesteuert
wird 61.
1.6 Intrazelluläre Jak/STAT Signaltransduktion in Lymphozyten
Eine wichtige und schnelle Signalkaskade in Lymphozyten ist neben weiteren Signalwegen,
auf die in dieser Arbeit nicht näher eingegangen wird, der JAK/STAT-Signaltransduktionsweg (Abb. 1.2: 1-3). Bei diesem Signalweg werden, induziert durch ein ZytokinRezeptorsignal, zunächst Tyrosinkinasen (z.B. Janus kinasen [Jak]) aktiviert. Die Vertreter
-8-
Einleitung
der Tyrosinkinasen (Jak1, Jak2, Jak3 und Tyk2) sind bei der Signaltransduktion einer
Vielzahl von Zytokinen beiteiligt
exprimiert wird
67
62-66
, wobei Jak3 in Lymphozyten besonders stark
. Die Aktivierung der Tyrosinkinasen führt zu einer Phosphorylierung des
intrazellulären Anteils des Zytokinrezeptors, der Bindungsstellen für SH2-Signalproteine
bietet, die wiederum phosphoryliert werden 68. Diese Phosphorylierung geht dann auf „Signal
Transducer and Activator of Transcription“ Moleküle (STATs) über. Grundsätzlich gibt es 6
verschiedene STAT-Moleküle, die in der Reihenfolge ihrer Entdeckung benannt worden und
wiederum in verschiedenen Isoformen vorkommen. Phosphorylierte STATs sind in der Lage,
Dimere zu bilden und in dieser Form in den Zellkern zu wandern. Dort binden sie an
spezifische DNA-Bindungsstellen und induzieren so die Expression von Zielgenen 69.
1
L-Ligand
2
M-Membran
3
R-Rezeptor
Z-Zellkern
Abb. 1.2: JAK/STAT Signaltransduktionsweg
Dabei wird über Rückkopplungsschleifen („Feedback-loops“) eine negative Regulation
erreicht 70. Aber auch positive Rückkopplungen existieren, denn zum Beispiel induziert IL-2
durch den JAK/STAT-Weg wiederum die Transkription und Produktion von IL-2. Allerdings
nutzen Zytokine mehrere der bekannten drei JAK- und sieben STAT-Moleküle, aber auch
jedes JAK- und STAT-Molekül kann durch verschiedene Zytokine genutzt werden
68
. Im
Zellkern binden die STAT-Moleküle an die Promotorregionen der Zielgene auf der DNA und
induzieren
so
die
Transkriptionskaskade.
Diese
Signalkaskaden
können
durch
Regulationsmoleküle, wie den „Protein Inhibitor of Activated STATs“ (PIAS) oder den
„suppressors of cytokine signalling“ (SOCS), negativ beeinflusst werden
71, 72
. SOCS
Moleküle wurden 1997 erstmalig beschrieben, hemmen spezifisch den JAK/STATSignalweg,
wodurch
sie
wichtige
Elemente
Signalübertragung in Immunzellen darstellen 72.
-9-
der
Regulation
der
intrazellulären
Einleitung
Die Placenta - ein immunprivilegiertes Organ?
- Die Reproduktionsimmunologie -
1.7 Trophoblastzellen und die Entwicklung der Placenta
Trophoblastzellen der Placenta haben in den verschiedenen Species viele Mechanismen
entwickelt, in den Uterus zu invadieren und in die Blutgefäße einzudringen, um einen
effizienten feto-maternalen Stoffaustausch zu gewährleisten. Das Invasionsverhalten ist streng
räumlich und zeitlich kontrolliert, dauert beim Menschen bis zum Ende des ersten Trimesters
der Schwangerschaft und ist begrenzt auf das Endometrium, bzw. das erste Drittel des
Myometriums
73
. Bevor eine Invasion stattfindet, muss jedoch die Blastozyste an die
Basalmembran-Matrix binden und durch die Sekretion von Matrix-Metalloproteinasen
(MMPs) und Serinproteasen die Basalmembran abbauen
74
. Anschließend beginnen
Zytotrophoblastzellen MMPs zu sezernieren und invasiv in Uterusgewebe einzuwachsen,
Abb 1.3: schematischer Querschnitt einer humanen
Placenta (www.mhhe.com/socscience/devel/ibank/image/0038.jpg)
kontrolliert durch antiinvasive Faktoren, die im Deciduagewebe und durch fetale Zellen
produziert werden. Wie schon anfänglich erwähnt, stammen Zytotrophoblastzellen von
trophektodermalen Zellen der Blastozyste ab und repräsentieren eine heterogene Population
während der frühen Schwangerschaft. Nach dem ersten Kontakt der Blastozyste mit dem
Uterusgewebe
beginnen
Zytotrophoblasten
(Syncytiotrophoblasten) zu bilden
75
zu
fusionieren
und
ein
Syncytium
. Somit sind für invasive Vorgänge, die mit der
Verdrängung von mütterlichem Gewebe einhergehen, Zytotrophoblasten verantwortlich,
während endokrine- und Transportfunktionen von den Syncytiotrophoblasten übernommen
werden 76.
- 10 -
Einleitung
1.8 Steuerung des Trophoblastenwachstums, der Invasion und Migration
Grundsätzlich kann das Invasionsverhalten von Trophoblastzellen durch Hormone, Zytokine,
Enzyme u.a. positiv oder negativ beeinflußt werden. Dabei werden diese Stoffe sowohl von
embryonalem als auch maternalem Gewebe produziert. Um dieses komplizierte
Steuerungssystem näher zu beschreiben, wird im folgenden auf einzelne Faktoren
eingegangen.
Induktion der Invasion: Für eine gerichtete Invasion von Zellen ist die Realisierung der
Umwelt von maßgeblicher Bedeutung, wobei die extrazelluläre Matrix (ECM) eine wichtige
Rolle spielt 77. Collagen Typ-1, ein großer Bestandteil der ECM, stimuliert die Sekretion von
Gelatinase in Zytotrophoblastzellen
78
. Laminin, das die Invasion von Melanomzellen und
deren Sekretion von MMP-2 induziert und ähnliche Effekte auf Choriokarzinomzellen hat,
beeinflusst Zytotrophoblasten dagegen nicht
78
. Zytotrophoblasten zeigen unterschiedliche
Reaktionen auf verschiedene exogene Reize, abhängig von der Matrigeldichte, auf der sie
kultiviert werden. Weiterhin kann auch durch Zell-Zell Kontakt die Sekretion von MMPs
induziert werden. So wird zum Beispiel bei verschiedenen Tumoren, die keine MMPs
produzieren, deren Sekretion durch die umliegenden Zellen bei direktem Zell-Zell Kontakt
induziert. Auch transfizierte embryonale Zellen von Ratten sind in der Lage, die Produktion
von MMP-9 in Fibroblasten durch Zell-Zell Kontakt zu induzieren
79
. Somit spielt dieser
Mechanismus eine wichtige Rolle in der Kontrolle der Invasion von Trophoblastzellen.
Interleukin-1 (IL-1) wird von Monozyten und Makrophagen, Zellen in der feto-maternalen
Grenzfläche, sowie prä-implantativen Embryonen produziert. IL-1 Rezeptoren werden von
endometrialen Endothelzellen während der sekretorischen Phase und während der
Implantation exprimiert. IL-1-Antagonisten führen zu einer signifikant reduzierten Anzahl
von implantierten Embryos bei Mäusen, was zu der Schlussfolgerung führt, dass IL-1 ein
wichtiger Mediator während der Implantationsphase der
Schwangerschaft ist
80
. Beim
Mensch exprimieren endometriale Epithelzellen und extravillöse Zytotrophoblasten den IL-1Rezeptor, während IL-1 sowohl von extravillösen als auch von villösen Zytotrophoblasten,
nicht aber von epithelialen Zellen exprimiert wird. Im Endometrium wird IL-1 in
dezidualisierten und pseudo-dezidualisierten Zellen produziert. Es führt zu einer Stimulation
der Aktivität von MMP-1, MMP-3 und des „Tissue Inhibitor of Metalloproteinase“ (TIMP) in
Fibroblasten und MMP-9 in Zytotrophoblasten 81, 82.
Interleukin-6 (IL-6) wirkt auf Zellen durch die Bindung an zwei Membranproteine; ein 80
kDa IL-6-Bindeprotein (IL-6R) und einem 130 kDa Signaltransduktionsprotein (gp130). Das
Signaltransduktionsprotein gp130 ist ebenfalls mit dem Leukemia Inhibitory Factor (LIF)- 11 -
Einleitung
Rezeptor assoziiert. IL-6 wird vom Endometrium in der Mitte der sekretorischen Phase und
von allen Trophoblasten (Cyto- und Syncytiotrophoblasten) des ersten Trimesters gebildet.
Der IL-6 Rezeptorkomplex ist auf endometrialen Endothelzellen vorhanden, während nur der
gp130-Anteil in der Decidua und Trophoblasten des ersten Trimesters sowie auf Blastozysten
gefunden werden kann. IL-6 induziert die Aktivierung von MMP-2 und MMP-9 in
Trophoblasten, allerdings nicht deren Synthese
81
. LIF wird im Mausendometrium ab dem
vierten Schwangerschaftstag kurz vor der Implantation der Blastozyste produziert. Das Signal
von LIF wird innerhalb der Trophoblastzellen via STAT3 übertragen. „Knock Out“ Versuche
in Mäusen zeigten, daß dieses durch LIF induzierte STAT3-Signal essentiell für eine
erfolgreiche Implantation des Embryo ist
83
. Der LIF-Rezeptor kann sowohl auf villösen als
auch extravillösen Zytotrophoblasten gefunden werden. LIF führt zu einer TIMP-Stimulation
in Fibroblasten
84
und inhibiert die gelatinolytische Aktivität von Zytotrophoblasten, die
Laminin-Rezeptoren tragen, nicht aber die von Zytotrophoblasten, die FibronektinRezeptoren exprimieren
85
erfolgreiche Placentation
86
. Zusammengefaßt ist LIF ein wichtiges Zytokin für eine
, sowie für die Invasion
87
, Migration und Proliferation
88
von
Trophoblastzellen. Interleukin-15 (IL-15), was von Trophoblasten produziert wird, induziert
die
Invasion,
Migration
und
MMP-1
Produktion
von
Trophoblast-
und
Jeg-3
Choriokarzinomzellen. IL-15 hat allerdings keinen Effekt auf die Produktion von MMP-2 und
MMP-9
89
. Der „Tumor Nekrosis Factor“ (TNF)-α
α wird vor allem von Makrophagen und
endometrialen Zellen produziert. TNF-α induziert die Produktion von MMP-9 in
Endothelzellen von Rindern 90, sowie MMP-1 und MMP-3 in Chorionzellen des Menschen 91.
Außerdem verringert TNF-α im Gegensatz zu IL-10 die TIMP-Expression
92
. In
Trophoblastzellen induziert TNF-α die Produktion von MMP-9, nicht aber von MMP-2
81
.
Der „Epidermal Groth Factor“ (EGF) und der „Transforming Groth Factor“ (TGF)-α
α
besitzen gleiche Sequenzabschnitte und binden mit diesen Regionen an ein und den selben
Rezeptor. EGF wird besonders von dezidualen Zellen produziert, kann aber auch in dem
Endometrium während der proliferativen und sekretorischen Phase nachgewiesen werden.
Der Nachweis von EGF in Trophoblastzellen ist allerdings auf die Überexpression von
EGF/TGFα-Rezeptoren auf Zytotrophoblasten zurückzuführen 93. Die Stimulation von MMP1 und MMP-3
91
, sowie die synergistische Stimulation dieser Enzyme durch IL-1 und EGF
führt zu einer gesteigerten Invasivität von Zytotrophoblast- und Sarkomzellen
93, 94
. Der
„Insulin-like Growth Factor“ (IGF)-II wird sowohl von extravillösen als auch von villösen,
proliferierenden Zytotrophoblasten nach der abgeschlossenen Implantation bis zum Ende der
Schwangerschaft produziert
95-97
. IGF-II induziert eine Erhöhung der Invasion von
- 12 -
Einleitung
Trophoblastzellen in Matrigel durch Bindung an den IGF Rezeptor Typ 2
98, 99
. Somit stellt
IGF-II ein Schlüsselmolekül in der autokrinen Regulation der Trophoblastinvasion dar. Ein
anderes Zytokin, was im Placentagewebe produziert wird und parakrin auf Trophoblasten
wirkt ist der „Hepatocyte Growth Factor“ (HGF). HGF ist ein Regulationsmolekül, das die
Proliferation, Invasion und Differenzierung von Trophoblasten 100, 101, sowie die Motilität von
Tumorzellen
102
beeinflusst. Es wurde beobachtet, dass eine verminderte Expression des
HGF-Rezeptors auf Trophoblastzellen mit Wachstumsretardierungen und Präeklampsie
bzw. mit dem Tod des Embryo assoziiert ist
104
103
,
. Somit ist HGF ein essentieller Mediator für
Mesenchym-Trophoblastepithel-Interaktionen, sowie für die Organogenese der Placenta 105.
Inhibition der Invasion: Eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Invasionsverhaltens
invadierender Zellen spielen TIMP-Moleküle. TIMPs neutralisieren MMPs durch Bindung
an die hoch konservierte Zink-Bindungsseite aktiver MMPs und beeinflussen somit die
Trophoblasteninvasion negativ
74, 106
. Die TIMP-Expression wird durch den „Transforming
Growth Factor“ (TGF)-β
β in Trophoblastzellen induziert. Weiterhin steuert TGF-β die
Differenzierung der invasiven Trophoblastzellen in vielkernige Riesenzellen ohne invasiven
Charakter,
wodurch
TGF-β
eine
wichtige
Bedeutung
Trophoblastendifferenzierung der frühen Schwangerschaft zukommt
107
bezüglich
der
. TGF-β wird vom
Endometrium und Zellen der Decidua, vor allem aber von villösen und extravillösen
Zytotrophoblasten, sowie Syncytiotrophoblasten produziert. In Fibroblasten, Keratinozyten
und cervikalen Zellen steigert TGF-β die MMP-2 und MMP-9 Aktivität, wobei es TIMP
verringert
108-110
. Diese Effekte treffen allerdings nicht auf Zytotrophoblasten zu, bei denen
TGF-β die Invasion und Migration inhibiert und, wie schon erwähnt, die Differenzierung der
invasiven Trophoblastzellen in Syncytiotrophoblasten induziert
81, 111, 112
. Hormone, die das
Invasionsverhalten von Trophoblasten beeinflußen, sind vor allem Progesteron und „Human
Chorionic Gonadotropin“ (hCG). Diese Hormone werden durch Syncytiotrophoblasten in
großen Mengen produziert und sind somit an der feto-maternalen Grenzfläche präsent.
Progesteron verringert die Produktion von MMP-9 in Ersttrimester-Zytotrophoblasten
113
ebenso
der
bewirkt
es
mit
fortschreitender
Schwangerschaft
eine
Verringerung
,
Gelatinaseproduktion von Zytotrophoblasten. Ähnlich wie Progesteron, spielen auch hCG und
das luteinisierende Hormon (LH) eine wichtige Rolle bezüglich der Trophoblasteninvasion
und -transformation, denn hCG-Rezeptoren sind sowohl auf extravillösen und endovaskulären
Trophoblasten, als auch auf Syncytiotrophoblasten vorhanden
114
. Es konnte gezeigt werden,
dass hCG die Invasion von Zytotrophoblasten in vitro konzentrationsabhängig inhibiert, ohne
die Bindung an die Basalmembran zu beeinflussen
- 13 -
115
. Unter experimentellen Bedingungen
Einleitung
wurde die Collagenaseaktivität, nicht aber deren mRNA reduziert; ebenfalls blieb die TIMP-1
mRNA unbeeinflusst durch hCG. Die Sekretion anderer Proteasen, die als Induktoren von
MMPs bekannt sind (z.B. Urokinase Type Plasminogen Aktivator), wird durch hCG reduziert
115
. Daraus kann geschlußfolgert werden, dass die Fähigkeit von hCG, die kollagenolytische
Kaskade abzuwenden, zur Regulation der Invasion von Trophoblasten beiträgt. Interleukin10 (IL-10) wird in vitro von Zytotrophoblasten produziert und reduziert die Expression von
MMP-9, sowie die Invasion dieser Zellen, steigert allerdings die Expression von HLA-G
116
.
Die Bedeutung von IL-10 für die Entwicklung der Placenta wird auch durch die Beobachtung
unterstützt, dass Krankheitsbilder mit gestörter Trophoblasteninvasion und verminderter
HLA-G-Expression, wie z.B. Präeklampsie, oft mit einer verminderten IL-10-Expression
einhergehen
117
. Da Zytotrophoblasten sowohl IL-10 als auch den IL-10-Rezeptor
exprimieren, dient dieses Interleukin als wichtiges Werkzeug der autokrinen Regulation der
Invasion
118
. Ein weiteres wichtiges Kriterium für eine Kontrolle der Proliferation und
letztlich auch der Invasion dürfte die Aktivität des Telomeraseenzyms sein. Die Verkürzung
der Telomere an den Enden der Chromosomen und die Aktivität der Telomerase stellen
einen regulatorischen Mechanismus für eine Kontrolle der mitotischen Aktivität dar
119-122
.
Immortalisierte Tumorzellen entgehen dem DNA-Abbau durch die Reaktivierung der
normalerweise in ihrer Expression inhibierten Telomerase
120
. Durch sie werden die, durch
jede Mitose immer kürzer werdenden Chromosomenenden wieder verlängert
123, 124
. Im
Gegensatz zu den meisten somatischen Zellen, exprimierten Zellen der Placenta, ähnlich wie
den meisten Tumoren, Telomerasen 125, 126.
1.9 MHC-Expression in der Placenta
Wie bereits erwähnt, invadieren während der Entwicklung der Placenta fetale Zellen in
mütterliches Gewebe und kommen in direkten Kontakt mit dem Immunsystem der Mutter.
Bei der Betrachtung der MHC-Molekülstruktur dieser Zellen fällt auf, dass polymorphe HLAA- und HLA-B-, sowie HLA-Klasse-II-Moleküle nicht auf ihrer Zelloberfläche exprimiert
werden. Diese Nicht-Expression verhindert eine mögliche anti-paternale-allo-Immunantwort
der Mutter gegenüber Antigenen paternalen Ursprungs auf Trophoblastzellen. Stattdessen
exprimieren Trophoblastzellen oligomorphe HLA-G, -E, -F und HLA-C Moleküle. Während
die Expression von HLA-C keine Besonderheit darstellt, ist die Expression von HLA-G,
abgesehen von einigen Tumoren, auf Gewebe der Placenta beschränkt. Die selektive
Expression dieses nicht-klassischen MHC-Klasse-1 Moleküls auf extravillösen Trophoblastzellen, die bis in maternale Blutgefäße invadieren, ließ früh die Vermutung zu, dass HLA-G
eine besondere Rolle in der feto-maternalen Toleranz spielt.
- 14 -
Einleitung
Eigenschaften von HLA-G: HLA-G wurde erstmalig von Ellis et. al. 1990 beschrieben und
kommt in vier Membran-gebundenen (HLA-G1 bis -G4) und drei löslichen Isoformen (HLAG5 bis -G7, auch als sHLA-G1, sHLA-G2 und sHLA-G3 bezeichnet) vor . Bei der Expression
von sHLA-G1 wird das Intron 4, in dem ein Stopkodon enthalten ist, nicht „gespliced“.
Dadurch wird der transmembrane Anteil des HLA-G Moleküls nicht exprimiert, wodurch eine
Verankerung in der Zellmembran nicht möglich ist und die Moleküle statt auf der
Zelloberfläche fixiert, in das Medium abgegeben werden. Das Molekulargewicht von
löslichem HLA-G beträgt ca 35 kDalton und es wird vorrangig von Hofbauerzellen, fetalen
Makrophagen und dem Endothelium der Chorionzotten exprimiert. Die lösliche Form von
HLA-G kann ebenfalls durch eine Abspaltung der membrangebundenen Form entstehen.
sHLA-G kann in der gesamten Placenta, in fetalem, sowie in mütterlichem Blut nachgewiesen
werden. Membrangebundenes HLA-G ist außer auf extravillösen Zytotrophoblastzellen im
embryonalen Endothelium der Chorionzotten, im Amnionepithel, im Thymus und auf einigen
Karzinomzellen (Lymphomen, Melanomen, uvm.) zu finden. HLA-G mit seinen 8 betaSchleifen, 2 Alphahelices und einem Molekulargewicht von 39-40 kDalton scheint dem HLAA sehr ähnlich zu sein. Das Genom enthält 8 Exons und 7 Introns. Die Transkription wird
durch cis-Regulation (Methylierung und multiple CpG-Wiederholungen oberhalb des
Initiationslocus) und Trans-Regulation (TATA-box, -50 bp RNA-Polymeraseinitiation, Upstreamelemente, u.a.) gesteuert. Im Gegensatz zu dem Polymorphismus von HLA-Klasse-IaMolekülen ist HLA-G oligomorph mit nur 10-20 Variationen. Diese Variationen sind meist
synonyme Substitutionen, die niemals in einer Peptid-Bindebox vorkommen. In der Decidua,
wo fetale, invadierende Trophoblastzellen und maternale Lymphozyten in direkten Kontakt
treten, müssen für eine normale Placentation zytolytische Reaktionen der Immunzellen
unterdrückt werden. Die Rolle von HLA-G in dieser lokalen Immunsuppression wird in den
folgenden Abschnitten näher diskutiert.
1.10 Immunzellen, Hormone, Enzyme und Zytokine in der Placenta
In der Dezidua des ersten Trimenons stellen die CD56++ uNK Zellen mit ca. 80% die größte
Population immunaktiver Zellen dar
127-129
. Eine Aufgabe der uNK-Zellen könnte die
Kontrolle der Zytotrophoblasteninvasion in mütterliches Gewebe in den ersten 18
Schwangerschaftswochen durch ihre zytotoxische Aktivität, sowie durch die Produktion von
Zytokinen sein
130, 131
. NK-Zellen scheinen aktiv aus dem peripheren Blut in deziduales
Gewebe einzuwandern und erreichen ihre Höchstzahl gegen Ende des ersten Trimenons. Sie
exprimieren das „Vascular Cell Adhesion Molecule“ (VCAM)-1, was für die Adhäsion dieser
Zellen an Blutgefäße notwendig ist
132, 133
, sowie CXCR-4 (CD184), einen Rezeptor der an
- 15 -
Einleitung
der Migration beteiligt ist
134
und dessen Ligand CXCL12, von invadierenden extravillösen
Trophoblasten exprimiert wird. Dabei ist die Migration von mütterlichen NK-Zellen in die
Dezidua ein, von Trophoblasten unterstützter, streng kontrollierter Prozess. Dies scheint
verwunderlich, wenn man bedenkt, dass diese NK-Zellen potentiell zytotoxisch gegenüber
Trophoblasten sind. Doch uNK Zellen übernehmen in dem schwangeren Uterus durch die
Sekretion von IFN-γ, was hauptsächlich von uNK-Zellen in der Dezidua sezerniert wird
135
,
die Aufgabe der Umformung uterinen Gewebes. Dabei spielt IFN-γ eine entscheidende Rolle,
denn ohne dessen Produktion kann keine erfolgreiche Schwangerschaft etabliert werden
136
.
IFN-γ begünstigt die Bildung neuer Blutgefäße, genauso wie der „Vascular Endothelial
Growth Factor“ (VEGF), der ebenfalls von uNK Zellen exprimiert wird
132
. Somit stellen
diese Zellen eine Vorraussetzung für eine normale Schwangerschaft dar.
Die Migration von NK-Zellen in die Dezidua wird durch HLA-G, was die Adhäsion von NKZellen an das Endothel reduziert
von uNK-Zellen produziert
Produktion
führt.
Der
138
137
, negativ beeinflußt. Interessanterweise wird auch IL-10
, was in Trophoblasten zu einer Erhöhung der HLA-G
Kontakt
Apoptosevorgänge auszulösen
139, 140
mit
HLA-G
scheint
außerdem
in
uNK-Zellen
, die auch bei isolierten uNK Zellen aus Mäusen in
Kultur nicht abgewendet werden konnten
140
. Gegen Ende der Schwangerschaft gehen diese
Apoptose- in Nekroseprozesse über 141.
Eine weitere Gruppe von Immunzellen in der Decidua sind T-Helferzellen (CD4+). THelferzellen können sich in zwei verschiedene Subtypen (Th1 und Th2) differenzieren, die
sich durch ihr Muster an sezernierten Zytokinen unterscheiden. CD4-Zellen, die Zytokine aus
beiden Gruppen sezernieren, werden als Th0-Zellen bezeichnet. Zu den in der
Schwangerschaft bedeutsamen Th1 Zytokinen gehören TNF-α und IFN-γ. Wie schon
erwähnt, hemmt TNF-α die Trophoblastenmotilität, induziert die Expression von MMPs und
scheint somit einen wichtigen Beitrag in der Kontrolle der Trophoblasteninvasion zu leisten
142
, während IFN-γ die Expression von MHC-I und MHC-II Molekülen auf verschiedenen
Zellen verstärkt. Wichtige Th2 Zytokine in der Schwangerschaft sind IL-4, das die Wirkung
von IFN-γ reguliert und IL-10. Ebenfalls von Bedeutung ist der „Granulocyte-macrophage
colony-stimulatory Factor“ (GM-CSF), der sowohl von Trophoblastzellen als auch von
uterinen Leukozyten produziert wird
143
. In Mäusen mit hohem Risiko für Spontanaborten
führt die Applikation von GM-CSF zu einer starken Senkung der Abortrate 144.
Eine weitere T-Zell-Population in der Dezidua stellen CD8+ zytotoxische T-Zellen dar.
Diese Zellen erkennen nicht nur klassische MHC-Moleküle; sie sind auch in der Lage, HLAG zu erkennen und dadurch mit Trophoblastzellen zu interagieren
- 16 -
145
. Der Kontakt mit HLA-
Einleitung
G führt zu einer Induktion des FAS-Liganden und steht im Verdacht Apoptose der CD8+
Zellen auszulösen
146, 147
. Obwohl zytotoxische T-Zellen, verglichen mit NK-Zellen nur in
sehr geringer Anzahl in der Dezidua vorkommen
CD8-Zellen
aus
dem
mütterlichen
148, 149
, führt jedoch eine Depletion von
Blutkreislauf
zu
einer
Erhöhung
von
Schwangerschaftsaborten und einem verminderten fetalen und placentaren Wachstum in
Mäusen 150.
Auch wenn während der Schwangerschaft Veränderungen in der Anzahl immunkompetenter
Zellen und dem Zytokinnetzwerk im Uterus auftreten, ist die Placenta keineswegs ein
immunprivilegiertes Organ. Wie schon erwähnt, sind antigenspezifische T- und BLymphozyten in geringerer Anzahl während der Schwangerschaft im Uterus vorhanden und
werden durch Elemente der natürlichen Immunität, Makrophagen und NK-Zellen, ersetzt. Im
Allgemeinen kann man sagen, dass sich das TH1/TH2-Verhältnis während der
Schwangerschaft in Richtung TH2 verschiebt
151
. Anti-inflammatorische Zytokine wie IL-10,
die die zellvermittelte Immunität vermindern, werden stark exprimiert. Es wird angenommen,
dass Th1-Zytokine die placentare Entwicklung hemmen, während Th2-Zytokine wie IL-4 und
IL-10 einen positiven Einfluss auf die Entwicklung der Placenta haben
131
. Die erfolgreiche
Schwangerschaft als so genanntes Th2-Phänomen wurde erstmals von Tom Wegmann als
Hypothese formuliert
mehr umstritten ist
152
und im Mausmodell bestätigt, während es beim Mensch mehr und
153, 154
Polypeptidhormonen
155
. Produkte von Zellen aus der Placenta, einschließlich Steroid- und
, Arachidonsäure und spezielle Modulatoren wie HLA-G tragen zu
den immunologischen Veränderungen bei (Abb. 1.5). Das Steroidhormon Progesteron wird in
der Placenta synthetisiert und ist für den Erfolg einer Schwangerschaft essentiell. Es wirkt
stark inhibierend auf die Produktion von inflammatorischen Zytokinen, wie zum Beispiel
TNF-α; die Produktion von anti-inflammatorischen Zytokinen, wie Interleukin-10 (IL-10)
wird dagegen stimuliert. Wie schon erwähnt, verstärkt IL-10 die Synthese von HLA-G in
Trophoblastzellen, was zu Veränderungen in der Expression von Genen in maternalen
Lymphozyten führt, die mit der Kommunikation, Proliferation und der Induktion von
Apoptose in Verbindung stehen.
Ein weiteres wichtiges Enzym bezüglich der Immunsupression in der Placenta ist das Enzym
Indoleamin 2,3-Dioxygenase (IDO). IDO wandelt Tryptophan in Kynurenin um, was zu
einem lokalen Tryptophanmangel und damit zu einer verminderten Lymphozytenproliferation
und Zytotoxizität führt
156, 157
. Weiterhin führt eine Inhibition von IDO immer zum Abbruch
der Schwangerschaft in Mäusen
157, 158
. IDO scheint aber auch vor und während der
Implantation des Embryo für die Reproduktion wichtig zu sein, denn es wird schon mit dem
- 17 -
Einleitung
Seminalplasma
in
den
Vaginaltrakt
gebracht
und
sorgt
so
Immunsuppression, was für die allogenen Spermatozyten essentiell ist
Placentation
wird
IDO
sehr
stark
von
extravillösen
für
159
eine
regionale
. Auch während der
Zytotrophoblasten
und
Syncytiotrophoblasten exprimiert, wodurch vor allem T-Zellen an der feto-maternalen
Grenzfläche gehemmt werden 160.
Abb. 1.5 vereinfachte Darstellung der immunologischen
Kommunikation zwischen Fetus und maternalen NK-Zellen
1.11 Produktion immunregulatorischer Substanzen im präimplantativen
Embryo
Bereits während der Wanderung des Embryo durch den Eileiter und vor der Implantation
werden immunregulatorische Stoffe von dem Embryo produziert. Dabei sind vor allem Stoffe
interessant, die Effektorzellen des maternalen Immunsystems hemmen, das Endometrium auf
die bevorstehende Implantation vorbereiten und die beginnende Invasion der Trophoblasten
positiv beeinflussen. Durch die Sekretion von IL-4 und IL-10 wird in maternalen T-Zellen
eine Th2-Antwort induziert
131
, was zur Toleranz der Blastozyste führt. Des Weiteren trägt
auch die Expression von sHLA-G zum Schutz des präimplantativen Embryo vor der
zytotoxischen Reaktion von maternalen NK-Zellen bei
161
. Dabei wird durch IL-10 autokrin
die Expression von sHLA-G in den sich differenzierenden Trophoblastzellen nach der
Implantation verstärkt 116. Die Sekretion von IFN-γ begünstigt die Anlagerung der Blastozyste
an das Endometrium, deren Implantation und die beginnende Proliferation von
Trophoblastzellen
162, 163
. TNF-α, das die Invasion von Trophoblasten steigert
81
, wird
ebenfalls von der Blastozyste produziert. Es beeinflusst den präimplantativen Embryo
allerdings eher negativ
164, 165
. Alle genannten Substanzen sind im Kulturmedium von
Embryonen nach erfolgter in vitro Fertilisation (IVF) nachweisbar, wobei es für eine
- 18 -
Einleitung
erfolgreiche Implantation der Blastozyste nicht ausschlaggebend ist, ob die Substanzen in
bestimmten Konzentrationen vorkommen
166 167
. Es scheint eher das Verhältnis der, von der
Blastozyste produzierten Zytokine zueinander über den Erfolg der Implantation des Embryo
entscheiden.
Allerdings scheint die Expression von sHLA-G für eine erfolgreiche Implantation essentiell
zu sein. Mehrere Studien zeigen, dass ein Implantationserfolg mit der Sekretion von sHLA-G
korreliert 168-170. Im Gegensatz dazu könnte eine Mutation im HLA-G-Gen mit Infertilität und
dem Auftreten von Spontanaborten assoziiert sein 171.
1.12 HLA-G und sHLA-G Expression von Tumoren
Die schon beschriebene immunregulatorische Rolle von HLA-G und sHLA-G spielt nicht nur
in der Schwangerschaft eine Rolle, sondern scheint auch bei der Entstehung von Tumoren
entscheidend zu sein. Während Zellen in normalem Gewebe, außer Trophoblasten der fetomaternalen Grenzfläche, kein HLA-G produzieren
172-174
, wurde die Expression von HLA-G
in verschiedenen Tumoren einschließlich Melanomen, Nierenzell-Karzinomen, Brusttumoren
und Lungentumoren nachgewiesen 175-180. Dabei wurde, ähnlich wie bei der Schwangerschaft,
gezeigt, dass die Expression von HLA-G in diesen Zellen essentiell für eine Unterdrückung
der Immunantwort durch T-Lymphozyten und NK-Zellen ist
172,
175-177,
181,
182
.
Choriokarzinomzellen, die außer ihrer sehr starken Invasivität, wesentliche Eigenschaften mit
Trophoblastzellen gemeinsam haben, exprimieren ebenfalls oft HLA-G (z.B. Jeg-3). Die
Messung von gelöstem HLA-G (HLA-G1s) im Serum von Patienten mittels „Enzyme Linked
Iummunosorband Assay“ (ELISA) könnte somit einen guten Marker für die Tumordiagnostik
darstellen, da im Gegensatz zu anderen löslichen Tumormarkern, die Messung von HLA-G
eine hohe Sensitivität und Spezifität aufweist, während viele andere Marker ebenfalls von
weiteren Geweben exprimiert werden 183-185.
1.13 Regulation der Signalübertragung in Immunzellen während der
Schwangerschaft
Wie schon erwähnt, bietet der JAK/STAT-Signaltransduktionsweg eine sehr schnelle
Möglichkeit, Signale in Zellen weiterzuleiten. So stimuliert beispielsweise IL-2 in NK-Zellen
STAT1, STAT3, STAT5 und führt so zu einer Erhöhung der Zytotoxizität und Proliferation
186
, während in manchen NK-Zellinien ebenfalls STAT4 aktiviert wird. Ein STAT4-Signal in
NK-Zellen erhöht wiederum die Empfindlichkeit auf IL-12
Aktivierung und Perforin-Expression in diesen Zellen
- 19 -
187
186
und führt zur Proliferation,
. Für eine optimale NK-Zell-
Einleitung
Entwicklung und Aktivierung, sowie für die zytolytische Aktivität sind IL-2-Rezeptor-βSignale notwendig, die ebenfalls die Expression des Effektormoleküls Perforin verstärken. IL18 führt in der NK-Zellinie NK92 zu einer Aktivierung von STAT3
Erhöhung der Zytotoxizität gegenüber Zielzellen führt
188
188
, was zu einer
. STAT3 scheint grundsätzlich in
NK-Zellen ein wichtiges Regulationsmolekül für die Zytotoxizität und die Sekretion von
Perforin zu sein. Uterine NK-Zellen aus dem Endometrium exprimieren außerdem ProlaktinRezeptoren, die potentielle Ziele für das Hormon Prolaktin darstellen könnten, welches zu
Anfang der Schwangerschaft verstärkt und zum Ende verringert exprimiert wird
189
. Durch
eine Prolaktinbindung wird eine Tyrosinphosphorylierung von JAK2, STAT1, sowie von
STAT6 ausgelöst und der MAPK/ERK-Signaltransduktionsweg aktiviert.
In der Differenzierung von Th0 zu Th2-Zellen, ist IL-4 ein essentielles Zytokin. IL-4
induziert eine Erhöhung der Expression von GATA, einem weiteren Signaltransduktor via
STAT6, was zu einer verstärkten Produktion von Th2-Zytokinen führt und die Produktion
von IFN-γ als Th1-Zytokin stoppt. Unterstützt wird diese These durch die Beobachtung, dass
STAT6-„Knock Out“-Mäuse nur eine Th1-Antwort entwickeln
190
. Viele Faktoren können T-
Zellen in ihrer Differenzierung beeinflussen, wobei Zytokine, wie IL-2, IL-4 und IL-12 u.a.
die Hauptrolle spielen 191. IL-12, dessen Signal in T-Zellen via STAT4 übertragen wird, kann
durch Antigen-präsentierende Zellen, dendritische Zellen, sowie durch Makrophagen
produziert werden und fördert eine Th1-Antwort
46
. Deutlich wird dies dadurch, dass IL-12,
bzw. STAT4 defiziente Mäuse keine Th1-Antwort erzeugen können
192, 193
. IL-2 wird durch
Th1 Zellen selbst produziert und dient als autokrines Signal via IL-2 Rezeptoren auf der
Oberfläche, deren Aktivierung auf STAT3-Moleküle übergeht, die wiederum die IL-2
Produktion fördern. Während in Th1-Zellen STAT4 und in Th2-Zellen STAT6 polarisiert
aktiviert werden, werden STAT3 und STAT5 selektiv in Th1-Zellen nach ihrer
Differenzierung aktiviert, was mit einer selektiven Induktion von SOCS-Molekülen assoziiert
ist
132
. Damit kann vermutet werden, dass STAT3 und STAT5 die Expression von SOCS-
Molekülen steuern und eine wichtige Rolle in der Differenzierung von Th-Zellen (Th1 und
Th2) spielen.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass STAT1-Signale eine Hauptrolle in der Induktion von
SOCS-Molekülen in Th-Zellen spielen, und dass die SOCS-Expression durch IL-4, IL-12
oder IFN-γ in STAT1-defizienten Th-Zellen beeinträchtigt ist. IL-4 induziert eine STAT1Aktivierung in Th2-, nicht aber in Th1-Zellen. Durch „Knock Out“-Experimente in Th2Zellen konnte gezeigt werden, dass eine STAT1-Aktivierung mit der Expression von SOCS1
und SOCS3 korreliert ist
194
, während eine Überexpression von SOCS1 in Th2-Zellen die
- 20 -
Einleitung
STAT6-Aktivierung und damit eine IL-4 induzierte Proliferation unterdrückt. Eine Depletion
von SOCS1 durch „anti-sense“ cDNA führt dagegen zu einer konstitutiven Aktivierung von
STAT6 in Th2-Zellen 194.
1.14 STAT3 und STAT6 in Trophoblast- und Karzinomzellen
Wie schon im Abschnitt „Trophoblasteninvasion“ kurz erwähnt, sind bei Trophoblasten die
verschiedensten Signaltransduktionsmoleküle bei der Reizaufnahme und der Wahrnehmung
der Umwelt beteiligt. Eines dieser Moleküle ist STAT3, das viele verschiedene Funktionen in
der Embryonalentwicklung und im ausgewachsenen Organismus übernimmt 195. Eine STAT3Aktivität kann schon ab dem Beginn der Implantation des Embryo nachgewiesen werden und
spielt eine wichtige Rolle während der Embryogenese
196
. Ein STAT3-„Knock Out“ führt
immer zum Abort des Embryo am Tag 7,5 post coitus (pc) bei Mäusen, wo hingegen eine
Substitution von STAT3 den Schwangerschaftserfolg herbeiführt
197
. Aktiviertes STAT3
kommt in vielen stark invasiven Tumoren, wie Gehirntumoren, Mamma-, Prostata- und
Ovarialkarzinomen vor und erhöht die Proliferation und Invasivität
198-201
. Weiterhin steht es
mit der Metastasierung von Tumoren im Zusammenhang 202. Die DNA-Bindungsaktivität von
STAT3, welche eine funktionelle Aussage über den Aktivierungsgrad gibt, kann durch LIF in
verschiedenen stark invasiven Tumorzellen (z.B. Jeg-3 Choriokarzinomzellen) und in
Zytotrophoblasten induziert werden
203
. Die Beobachtung, dass STAT3 defiziente Mäuse
komplett resistent gegenüber karzinogenen Stoffen sind zeigt, dass STAT3 für eine
Karzinogenese essentiell ist
204
. Somit stellt STAT3 ein Schlüsselmolekül sowohl für eine
erfolgreiche Schwangerschaft als auch für die Tumorinvasion dar. Doch sowohl Tumor- als
auch andere invadierende Zellen werden durch Hormone beeinflusst. So ist bei vielen
Karzinomarten,
allen
voran
dem
Mammakarzinom,
die
Östrogen-
und
Testosteronabhängigkeit bekannt. 3beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase/ Isomerase (3betaHSD) Isoenzyme katalysieren wichtige Schritte in der Bildung dieser Sexualhormone. Die
zwei Isoenzyme werden zum einen in der Placenta, zum anderen in den Gonaden und der
Nebenniere exprimiert. Doch auch in Mammakarzinomzellen konnte die Expression dieser
Enzyme durch IL-4 und IL-13 induziert werden, deren Signal durch STAT6
weitergeleitet wurde
205
. Die Induktion der Expression dieses Enzyms durch IL-4 und IL-13
via STAT6 konnte ebenfalls in Cervix- (ME-180), Colon- (HT-29), sowie in
Mammakarzinomzellen (BT-20, ZR-75-1) beobachtet werden
27, 205
. Doch scheint das Signal
von IL-4 nicht nur durch STAT6 weitergegeben zu werden, denn STAT6-Knock Out
Experimente zeigten, dass ein IL-4-Signal in diesen Zellen auch via STAT1 übertragen
- 21 -
Einleitung
werden kann
206
(Abb. 1.6). Obwohl in Mammakarzinomzellen die STAT6-Aktivierung mit
einer Inhibition der Proliferation korreliert
207
, scheint jedoch die Signalübertragung von IL-4
via STAT6 in anderen Karzinomzellen für Vorgänge bedeutend zu sein, die mit Malignität,
Proliferation und transkriptionellen Aktivierung von IL-6 und dem “Monocyte chemotactic
protein-1”(MCP-1) in Verbindung stehen 208, 209.
Abb: 1.6 Vereinfachtes Beispiel der Mechanismen von intrazellulären STATSignalen in Tumorzellen
1.15 STATs und Apoptose in Tumorzellen
STATs spielen eine wichtige Rolle in der Steuerung von Apoptosevorgängen in Tumorzellen.
Aktiviertes STAT3, dessen Rolle bezüglich der Invasivität erläutert wurde, scheint in einer
Vielzahl von Tumorzellen (Prostata-, Lungen-, Gehirn-, Mammatumoren u.a.) Apoptosevorgänge zu unterdrücken 201, 210-213. „Knock Down“ Versuche von STAT3 mittels siRNA in
Prostatakarzinomzellen zeigen ein vermindertes Wachstum und die Zellen wurden
apoptodisch
214
. Doch auch die Unterdrückung der Signalweiterleitung durch eine IL-6
Rezeptor Blockade induziert Apoptose in multiplen Myelomzellen, wenn nicht weitere
Signaltransduktoren (z.B. MEK1,2/ERK1,2) aktiviert werden
210
. STAT5 und STAT6
besitzen ebenfalls die Fähigkeit, Apoptosevorgänge in einigen Karzinomzellen zu
- 22 -
Einleitung
unterdrücken
215, 216
. Im Gegensatz dazu sind durch STAT6 vermittelte IL-4-Signale in
Mammakarzinomzellen essentiell für die Inhibition der Proliferation und die Induktion von
Apoptose
207
. Bei der Regulation der Apoptose spielt auch STAT1 eine entscheidende Rolle
in Tumorzellen, denn es kann sowohl pro- als auch anti-apoptotische Vorgänge, je nach Art
der Aktivierung induzieren 217.
1.16 Xenogene Schwangerschaften, Xenotransplantation
Wie schon einleitend erwähnt, stellt die maternale Toleranz gegenüber dem semiallogenen
Fetus, der als physiologisches Transplantat angesehen werden kann, eine immunologische
Besonderheit dar. Die Auswirkungen der feto-maternalen Immuntoleranz sind so
weitreichend, dass Leihmutterschaften sogar artübergreifend, beispielsweise zwischen Esel
und Pferd (xenogene Schwangerschaft), möglich sind. Auch zeigen extrauterine
Schwangerschaften, daß für die Implantation einer Blastozyste und für eine Placentation nicht
unbedingt Uterusgewebe nötig ist. Diese immunologischen Besonderheiten werden in
Experimenten genutzt, in denen Gewebe oder Organe in andere Tierarten transplantiert
werden (Xenotransplantation). Von besonders großer Bedeutung sind Xenotransplantationen
von Organen aus Tieren in Menschen, denn die Zahl der auf ein Organ wartenden Patienten
ist momentan fünfmal höher, als Organe zur Verfügung stehen
als
40
Jahren
Versuche
unternommen,
218
. Deshalb werden seit mehr
Transplantationen
vorzunehmen,
ohne
Abstoßungsreaktionen auszulösen. Eine Xenotransplantation ist definiert als Transplantation
von Organen oder Geweben zwischen verschiedenen Spezies. 1962 wurde erstmals eine
Pavian-Niere auf einen Menschen transplantiert
219
. Ein Jahr darauf wurden Schimpansen-
Nieren auf Menschen transplantiert und funktionierten mehrere Monate
220
. Bis 1969 wurde
jedoch noch von keinem Fall berichtet, in dem das Transplantat oder der Empfänger länger
als ein Jahr überlebten
221
, weshalb das Interesse an Xenotransplantationen stark abnahm.
1984 startete die zweite Welle an Xenotransplantationen mit der Pavian-Herz-Verpflanzung
auf das berühmt gewordene Baby Fae. Seit dem wurden weitere Versuche unternommen,
Pavian-Nieren und -Knochenmarkszellen, sowie Schweine-Lebern und Inselzellen zu
transplantieren 222-224. Aktuelle klinische Studien betreffen die Übertragung von Nervenzellen
vom Schwein auf Morbus Parkinson und Chorea Huntington Patienten, die teilweise nach 8
Monaten beim Empfänger noch nachweisbar waren
225
transplantierten
von
Organe
auf
Grund
der
Bildung
Komplementaktivierung 226.
- 23 -
. Abgestoßen werden die
Antikörpern
und
der
Einleitung
Ein
weiterer
Schwerpunkt
von
Xenotransplantationsexperimenten
Verständnis
der
Tumor-
grundsätzlichen
und
liegt
in
Reproduktionsimmunologie.
dem
Durch
Xenotransplantationsstudien können Immunreaktionen in vivo analysiert werden. So wurde
beispielsweise beobachtet, daß in Mäuse transplantierte humane Choriokarzinomzellen
(Modellzellen für Trophoblasten), die HLA-G, sowie geringe Mengen HLA-C produzieren
und NK-unsensitiv sind, nicht vom Immunsystem der Versuchstiere als fremd erkannt und
bekämpft werden
227, 228
. Auch die Zellkulturüberstände dieser Zellen unterdrücken
Immunreaktionen der Versuchstiere nach der Transplantation von Zellen, die normalerweise
abgestoßen werden sollten
229
. Die Fähigkeit dieser Choriokarzinomzellen, eine
Immunantwort in den Versuchstieren zu unterdrücken, könnte dem Mechanismus der
Immunsuppression bezüglich des Fetus und der halballogenen Mutter ähneln und zum
immunologischen Verständnis der Schwangerschaft beitragen.
Weiterhin werden durch die Transplantation von Tumorgewebe in Mäuse seit den frühen 70er Jahren Homone, Wachstumsfaktoren und andere immunregulatorische Substanzen
analysiert, die von dem transplantierten Gewebe produziert werden
230, 231
. Auf diese Weise
können durch heterogene Transplantationsstudien die Morphologie, Angiogenese, Invasivität
und Malignität von Tumoren in vivo untersucht und neue Therapieansätze erprobt werden
236
232-
. Für diese Studien eignen sich besonders Mäuse, die weder B- noch T-Lymphozyten
bilden (serve combined immunodeficiency, SCID) und eine Vielzahl von Transplantaten
tolerieren 237-240.
In dieser Arbeit wurden Xenotransplantationen menschlicher Trophoblasten in Mausnieren
durchgeführt, um die morphologische Entwicklung zu analysieren und den Einfluss von
Schwangerschafts-spezifischen
Erkrankungen,
wie
untersuchen.
- 24 -
zum
Beispiel
Präeklampsie
zu
Ziele dieser Arbeit
2. Ziele dieser Arbeit
In der Reproduktionsimmunologie sind viele Fragestellungen noch weitgehend ungeklärt. So
ist der Prozess der Implantation des Embryo und der Invasion von fetalen, allogenen
Trophoblastzellen in maternales Gewebe ein streng regulierter Vorgang, bei dem eine Fülle
von Zellen, Zytokinen und Hormonen beteiligt sind. Vor allem NK-Zellen des mütterlichen
Immunsystems in der sich bildenden Dezidua exprimieren Moleküle, deren Aufgabe die
Kontrolle der Invasion und Migration von fetalen Zellen in mütterliches Gewebe darstellt,
während fetale, invasiv wachsende Trophoblastzellen immunregulatorische Substanzen
produzieren, die wiederum auf maternale Immunzellen wirken. So besteht ein dichtes
Zusammenspiel und ein starker Informationsaustausch in Form von Signalmolekülen
zwischen dem Fetus und der Mutter.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen Mechanismen und Faktoren der Interaktion von
dezidualen NK-Zellen mit fetalen Trophoblastzellen. Dabei werden sowohl Primärzellen als
auch Zellinien als Modelle betrachtet. In der vorliegenden Arbeit sollen folgende
Fragestellungen betrachtet werden.
-
Welchen Einfluss haben die in der Decidua präsenten und für Tumorentwicklung
bedeutsamen Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF auf die Phosphorylierung von STAT3
in Jeg-3 Choriokarzinomzellen?
-
Unterscheiden sich Trophoblasten verschiedener Entwicklungsstufen der Schwangerschaft
in ihrem Invasionsverhalten in vitro und in vivo?
-
Welchen Einfluss hat STAT3 bezüglich des Proliferations- und Invasionsverhaltens
invasiver Karzinom- und Trophoblastzellen?
-
Welchen Einfluss hat SOCS3 auf das Proliferationsverhalten und die Signaltransduktion
von STAT3 in Jeg-3 Zellen?
-
Welchen Einfluss hat STAT3 bezüglich des Apoptoseverhaltens von Trophoblastzellen?
- 25 -
Ziele dieser Arbeit
-
Welchen Einfluss hat STAT6 auf das Invasions und Proliferationsverhalten von Jeg-3
Zellen?
-
Ist es möglich, die Gesamt-Expression von HLA-G, sowie selektiv die Expression der
Isoform HLA-G1 in Jeg-3 Zellen mittels siRNA zu verringern? Welche immunologischen
Effekte entstehen hierdurch?
-
Welchen Einfluss hat STAT3 auf die Zytotoxizität dezidualer NK-Zellen?
-
Werden die Zytokine IFN-γ, IL-10, IL-6, IL-4, TNF-α und sHLA-G, die zur Immunregulation im Uterus beitragen könnten, von humanen Blastozysten nach erfolgreicher
IVF sezerniert?
-
Ist es möglich, durch Xenotransplantation in vivo eine stabile Kultur von humanen
Trophoblastzellen zu erzeugen? Welche Unterschiede gibt es bei der in vivo Kultur von
Trophoblastzellen unterschiedlicher Entwicklungsstufen?
-
Gibt es speziesübergreifende Mechanismen der Induktion einer fetomaternalen
Immuntoleranz?
- 26 -
Material und Methoden
3. Material und Methoden
3.1 Biologische Materialien
Zellinien
Die Choriokarzinom-Zellinie Jeg-3 und die Kolonkarzinom-Zellinie HT29 wurden in
DMEM-Medium (10% FKS, 2% AAS) unter Standardbedingungen kultiviert. Beide Zellinien
wurden aller drei Tage trypsiniert und regelmäßig auf Kontamination durch Mycoplasmen
getestet.
Trophoblastzellen für in vitro Experimente
Als Gewebe zur Isolation von Zytotrophoblastzellen dienten humane Placenten nach
unauffälligem Schwangerschaftsverlauf und termingerechter Geburt bzw. nach Interruptio vor
dem Ende des ersten Trimenons.
Trophoblastzellen für die Xenotransplantation
Für die Xenotransplantation von humanen Trophoblastzellen in immunkompetente und
immundefiziente Mäuse wurde Deciduagewebe von Interruptiones der 5. SSW, der 10.SSW,
sowie nach termingerechter Geburt als Transplantate verwendet. Die Gewebe wurden von
Frau Dr. Isabella Cannigia, Mount Sinai Hospital Toronto, Ontario, Kanada bereitgestellt.
Wirtsorganismen für die Xenotransplantation
Als Wirte für Xenotransplantationsstudien wurden Mäuse der Stämme RAG-2-null/γc-null 241
und C57BL/6J
242
benutzt. RAG-2-null/γc-null-Mäuse werden auch als SCID-(serve
combined immunodeficiency)-Mäuse bezeichnet und bilden weder B- noch T-Lymphozyten,
während C57BL/6J ein normales Immunsysten besitzen.
NK-Zellen
Als Gewebe zur Isolation von NK-Zellen dienen humane Placenten nach unauffälligem
Schwangerschaftsverlauf und termingerechter Geburt.
Überstände von Embryokulturen
Die Überstände von Embryokulturen wurden uns freundlicherweise von Frau Dr. Hoppe aus
dem IVF Labor der Universitätsfrauenklinik Jena zur Verfügung gestellt. Darin wurden die
humenen Embryonen für 72 Stunden einzeln kultiviert.
- 27 -
Material und Methoden
3.2 Geräte und Reagenzien
Geräte
Autoklav
KSG-112-Olching
Brutschrank
Heraeus CO2 Inkubator
Durchflußzytometer
Flowmax Galaxy (DAKO)
FACSCalibur (BD)
Elektrophoresekammer
Life Technology
MACS Midi Multi Stand
Miltenyi Biotech
Micro Plate reader MPR A4
Dementitec Diagnostics
Mikroskop Axiovert 25
Zeiss
Pipetten
Eppendorf
Orbitalschüttler Polymax 1040
Heidolph
Spektrophotometer Cary UV 50
Bio Varian
Waagen
Satorius Basic
Owa Labor (VEB Wägetechnik Rapido)
Zentrifugen
Biofuge 13
(Heraeus)
Labofuge T
(Heraeus)
Mikro 22R
(Hettich)
Mikrizentrifuge (Roth)
Verbrauchsmittel
Eppendorfgefäße
Sarstedt
UV Film, Skeletal/RA 18x24cm
Kodak
Filmkasette
Kisker
Zellkulturflaschen
Greiner
Küvetten Halb-Mikro
Greiner
MACS Separation Columns LS
Miltenyi Biotech
Membran PVDF Hybond-ECL
Amersham Pharmacia Biotech
PP-Testtubes Falcon
Greiner
Zellkulturplatten
Greiner
- 28 -
Material und Methoden
Reagenzien
Acrylamid 40%
Roth
Ammoniumperoxodisulfat
Roth
Ammoniumsulfat
Sigma
Antibiotic Antimycotic Solution
Sigma
Bromphenolblau
Roth
Cell Proliferation Assay
Promega
Chemiluminescent detection reagent
Cell Signaling Technology
Coomassie Brillantblau G250
Roth
Cytometric Bead Array Kit (-II)
BD
Dimethylsulfoxid
Merck
Essigsäure
Baker
Ethanol
Roth
Ethylendiamintetraacetat
Sigma
Fetales Kälberserum
Bio Whittaker
Glycerin
Roth
Human IL-2
Hölzel Diagnostika
Human LIF
Hölzel Diagnostika
Human IL-6
Hölzel Diagnostika
Human IGF-2
Hölzel Diagnostika
HGF
Hölzel Diagnostika
Lymphozytenseperationsmedium
PAA Laboratories
β-Mercaptoethenol
Roth
Methanol
Roth
Molekulargewichtsmarker (Roti-Standard) Cell Signaling Technology
Ponceau S
Roth
Protease Inhibitor Cocktail
Sigma
Tris-Hydrochlorid
Roth
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Roth
Zell-Lysepuffer
Cell Signaling Technology
- 29 -
Material und Methoden
Zellkulturmedien
RPMI 1640
Bio Whittacker
PBS
Bio Whittacker
DMEM
Bio Whittacker
Optimem
Bio Whittacker
verwendete Antikörper
Rabbit anti human STAT3
Cell Signaling Technology
Rabbit anti human Phospho-STAT3
Cell Signaling Technology
Rabbit anti human STAT6
Cell Signaling Technology
Rabbit anti human SOCS3
Cell Signaling Technology
Rabbit anti human Aktin
Cell Signaling Technology
Anti Rabbit IgG HRP-linked
Cell Signaling Technology
Anti-CD3-Cy5
DAKO
Anti-CD16-RPE
DAKO
Anti-CD56-FITC
DAKO
Anti-CD19-Cy5
DAKO
Versuchsdurchführung
Die Experimente in dieser Arbeit wurden in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Anne Croy und
Herrn Dr. Chandrakant Tayade während eines Forschungsaufenthaltes an der University of
Guelph, mit Frau Anja Meissner und Herrn PD. Dr. Karlheinz Friedrich in dem Institut für
Biochemie der FSU Jena und mit Frau Susann Salzmann der Forschergruppe “Klinische
Molekularbiologie” der Frauenklinik der FSU Jena durchgeführt.
- 30 -
Material und Methoden
3.3 Übersicht der in vitro Versuche
(4.1)
(4.2-4.4, 4.7)
(4.5-4.6)
(4.8)
(4.9-4.10)
(4.11)
(4.12)
Abb. 3.1: Übersicht der in vitro Versuchsansätze
- 31 -
Material und Methoden
3.4 Methoden
3.4.1 Isolierung von Primärzellen
Isolierung von Trophoblastzellen
Für die Isolierung von Trophoblastzellen wurden ca. 30g Gewebe der Decidua in eine
Petrischale überführt und mit 10 ml HBSS überschichtet. Anschließend wurde das Gewebe
grob von dem Bindegewebe befreit und es erfolgte die mechanische Zerkleinerung des
Gewebes mittels Schere und Skalpell. Der gesamte Prozess erfolgte unter sterilen
Bedingungen. Anschliessend wurden die Gewebsstücke in eine Gewebekulturflasche
überführt und mit Verdauungspuffer 1 Stunde inkubiert. Die Zellsuspension konnte danach
abgenommen und bei 100g für 10min zentrifugiert werden.
Neuer Verdauungspuffer wurde in die Gewebekulturflasche
gegeben und für weitere 30 min inkubiert. Dieser Schritt
erfolgte zwei weitere Male. Während der Verdauungsschritte
wurde ein Percoll-Stufen-Gradient, bestehend aus je 1ml
eines 10%-60% -igem Percolls in 15 ml Reaktionsgefäßen,
vorbereitet. Anschliessend wurde die aufkonzentrierte
Zellsuspension auf den Percoll-Gradient geschichtet und bei
800g für 20 min zentrifugiert. In Abbildung 3.2 ist die
entstandene Schichtung zu erkennen. Es wurden die
gekennzeichneten Schichten, in denen die Trophoblasten
enthalten waren abgenommen und mit Waschlösung
gewaschen.
Es folgte die Aufreinigung der Zytotrophoblasten mittels
Abb.: 3.2: Percoll Gradient,
Pfeile markieren Schichten,
in denen Trophoblasten enthalten sind.
Dynabeads. Dabei inkubierte man die Zellsuspension mit anti CD3, CD9, CD14, CD31 und
CD45-Antikörpern
(Maus, Firma DAKO) für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter
Lichtausschluß, gefolgt von der Zugabe von Anti-Maus IgG-Antikörpern (Ziege, Firma
Dynal). Durch diese Eisenpartikel-beladenen Antikörper konnten die Lymphozyten und
Monozyten depletiert werden. Die Zytotrophoblastzellen wurden unter Standardbedingungen
in DMEM-Medium (10% FKS, 2% AAS) kultiviert.
Die Bestimmung der Reinheit der Trophoblastkulturen erfolgte durch FACS-Analysen.
- 32 -
Material und Methoden
Verdauungspuffer:
Waschlösung:
Percoll-Gradient:
HBSS
2% AAS
Trypsin 1:250
Hepes (1M) 12,5ml in 500ml
HBSS
2% AAS
60%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 10% in HBSS
Isolierung von Lymphozyten und NK-Zellen aus der Placenta
Bei der Isolierung von Lymphozyten und NK-Zellen aus der Placenta wurde das Gewebe in
einer Perfusionsvorrichtung mit steriler NaCl-Lösung gespült
und somit Blut aus dem Gewebe entfernt. Das blutleere
Deciduagewebe (ca. 30 g) wurde in eine Petrischale überführt
und mit 10 ml RPMI-Medium überschichtet. Anschließend
erfolgte die Zerkleinerung des Placentagewebes mittels Schere
und Skalpell und die Zugabe von 40 µl Kollagenase (100 U)
pro 10 g Gewebe. Dabei war darauf zu achten, dass der gesamte
Prozess unter sterilen Bedingungen zu erfolgen hatte. Nach
einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37 °C wurde die
Zellsuspension durch ein Sieb (250µm) gedrückt, somit von
Gewebe befreit und mit 10 ml RPMI-Medium gespült.
Abb 3.3: Ficoll Gradient,
Pfeil markiert Schicht, in
der Lymphozyten enthalten sind.
Die gewebefreie Zellsuspension schichtete man auf 3 ml Ficoll
(Biocoll Separating Solution, Biochrom AG, Germany) in ein 15 ml Reaktionsgefäß (Greiner)
und zentrifugierte bei 800g für 20 min. Danach war die in Abbildung 3.3 gezeigte,
charakteristische Auftrennung zu erkennen. In der untersten Schicht waren Erythrozyten, in
der nächsten Schicht das Ficoll und darüber die Lymphozyten zusammen mit den Monozyten
zu finden. Die oberste Schicht enthielt das Medium/Puffer/Plasma-Gemisch. Die markierte
Lymphozytenschicht wurde abgenommen, mit 5 ml RPMI-Medium gespült und bei 600g
zentrifugiert. Dieser
Waschschritt wurde wiederholt, um das für Lymphozyten toxische
Ficoll aus der Lösung zu entfernen.
Anschließend erfolgte die Isolierung der NK-Zellen aus der Lymphozyten-MonozytenMischung. Dafür wurden die Zellen ein weiteres Mal zentrifugiert, der Überstand verworfen
und dem Pellet (ca. 50 µl) 2.5 µl anti-CD3, CD14, CD19, CD36 und IgE-Antikörper
zugegeben. Diese primären Antikörper waren Hapten-konjugiert, so dass man nach einer
Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur 2,5µl die sekundären Anti-Hapten- 33 -
Material und Methoden
MicroBeads zugeben konnte. Während einer weiteren Inkubationszeit von 30 min bei
Raumtemperatur wurde eine MACS-Magnetsäule (Miltenyi Biotec, Germany) mit 98%igem
Ethanol und anschließend RPMI-Medium gespült. Die Säule wurde in einem homogenen
Magnetfeld (Mini-Machs; Miltenyi Biotec, Germany) platziert, die Lymphozyten auf die
Säule gegeben und mit weiteren 10 ml PBS gewaschen. In der, aus der Säule austretenden
Flüssigkeit waren nun die NK-Zellen angereichert. Diese wurden durch Zentrifugation (600g,
5 min, RT) aufkonzentriert, konnten in einer Neubauer-Kammer gezählt und unter
Standardbedingungen in RPMI-Medium (mit 10% FKS, 2% AAS) in Kulturflaschen (Cellstar
50 ml) oder in Assay-Kulturplatten (24 Loch) kultiviert werden.
3.4.2 Transfektion von Zellen mit „small interfering“ RNA (siRNA)
Isolierte Zellen oder Zellinien dienten als Ausgangsmaterial für die Transfektion mit siRNA.
Mit dieser Technik sollte die Expression von spezifischen Genen gehemmt und unterdrückt
werden (Abb 3.4). Dazu wurden die Zellen mit Optimen-Medium (Firma GibcoTM)
gewaschen. OligofectamineTM Reagent (Firma Invitrogen) wurde mit Optimem Medium
verdünnt und die spezifischen RNA-Oligonukteotide in einer Endkonzentration von 60 nM zu
den Zellen gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 4 Stunden wurde DMEM-Medium
(Firma GibcoTM) mit 30% FCS zugegeben.
Zielgene für die Transfektion waren HLA-G, HLA-G1, SOCS3, STAT3 und STAT6. Jedem
„Knock Down“ wurde eine Negativkontrolle zugefügt, in der die selben Nukleotide in einer
nicht-genomischen Reihenfolge angeordnet waren. Der erfolgreiche „Knock Down“ der
Zielgene wurde mittels Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) und Western Blot
nachgewiesen.
Abb. 3.4: vereinfachte Übersicht des Mechanismus
des siRNA-„Knock Down“
- 34 -
Material und Methoden
Sequenzen der Oligonukleotide 243, 244:
STAT3-Inhibition
Sense:
5´UGU UCU CUA UCA GCA CAA Utt 3´
Antisense:
5´AUU GUG CUG AUA GAG AAC Att 3´
STAT6-Inhibition
Sense:
5´GCA GGA AGA ACU CAA GUU UUU 3´
Antisense:
5´AAA CUU GAG UUC UUC CUG CUU 3´
HLA-G-Inhibition
Sense:
5´UGU GGC UGA ACA AAG GAG Att 3´
Antisense:
5´ACA CCG ACU UGU UUC CUC Utt 3´
HLA-G1-Inhibition
Sense:
5´CAG UAU GCC UAC GAU GGC Att 3´
Antisense:
5´UGC CAU CGU AGG CAU ACU Gtt 3
SOCS3-Inhibition
Sense :
5´GAC CUU CAG CUC CAA GAG Ctt 3´
Antisense :
5´GCU CUU GGA GCU GAA GGU Ctt 3´
HLA-G-Kontrolle
Sense:
5´AGA GUG GUA ACG GAC AAG Utt 3´
Antisense:
5´ACU UGU CCG UUA CCA CUC Utt 3´
STAT3-Kontrolle
Sense:
5´GCC ACU UAU AAA UUC GUU Ctt 3´
Antisense:
5´GAA CGA AUU UAU AAG UGG Ctt 3´
Diese Kontroll-Oligonukleotide wurden auch als nicht-genomische Kontrollen für SOCS3-,
STAT6-, und HLA-G1-siRNA benutzt.
3.4.3 Fuktionelle Analysemethoden
Proliferationsassay
Die Proliferation von Zellen wurde mit CellTiter 96 One Solution Cell Proliferation Assay
bestimmt. Dafür wurden die Trophoblast- oder NK-Zellen in einer Neubauer-Zählkammer
gezählt, je 100000 Zellen in 100µl Medium in einer 96 Well-Zellkulturplatte für 72 Stunden
inkubiert und anschließend 20µl der Assay-Lösung zugegeben. Nach einer weiteren
Inkubationszeit von zwei bis drei Stunden konnte die Absorption der Proben bei 490nm
Wellenlänge in einem ELISA-Reader gemessen werden. Bei diesem Assay, auch als MTT- 35 -
Material und Methoden
Test bezeichnet, wurde die Reduktion der MTS-Tetrazolium-Verbindung (Owen´s Reagenz)
zu dem farbigen Formazanprodukt gemessen.
Invasionsassay
Zur Bestimmung der Invasivität von Zellen wurden 200µl eines 2% -igen Matrigels (BD
MatrigelTM Matrix BD Bioscience, USA) auf Filter in einen Zellkultureinsatz für 6 Well
Zellkulturplatten (8,0µm Polycarbonate Membrane NUNCTM Denmark) gegeben. Das
Matrigel wurde 24 Stunden unter Standardbedingungen getrocknet und anschließend wurden
2 ml Medium unter den Filter und die zu analysierenden Zellen (200000 Zellen/ml) in 1 ml
Medium über den Filter und das Gel aufgetragen.
Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden unter Standardbedingungen wurden die Zellen im
unteren Kompartiment, sowie der Filter unter dem Gel trypsiniert (Trypsin EDTA, 200mg/l
EDTA, 500mg/l Trypsin 1:250, Biowhittacker Europe) und die Zellen gezählt. Anschließend
konnte das Verhältnis der aufgetragenen Zellen zu den, durch das Gel invadierten Zellen
gebildet werden. Die Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Frau Anja Meissner im
Institut für Biochemie der FSU-Jena durchgeführt.
Untersuchung des Apoptoseverhaltens von Zellen durch Messung der gespaltenen PolyADP-ribose polymerase (PARP)
Um zu untersuchen, ob Substanzen Apoptose in Zellen induzieren, wurden gespaltene PARPMoleküle gemessen. Dieses „cleaved“-PARP-Molekül wird von der Zelle in einem frühen
Stadium der Apoptose gebildet und konnte somit als Apoptosemarker verwendet werden.
Dazu benutzte man Anti-cleaved PARP-Antikörper, die nach der Fixation der Zellen mit
0,05% Formaldehydlösung (5 Minuten) und Inkubation mit Permäabilisierungspuffer (PBS,
0,1% Triton, 5 Minuten) zugegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter
Lichtausschluß inkubiert wurden. Die intrazelluläre Färbung wurde anschließend im
Durchflußzytometer gemessen.
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western Blot
Diese Technik diente dazu, die Expression von Proteinen in Zellysaten zu untersuchen. Dazu
wurden die Zellen mit einem Zellschaber von der Kulturplatte gelöstund in Vorbereitung auf
die PAGE in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäße überführt und zwei mal mit PBS (PBS,
Proteinaseinhibitor) gewaschen. Die Zellen wurden abzentrifugiert (1075g, 5 min, RT), der
Überstand wurde verworfen und 50µl Zell-Lyse Puffer zugegeben. Anschließend wurden die
Zellen durch abwechselndes gefrieren, auftauen und durchmischen lysiert. Der Lyse folgte ein
- 36 -
Material und Methoden
letzter Zentrifugationsschritt (34000g, 30 min, 4°C), bevor die Proteinkonzentration im
Überstand mittels Bradford-Methode bestimmt werden konnte. Dazu wurden 5µl der
Proteinlösungen, sowie der Standards mit 1 ml Bradford-Reagenz versetzt, für 10 min bei
Raumtemperatur unter Lichtausschluß inkubiert und die Absorption bei 595nm gemessen.
Für die PAGE wurde ein 12,5 %-iges Gel verwendet, auf welches je 20 µg denaturiertes
Protein aufgetragen wurde. Für die Denaturierung wurde die jeweils bestimmte Proteinmenge
mit 10 µl Auftragspuffer versetzt und für 5 min bei 95°C inkubiert. Die Proteine wurden auf
dem Gel bei 120V und 100mA aufgetrennt. Der Blot auf die Nitrozellulosemembran
(HybondTM-ECLTM, Amersham Biosciences) erfolgte bei 150V und 150mA für 30 min. Als
Auftragskontrolle wurde eine Ponceau S-Färbung durchgeführt, bzw. Aktin nachgewiesen.
Das Blocken der unspezifischen Bindungen erfolgte mittels NET-G-Puffer für 30 min bei
Raumtemperatur. Der Primärantikörper wurde 1:1000 mit NET-G-Puffer verdünnt und für 48
Stunden mit der Membran bei 8°C inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit NET-G-Puffer
wurde der Sekundärantikörper (1:10000 in NET-G) zu der Membran gegeben, die nach einer
weiteren Stunde Inkubationszeit bei Raumtemperatur mit NET-G-Puffer gewaschen wurde.
Anschließend erfolgte die Detektion mittels „ECL-Detektion Reagent“ (Cell Signaling).
Auftragspuffer
62,5 mM Tris/HCl
25 % Glycerin
2 % SDS
0,01% Bromphenol Blau
2% beta-Mercaptoethanol
-pH 6,8
Laufpuffer
Ponceau S
1g/l Ponceau S
0,05% Essigsäure
10x Tris-Glycin-Puffer
24mM Tris Base
120mM Tris Base
190mM Glycin
960mM Glycin
0,1% SDS
-pH 8,5
Transferpuffer
10x NET-G-Puffer
100ml Tris-Glycin-Puffer
1,5M NaCl
200ml Methanol
50mM EDTA
700ml H2O
500mM Tris Base
0,5% Triton X100
2% Gelatine
-pH 7,5
- 37 -
Material und Methoden
Zytotoxizitäts-Assay
Der Zytotoxizitäts-Assay diente als Funktionstest für NK-Zellen und somit zur quantitativen
Bestimmung der zytotoxischen Aktivität. Dabei wurden Zielzellen der Linie K562 bzw. Jeg-3
mit dem Farbstoff „Carboxyfluorescein diacetate succinimidylester“ (CFSE) markiert (1 mM
CFSE) und für 12 Stunden unter Standardbedingungen kultiviert. Anschließend wurde eine
definierte Zellzahl (50000) zusammen mit den NK-Zellen (10000) für 4 Stunden erneut bei
37°C, 5% CO2 inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe der Propidiumjodid-Lösung (100µg/ml)
zu den Proben, um die, durch die Lyseaktivität der NK-Zellen freigewordene DNA der
Zielzellen anzufärben. Im Durchflußzytometer konnten durch die zwei Farbstoffe
Propidiumjodit und CFSE die toten (Propidiumjodit-markierte) und lebenden (CFSEmarkierte) Zielzellen unterschieden werden.
Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)
Die Durchflußzytometrie dient der Analyse von Zellen und deren Eigenschaften. Dabei
können durch die Antikörper-gekoppelte Färbung eine Vielzahl von Epitopen extrazellulär
auf- und intrazellulär in den Zellen markiert und analysiert werden. Weiterhin können durch
Fluoreszenzfarbstoffe Zellen direkt gefärbt werden (Zytotoxizitäts-Assay). Für die
Durchflußzytometrie wurde ein 5-Kanal-Durchflußzytometer vom Typ DAKO Galaxy
benutzt. Alle Messungen und Auswertungen wurden mit der Partec Flow Max-Software
durchgeführt.
Mit dem FACS wurden die Zytotoxizitäts-Assays, die Zytokin-Bestimmungen, sowie die
Reinheitsbestimmungen der isolierten Primärzell-Populationen analysiert. Dafür wurden 104
Zellen pro Messung benötigt, die in einem Eppendorf-Gefäß (1,5 ml) abzentrifugiert (1500g,
10 min, RT) wurden. Anschließend wurde der Überstand verworfen. Die anschließende
Markierung mit Fluoreszenz-Antikörpern diente der Reinheitsbestimmung isolierter
Primärzellen. Dafür wurden je 2,5 µl Fluoreszenz-Antikörper (Firma DAKO, Germany) zu
den Zellen gegeben und für 30 min bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß inkubiert.
Anschließend konnten die Zellen im FACS analysiert werden.
Zytokin-Bestimmung
In dem BD Cytometric Bead Array (BD CBA) für Th1/Th2-Zytokine sind 6
Partikelpopulationen mit verschiedenen Fluoreszenzintensitäten enthalten, an denen
Antikörper gegen IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α und IFN-γ gebunden sind (Abb. 3.5). Für
die Untersuchung der Zytokinproduktion von Zellen wurden die zellfreien Kulturüberstände
(50µl) zusammen mit der „Cytokine Capture Bead“-Lösung und 50µl PE-kunjugierten
Detektionsantikörpern in einem FACS-Analysegefäß inkubiert. Nach drei Stunden Inkubation
- 38 -
Material und Methoden
bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß wurden die Proben mit Waschpuffer versetzt,
zentrifugiert (800g, 5 min) und im FACS zusammen mit den Standards analysiert (Abb. 3.6).
Anhand der Fluoreszenzstärke der Beads konnten die einzelnen Zytokine unterschieden und
durch die PE-kunjugierten Detektionsantikörper die Konzentration der Zytokine im FACS
bestimmt werden. Zur Auswertung der Messdaten diente die FACS-Comp-Software (Firma
BD Biosciences).
Abb. 3.5 Funktionsweise des Cytometric Bead Array
Abb. 3.6 Darstellung der Messergebnisse
der Standards im FACS
Nachweis von sHLA-G in den Embryokulturüberständen
Für den Nachweis von sHLA-G in den Kulturüberständen humaner Embryonen wurde ein
sHLA-G ELISA der Firma EXBIO (Czech Republic) verwendet. Dafür wurden ELISAPlatten mit MEM-G/9-Antikörpern (Anti sHLA-G) beschichtet und mit den Proben für 2
Stunden inkubiert. Nach zwei Waschschritten erfolgte die einstündige Inkubation mit
Detektionsantikörpern
(Anti-β2-Mikroglobulin),
- 39 -
die
Horseradishperoxydase
(HRP)-
Material und Methoden
konjugiert waren. Nach zwei weiteren Waschschritten wurde das Substrat (H2O2Tetramethylbenzidin) zugegeben und nach ausreichender Farbänderung die Reaktion durch
die Änderung des pH-Wertes (durch Zugabe 0,2M Schwefelsäure) gestoppt. Detektiert wurde
der ELISA durch Messung der Absorption bei 450nm.
3.4.4 Xenotransplantation von humanen Trophoblastzellen in
RAG-20/γγc0 und C57BL/6J Mäuse
In diesem Experiment sollten humane Trophoblastzellen unter die Nierenkapsel von
Mäusen transplantiert werden. Danach sollte beobachtet werden, in wieweit die Mäuse
auf das Transplantat reagieren und durch histologische Schnitte der Zielgewebe die
Entwicklung und das Wachstum der Transplantate analysiert werden. Diese Arbeiten
wurden am „Ontario Veterinary College“ an der „University of Guelph“, Kanada in
der Arbeitsgruppe von Dr. Anne Croy in Zusammenarbeit mit Dr. Isabella Caniggia
aus dem „Samuel Lunenfeld Resaerch Institute“ des „Mount Sinai Hospital“, Toronto
dürchgeführt. In Abbildung 3.7 ist dieser Versuch als Überblick schematisch
dargestellt.
Haltung der Versuchstiere
Die Versuchstiere wurden im Tierexperimentellen Zentrum der „University of Guelph“,
Ontario, Kanada unter sterilen Bedingungen in Standardkäfigen gehalten (Lab Products Inc.,
Federalsburg, MD) und nach Standarddiäten gefüttert. Die Versuchstiere waren
augenscheinlich gesund und ausgewachsen. Alle Protokolle wurden vom „Animal Care
Commitee of the University of Guelph“ geprüft und beinhalteten die Richtlinien des
„Canadian Council of Animal Care“.
Genotypisierung der Versuchstiere (RAG-20/γc0)
Um zu überprüfen, ob bei den Versuchstieren des Stammes (RAG-20/γc0) beide Gene (Rag-2
-/- und Zytokin-Rezeptor-Kette-γ -/-) nicht in dem Genom enthalten sind, wurde DNA aus
einem kurzen Stück Gewebe des Schwanzes isoliert. Dazu wurde nach dem Anästhesieren der
Mäuse ca. 0,5 cm Gewebe des Schwanzes entnommen. Dieses Gewebsstück wurde in 600µl
TNES-Puffer und 35µl Proteinase K (10mg/ml) für 24 Stunden bei 57°C inkubiert.
Anschließend gab man 166 µl NaCl (6M) zu und nach kurzem Schütteln zentrifugierte man
die Lösung bei 12000g und Raumtemperatur für 5 min. Der Überstand wurde in ein neues
Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und es wurden 800µl kalter, 95% -iger Ethanol zugefügt.
- 40 -
Material und Methoden
Danach erfolgte die Zugabe von 40µl Natriumacetat (3M) und die Zentrifugation bei 12000g
für 30 min bei 4°C. Es folgten zwei Waschschritte mit 70% -igem Ethanol und das Lösen des
Pellets in 100µl Tris-EDTA. Letztlich wurde die DNA-Lösung für 10 min bei 65°C erhitzt
und spektrometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm quantifiziert.
Für den Nachweis der Gene für Rag-2 und der Zytokin-Rezeptor-Kette-γ wurde eine „HotStart“-PCR (Thermocycler Firma Eppendorf) durchgeführt (92°C für 30s, 60°C für 90s, 72°C
für 120s; 30 Zyklen - 72°C für 10 Minuten), die DNA in einem 2%-igen Agarosegel
aufgetrennt und die Fragmente mittels Ethidiombromid und UV-Strahlung sichtbar gemacht.
Für das Transplantatiosexperiment wurden anhand dieser Analyse die Tiere ausgewählt, die
für die Rag-2-Gene und die Gene der Zytokin-Rezeptor-Kette-γ -/- negativ waren.
TNES:
Tris-EDTA:
10mM Tris, pH 7,5
PCR-Ansatz : Wasser
14,8µl
400mM NaCl
10x PCR Puffer
2,5µl
100mM EDTA
Nukleotide
4,0µl
0,6% SDS
Primer (10pmol/ml) je 1,25µl
10mM Tris, pH 8,0
Taq Polim. (0,31U)
4,0 µl
1mM EDTA
DNA
1µl
Präparation des humanen Deciduagewebes zur Transplantation
Das Deciduagewebe wurde von Frau Dr. Isabella Cannigia isoliert und in DMEM-Medium
(10% FKS, 2% AAS) kultiviert. Die Gewebsstücke waren je ca. 2 mm groß und wurden von
Interruptio-Placenten der 5. und 10.SSW bzw von Placenten der 40.SSW isoliert. Als
Transportgefäße von dem Mont Sinai Hospital, Toronto nach Guelph dienten 1,5ml
Eppendorf-Reaktionsgefäße, die bei 4°C gelagert wurden.
Transplantation
Ziel dieses Experimentes war eine stabile Kultur von humanen Trophoblastzellen unter der
Nierenkapsel von immundefizienten und -kompetenten Mäusen zu etablieren. Weiterhin sollte
durch histologische und immunologische Analysen die Vitalität der Transplantate
nachgewiesen und verglichen werden.
Dazu wurde unter Allgemeinanästhesie (subkutane Injektion von 0,2-0,6ml Avertin
245
) in
Bauchlage die Oberhaut der Mäuse unter sterilen Bedingungen im Bereich der Wirbelsäule
1cm horizontal eröffnet und bis zum rechten Nierenlager abgeschoben. Es erfolgte die
Eröffnung der Bauchhöhle durch einen Unterhautquerschnitt und die Niere wurde unter
Erhaltung des Nierenstieles exponiert. Die Nierenkapsel wurde an dem unteren Pol inzidiert
und das Transplantat mittels einer Glaspipette unter die Nierenkapsel eingeschoben und am
- 41 -
Material und Methoden
oberen Pol fixiert. Anschließend wurde die Niere in den Eingeweidesack reponiert und die
Wunde mit sterilen Wundverschlussklemmen verschlossen. Die Lagerung der Tiere bis zum
Erwachen erfolgte unter einer Wärmelampe.
Versuchsschema:
Humanes
Placentagewebe
-Separation in Gewebsstücke (5mm2)
-Isolation von Trophoblasten
-Transplantation unter die rechte Nierenkapsel
RAG-2º/ãcº
n=140
C57Bl/6J
n=40
(immundefizient)
(immunkompetent)
Intravenöse
Injektion von 100µl
Serum von
Patienten mit
Präeklampsie
n=4
Euthanisierung nach
2 bis 68 Tagen
Serum-Hormon-Analysen,
Histologie
Abb 3.7: Übersicht des Transplantationsexperimentes, Versuchsaufbau
Gewebe und Blutentnahme
Nach der Inkubationszeit (2-68 Tage) wurden die Versuchstiere in einer Kammer durch
Zugabe von Kohlenstoffdioxid getötet und ca. 1 ml Blut für Hormonanalysen aus dem Herz
entnommen. Anschließend wurden die Ovarien, der Uterus und die Nieren entnommen.
Histologie
Durch histologische Untersuchungen sollten die erfolgreiche Transplantation und die Invasion
der Transplantate beobachtet werden. Die entnommenen Gewebe wurden in Formalin (5%)
fixiert und über Nacht entwässert und mit Paraffin durchdrängt. Anschließend wurden die
Gewebe in Paraffin-Blöcke eingegossen und ausgehärtet. Die Blöcke wurden durch ein
Mikrotom geschnitten, auf Objektträgern fixiert und getrocknet. Die Objektträger wurden
- 42 -
Material und Methoden
durch Xylen- und Ethanolbäder deparafinisiert und in Wasser gewaschen. Danach folgte der
Färbeschritt mit Hematoxalin (Poly Scientific); anschließend wurden die Objektträger in
Wasser gewaschen, mit Ethanol entfärbt und nach wiederholtem Wasserbad für den zweiten
Färbeschritt kurz in Eosin (Poly Scientific) getaucht. Zum Abschluss der Färbung wurden die
Objekte wieder durch Ethanolbäder entwässert und im Xylenbad für das Abdecken mit
Deckgläschen vorbereitet. Dazu wurde ein Tropfen Permount (Firma Fisher Scientific) auf
den Objektträger gegeben, das Deckgläschen blasenfrei aufgelegt und über Nacht getrocknet.
Die Histologischen Schnitte wurden mikroskopisch ausgewertet (Axiowert 25, Firma Zeiss)
und fotografiert.
Enzyme Linked Immonusorband Assay (ELISA)
Zur Analyse der Vitalität und zum Vergleich des Wachstums von humanen Trophoblastzellen
in Mäusen wurde das Serum der Versuchstiere auf die Konzentration von β-HCG (Human
Free β-HCG ELISA Kit, Alpha Diagnostic International, Inc., USA) untersucht. β-HCG wird
von humanen Trophoblastzellen sezerniert und dient als Vitalitätsnachweis. Dafür wurden
25µl der Serumproben in die vorgefertigten ELISA-Platten gegeben, mit 100µl AntikörperEnzym Konjugat versetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend
wurden die Platten mit Waschpuffer gespült, man gab 100 µl des HRP-Substrates (Lösung A)
und 100 µl des HRP-Substrates (Lösung B) zu und inkubierte es für weitere 10 Minuten bei
Raumtemperatur. Nach der Zugabe von 50µl Stopp-Lösung wurde die Absorption bei 450 nm
Wellenlänge gemessen und die Proben mit den Standards verglichen.
3.5 Statistik
Für die statistische Analyse der Ergebnisse wurde der T-Test für gepaarte Stichproben
verwendet. Für p<0,05 wurde das Ergebnis als statistisch signifikant betrachtet. Die
Berechnungen erfolgten mittels SPSS 11.5S Software, die freundlicherweise von dem
Universitätsrechenzentrum zur Verfügung gestellt wurde.
3.6 Darstellung der Ergebnisse
Die Ergebnisse der numerischen Tests (Invasionsassays, ELISAs, Proliferationstests,
Zytotoxizitätstests u.a.) sind in Balkendiagrammform dargestellt. Abgebildet werden die
Mittelwerte, sowie der Standardfehler. Für die Western Blot Analysen wurden die relevanten
Banden abgebildet und teilweise Intensitätsanalysen mittels Scion Image Software dargestellt.
Für die histologischen Untersuchungen wurden repsäsentative Objektausschnitte im Anhang
abgebildet.
- 43 -
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1 Einfluss der Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF auf die STAT3Aktivierung in Choriokarzinom-Zellen
In diesem Experiment sollten die Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF auf ihre Fähigkeit
untersucht werden, in Jeg-3 Choriokarzinomzellen als Modell für Trophoblastzellen eine
Phosphorylierung von STAT3 zu induzieren. Dafür wurden die Zellen kultiviert, Zytokine
zugegeben und nach verschiedenen Zeitpunkten Proben für die PAGE und den Western Blot
entnommen. Die abgebildeten Western Blots zeigen die Phosporylierung von STAT3 (Tyr
705) in den einzelnen Proben verglichen mit einer Positiv- und Negativkontrolle für die
Phosphorylierung, sowie die Expression von STAT3 als Auftragskontrolle.
15 min
30 min
60 min
ß Phospho-STAT3 (Tyr 705)
ß STAT3
-
1
10
100
1
10
100
1
10
100
+
LIF (ng/ml)
Abb: 4.1 Western Blot für Phospho-STAT3 und
STAT3 aus Jeg-3 Zellen nach Stimulation mit LIF
Es ist zu erkennen, dass LIF in einer Konzentration von 10 ng/ml nach 15 min eine
Phosphorylierung von STAT3 in Jeg-3 Zellen induziert, die bei höheren Konzentrationen
verstärkt wird (Abb: 4.1). Nach einer Inkubationszeit von 30 min lässt sich auch bei einer
Konzentration von 1 ng/ml eine leichte Phosphorylierung erkennen. Nach 60 min nimmt die
Phosphorylierung bei einer Konzentration von 200 ng/ml leicht ab, während kein Unterschied
in den anderen Konzentrationen zu beobachten ist.
Bei der Betrachtung der Western Blots für Jeg-3 Zellen, die mit IL-6 stimuliert wurden, fällt
auf, dass nach 15 min keine Phosphorylierung zu sehen ist (Abb: 4.2). Nach einer
Inkubationszeit von 30 min ist eine leichte Phosphorylierung von STAT3 bei einer
Konzentration von 20 ng/ml und 200 ng/ml, verglichen mit den Kontrollen zu erkennen. Nach
einer Inkubationszeit von 60 min ist keine Phosphorylierung zu detektieren.
- 44 -
Ergebnisse
15 min
30 min
60 min
ß Phospho-STAT3 (Tyr 705)
ß STAT3
-
2
20
200
2
20
200
2
20
200
+
IL-6 (ng/ml)
Abb: 4.2 Western Blot für Phospho-STAT3 und
STAT3 aus Jeg-3 Zellen nach Stimulation mit IL-6
Die Abbildung des Western Blots für Phospho-STAT3 aus Jeg-3 Zellen, stimuliert mit IGF-2
zeigt, dass dieses Zytokin eine sehr schwache Phosphorylierung von STAT3 bei 125 ng/ml
und 1250 ng/ml nach 30 min induziert (Abb: 4.3). In den anderen Konzentrationen, bzw. nach
anderen Zeitintervallen beeinflußt IGF-2 die Phosphorylierung von STAT3 nicht.
15 min
30 min
60 min
ß Phospho-STAT3 (Tyr 705)
ß STAT3
-
12,5 125 1250
12,5
125 1250 12,5 125
1250
+
IGF-2 (ng/ml)
Abb: 4.3 Western Blot für Phospho-STAT3 und
STAT3 aus Jeg-3 Zellen nach Stimulation mit IGF-2
Die Western Blots von Jeg-3 Zellen stimuliert mit HGF zeigen, dass dieses Zytokin keinen
Einfluss auf den Phosphorylierungszustand von STAT3 in Jeg-3 Zellen hat (Abb: 4.4).
- 45 -
Ergebnisse
15 min
30 min
60 min
ß Phospho-STAT3 (Tyr 705)
ß STAT3
-
1
10
100
1
10
100
1
10
100
+
HGF (ng/ml)
Abb: 4.4 Western Blot für Phospho-STAT3 und
STAT3 aus Jeg-3 Zellen nach Stimulation mit HGF
Es kann zusammengefasst werden, daß nur LIF in der Lage ist, eine starke Phosphorylierung
von STAT3 in Jeg-3 Zellen zu induzieren; IL-6 und IGF-2 induzieren eine sehr geringe
Phosphorylierung von STAT3.
4.2 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von HT-29 Zellen
In diesem Experiment sollte die Rolle von STAT3 bezüglich der Invasivität von HT-29
Kolonkarzinimzellen untersucht werden. Da an diesen Zellen schon mehrfach erfolgreiche
Transfektionen durchgeführt wurden, diente diese Versuchsreihe der Etablierung der
Oligonukleotide zum „Knock Down“ von STAT3. Es wurden zum einen Transfektionen mit
unterschiedlichen Konzentrationen von STAT3-siRNA-Oligonukleotiden und zum anderen
eine Kontrolltransfektion durchgeführt, um die Spezifizität des STAT3 „Knock Down“ zu
kontrollieren. Bei der Kontrolltransfektion wurden die selben Nukleotide verwendet, wie in
den „Knock Down“-Oligonukleotiden, allerdings waren diese in einer nicht-genomischen
Reihenfolge angeordnet.
Die Abbildung 4.5 zeigt die Korrelation der STAT3-Expression auf das Invasionsverhalten
von HT-29 Kolonkarzinomzellen; der abgebildete Western Blot zeigt die Expression von
STAT3. Es ist zu sehen, dass die Kontrolltransfektion keinen Einfluss auf das
Invasionsverhalten dieser Zellen hat, während eine Reduktion der STAT3-Expression die
Invasion der Zellen signifikant reduziert. Diese Reduktion der Invasivität ist von der
Konzentration der transfizierten siRNA und somit von der Konzentration der exprimierten
STAT3-Moleküle abhängig.
- 46 -
Ergebnisse
ß STAT3
35
% invadierte Zellen
30
25
*
20
*
15
*
*
10
1-
2
Transfektion
mit KontrollsiRNA
3
132nM
4
66nM
5
33nM
6
10mM
Transfektion mit STAT3 siRNA
Abb. 4.5: Western Blot für STAT3 aus HT-29 Kolon-Karzinom-Zellen nach STAT3„Knock Down“ mittels siRNA, Ergebnisse der Matrigel-Invasionsassays. Dargestellt sind
die Standardfehler und Signifikanzen (p<0,05), n=3
Tabelle 4.1 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten
der Werte aus Abbildung 4.5
Proben
Irrtumswahrscheinlichkeit
nativ – Kontroll-siRNA
p=0,622
nativ – STAT3-siRNA (132nM)
p=0,006
nativ – STAT3-siRNA (66nM)
p=0,001
nativ – STAT3-siRNA (33nM)
p=0,007
nativ – STAT3-siRNA (10nM)
p=0,003
Es kann zusammengefasst werden, dass die designten Oligonucleotide spezifisch an die
STAT3-mRNA gebunden haben und die Expression von STAT3 in HT-29 Zellen vermindert
werden konnte. Die Invasivität korrelierte mit dem STAT3-Gehalt der HT-29 Zellen.
- 47 -
Ergebnisse
4.3 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von Jeg-3 Zellen
In den folgenden Experimenten sollte der Zusammenhang zwischen den Beobachtungen aus
den
vorangegangenen
Versuchen
und
der
physiologischen
Bedeutung
in
Jeg-3
Choriokarzinomzellen als Modell für Trophoblastzellen untersucht werden. Dazu wurden zum
einen Jeg-3 Zellen mit IL-6 und LIF in Invasionsassays stimuliert und zum anderen durch die
Transfektion mit siRNA die Expression von STAT3 unterdrückt.
-
LIF
(10 ng/ml)
Jeg3Zellen
-
LIF
(10 ng/ml)
Transfektion
mit KontrollsiRNA
-
LIF
(10 ng/ml)
Transfektion
mit STAT3
siRNA
Abb. 4.6: Western Blot für STAT3 aus Jeg-3 Choriokarzinomzellen
nach STAT3-Knock Down mittels siRNA, Stimulation mit LIF
In dieser Abbildung ist zu erkennen, dass die Expression von STAT3 mittels siRNA (66nM)
in Jeg-3 Zellen als Modellzellinie für Trophoblastzellen erfolgreich unterdrückt werden
konnte. Weiterhin ist zu erkennen, dass durch LIF die Expression von STAT3 nicht
beeinflusst wird.
*
60
% invadierte Zellen
50
*
*
40
Jeg-3 Zellen
Jeg-3 Zellen + IL-6 (20 ng/ml)
Jeg-3 Zellen + LIF (10 ng/ml)
30
20
10
0
1
Jeg-3 Zellen
2
Transfektion
mit Kontroll
siRNA
3
Transfektion
mit STAT3siRNA (60 nM)
Abb. 4.7: Ergebnisse der Matrigel-Invasionsassays von Jeg-3 Choriokarzinomzellen nach
STAT3-„Knock Down“ mittels siRNA und Stimulation mit IL-6 und LIF, Dargestellt sind
die Standardfehler und die relevanten Signifikanzen (p<0,05), n=3
- 48 -
Ergebnisse
Die Abbildung 4.7 zeigt den Einfluss der Zytokine IL-6 und LIF auf die Invasivität von Jeg-3
Zellen. Es ist zu erkennen, dass IL-6 die Invasion von Jeg-3 Zellen signifikant erhöht
(p=0,02). LIF hat einen noch stärkeren Effekt bezüglich der Invasion in Jeg-3 Zellen
(p=0,001). Diese Beobachtung korreliert mit den Ergebnissen aus den Western Blots, die eine
Aktivierung von STAT3 durch diese Zytokine aufwiesen. Die Kontrolltransfektion zeigt
kaum einen Unterschied zu den Ausgangszellen, während ein STAT3 „Knock Down“ die
Invasion dieser Zellen signifikant reduziert (p=0,002). Die stimulatorischen Effekte von IL-6
und LIF bezüglich der Invasion waren in den STAT3 „Knock Down“ Zellen nicht zu
beobachten (p>0,05).
Tabelle 4.2 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten
der Werte aus Abbildung 4.7
Proben
Irrtumswahrscheinlichkeiten
nativ – nativ+IL-6
p=0,02
nativ – nativ+LIF
p=0,001
nativ – STAT3-siRNA
p=0,002
STAT3-siRNA – STAT3-siRNA-IL-6
p=0,529
STAT3-siRNA – STAT3-siRNA-LIF
p=0,069
4.4 Einfluss von STAT3 auf das Invasionsverhalten von Trophoblastzellen
Jeg-3 Zellen dienen als Modell für Trophoblastzellen, da wesentliche Merkmale und
Eigenschaften mit denen von Trophoblastzellen übereinstimmen. Während der Entwicklung
der Placenta invadieren Trophoblastzellen unterschiedlich stark in mütterliches Gewebe ein.
Die Rolle von STAT3 in diesem streng kontrollierten Prozess sollte in einem weiteren
Experiment untersucht werden. Dazu wurden Trophoblastzellen aus Placenten der 12. und
40.SSW (nach termingerechter Geburt) isoliert und das Invasionsverhalten in Invasionsassays
analysiert. Weiterhin wurde in diesen Primärzellen die Expression von STAT3 mittels siRNA
unterdrückt.
Die Abbildung 4.8 zeigt einen Western Blot für STAT3 von Trophoblasten der 12. und
40.SSW (reife Trophoblasten), sowie die Aktin-Ladekontrolle. Es ist zu erkennen, dass in
den, mit STAT3-siRNA transfizierten Trophoblasten weniger STAT3 exprimiert wurde, als in
den Kontrollen.
- 49 -
Ergebnisse
Abb. 4.8: Western Blot für STAT3 und Aktin aus primären
Trophoblastzellen nach STAT3-Knock Down mittels siRNA,
graphische Darstellung der Intensität der Banden
In der Abbildung 4.9 sind die Ergebnisse der Invasionsassays von Jeg-3 und
Trophoblastzellen nach STAT3 „Knock Down“ abgebildet. Es ist zu erkennen, dass
Trophoblastzellen aus Placenten nach der Geburt eine sehr geringe Invasivität aufweisen, die
auch nur bedingt durch LIF gesteigert werden kann. Trophoblasten der 12.SSW weisen ein
erhöhtes Invasionsverhalten auf, was durch LIF signifikant gesteigert werden konnte. Die
Invasivität und der Einfluss von LIF war bei Jeg-3 Zellen am größten. Die Zellen, die mit
Kontroll-siRNA transfiziert wurden, wiesen kaum Unterschiede zu den nativen Zellen auf,
während in den STAT3-„Knock Down“-Zellen die Invasion in allen Zellpopulationen
signifikant gesunken war (Abb: 4.9, Tab: 4.3). Der Einfluss von LIF auf die Invasivität dieser
Zellen konnte nicht mehr beobachtet werden.
Tabelle 4.3 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten
der Werte aus Abbildung 4.9
Proben
Irrtumswahrscheinlichkeiten
Troph. 40.SSW – Troph. 40.SSW (Kontroll-siRNA)
p=0,713
Troph. 40.SSW – Troph. 40.SSW (STAT3-siRNA)
p<0,001
Troph. 40.SSW – Troph. 40.SSW (+LIF)
p=0,001
Troph. 40.SSW (STAT3 siRNA) –
Troph. 40.SSW (STAT3-siRNA) (+LIF)
p=0,760
Troph. 12.SSW – Troph. 12.SSW (Kontroll-siRNA)
p=0,424
Troph. 12.SSW – Troph. 12.SSW (STAT3-siRNA)
p<0,001
Troph. 12.SSW – Troph. 12.SSW (+LIF)
p<0,001
- 50 -
Ergebnisse
Fortsetzung Tabelle 4.3
Troph. 12.SSW (STAT3-siRNA)
– Troph. 40.SSW (STAT3-siRNA) (+LIF)
p=0,462
Jeg 3 – Jeg 3 (Kontroll-siRNA)
p=0,385
Jeg 3 – Jeg 3 (STAT3-siRNA)
p<0,001
Jeg 3 – Jeg 3 (+ LIF)
p<0,001
Jeg 3 (STAT3-siRNA)– Jeg 3 (STAT3-siRNA) (+LIF)
p=0,015
*
*
60
*
% invadierte Zellen
50
40
*
*
*
30
20
10
0
Zellen
Zellen
+ LIF
(10 ng/ml)
Zellen
Zellen
+ LIF
(10 ng/ml)
Zellen
KontrollsiRNA
Trophoblastzellen der 40.SSW
Trophoblastzellen der 12.SSW
Zellen
+ LIF
(10 ng/ml)
STAT3-siRNA
Jeg-3 Zellen
Abb. 4.9: Ergebnisse der Matrigel-Invasionsassays von erst-Trimester-Trophoblastzellen,
reifen Trophoblasten und Jeg-3 Choriokarzinomzellen nach STAT3-„Knock Down“,
Stimulation mit IL-6 und LIF. Dargestellt sind die Standardfehler und relevante
Signifikanzen (p<0,05), n=3
- 51 -
Ergebnisse
4.5 Einfluss von SOCS3 auf die Phosphorylierung von STAT3 in Jeg-3
Zellen
Dieser Test sollte die Wirkung von SOCS3 auf die durch IL-6 induzierte Prosphorylierung
von STAT3 in Jeg-3 Zellen zeigen. Dazu wurde die Expression von SOCS3 in Jeg-3 Zellen
durch die Transfektion mit siRNA unterdrückt und die Zellen wurden 24 Stunden nach der
Transfektion mit IL-6 (200ng/ml) für 30 min stimuliert. Anschließend wurde die Expression
von Phospho-STAT3 und STAT3 mittels Western Blot analysiert.
ß Phospho-STAT3 (Tyr 705)
ß STAT3
-
Transfektion
mit KontrollsiRNA
Transfektion
mit SOCS3siRNA (66nM)
Abb 4.10: Western Blot für Phospho-STAT3 und STAT3 in Jeg-3 Zellen
nach Transfektion mit SOCS3-siRNA, Stimulation mit IL-6
In Abbildung 4.10 (siehe auch Abb 4.2) ist zu erkennen, dass die Stimulation mit IL-6 eine
Phosphorylierung von STAT3 induziert. Der „Knock Down“ von SOCS3 verstärkt den
Phosphorylierungsgrad von STAT3, verglichen mit den Kontrollen. Der Western Blot für
STAT3 dient als Auftragskontrolle.
4.6 Einfluss von STAT3 und SOCS3 auf die Proliferation von Jeg3-Zellen
Dieser Test sollte den Einfluss des STAT3- und SOCS3-„Knock Downs“, sowie die Wirkung
von LIF auf die Proliferation von Jeg-3 Zellen zeigen. Dazu wurde die Expression von
STAT3 und SOCS3 in Jeg-3 Zellen durch die Transfektion mit siRNA unterdrückt und die
Zellen wurden mit LIF (10ng/ml) stimuliert. Nach 48 Stunden wurde die Proliferation der
Zellen durch Messung der Absorption bei 495 nm nach Zugabe des „Cell Titer 96Aqueous
One Solution Reagent“ ermittelt.
In der Abbildung 4.11 ist die Steigerung der Proliferation von Jeg-3 Zellen induziert durch
LIF dargestellt. Es ist zu beobachten, dass die Stimulaion mit LIF zu einer leichten Erhöhung
in nativen Jeg-3 Zellen und Jeg-3 Zellen der Kontrolltransfektion führt. In STAT3-„Knock
Down“ Zellen hat LIF keinen steigernden Effekt, während die LIF-Stimulation von Zellen,
- 52 -
Ergebnisse
die mit SOCS3-siRNA transfiziert wurden, zu einer signifikanten Erhöhung der Proliferation
führt.
50
*p=0,002
durch LIF in %
Steigerung der Proliferation
40
30
20
10
0
-10
KontrollsiRNA
-
SOCS3Knock Down
STAT3Knock Down
Abb: 4.11 Ergebnisse der Proliferationstests von Jeg-3 Zellen, Stimulation mit LIF
(10 ng/ml). Dargestellt sind die Differenzen der Proliferation zwischen stimulierten und
unstimulierten Zellen, die Standardfehler und relevante Signifikanzen (p<0,05), n=5
Tabelle 4.4 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten
der Werte aus Abbildung 4.10
Proben
Irrtumswahrscheinlichkeiten
nativ – Kontroll-siRNA
p=0,514
nativ – STAT3-siRNA
p=0,244
nativ – SOCS3-siRNA
p=0,002
4.7 Einfluss von STAT3 auf das Apoptoseverhalten von Trophoblasten
Um zu untersuchen, ob die beobachteten Effekte nach dem „Knock Down“ von STAT3 durch
die Induktion der Apoptose entstanden, wurde die gespaltene Poly ADP-Ribose Polymerase
in diesen Zellen gemessen. PARP ist ein Reparaturenzym, welches an DNAEinzelstrangbrücke bindet, die bei beginnender Apoptose entstehen. Durch verschiedene
Enzyme werden diese Moleküle nach Induktion der Apoptose in zwei Teile gespalten und
diese können durch Antikörper nachgewiesen werden.
- 53 -
Ergebnisse
cleaved PARP + Zellen in %
10
8
6
4
2
0
-
Kontroll siRNA
Stat3-KO
Abb. 4.12: Ergebnisse der intrazellulären cleaved PARPFärbung als Apoptosemarker in reifen Trophoblasten nach
STAT3-Knock Down, dargestellt sind die Standardfehler.
n=3
In der Abbildung 4.12 ist zu erkennen, dass der Knock Down von STAT3 keinen
signifikanten Einluß auf das Apoptoseverhalten von Trophoblastzellen der 40.SSW hat. Somit
kann ausgeschlossen werden, dass die entstandenen Effekte des STAT3-„Knock Down“ in
den vorangegangenen Experimenten durch die Induktion der Apoptose in diesen Zellen
entstanden sind.
Tabelle 4.5 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten
der Werte aus Abbildung 4.11
Proben
Irrtumswahrscheinlichkeiten
nativ – Kontroll-siRNA
p=0,284
nativ – STAT3-siRNA
p=0,328
4.8 Einfluss von STAT6 auf das Invasionsverhalten und die Proliferation
von Jeg-3 Zellen
STAT6 ist maßgeblich an der Entwicklung stark invadierender Zellen beteiligt, reguliert die
Proliferation, Malignität und Produktion von Hormonen in Tumorzellen. In diesem
Experiment sollte untersucht werden, ob die Stimulation von STAT6 durch IL-4, bzw. ein
„Knock Down“ von STAT6 in Jeg3 Zellen deren Invasionsverhalten beeinflusst. Dazu
wurden native Jeg-3 Zellen mit Kontroll-siRNA, sowie mit unterschiedlichen Konzentrationen von STAT6-siRNA transfiziert und in Matrigel-Invasionsassays analysiert.
- 54 -
Ergebnisse
% invadierte Zellen
25
20
Jeg-3 Zellen
Jeg-3 Zellen + IL-4 (50ng/ml)
15
10
5
0
KontrollsiRNA
-
176nM
132nM
66nM
Transfektion mit STAT6 siRNA
Abb. 4.13: Ergebnisse der Matrigel-Invasionsassays von Jeg-3 Choriokarzinomzellen nach
STAT6-„Knock Down“, Stimulation mit IL-4. Dargestellt sind die Standardfehler. n=3
In der Abb. 4.13 ist zu erkennen, dass weder die Stimulation mit IL-4, die Transfektion mit
Kontroll-siRNA, noch der „Knock Down“ von STAT6 einen Einfluss auf die Invasivität von
Jeg3 Zellen haben (p>0,05). Selbst bei sehr großen Konzentrationen der STAT6-siRNA (176
nM) konnte kein Effekt beobachtet werden.
Weiterhin sollte untersucht werden, ob die durch IL-4 induzierte Stimulation der Proliferation
von Jeg-3 Zellen, durch einen STAT6 „Knock Down“ beeinflusst werden kann. Die
Ergebnisse der Proliferationstests
14
Erhöhung der Proliferation von
12
dass
IL-4
zu
Jeg-3 Zellen führt (Abb: 4.14).
Eine ähnliche Reaktion zeigen
Jeg-3 Zellen, die mit KontrollsiRNA
transfiziert
während
in
wurden,
STAT6-„Knock
Down“ Zellen die Steigerung der
Proliferation,
induziert
durch
Relative Erhöhung der
Proliferation durch IL4 in %
einer
zeigen,
10
8
6
4
2
0
-2
-
IL-4, stark abnahm. Auf Grund
der
Schwankungsbreite
der
Ergeb-nisse ergaben sich zwar
keine
Signifikanzen
doch
wiesen
die
(p>0,05),
Transfektion
mit KontrollsiRNA
176nM
132nM
66nM
Transfektion mit STAT6 siRNA
Abb: 4.14 Ergebnisse der Proliferationstests. Dargestellt
ist die Differenz der Proliferation von Jeg-3 Zellen
zwischen mit IL-4 stimulierten und unstimulierten Zellen.
Dargestellt sind die Standardfehler. n=5
Ergebnisse
eindeutige Tendenzen auf.
- 55 -
Ergebnisse
4.9 „Knock Down“ von HLA-G und HLA-G1 in Jeg3-Zellen
Jeg-3 Zellen exprimieren, wie auch Trophoblastzellen und andere Tumorzellinien, HLA-G
und werden so vor einer möglichen Immunantwort geschützt. In diesem Experiment sollte
durch die Transfektion mit siRNA die Expression von HLA-G bzw. HLA-G1 unterdrückt
werden. Da mittels siRNA nur die Neuexpression unterdrückt, nicht aber vorhandene HLAG-Moleküle abgebaut werden, sollte untersucht werden, ob 24 Stunden nach der Transfektion
ein Effekt beobachtet werden kann.
ß HLA-G
ß Aktin
Abb. 4.15: Western Blot für HLA-G und Aktin aus
Jeg-3 Choriokarzinomzellen nach HLA-G und HLAG1 Knock Down mittels siRNA.
In der Abbildung 4.15 ist ein repräsentativer Western Blot für HLA-G von Jeg-3
Choriokarzinomzellen nach dem „Knock Down“ von HLA-G und HLA-G1 mittels siRNA
dargestellt. Der Nachweis von Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet. Es ist zu
beobachten, dass durch die Transfektion mit siRNA die Expression von HLA-G verringert
werden konnte. Dabei fällt auf, dass sich die Expression von HLA-G in Zellen, die mit HLAG siRNA bzw. mit HLA-G1 siRNA transfiziert wurden, kaum unterscheidet. Die geringste
HLA-G Expression wurde in den Zellen gemessen, die mit der größten Konzentration
(132nM) HLA-G1-siRNA transfiziert worden sind.
- 56 -
Ergebnisse
4.10 Einfluss von HLA-G und HLA-G1 in Jeg-3 Zellen auf die Zytotoxizität
von NK-Zellen
In diesem Versuch sollte untersucht werden, in wieweit der „Knock Down“ von HLA-G und
HLA-G1 in Jeg-3 Zellen, die als Zielzellen dienen, die Zytotoxizität von NK-Zellen
beeinflusst. Dazu wurden Jeg-3 Zellen nach der Transfektion mit HLA-G und HLA-G1
siRNA mit CFSE gefärbt und zusammen mit isolierten NK-Zellen aus dem peripheren Blut
für 12 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Zellen im FACS analysiert, nachdem die
toten Zellen mit Propidiumjodit angefärbt wurden.
140
rel. Zytotoxizität
130
120
110
100
90
80
Jeg-3 Zellen
Jeg-3 Zellen,
Transfektion
mit Kontroll siRNA
Jeg-3 Zellen,
Transfektion
mit HLA-GsiRNA
Jeg-3 Zellen,
Transfektion
mit HLA-G1siRNA
Abb. 4.16: Graphische Darstellung der Zytotoxizität von NK-Zellen
gegenüber Jeg-3 Zellen nach HLA-G und HLA-G1-„Knock Down“.
Dargestellt sind die Standardfehler. n=3
In der Abbildung 4.16 ist die relative Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber Jeg-3 Zellen
dargestellt, wobei die Aktivität der NK-Zellen gegenüber nativen Jeg-3 Zellen als 100%
betrachtet wurde. Es ist zu sehen, dass die Transfektion mit HLA-G1-siRNA zu einer starken,
wenn auch nicht signifikanten Erhöhung der Zytotoxizität, verglichen mit den Kontrollen
führt. Die Transfektion mit HLA-G-siRNA löste eine geringe Steigerung der Zytotoxizität
aus.
Tabelle 4.6 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten
der Werte aus Abbildung 4.16
Proben
Irrtumswahrscheinlichkeiten
Jeg-3 nativ – Kontroll-siRNA (66nM)
p=0,849
Jeg-3 nativ – HLA-G-siRNA (66nM)
p=0,056
Jeg-3 nativ – HLA-G1-siRNA (66nM)
p=0,119
- 57 -
Ergebnisse
4.11 Einfluss von STAT3 auf die Zytotoxizität von dezidualen NK-Zellen
In diesem Experiment sollte die Bedeutung des Signaltransduktors STAT3 bezüglich der
Zytotoxizität von dezidualen NK-Zellen untersucht werden. Dazu wurde in NK-Zellen aus
dem peripheren Blut die Expression von STAT3 mittels siRNA unterdrückt und nach einer
Inkubationszeit von 24 Stunden ein Zytotoxizitätstest durchgeführt. Als Zielzellen dienten
K562-Zellen, die nach der Kultivierung zusammen mit den NK-Zellen im FACS analysiert
wurden. In der Abbildung 4.17 ist die relative Zytotoxizität dargestellt, wobei die Aktivität
der nativen NK-Zellen als 100% betrachtet wurden. Es ist zu sehen, dass die Transfektion mit
Kontroll-siRNA nur eine sehr kleine, nicht signifikante Reaktion auslöst, während die
Transfektion mit STAT3-siRNA die Zytotoxizität, abhängig von der Konzentration der
Oligonukleotide, signifikant hemmt.
120
*
*
rel. Zytotoxizität in %
100
80
60
40
20
0
-
Transfektion
mit KontrollsiRNA
198 nM
132 nM
66 nM
Transfektion mit
STAT3 siRNA
Abb. 4.17: Graphische Darstellung der Zytotoxizität von NKZellen nach STAT3-Knock Down gegenüber K562-Zellen.
Dargestellt sind die Standardfehler und relevante Signifikanzen
(p<0,05). n=3
Tabelle 4.7 Darstellung der Irrtumswahrscheinlichkeiten
der Werte aus Abbildung 4.17
Proben
Irrtumswahrscheinlichkeiten
nativ – STAT3-siRNA (198nM)
p=0,035
nativ – STAT3-siRNA (132nM)
p=0,043
nativ – STAT3-siRNA (66nM)
p=0,63
- 58 -
Ergebnisse
4.12 Zytokinproduktion humaner Embryonen
In dieser Versuchsreihe sollte die Konzentration ausgewählter Zytokine und sHLA-G1 in den
Überständen von Embryokulturen analysiert werden. Dabei wird dieses Experiment mit einer
relativ geringen Probenanzahl als Vorversuch für folgende Projekte in Zusammenarbeit mit
Frau Dr. Hoppe des IVF-Labors der Universitätsfrauenklinik Jena dargestellt. Die Embryonen
wurden in 500µl IVF-Medium für 72 Stunden unter Standard-bedingungen inkubiert, die
Überstände wurden bei –20°C gelagert und freundlicherweise von Frau Dr. Hoppe zur
Verfügung gestellt. Bei der Zytokinanalyse standen besonders die Zytokine IL-10, IL-6, IL-4,
IFN-γ und TNF-α im Mittelpunkt.
Konzentration in pg/ml
16,0
14,0
12,0
10,0
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
IFNg
IFN-γ
IL-10
IL-10
IL-6
IL-6
IL-4
IL-4
TNFa
TNF-α
Abb. 4.18: Graphische Darstellung der mittleren Zytokinkonzentration in Embryokulturüberständen nach 24 Stunden Kultivierung (n=7)
In der Abbildung 4.18 ist zu erkennen, dass vor allem IL-4 konstant und in großen Mengen
von humanen Embryonen in vitro sezerniert wird. Auch IFN-γ konnte in großen, allerdings
stark schwankenden Konzentrationen detektiert werden. IL-10 und IL-6 wurden nur in sehr
geringen Konzentrationen nachgewiesen und die Konzentration von TNF-α lag am unteren
Rand der Nachweisgrenze. Alle hier betrachteten Embryonen wurden transferiert. Da
allerdings meist zwei oder drei Embryonen übertragen wurden, ist es nicht möglich
nachzuverfolgen, welche Embryonen zu einem Schwangerschaftserfolg führten.
- 59 -
Ergebnisse
350
300
*
des
* - außerhalb
Meßbereichs
250
- erfolgte Einlingsschwangerschaft
200
150
100
50
0
Patient:
1
2
3
4
5
Abb. 4.19: Graphische Darstellung der sHLA-G Konzentration in Embryokulturüberständen nach 72 Stunden Kultivierung (n=3 Parallelbestimmungen aus einer Probe).
Dargestellt sind sHLA-G Konzentrationen in einzelnen Embryokulturüberständen von 5
Patienten.
In Abbildung 4.19 sind die Konzentrationen von sHLA-G in den Embryokulturüberständen
einzeln dargestellt. Es ist zu sehen, dass die sHLA-G Konzentration in den Embryokulturüberständen von Patient 1 am größten ist. Dieser Embryo wurde bis zum Vierzellstadium
kultiviert und augenscheinlich als sehr gut eingestuft. Allerdings waren die endometrialen und
hormonellen Voraussetzungen der Frau sehr schlecht (nach Angaben des Klinikers). Es
konnten Schwangerschaften mit einem implantierten Embryo nur bei den Patienten 3 und 4
nachgewiesen werden, obwohl alle dargestellten Embryonen tranferiert wurden. Der Embryo
von Patientin 5 wurde bis zu Blastozystenstadium kultiviert.
Es kann zusammengefasst werden, dass bei der Betrachtung dieser geringen Probenzahl keine
eindeutige Korrelation zwischen der Zytokin- bzw. sHLA-G-Sekretion und der erfolgreichen
Implantation eines Embryo nachgewiesen werden konnte.
- 60 -
Ergebnisse
4.13 In-vivo-Kultivierung von Trophoblastzellen – Xenotransplantation
von humanen Trophoblastzellen in immundefiziente und immunkompetente Mäuse
Bei dieser Versuchsreihe sollten humane Trophoblastzellen verschiedener Entwicklungsstufen (5.SSW, 10.SSW, 40.SSW) unter die Nierenkapsel immunkompetenter und immundefizienter Mäuse transplantiert werden (Xenotransplantation). Dabei sollte untersucht
werden, ob die Trophoblasten in den Mäusen überleben, wenn ja proliferieren, sich
differenzieren, invadieren und ob sie β-HCG produzieren. Das Experiment sollte dazu dienen,
Einflüsse von verschiedenen Stoffen auf das Wachstums- und Differenzierungsverhalten von
Trophoblasten in vivo zu untersuchen, um Vorgänge bei verschiedenen Erkrankungen (zB.
Präeklampsie) zu verstehen. Diese Versuchsreihen stellen hierbei Vorversuche dar, um die
Funktionalität der Experimente zu prüfen und die Möglichkeit der Beeinflussung des
Wachstums der transplantierten Zellen zu untersuchen. Dafür wurde 4 Versuchstieren Serum
von Patienten mit Symptomen einer Präeklampsie injiziert.
Die in den folgenden Abschnitten erwähnten Abbildungen sind im Anschluß an 4.13.3
dargestellt.
4.13.1 Auswertung des ersten Teils des Experimentes – Transplantation von
Trophoblastengewebe unter die Nierenkapsel immundefizienter Mäuse (RAG-2º/ cº)
In der Abbildung 4.20 ist ein histologischer Schnitt durch das Zielorgan der
Xenotransplantation, der Niere von Mäusen dargestellt. Dabei sind die typischen
Nierenstrukturen und die Nierenkapsel zu erkennen. In allen Versuchstieren konnte nach der
Transplantation eine stabile Kultur des Trophoblastengewebes von bis zu 84 Tagen
nachgewiesen werden. Exemplarisch dafür sind in Abbildung 4.21 Trophoblasten (zwei Tage
nach der Transplantation) dargestellt, die beginnen in angrenzendes Fettgewebe zu
invadieren. Weiterhin konnte mit längeren Kultivierungszeiten eine zunehmende Invasion der
Trophoblasten, abhängig von ihrer Entwicklungsstufe festgestellt und die Produktion von βHCG nachgewiesen werden. Allerdings unterschieden sich die Entwicklungen der
Trophoblasten der 5.SSW erheblich von denen der 10.SSW.
Trophoblasten der 5.SSW waren weniger invasiv als die der 10.SSW und wuchsen an der
Peripherie der Niere entlang der Kapsel (Abb: 4.22). Bei den Trophoblasten der 5.SSW
konnte
jedoch
am
16.Tag
nach
der
Transplantation
- 61 -
eine
Differenzierung
der
Ergebnisse
Zytotrophoblasten in Syncytiotrophoblasten beobachtet werden (Abb: 4.23) und es waren
Ansätze für die Bildung von Blutgefäßen zu erkennen (Abb: 4.23, 4.24).
Im Gegensatz dazu waren die Trophoblasten der 10.SSW sofort nach der Transplantation
stark invasiv (Abb: 4.25, 4.26) und drangen tief in das umliegende Gewebe ein, was mit der
Zerstörung des Nierengewebes einher ging (Abb: 4.27). Auch diese Trophoblasten zeigten ab
dem 12. Tag nach der Transplantation eine Differenzierung in Syncytiotrophoblasten (Abb:
4.28, 4.29). Bei vielen Versuchstieren fielen stark geschwollene Uteri und blutgefüllte
Ovarien auf (Abb: 4.30). Diese Veränderungen sind wahrscheinlich darauf zurückzuführen,
dass die transplantierten Trophoblastzellen Zytokine und Hormone sezernieren, die in dem
Wirtsorganismus aktiv sind. Deshalb wurde die Konzentration von β-hCG im Serum der
Versuchstiere bestimmt, worauf im folgenden Abschnitt eingegangen wird.
Trophoblasten der 40.SSW (nach termingerechter Geburt) waren weniger invasiv als die
Konzentration von HCG in IU .
Trophoblasten der 10.SSW (Abb: 4.32, 4.33),
250
bildeten aber ebenfalls große Syncytien und
200
eine Proliferation konnte über den gesamten
150
Beobachtungszeitraum (bis zu 68 Tage nach
100
der Transplantation) beobachtet werden.
50
Erhebliche Unterschiede in der Produktion von
0
Trophoblasten
der 5.SSW
Trophoblasten
der 10.SSW
Abb. 4.31: Graphische Darstellung der
Konzentration von β-hCG im Serum von
Mäusen, 30 Tage nach Xenotransplantation
von Trophoblasten unter die Nierenkapsel.
β-hCG wurden im Serum der Versuchstiere 30
Tage nach der Transplantation beobachtet. Die
Seren der Versuchstiere, in die Trophoblasten
der 5.SSW transplantiert wurden, enthielten
erheblich weniger β-hCG als die Vergleichs-
gruppe nach der Transplantation mit Trophoblastzellen der 10.SSW (Abbildung 4.31).
4.13.2 Auswertung des zweiten Teils des Experimentes – Transplantation von
Trophoblastengewebe unter die Nierenkapsel immunkompetenter Mäuse (C57Bl/6J)
Trophoblasten der 10.SSW wurden ebenfalls in immunkompetente Mäuse transplantiert. Es
fiel auf, dass diese Transplantate nach geringer Inkubationszeit sehr viel größer waren als die
Vergleichstransplantate in immundefizienten Mäusen. Die Trophoblastzellen invadierten
ebenfalls tief in das Wirtsgewebe ein und bildeten Syncytien, so dass vergleichbare Bilder wie
nach der Transplantation in immundefizinte Mäuse entstanden (Abb: 4.34, 4.35). Weder eine
zellvermittelte Abstoßung durch das Immunsystem der Mäuse, noch Apoptose oder Nekrose
- 62 -
Ergebnisse
der Trophoblasten konnte festgestellt werden, obwohl es Anzeichen für inflammatorische
Vorgänge gab.
4.13.3 Auswertung des dritten Teils des Experimentes – Transplantation von
Trophoblastengewebe unter die Nierenkapsel immundefizienter Mäuse (RAG-2º/ cº),
Zugabe von Serum von Patienten mit Präeklamsie
Die Seruminjektion von Patienten mit Präeklampsie nach der Transplantation von humanan
Trophoblasten der 10.SSW unter die Nierenkapsel immundefizienter Mäuse führte zu starken
Veränderungen im Wachstum und der Differenzierung der transplantierten Zellen (Abb: 4.36,
4.37). Innerhalb von 14 Tagen nach der Transplantation und Zugabe des Serums wurden
Nekrosen des villösen Mesenchymkerns und der Zelltod der Trophoblasten festgestellt.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sowohl in immundefizienten als auch in
immunkompetenten Mäusen eine stabile Kultur von Trophoblasten aller Altersstufen gelang
und Immunreaktionen der immunkompetenten Mäuse keinen Einfluss auf das Wachstum und
die Differenzierung der Transplantate hatte. In vielen Versuchstieren konnten
die
Auswirkungen der, durch die Trophoblasten sezernierten Zytokine und Hormone auf die Uteri
und Ovarien beobachtet werden. β-HCG wurde in den Ersttrimester Transplantaten detektiert.
Die Seruminjektion von Patienten mit Präeklamspie in den Blutkreislauf der Mäuse nach der
Transplantation führte zu Nekrosen und dem Tod der transplantierten Trophoblastzellen.
F
N
CT
Abb.: 4.20 Nierengewebe einer Maus
(RAG-2 null/γγc) bei 200-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung
N-Nierengewebe
CT-Cytotrophoblasten
F-Fettgewebe
Abb.: 4.21 Fett- und angrenzendes Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), sowie
invadierende humane Trophoblasten der
10.SSW, 2 Tage nach Transplantation bei
400-facher Vergrößerung nach H&EFärbung
- 63 -
Ergebnisse
N
N
CT
CT
ST
Abb.: 4.22 Nierenkapsel und Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc),
sowie humane Trophoblasten der 5.SSW,
6 Tage nach Transplantation bei 200facher Vergrößerung nach H&E-Färbung
ST
Abb.: 4.23 Nierengewebe einer Maus
(RAG-2 null/γγc), humane, stark
invadierende Zytotrophoblasten, sowie
differenzierte Syncytiotrophoblasten der
5.SSW, 16 Tage nach Transplantation
bei 200-facher Vergrößerung nach
H&E-Färbung
F
CT
CT
Abb.: 4.24 Ausschnitt aus 4.23 bei 400facher Vergrößerung
N
Abb.: 4.25 Nieren- und Fettgewebe einer
Maus (RAG-2 null/γγc), sowie invadierende humane Trophoblasten der
10.SSW, 2 Tage nach Transplantation bei
200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung
N-Nierengewebe
CT-Cytotrophoblasten
SC-Syncytiotrophoblasten
F-Fettgewebe
- 65 -
Ergebnisse
N
CT
CT
N
Abb.: 4.27 Nierengewebe einer Maus
(RAG-2 null/γγc), sowie humane, stark
invadierende
Zytotrophoblasten
der
10.SSW, 16 Tage nach Transplantation
bei 200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung
Abb.: 4.26 Nierengewebe einer Maus
(RAG-2 null/γγc), sowie humane, stark
invadierende
Trophoblasten
der
10.SSW, 6 Tage nach Transplantation
bei 200-facher Vergrößerung nach
H&E-Färbung
CT
ST
ST
N
CT
N
Abb.: 4.28 Nierengewebe einer Maus
(RAG-2
null/γγc),
humane,
stark
invadierende Zytotrophoblasten, sowie
differenzierte Syncytiotrophoblasten der
10.SSW, 12 Tage nach Transplantation bei
200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung
Abb.: 4.29 Nierengewebe einer Maus
(RAG-2
null/γγc),
humane,
stark
invadierende Zytotrophoblasten, sowie
differenzierte Syncytiotrophoblasten der
10.SSW, 16 Tage nach Transplantation
bei 200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung
N-Nierengewebe
CT-Cytotrophoblasten
SC-Syncytiotrophoblasten
- 66 -
Ergebnisse
Abb.: 4.30 Ovargewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), 2 Tage
nach der Transplantation von humanem Trophoblastengewebe
der 10.SSW bei 100-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung.
Die histologischen Veränderungen der Ovargewebe sind auf die
Wirkung von β-HCG, produziert durch die transplantierten,
humanen Trophoblasten, zurückzuführen.
N
ST
CT
ST
N
Abb.: 4.32 Nierengewebe einer Maus
(RAG-2 null/γγc), humane Zytotrophoblasten, sowie differenzierte Syncytiotrophoblasten einer Placenta nach der
Geburt, 14 Tage nach Transplantation bei
200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung
Abb.: 4.33 Nierengewebe einer Maus
(RAG-2 null/γγc), humane Zytotrophoblasten, sowie differenzierte Syncytiotrophoblasten einer Placenta nach der
Geburt, 68 Tage nach Transplantation bei
200-facher Vergrößerung nach H&EFärbung
N-Nierengewebe
CT-Cytotrophoblasten
SC-Syncytiotrophoblasten
- 67 -
Ergebnisse
N
N
ST
CT
CT
Abb.: 4.35 Nierengewebe einer Maus
(C57Bl/6J), transplantiertes, humanes
Gewebe, einer Placenta der 10.SSW, 52
Tage nach Transplantation bei 200-facher
Vergrößerung nach H&E-Färbung
Abb.: 4.34 Nierengewebe einer Maus
(C57Bl/6J), humane Zytotrophoblasten,
sowie differenzierte Syncytiotrophoblasten der 10.SSW, 6 Tage nach
Transplantation bei 200-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung
CT
ST
ST
N
N
Abb.: 4.36 und 4.37 Nierengewebe einer Maus (RAG-2 null/γγc), humanes Trophoblastengewebe der 10.SSW, 14 Tage nach Transplantation und Zugabe von Serum von
Patienten mit Präeklampsie bei 200-facher Vergrößerung nach H&E-Färbung.
N-Nierengewebe
CT-Cytotrophoblasten
SC-Syncytiotrophoblasten
- 68 -
Diskussion
5. Diskussion
In dieser Arbeit sollten Mechanismen und Faktoren der Interaktion zwischen NK-Zellen und
Trophoblastzellen untersucht werden. Besonderer Wert wurde dabei auf die Rolle von
intrazellulären Signaltransduktoren bezüglich der Steuerung der Invasivität und Proliferation
von Trophoblasten, sowie der Zytotoxizität dezidualer Lymphozyten, insbesondere von NKZellen gelegt. Weiterhin wurde durch „Knock Down“ Experimente mittels siRNA die
Funktion von HLA-G auf Trophoblastzellen untersucht.
5.1 Untersuchung der Phosphorylierung von STAT3, induziert durch die
Zytokine HGF, IGF-2, IL-6 und LIF
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Untersuchung des Einflusses von Zytokinen auf die
Aktivierung von intrazellulären Signaltransduktionsmolekülen, insbesondere dem Signal
Transducer and Activator of Transcription (STAT)-3 in der Choriokarzinomzellinie Jeg-3.
Dabei standen die Zytokine LIF, IL-6, HGF und IGF-2 im Mittelpunkt. Takeda et. al.
beschrieb das STAT3-Signal als essentiell für eine erfolgreiche Schwangerschaft
197
, und
deshalb ist es von besonders großem Interesse herauszufinden, welche Zytokine in der Lage
sind, dieses Signal zu induzieren.
Der Einfluss von LIF auf die Phosphorylierung von STAT3
Es konnte in dieser Arbeit beobachtet werden, dass LIF eine sehr starke Phosphorylierung der
STAT3-Moleküle
in
Jeg-3
Choriokarzinomzellen
induziert,
während
die
anderen
untersuchten Zytokine nur eine sehr schwache, bzw. keine Aktivierung auslösten 203, 243. Es ist
bekannt, dass LIF eine bedeutende Rolle während der Schwangerschaft in verschiedenen
Species spielt
246
und die Proliferation und Invasion von Trophoblastzellen steuert
247
. Dies
wird durch STAT3-„Knock Down“-Versuche in Trophoblastzellen unterstützt, wo das
Invasionsvermögen erheblich reduziert wurde
243
, sowie durch in-vivo-Versuche, die zeigen,
dass sich in LIF-„Knock Out“-Mäusen keine erfolgreiche Schwangerschaft etablieren kann,
wenn nicht LIF in den Uterus injiziert wird
86
. Embryonen von LIF-Rezeptor-„Knock Out“-
Mäusen implantieren zwar, sterben allerdings innerhalb 24 Stunden auf Grund nicht
ausreichender Placenta-Funktion 248. LIF wird durch Zellen des Endometriums produziert und
der LIF-Rezeptor wird sowohl von villösen und extravillösen Zytotrophoblasten
von verschiedenen Tumorzellen exprimiert
Fibroblasten
84
250, 251
249
, als auch
. Obwohl LIF zu einer TIMP-Stimulation in
und zu einer Inhibition der gelatinolytischen Aktivität von MMP-9
252
in
Zytotrophoblasten führt, die Laminin-Rezeptoren tragen 85, wird anscheinend in Jeg-3 Zellen,
- 69 -
Diskussion
die als Modell für Zytotrophoblasten dienen, die Invasivität verstärkt. Die Frage, ob
Zytotrophoblasten, die Fibronektin-Rezeptoren exprimieren, ebenfalls eine solche Reaktion
zeigen, kann hier nicht eindeutig beantwortet werden, allerdings wird deren gelatinolytische
Aktivität durch LIF zumindest nicht negativ beeinflusst
85
Erhöhung der MMP-9 Sekretion in Maus-Blastozysten
253
. Weiterhin induziert LIF eine
und in Trophoblasten
87, 254
.
Allerdings sollte erwähnt werden, dass eine Sekretion von MMPs nicht mit deren Aktivierung
gleichzusetzen ist. Doch eine durch LIF induzierte Aktivierung von MMP-9 konnte ebenfalls
gezeigt werden
255
. In einer anderen Studie wurde beobachtet, dass humane Endothelzellen,
denen LIF zugegeben wurde, eine Aktivierung von MMP-2 in Stomazellen induzieren
256
. An
dieser Stelle sollte erwähnt werden, dass die Rolle von MMPs bezüglich der Invasivität in der
Literatur kontrovers diskutiert wird und dass einige MMPs (einschließlich MMP-9) die
Invasivität von Zellen durch die Bildung von Angiostatin negativ beeinflussen
257
. Diese
Erkenntnis deckt sich mit Studien die zu dem Schluss kommen, dass die Expression von
MMP-2 und MMP-9 in Trophoblasten nicht zwangsläufig mit deren Invasivität korreliert
258
.
Dies könnte eine erhöhte Aktivierung trotz geringerer Expression von MMP-9 durch einen
verminderten Einfluss von TIMP-1 erklären. Eine Balance von TIMP-1, TIMP-2 und MMP-2,
MMP-9-Molekülen scheint das entscheidende Steuerelement für die Kontrolle der
Trophoblasteninvasion zu sein
259, 260
. Interessanterweise stimuliert LIF die Expression von
HLA-G, welches in die feto-maternale Immuntoleranz involviert ist
261
und später diskutiert
wird.
Der Einfluss von IL-6 auf die Phosphorylierung von STAT3
IL-6, das vom Endometrium in der Mitte der sekretorischen Phase und von allen
Trophoblasten (Cyto- und Syncytiotrophoblasten) des ersten Trimesters gebildet wird
81
,
wirkt auf diese Zellen durch die Bindung an zwei Membranproteine. Dabei benutzt IL-6, wie
alle Mitglieder der IL-6-Rezeptor-Familie, das gleiche Rezeptormolekül (gp130) für die
Aktivierung von STAT3 wie LIF. Allerdings löst IL-6 eine sehr viel geringere
Phosphorylierung von STAT3 als LIF in Jeg-3 Zellen aus, führt aber zur Aktivierung von
MMP-2 und MMP-9 in Trophoblasten
243
81
und zu einer erhöhten Invasivität von Jeg-3 Zellen
. IL-6 ist, ähnlich wie LIF, ein antiapoptotischer Faktor bei Ösophaguskarzinomzellen
262
und das durch IL-6 vermittelte Signal wird ebenfalls durch SOCS3 reguliert 263, 264. Insgesamt
scheint IL-6 ähnliche, wenn auch sehr viel geringere Wirkungen auf Trophoblastzellen zu
haben wie LIF. Allerdings führt ein IL-6 „Knock Out“ bei Mäusen zu einer normalen
Schwangerschaft
265
und nicht wie bei LIF zu einem Schwangerschaftsabbruch. Doch auch
eine IL-6 vermittelte STAT3 Aktivierung steht in Verbindung mit der Entstehung und der
- 70 -
Diskussion
Erhöhung der Proliferation verschiedener Tumoren 266-268. Dabei wird bei einem IL-6 Signal
sowohl der Ser727-Abschnitt, als auch der Tyr705-Abschnitt phosphoryliert, der eine
Dimerisierung, den Transport durch die Kernmembran und die DNA-Bindung ermöglicht
269
.
Allerdings führt die IL-6 Stimulierung einiger Tumoren auch zu einer Verminderung der
Proliferation, immer jedoch zu einer erhöhten Migration 270.
Der Einfluss von IGF-2 auf die Phosphorylierung von STAT3
IGF-2, das von extravillösen als auch von villösen, proliferierenden Zytotrophoblasten
während der gesamten Schwangerschaft produziert wird
95-97
, induziert eine Erhöhung der
Invasion von Trophoblastzellen in Matrigel durch Bindung an den IGF Rezeptor Typ 2
98, 99
und stellt somit ein autokrines Regulationsmolekül dar. Weiterhin führt ein IGF-2 „Knock
Out“ zu einer verminderten Placentation, Migration und Invasion von Trophoblastzellen und
endet in einer Wachstumsretardierung des Embryo
271, 272
. IGF-2 ist zweifellos ein wichtiges
Zytokin für eine erfolgreiche Schwangerschaft, welches sein Signal anscheinend nicht über
STAT3 weitergibt.
Der Einfluss von HGF auf die Phosphorylierung von STAT3
HGF wird sowohl von Syncytio- als auch von Zytotrophoblasten, vom Amnionepithel und
vom villösen Mesenchym produziert. HGF induziert eine erhöhte Proliferation von
Hepatozyten, Trophoblasten und vielen Tumoren
273,
274
. Es dient als parakriner
Wachstumsregulator bei Trophoblastzellen, obwohl es nicht zu einer Differenzierung beiträgt
275
. HGF ist allerdings an der Steuerung der Invasion von Trophoblastzellen beteiligt 103, denn
eine verminderte Trophoblasteninvasion, wie sie zum Beispiel bei Präeklampsie vorkommt,
ist oft mit einer verminderten HGF-Produktion in der Placenta assoziiert
100
. HGF induziert,
ähnlich wie LIF in Choriokarzinomzellen, eine Erhöhung der STAT3-DNA-Bindungsaktivität
in Bronchialkarzinomzellen
276
und wird von vielen Tumoren mit schlechter Prognose
produziert. Eine starke HGF-Expression begünstigt die Tumorgenese und Metatasierung autound parakrin
277
. Obwohl HGF viele Gemeinsamkeiten mit LIF hat, induziert dieses Zytokin
in Jeg-3 Zellen keine Phosphorylierung von STAT3. Ursächlich dafür könnten andere
Signaltransduktionswege sein, die STAT3 erst später in der Reaktion auf HGF involvieren.
Interessanterweise wird durch LIF die Expression von HGF in verschiedenen Melanomen
verstärkt 278.
- 71 -
Diskussion
5.2 Einfluss von LIF, SOCS3 und STAT3 bezüglich der Proliferation von
Jeg-3 Zellen
In dieser Arbeit konnte eine gesteigerte Proliferation durch die LIF-induzierte STAT3Aktivierung beobachtet werden. Nach dem „Knock Down“ von STAT3 konnte die Wirkung
von LIF weitgehend aufgehoben werden, während ein „Knock Down“ von SOCS3 zu einer
übermäßig starken Erhöhung der Proliferation nach LIF-Stimulation führte. Diese Ergebnisse
werden durch Arbeiten unterstützt, die über den Einfluss von STAT3 auf das
Wachstumsverhalten
von
Zellen
berichten
279
und
die
Rolle
von
SOCS3
als
Regulationsmolekül für die Aktivierung von STAT3 zeigen 280. Weiterhin führt eine SOCS3Aktivierung zu einer Inhibition der Proliferation von Bronchialkarzinomzellen
281
und zu
einer verminderten Sensitivität gegenüber Zytokinen bei Mammakarzinomzellen
282
.
Interessanterweise führt eine Aktivierung von SOCS3 in Melanozyten und frühen
Melanomzellen auch zu einer verminderten Sensitivität gegenüber Onkostatin M, einem
wachstumsinhibierenden Faktor
283
. Viele dieser Effekte resultieren wahrscheinlich aus der
Inhibition der Cytokinrezeptor-vermittelten Signalübertragung auf STAT3 durch SOCSMoleküle. Dabei können SOCS-Moleküle zum einen über die SH2-Domäne an das
Phosphotyrosin des Zielproteins binden, was zu einer Inhibition der Signaltransduktion über
die N-termiale Inaktivierung der JAKs führt, oder zum anderen die Bindung von STATs an
die entsprechende Rezeptorstelle verhindern
284
. Weiterhin wird davon ausgegangen, dass die
antiproliferativen Effekte von IFN-γ auf die Erhöhung der SOCS3-Expression zurückzuführen
sind 285. Dagegen ist eine Aktivierung von STAT3 in verschiedenen Tumoren wahrscheinlich
für die Hochregulation von Genen zum Unterdrücken der Apoptose (bcl-xL, mcl-1, Survivin)
und den Zellzyklus (Cyclin D1, c-myc) verantwortlich 213, 286, 287, während ein STAT3 „Knock
Down“ nicht zwangsläufig zu einer erhöhten Apoptoserate führt 243.
5.3 Die Rolle von STAT3 bezüglich der Invasivität von Karzinom- und
Trophoblastzellen
Eine weitere Frage in dieser Arbeit war, in wieweit STAT3 das Invasionsverhalten von
Trophoblast- und Tumorzellen beeinflusst. Wie bereits erläutert, spielt STAT3 eine wichtige
Rolle in der Migration und Tumorgenese verschiedener Typen von Tumor- und pluripotenten
Zellen
102, 277, 288, 289
und es scheint die transkriptionale Regulation von verschiedenen
Proteasen, die bei invasivem Wachstum benötigt werden, maßgeblich zu beeinflussen
290-292
.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl in Tumor- als auch in Trophoblastzellen
- 72 -
Diskussion
ein „Knock Down“ von STAT3 zu einer starken Inhibierung der Invasivität führt und der
steigernde Effekt von LIF auf die Proliferation und Invasion dieser Zellen ausbleibt. Diese
Ergebnisse lassen eine kausale Verbindung der durch LIF induzierten STAT3-Aktivität, der
Invasivität und dem veränderten Expressionsmuster von Proteasen in Jeg-3 Choriokarzinomund Trophoblastzellen vermuten. In unserer Arbeitsgruppe konnte ebenfalls gezeigt werden,
dass die Proteasen, deren mRNA-Levels durch eine LIF induzierte STAT3-Aktivierung
beeinflusst werden, direkt mit dem Invasionsverhalten von Zellen und der Implantation in
Verbindung stehen. Die Expression von TIMP-1 wird durch LIF herunterreguliert, was zu
einer Inhibition der Metastasierung führt
247, 293, 294
. Vermutlich wird die TIMP-1-Expression
in Trophoblast- und Jeg-3 Zellen direkt durch die STAT3-Aktivität beeinflusst, da dies unter
anderem bei Hepatozyten und einigen anderen Zellen gezeigt werden konnte
TIMP1-Promoter STAT3-Erkennungselemente besitzen
297
295, 296
und die
. LIF steigerte die Invasion von
Jeg-3 Zellen, Trophoblastzellen der 10., sowie der 40.SSW. In der Literatur wird beschrieben,
dass alle Zellen der Trophoblasten-Linie den LIF-Rezeptor exprimieren, allerdings verändert
sich der Ort der LIF-Expression. Zu Beginn einer Schwangerschaft wird LIF von dem
glandulären Epithel produziert, während nach der Implantation diese Aufgabe deziduale NKZellen übernehmen. Dabei reguliert LIF durch Negativ-„Feed-Back“ Effekte seine eigene
Produktion
197
. Dies könnte die Steuerung der Aktivierung von STAT3 in dem luminalen
Epithel erklären, die mit der Embryo-Implantation beginnt
83
. Darüber hinaus induziert LIF
zum Zeitpunkt der Implantation die Differenzierung von invasiven Riesenzellen aus
epidermalen Trophektodermzellen in vivo und in vitro. Diese Differenzierung wird durch
SOCS3 negativ reguliert, das die JAK/STAT-Signale unterdrückt und durch ein breites
Spektrum von Zytokinen, inklusive LIF reguliert wird 72, 264.
Daraus lässt sich vermuten, dass die durch LIF induzierte Aktivierung von STAT3 die
Malignizität und Invasivität von Tumorzellen, sowie die Implantation des Embryo und die
Invasion von embryonalen Trophoblastzellen steuert.
5.4 Einfluss von STAT3 auf die Induktion der Apoptose in
Trophoblastzellen
Die Induktion der Apoptose ist ein streng regulierter Prozess, an dem viele verschiedene
Signaltransduktionsmoleküle beteiligt sind. STAT3 hat in der Kontrolle der Apoptose eine
wichtige Funktion, da durch die aktivierte Form von STAT3 Apoptosevorgänge in
Tumorzellen abgewendet werden
201, 213
. In vielen Karzinomen wird durch den „Knock
Down“ von STAT3 die Apoptoserate jener Zellen verstärkt, die hohe Konzentrationen von
- 73 -
Diskussion
aktiviertem STAT3 enthalten
214, 298
. Prostatakarzinomzellen, die kaum aktiviertes STAT3
enthielten, blieben vom STAT3-„Knock Down“ dagegen unbeeinflusst
Trophoblastzellen der 40.SSW
243
214
, ähnlich wie
. Auch andere Gruppen beobachteten, dass ein STAT3
„Knock Down“ nicht zwangsläufig zu einer Erhöhung der Apoptoserate führt
299
.
Anscheinend spielt auch STAT1 eine große Rolle in der Steuerung der Apoptose. STAT1
kann durch die Art der Aktivierung sowohl pro- als auch anti-apoptotische Signale übertragen
217
. Doch werden in der Literatur STAT3 und STAT1 als Gegenspieler in der Steuerung von
Apoptoseprozessen dargestellt
287
. Nebenbei führt IL-6, das über den IL-6-Rezeptor STAT3
aktiviert und somit Apoptosevorgänge unterdrückten würde, auch zu einer Aktivierung von
STAT1 in Kolonkarzinomzellen 300.
Somit stehen sich STAT1 und STAT3 weniger als Gegenspieler gegenüber, sondern stellen
eher zwei synergetische Steuerelemente der Apoptose dar.
5.5 Die Rolle von STAT6 bezüglich der Invasivität und Proliferation von
Jeg-3 und Trophoblastzellen
IL-4 ist ein Aktivator von STAT6 und an einer Veilzahl von Reaktionen in der Immunabwehr
beteiligt. In verschiedenen Tumoren induziert das IL-4 Signal das Zellwachstum und wendet
Apoptosevorgänge ab 216. So scheint es nicht verwunderlich, dass aktiviertes STAT6 in vielen
stark invasiven Tumoren vorkommt
27
, die hochaffine Rezeptoren für IL-4 haben
301
. Doch
trifft dies anscheinend nicht für alle Tumorzellen zu, denn in der Literatur wird ebenfalls über
Proliferations-inhibierende und Apoptose-auslösende Effekte von IL-4 berichtet, das sein
Signal auch via STAT1 weitergeben kann 206, 207.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der „Knock Down“ von STAT6, sowie die
Stimulierung mit IL-4 keinerlei Einfluß auf die Invasivität von Jeg-3 Choriokarzinomzellen
haben. Die Proliferation dieser Modellzellen für Trophoblasten wurde allerdings durch IL-4
stark erhöht, dessen Wirkung durch einen „Knock Down“ von STAT6 dosisabhängig
reduziert werden konnte. Diskutiert werden sollte hierbei die Rolle der Signalübertragung von
IL-4 via STAT6 bezüglich der Malignität, Proliferation und transkriptionellen Aktivierung
von IL-6 in Tumoren
Tumorzellen
302, 303
208, 209
. IL-6 stimuliert die Invasivität und Proliferation verschiedener
. Wenn die Expression und transkriptionelle Aktivierung von IL-6 durch
ein IL-4 Signal via STAT6 induziert würde, wäre STAT6 ein wichtiges Molekül in der
autokrinen Regulation der Invasivität von Tumorzellen.
- 74 -
Diskussion
5.6 Die Rolle von STAT3 bezüglich der Zytotoxizität von NK-Zellen
NK-Zellen sind in der Lage, Tumorzellen mit einer verminderten MHC-Expression oder
Zellen mit einer fremdartigen MHC-Struktur ohne vorherige Sensibilisierung abzutöten
27
23, 25-
. Dabei wird durch stimulierende und inhibierende Rezeptoren über die Art der Reaktion
entschieden
29, 30
. Sowohl stimulierende als auch inhibierende Signale werden unter anderem
durch STATs weitergeleitet. Eines dieser Signaltransduktionsmoleküle, STAT3, ist an der
Regulation der Expression des porenbildenden Proteins Perforin beteiligt 304, 305. Auch STAT4
und STAT5 sind in der Lage, die Perforinexpression in NK-Zellen zu induzieren
187
, jedoch
ist der Einfluss all dieser Signaltransduktoren in NK-Zellen auf deren Zytotoxizität unklar. In
dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der „Knock Down“ von STAT3 in NK-Zellen zu
einer starken Verringerung der Zytotoxizität führt. Die Wirkung verschiedener Zytokine, wie
z.B. IL-18, die unter anderem via STAT3 zu einer Erhöhung der zytolytischen Aktivität von
NK-Zellen führen
305
, dürfte durch einen STAT3-„Knock Down“ ebenfalls eingeschränkt
werden. Allerdings konnte in den, mit STAT3 siRNA transfizierten NK-Zellen die
Zytotoxizität nicht vollständig unterdrückt werden. Somit scheint der STAT3-Signalweg nicht
vollständig unterdrückt worden zu sein oder präformiertes Perforin, bzw. weitere
Zytotoxizitätsfaktoren könnten zu dieser Restzytotoxizität geführt haben. Weiterhin könnten
andere Signaltransduktionswege ebenfalls die Zytotoxizität von NK-Zellen regulieren.
STAT4 und STAT5 könnten dabei eine Rolle spielen
187
. Doch auch STAT1 alpha, das
zusammen mit STAT3 durch die Zytokine IL-6 und IL-2 aktiviert werden kann, besitzt die
Fähigkeit
die
Expression
von
Perforin
zu
modulieren
304
.
Ein
weiteres
Signaltransduktionsmolekül, STAT6, wird durch IL-13 und IL-4 aktiviert und beeinflusst
ebenfalls die Zytotoxizität von NK- und T-Zellen
306
.
Allerdings sollte erwähnt werden, dass ein Einfluss von Signaltransduktionsmolekülen auf die
Expression von Perforin nicht mit dem Einfuß auf die Zytotoxizität gleichzusetzen ist. Da
aber die Zytotoxizität dieser NK-Zellen durch den „Knock Down“ von STAT3 inhibiert
wurde, wird deutlich, dass STAT3 sowohl an der Steuerung der Perforinexpression 304, 305, als
auch an der Regulation der Zytotoxizität beteiligt ist.
5.7 Funktion und Regulation der Expression von HLA-G in Jeg-3 Zellen
HLA-G stellt ein zentrales Molekül der Immuntoleranz sowohl in der Tumor- als auch in der
Reproduktionsimmunologie dar. Durch die Expression HLA-G sind fetale Zellen, als auch
Tumorzellen in der Lage, sich vor einer Immunantwort, insbesondere vor der zytotoxischen
Reaktion von NK-Zellen zu schützen. In dieser Arbeit wurde die Expression von HLA-G und
- 75 -
Diskussion
selektiv von HLA-G1 in Jeg-3 Choriokarzinomzellen unterdrückt. Es wurde gezeigt, dass 24
Stunden nach der Transfektion dieser Zellen mit den siRNA-Oligonukleotiden, die HLA-G
Expression geringer ist, als in den Kontrollen. Erwartet wurde, dass die HLA-GKonzentration in den Zellen am geringsten ist, in denen die gesamte HLA-G Expression
unterdrückt werden sollte, was allerdings nicht beobachtet werden konnte. Die Western Blots
zeigten, dass die Expression von HLA-G in gleichem Maße bzw. durch die HLA-G1 siRNA
stärker inhibiert wurde, als durch die HLA-G siRNA. Ursache dafür könnte sein, dass die
HLA-G siRNA eine geringere Wirkungsspezifität hat als die HLA-G1 siRNA. Weiterhin
wäre es möglich, dass Jeg-3 Zellen verstärkt HLA-G1 exprimieren, so dass kaum
Unterschiede in der HLA-G Expression zwischen den siRNA-Oligonukteotiden nach der
Transfektion zu detektieren sind. Dem widerspricht, dass die Zytotoxizität von NK-Zellen
gegenüber den, mit HLA-G1 siRNA transfizierten Zellen höher ist als gegenüber den mit
HLA-G transfizierten Jeg-3 Zellen. Sicher scheint jedoch, dass die Expression von HLA-G
Jeg-3 Zellen, als Modell für Trophoblasten, und andere Karzinomzellen vor zytotoxischen
Reaktionen von Lymphocyten in vitro als auch in vivo schützt 228 und somit essentiell für eine
Etablierung
verschiedener
Schwangerschaft ist
307, 308
Tumoren
und
ausschlaggebend
für
eine
erfolgreiche
. Interessanterweise wirkt IL-2 auf Trophoblasten, die kein HLA-G
produzieren toxisch, während bei HLA-G produzierenden Trophoblasten diese Wirkung
ausbleibt
309
. Die Expression von HLA-G kann durch IL-10 induziert werden
116
, was die
selben intrazellulären Signaltransduktoren benutzt wie Zytokine der IL-6-Familie
310
.
Weiterhin führen IL-6-Type Zytokine, wie LIF oder IL-6, die eine Steigerung der Invasivität
von Tumoren und Trophoblasten induzieren, auch zu einer Steigerung der Expression von
HLA-G und somit zu einem erhöhten Schutz vor dem Wirts-Immunsystem
261
.
Entgegengesetzt betrachtet, kann vermutet werden, dass auch IL-10 die Invasivität von
Trophoblasten positiv beeinflusst. Diese Überlegung geht mit der Beobachtung einher, dass
Trophoblasten von Patienten mit gestörter Trophoblasteninvasion (Präeklampsie) kein IL-10
produzieren. Somit scheint HLA-G in dem komplexen Mechanismus der Etablierung von
Tumorern und der Tumor-Immuntoleranz, sowie in der Reproduktion eine entscheidende
Rolle zu spielen.
5.8 Produktion von Zytokinen durch Embryonen
Die Implantation des Imbryo, sowie Proliferations- und Invasionsvorgänge von Trophoblasten
und Tumorzellen werden unter anderem durch Zytokine gesteuert. Immunmodulierende
Substanzen, die vom Embryo bereits während der Wanderung durch die Tuben und vor der
- 76 -
Diskussion
Implantation produziert werden, bereiten das Endometrium und maternale Immunsystem auf
die bevorstehende Implantation vor. Dabei sind vor allem Zytokine von Bedeutung, die in
mütterlichen T-Zellen eine Th2-Antwort erzeugen, die Anheftung der Blastozyste an das
Endometrium positiv beeinflussen, Differenzierungsvorgänge von Trophoblasten und die
Expression von weiteren Mediatoren, wie z.B. LIF in umliegenden Geweben induzieren.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen die Zytokine IL-4, IL-6, IL10, TNF-α und IFN-γ. IL-4,
das besonders stark von Embryonen nach erfolgreicher IVF exprimiert wird, beeinflusst vor
allem Adhäsionsvorgänge von Lymphozyten
311
, die Funktion von Monozyten
312
reduziert die Zytotoxizität und die Bindung von NK-Zellen an das vaskuläre Epithelium
und
313
.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass humane Embryonen dieses Zytokin relativ
konstant exprimieren. Die geringen Abweichungen in der Sekretion von IL-4 lassen auf
dessen konstitutive Expression im präimplantativen Embryo schließen. IL-4 induziert
zusammen mit IL-6 die Freisetzung von β-hCG in Trophoblasten, was wiederum zu einer
Produktion von Progesteron im Corpus Luteum während der Schwangerschaft führt
314, 315
.
Dieser Anstieg der Progesteronkonzentration bewirkt synergetisch mit IL-4 die Induktion der
Expression von LIF, was essentiell für eine erfolgreiche Implantation und Entwicklung des
Embryo ist
316, 317
. Somit ist dieses Zytokin nicht nur für die Induktion einer Th2-Antwort in
maternalem T-Zellen verantwortlich, sondern induziert zusammen mit IL-6 Veränderungen
im Zytokin- und Hormongleichgewicht der Mutter.
Abb 5.1: autokrine Regulation der LIF-Produktion
- 77 -
Diskussion
Die durch IL-4 und IL-6 induzierte LIF-Sekretion des Endometriums beeinflusst jedoch, wie
andere Zytokine der IL-6 Typ Familie, die frühen Phasen der Embryogenese nicht
318
. An
dieser Stelle sollte erwähnt werden, dass die Infertilität von Frauen in einigen Fällen auf eine
Mutation im LIF-Gen zurückgeführt werden kann
319
. Die Kontrolle der LIF Expression und
gegebenenfalls eine LIF-Substitution könnte zu einer Erhöhung der Implantationsrate nach
IVF führen
320
. IL-6 wurde in dieser Studie von den meisten Embryonen in nahezu gleicher
Konzentration produziert. Schon intrafollikulär kann es während der Reifung der Eizelle
detektiert werden, was eine wichtige parakrine und autokrine Funktion für das follikuläre
„Microenvironment“ vermuten lässt
321
. In der Literatur sind widersprüchliche Angaben
bezüglich einer Korrelation zwischen der Sekretion von IL-6 und der Implantationsrate nach
dem Embryotransfer zu finden
322, 323
. Es wurde allerdings beobachtet, daß die Embryogröße
beträchtlich sinkt, wenn wenig IL-6 vorhanden ist
323
. Bei Mäusen beeinflusst IL-6 die
Blastulation und Entwicklung des Embryo positiv; ähnliche Effekte konnten auch bei der
Studie von humanen triploiden Embryonen beobachtet werden 324. IL-10 induziert zusammen
mit IL-4 als antiinflammatorische Zytokine eine Th2-Antwort in maternalen T-Zellen und
erhöht die Resistenz von Trophoblasten gegenüber FAS-vermittelten Apoptosevorgängen
325
.
Mit der fortschreitenden Schwangerschaft gewinnt IL-10 an Bedeutung, da es die Expression
von HLA-G auf Trophoblasten und Monozyten induziert
116
und somit zur Immunmodulation
an der fetomaternalen Grenzfläche beiträgt. Die Bedeutung von IL-10 wird dadurch deutlich,
dass Schwangerschaften mit verminderter Trophoblasteninvasion (z.B. Präeklampsie) oft
auch mit einer verminderten IL-10 Produktion einhergehen
117
. Auch bei IL-10 gibt es
widersprüchliche Angaben über die Expression und den Fertilisierungsprozess
167, 326
. Sicher
scheint jedoch, dass nach abgeschlossener Implantation die Expression von IL-10 in der sich
bildenden Decidua essentiell für die Etablierung einer Schwangerschaft ist
167, 326
, was
eventuell auf die Bedeutung bezüglich der HLA-G Expression zurückzuführen ist. Weiterhin
trägt IL-10 zur Steuerung der Trophoblasteninvasion und Differenzierung bei
327
. In dieser
Arbeit konnte IL-10, ähnlich wie IL-6, in geringen Mengen, allerdings sehr konstant
detektiert werden. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass humane Embryonen große,
aber stark schwankende Mengen IFN-γγ produzieren. Die Expression von IFN-γ durch die
Blastozyste wirkt positiv auf Implantationsvorgänge
162
und trophektodermale Zellen
interagieren durch die Expression dieses Zytokins mit dem Immunsystem der Mutter
328
.
Zusammen mit weiteren Zytokinen, wie IL-1, TNF-α, GM-CSF oder CSF-1, scheinen sie die
Anlagerung der Blastozyste, deren Implantation, das Auswachsen und die Proliferation der
Trophoblasten zu beeinflussen
163
. Weiterhin spielt IFN-γ eine wichtige Rolle in der viralen
- 78 -
Diskussion
Abwehr des Feten
329
. Nebenbei beeinflussen die Zytokine Interferon-α, -β und -γ, sowie
TNF-α die Expression von HLA-G und tragen so zur Immunregulation in der
Schwangerschaft bei
330, 331
. Es kann vermutet werden, dass die placentaren Interferone zur
lokalen Immunmodulation und der Regulation von Zellproliferation und -Differenzierung
beitragen
332
, sowie immunregulatorische Effekte auf das Endometrium haben
333
. TNF-α
α
wird nur in sehr geringen Mengen von der Blastozyste exprimiert und konnte in dieser Arbeit
nur in so geringen Konzentrationen detektiert werden, die praktisch unter der Nachweisgrenze
liegen. In einer Schwangerschaft ist TNF-α ein wichtiger Regulator des Placentation und
Differenzierung,
Trophoblasten
sowie
333
ein
Modulator
der
maternalen
Immunreaktion
gegenüber
. Da TNF-α einen negativen Einfluss auf die Blastozyste und die
Entwicklung der Decidua hat
164, 165
wurde vermutet, dass eine Überexpression dieses
Zytokins im Embryo mit dem Ausbleiben der Implantation korreliert. Dies wurde allerdings
nicht beobachtet
166
. Die Expression von sHLA-G durch den Embryo stellt ein wichtiges
Kriterium für eine erfolgreiche Implantation dar
168-170
. Dabei könnte die sHLA-G-Sekretion
einen wichtigen Marker für die Vitalität des Embryo darstellen 334. Eine Mutation im HLA-GGen könnte dabei mit Infertilität und dem Auftreten von Spontanaborten assoziiert sein
171
. In
dieser Arbeit konnte retrospektiv kein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem
Implantationserfolg und der HLA-G-Expression des Embryo beobachtet werden. Dies ist
wahrscheinlich auf die geringe Probenzahl und Diversität der Probanden zurückzuführen. So
konnte beispielsweise bei einem Embryo, der augenscheinlich als „sehr gut“ eingestuft war,
eine sehr hohe sHLA-G Konzentration im Kulturmedium festgestellt werden, obwohl keine
Schwangerschaft erfolgte. Bei dieser Patientin scheinen allerdings die endometrialen und
hormonellen
Voraussetzungen
für
die
ausbleibende
Implantation
des
Embryo
ausschlaggebend gewesen zu sein. Weiterhin wiesen drei Embryonen einer Patientin
unterschiedlich große Mengen an sHLA-G im Kulturmedium auf. Alle drei Embryonen
wurden transplantiert, wobei ein Embryo erfolgreich implantieren konnte. Leider kann hierbei
nicht nachvollzogen werden, welcher der drei Embryonen implantierte. Ebenfalls ist es nicht
möglich mittels ELISA Punktmutationen im HLA-G-Gen zu detektieren, die eventuell
ausschlaggebend für die Wirkungsspezifität des sHLA-G Moleküls sein könnten.
5.9 Xenotransplantation
Auf der Suche nach geeigneten Modellen, um reproduktions- und tumorimmunologische
Vorgänge zu betrachten, haben sich in vitro Versuchsanordnungen (wie z.B. MatrigelInvasionsassays, Proliferationsassays, u.a.) nur als bedingt geeignet herausgestellt um in vivo
- 79 -
Diskussion
Verhältnisse
zu
simulieren.
Einzelne
Mechanismen,
wie
beispielsweise
das
Invasionsvermögen von Zellen oder die Proliferation können zwar untersucht werden, jedoch
kann eine komplexe immunologische Situation, wie die Implantation einer Blastozyste oder
die Etablierung eines Tumors nur bedingt betrachtet werden. Deshalb werden seit den 70er
Jahren xenogene Transplantationen von Zellen bzw. Zellverbänden als in-vivo-Modell
durchgeführt
335-337
und somit beispielsweise Hormone, Wachstumsfaktoren und andere
immunregulatorische Substanzen analysiert, die vom transplantierten Gewebe produziert
werden
230, 231
. Auf diese Weise konnten Morphologie, Angiogenese, Invasivität und
Malignität von Tumoren in vivo untersucht und neue Therapieansätze erprobt werden 232-236.
In dieser Arbeit sollte das Wachstums- und Invasionsverhalten humaner Trophoblasten
unterschiedlicher Schwangerschaftsstadien (5.SSW, 10.SSW, 40.SSW) untersucht werden. In
vorangegangenen Studien wurde gezeigt, dass alymphoide (SCID-) Mäuse für die
Transplantation humaner Trophoblasten
338
und weiterer xenogener Gewebe 239, 240, sowie für
die Beantwortung anderer Fragestellungen der Reproduktionsbiologie 135, 339-341 geeignet sind.
Ein experimenteller Teil dieser Arbeit beinhaltete die xenogene Transplantation von humanen
Trophoblastzellen unter die Nierenkapsel von SCID-Mäusen, in denen eine Proliferation und
oft eine Differenzierung der Trophoblasten beobachtet werden konnte. Ähnlich wie bei der
subkutanen Xenotransplantation von Jeg-3 Zellen, konnte β-HCG im Mausserum
nachgewiesen werden 227, wobei Trophoblastzellen der 10.SSW mehr β-hCG produzierten als
jene der 5.SSW. Auch die hormonellen Auswirkungen dieser β-HCG Produktion (blutgefüllte
Ovarien, geschwollene Uteri) konnten in ähnlicher Weise beobachtet werden, wie nach der
Transplantation von Jeg-3 Zellen. Da die Invasivität
89
115
und Migration von Zytotrophoblasten
, die Collagenaseaktivität und Induktoren für MMPs durch β-hCG inhibiert werden
115
,
könnte eine mögliche Funktion dieser β-hCG Produktion die autokrine Wachstumskontrolle
der Trophoblasten sein, bei der ab einem bestimmten β-HCG Level die Invasion gestoppt
wird. Auf Grund der Beobachtung, dass Trophoblasten der 5.SSW erheblich weniger β-HCG
produzierten als die der 10.SSW, könnte vermutet werden, dass die β-HCG-Expression erst
nach einer gewissen Entwicklungszeit des Embryo und der Placenta beginnt bzw. verstärkt
wird. Möglicherweise gibt es weitere Unterschiede in der Zytokinproduktion dieser
Trophoblasten und autokrinen Regulationsmechanismen, die davon beeinflusst werden.
Wahrscheinlich wird durch die hormonellen Veränderungen in den Versuchstieren, induziert
durch die Transplantate, die Produktion von Zytokinen beeinflusst. So konnte beobachtet
werden, dass in Schafen durch eine β-HCG-Stimulierung die LIF-Expression im
Endometrium induziert werden konnte
342
. Dies würde auch erklären, warum Trophoblasten
- 80 -
Diskussion
der 10.SSW bei einer sehr hohen β-HCG-Expression invasiver sind als die der 5.SSW. In
diesem Experiment konnte ebenfalls die Differenzierung von Zytotrophoblasten in
Syncytiotrophoblasten, sowie die Entwicklung von Blutgefäßen beobachtet werden. Die für
diese Vorgänge nötigen Regulationsmoleküle und Zytokine könnten entweder durch die
Trophoblasten selbst oder ebenfalls durch die Wirtstiere synthetisiert worden sein. Die
Beobachtung fetaler Erythrozyten in den histologischen Schnitten ist wahrscheinlich auf die
Verunreinigung der Trophoblastentransplantate mit pluripotenten Stammzellen oder anderen
Erythrozyten-Vorläuferzellen zurückzuführen.
Eine weitere Erkenntnis war, dass auch immunkompetente Mäuse (C57Bl/6J) für die
Transplantation und Kultur von humanen Trophoblastzellen geeignet sind.
Es scheint
verwunderlich, dass nach der Transplantation in diese Mäuse keine erfolgreichen
Immunreaktionen gegen die Transplantate beobachtet werden konnten, doch auch andere
Studien zeigen, dass xenogene Zellen, die HLA-G produzieren, nicht vom Wirtsimmunsystem
erkannt und abgestoßen werden
227, 228
. Interessanterweise führt auch die Injektion von Jeg-3
in vitro Kulturüberständen zu einer Unterdrückung der Immunantwort gegenüber
xenotransplantierten, allogenen Zellen
229
. Wahrscheinlich führt unter anderem die lösliche
Form von HLA-G (sHLA-G) in diesen Überständen zu den beobachteten Effekten. HLA-G,
das von Burt et.al. als Grund für diese Beobachtungen und essentiell für die feto-maternale
Immunsuppression
beschrieben
228
wurde
,
bezeichnete
Horuzsko
et.al.
als
Transplantationsantigen 343. Tatsächlich ist HLA-G einer der ausschlaggebenden Faktoren für
eine erfolgreiche Immunsuppression nach Organtransplantationen. Wie schon beschrieben,
wird die Funktion von HLA-G als Transplantationsantigen auch von verschiedenen Tumoren
179
und semiallogenen Trophoblastzellen genutzt 174, 344. Dabei wird die Expression von HLA-
G in stark invasiven Jeg-3 Choriokarzinomzellen durch LIF verstärkt, so dass durch die
Hormonproduktion der Trophoblasten und die damit verbundene LIF-Produktion des
Endometriums, der Schutz vor dem Immunsystem des Wirtstieres verstärkt wird. Dabei
wurden
die
proliferierenden
und
sich
differenzierenden
Trophoblastzellen
in
immundefizienten Mäusen in ihrer Entwicklung maßgeblich durch die Injektion von Plasma
aus Patienten mit Symptomen von Präeklampsie negativ beeinflusst. Diese Beobachtung wird
durch Studien von Neale et.al. bestätigt, in denen die Proliferation in Trophoblastkulturen in
vitro durch Zugabe von Serum aus Patienten mit Präeklampsie gehemmt wurde
345
. Eine
weitere Wirkung der Serumzugabe war die Induktion der Apoptose in diesen Zellen
346
.
Ursächlich dafür scheint allerdings weniger eine spezielle Substanz im Serum der Patienten,
als ein verändertes Verhältnis vieler regulatorischer Substanzen und Zytokine zu sein.
- 81 -
Diskussion
Dieses Experiment zeigt das Potenzial der Xenotransplantation, Zellen in vivo zu kultivieren
und in ihrem Wachstum, Proliferation und Differenzierung zu beeinflussen. Durch diese in
vivo Studien können weitere Erkenntnisse über die Ursachen von Krankheiten wie zum
Beispiel Präeklampsie gewonnen, sowie Vorgänge der frühen Schwangerschaft simuliert
werden. Weiterhin würden diese Experimente zum grundsätzlichen Verständnis der
Tumorimmunologie und -entstehung beitragen.
5.10 Ausblick
In weiterführenden Experimenten könnte durch den „Knock Down“ von Regulatormolekülen,
die den JAK/STAT Signaltransduktionsweg beeinflußen, die Steuerung der Invasivität von
Trophoblast- und Tumorzellen näher betrachtet werden. Auf diese Weise würden
beispielsweise die Funktion und Wirkungsweise von ERK- oder mTOR- Molekülen in der
Regulation dieses Prozesses näher erklärt. Im Mausmodell könnten Mechanismen beobachtet
werden, die zur Induktion der Invasion von Trophoblastzellen zu einem sehr frühen Zeitpunkt
der Embryogenese und Tumorzellen führen. Diese Beobachtungen würden Aufschluss über
die Entstehung von Tumoren und deren Behandlung geben. Weiterhin könnten nähere
Kenntnisse über die Vorgänge in der frühen Schwangerschaft dazu beitragen, die
Implantationsrate nach in vitro Fertilisationsn zu steigern und die Abortrate zu senken. In
weiterführenden Xenotransplantationsstudien könnten die Funktionen von intrazellulären
Signalübertragungsmolekülen und deren Regulatoren in Trophoblastzellen bezüglich der
Invasivität, Placentation und Zytokin- bzw. Hormonproduktion untersucht werden. Außerdem
wären diese in vivo Experimente dazu geeignet, Stoffe zu untersuchen, die einen Einfluss auf
das Wachstum und die Differenzierung von Trophoblasten haben, um so Mechanismen und
Vorgänge bei Krankheiten mit reduzierter Trophoblasteninvasion zu erklären. Dabei könnten
in vivo ebenfalls die Wirkung von Medikamenten untersucht werden. Durch den selektiven
„Knock Down“ verschiedener Isoformen von HLA-G, gefolgt von der Xenotransplantation in
immunkompetente Mäuse könnte untersucht werden, ob Abstoßungsreaktionen der
Transplantate auftreten, um so herauszufinden, ob die einzelnen Isoformen ähnliche
immunsuppressive Wirkungen haben. Dadurch wäre es möglich herauszufinden, in wieweit
eine Punktmutation in dem HLA-G-Gen den Schutz eines Embryo vor dem maternalen
Immunsystem und somit die Etablierung einer Schwangerschaft beeinflusst.
Durch diese Experimente könnten weitere Erkenntnisse zum Verständnis der besonderen
immunologischen
Situation
der
Schwangeschaft
erlangt
immunologische Therapien von Tumoren erprobt werden.
- 82 -
und
neue
Ansätze
für
Zusammenfassung
6. Zusammenfassung
Hintergrund: Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Interaktion von NK-Zellen und
Trophoblastzellen, die fetal und somit aus immunologischer Sicht der Mutter semiallogenen
sind. Durch die Expression von HLA-G schützen sich Trophoblast-, aber auch Tumorzellen
vor einer zytotoxischen Reaktion von NK-Zellen. Die Invasion von Trophoblastzellen wird
durch Zytokine und Hormone räumlich und zeitlich reguliert und verringert sich mit
fortschreitender Schwangerschaft. Bei der Regulation der Invasion von Trophoblast- und
Tumorzellen spielen „Signal Transducer and Activator of Transcription“ (STATs) eine
entscheidende Rolle. STAT3-Signale sind für eine erfolgreiche Schwangerschaft essentiell
und korrelieren bei Tumoren mit deren Invasivität. STAT6-Signale stehen in Verbindung mit
der Malignität, Proliferation und transkriptionellen Aktivierung von IL-6 in Tumoren. Von
NK-Zellen und anderen Lymphozyten sezernierte Zytokine der IL-6 Familie steigern die
Invasivität verschiedener Tumoren. „Suppressors of Cytokine Signalling“ (SOCS) regulieren
STAT-Signale negativ und tragen somit zur Steuerung der genannten Vorgänge bei.
Zielstellung: In dieser Arbeit soll die Regulation der Invasion von Trophoblast- und
Karzinomzellen, sowie die Regulation der NK-Zell-Antwort an der feto-maternalen Grenzfläche näher betrachtet werden. Weiterhin soll eine in vivo Kulturmethode humaner
Trophoblastzellen in der Maus etabliert werden.
Methoden: Mittels PAGE und Western Blot wurde untersucht, welche Zytokine eine
Phosphorylierung
von
STAT3
in
Jeg-3
Choriokarzinomzellen
induzieren.
In
Trophoblastzellen sowie in Zellinien ist mittels siRNA die Expression STAT3, STAT6,
SOCS3 unterdrückt worden („Knock Down“). Die Funktionen dieser Moleküle wurde in
Apoptose-, Invasions- und Proliferationsassays untersucht. Dem „Knock Down“ von HLA-G
und HLA-G1 in Jeg-3 Zellen, sowie dem „Knock Down“ von STAT3 in dezidualen NKZellen folgten Zytotoxizitätsassays. Mittels ELISA und Cytometric Bead Arrays wurde die
Konzentration von Zytokinen und löslichem HLA-G (sHLA-G) in humanen Embryokulturüberständen analysiert. Humane Trophoblastzellen wurden unter die Nierenkapsel
immundefizienter und -kompetenter Mäuse transplantiert, gefolgt von histologischen
Analysen.
Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass LIF eine starke Phosphorylierung von STAT3 in
Jeg-3 Zellen induziert, während IL-6, IGF-2 und HGF nur einen geringen bzw. keinen
Einfluss haben. LIF erhöht die Invasivität von Trophoblast- und Jeg-3 Zellen. Diese Wirkung
bleibt nach dem „Knock Down“ von STAT3 aus. IL-6 führt ebenfalls zu einer leichten
Erhöhung der Invasivität und Proliferation in Jeg-3 Zellen, was nach dem „Knock Down“ von
- 83 -
Zusammenfassung
STAT3 nicht mehr beobachtet werden kann. Diese Beobachtungen sind nicht auf die
Induktion von Apoptose zurückzuführen. Nach dem „Knock Down“ von SOCS3 induziert IL6 eine starke Phosphorylierung von STAT3. Die IL-4-Stimulierung von Jeg-3 Zellen sowie
der „Knock Down“ von STAT6 haben keinen Einfluss auf deren Invasivität. Die durch IL-4
induzierte Proliferation dieser Zellen kann allerdings durch den STAT6 „Knock Down“
inhibiert werden. Humane Trophoblastzellen können erfolgreich unter die Nierenkapsel
immundefizienter und -kompetenter Mäuse transplantiert und für bis zu 68 Tage kultiviert
werden. Dabei können Differenzierungsvorgänge beobachtet werden. Die Zytotoxizität von
NK-Zellen gegenüber Jeg-3 Zellen wird durch eine Verringerung der HLA-G bzw. HLA-G1
Expression erhöht. In dezidualen NK-Zellen wird die Zytotoxizität unter anderem durch
STAT3 reguliert. Ein „Knock Down“ von STAT3 führt zu einer verminderten Zytotoxizität
gegenüber Zielzellen. Humane Embryonen sezernieren in vitro die Zytokine IL-4, IL-6, IL10, IFN-γ und sHLA-G in unterschiedlichen Konzentrationen.
Schlußfolgerung:
LIF
steuert
via
STAT3
die
Proliferation
und
Invasion
von
Trophoblastzellen und ist für eine erfolgreiche Etablierung und den Erhalt einer
Schwangerschaft essentiell. Es stimuliert die Expression von HLA-G, welches in die fetomaternale Immuntoleranz involviert ist. Trophoblast- und Jeg-3 Zellen schützen sich durch
die Expression verschiedener Isoformen von HLA-G vor der zytotoxischen Reaktion von NKZellen. HLA-G wird dafür mitverantwortlich sein, dass Trophoblastzellen nach der
Xenotransplantation in immunkompetente Mäuse nicht vom Wirtsimmunsystem erkannt und
abgestoßen werden. Die durch die Zytokine LIF und IL-6, die das gleiche Rezeptormolekül
(gp130) benutzen, induzierte Signalkaskade wird in Jeg-3 und Trophoblastzellen durch
SOCS3 negativ reguliert. STAT6, das von IL-4 aktiviert wird und die Malignität
verschiedener Karzinomzellen, sowie die transkriptionelle Aktivierung von IL-6 beeinflusst,
ist ebenfalls an der Regulation der Proliferation von Jeg-3 Zellen beteiligt. Durch die
Produktion eines speziellen Zytokinprofils und sHLA-G bereitet der Embryo das maternale
Immunsystem auf die Implantation und Invasion vor.
Die Implantation des Embryo und Placentation, verbunden mit der Invasion von
Trophoblastzellen, sind streng regulierte Prozesse mit Parallelen zur Tumorgenese. Weitere
Erkenntnisse über diese Mechanismen könnten helfen Frühgeburts- und Abortbestrebungen
entgegen zu wirken und Tumore zu behandeln.
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Danksagung
Danksagung
Ich möchte mich bei all denen bedanken, die diese Arbeit ermöglicht und zu ihrem Gelingen
beigetragen haben:
- Allen voran Herrn PD. Dr. med. Udo Markert für die Überlassung der Arbeit und die
wissenschaftliche Betreuung, sowie Herrn Professor Liebmann, der sich als Betreuer
seitens der biologisch-pharmazeutischen Fakultät der FSU Jena zur Verfügung stellte.
- Allen Mitarbeitern des Placentalabors, der molekularen Gynäkologie, sowie des IVFLabors die mir mit Rat und Tat zur Seite gestanden haben. Hierbei sollen unter
anderem Frau Dr. Lydia Seyfarth, Herr PD. Ekkehard Schleussner, Frau Dr. Claudia
Backsch, Herr PD. Wolfgang Starker, Frau Dr. Ines Hoppe, Anja Keil, Susann
Busch,
Sandra Voigt, Justine Fitzgerald, Dr. Tobias Wengenmayer und Susann
Salzmann genannt sein.
- Bei dem Ärzte- und Schwesternteam des Kreissaals.
- Bei Herrn Dr. Wolfgang Michels für die Unterstützung in statistischen Fragen.
- Bei Frau Dr. Anne Croy und Herrn Dr. Chandrakant Tayade für die Zusammenarbeit
und die Unterstützung während meines Forschungsaufenthaltes am Ontario Veterinary
College der University of Guelph, Canada.
- Der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, dem Boehringer Ingelheim Fonds,
sowie der Aventis-Stiftung für die gewährten Reisekostenunterstützungen.
- Bei meinen Eltern, Verwandten und Freunden für die vielseitige Unterstützung,
Aufmunterungen und den Rückhalt in jeglicher Hinsicht.
Publikationsliste
Publikationsliste
Wissenschaftliche Publikationen
Poehlmann TG, Fitzgerald JS, Meissner A, Wengenmayer T, Schleussner E, Friedrich
K, Markert UR
Trophoblast invasion: Tuning through LIF, signalling via Stat3
Placenta (in press)
Poehlmann TG, Busch S, Mussil B, Winzer H, Weinert J, Mebes I, Schaumann A,
Fitzgerald JS, Markert UR.
The Jak/Stat pathway in lymphocytes at the fetomaternal interface.
Chem Immunol Allergy (in press).
Fitzgerald JS, Wengenmayer T, Poehlmann TG, Markert UR.
Intracellular signals in invading trophoblast cells.
Chem Immunol Allergy (in press).
Fitzgerald JS, Tsareva SA, Berod L, Poehlmann TG, Corvinus FM, Wiederanders B,
Friedrich K, Markert UR
Leukemia Inhibitory Factor (LIF) triggers STAT3 activation, proliferation and altered
protease expression in Jeg-3 choriocarcinoma cells.
Int J Biochem Cel Biol (in press)
Wengenmayer T, Poehlmann TG, Markert UR.
Inhibition of HLA-G production in JEG-3 choriocarcinoma cells by RNA interference
(RNAi).
Am J Reprod Immunol 2004; 51: 189-191.
Poehlmann TG, Bashar S, Markert UR, Caniggia I, Croy BA, Tayade C.
Human trophoblast allotransplants in alymphoid mice.
Placenta 2004; 25: 357-358
Gutiérrez G, Fitzgerald JS, Poehlmann TG, Hoppe I, Markert UR
Comparative effects of Tryptophan and Methyl-Tryptophan on immunoregulation
induced by sperm, human preimplantation embryo and trophoblast supernatants.
Am J Reprod Immunol. 2003; 50 (4): 309-315.
Fitzgerald JS, Storl F, Busch S, Poehlmann TG, Markert UR.
Th1-Th2 shift induced by trophoblast: Regulation at the Jak/Stat signal transduction
level and dependency of tryptophan catabolism.
Am J Reprod Immunol (revisions requested).
Poehlmann TG, Schaumann A, Le Bouteiller P, Markert UR.
Effects of HLA-G1s on decidual NK cells.
(In preparation)
Publikationsliste
Reisekostenunterstützungen/Awards
New Investigator Award
Fitzgerald JS, Corvinus F, Berod L, Poehlmann TG, Friedrich K, Markert UR.
Leukemia Inhibitory Factor Induces Stat3 DNA-Binding Activity in Jeg-3
Choriocarcinoma Cells
23rd Annual Meeting of the ASRI, June 18-21, 2003, Yale, USA
Travel Award for Outstanding Presentation
Pöhlmann TG, Schaumann A, Fitzgerald JS, Maryse Aguerre-Girr, Le Bouteiller P,
Markert UR
Effects of soluble HLA-G1 on human decidual natural killer cells
23rd Annual Meeting of the ASRI, June 18-21, 2003, Yale, USA
Best Poster Award
Poehlmann TG, Bashar S, Markert UR, Caniggia I, Croy BA, Tayade C.
Human trophoblast allotransplants in alymphoid mice.
Southern Ontario Reproductive Biology Meeting, April 2003, Kingston, Canada.
Poster presentation.
Best Abstract Award
TG Poehlmann, A Schaumann, P Le Bouteiller, UR Markert
HLA-G1s downregulates perforin mediated decidual NK cell killing activity via Stat3
suppression.
12th International Congress of Immunology, July 2004, Montreal, Canada
Y.W. Loke New Investigator Travel Award
T.G. Poehlmann, A. Meissner, T. Wengenmayer, E. Schleussner, K. Friedrich, U.R.
Markert
STAT3 regulates invasion of Jeg-3 choriocarcinoma and trophoblast cells
Placenta Conference September, 2004 Asilomar, CA, USA
Boehringer Ingelheim Stipendium
Für dreimonatigen Studienaufenthalt am Ontario Veterinary College im Labor von Frau
Dr. Anne Croy in Guelph, Ontario, Canada
Aventis iLab Award
Reisekostenunterstützung für Teilnahme an der “Placenta Conference”, September 2004
in Asilomar, CA, USA
Deutschen Gesellschaft für Immunologie
Reisekostenunterstützung für die Teilnahme an dem Workshop „Frontiers in
Reproduction“ am Marine Biological Laboratory, May 2005
Lebenslauf
Lebenslauf
Name:
Pöhlmann
Vorname:
Tobias
Adresse:
Gellertstraße 2a,
08065 Zwickau
Geburtsdatum:
29.08.1978
Geburtsort:
Zwickau
Schulbildung:
1985-1991: Polytechnische Oberschule “Friedrich Engels” Zwickau
1991-1997: “Käthe Kollwitz” Gymnasium
1997
Abitur
Grundwehrdienst:
Oktober 1997- Juli 1998 Bundeswehr (Heeresmusikkorps 13, Erfurt)
Studium:
Biologie Diplom 1998-2003 an der Friedrich-Schiller-Universität Jena
-Oktober 2000 Vordiplom
-April 2003 Diplom
Auslandsaufenthalte: -Februar 2003 bis Mai 2003 Arbeit im Ontario Veterinary College,
Guelph, Ontario, Canada
-Juni 2003 Immunology Workshop, Yale University, New Haven, USA
derzeitige Tätigkeit: Wissenschaftlicher Mitarbeiter und Doktorand im Placentalabor des
Klinikums der FSU Jena
Jena, den 28.04.2005
_____________________
Ehrenwörtliche Erklährung
Ehrenwörtliche Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Benutzung der
angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe. Dies ist geschehen im Rahmen der
Promotionsordnung der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der Friedrich-SchillerUniversität Jena.
Die vorliegende Arbeit wurde noch nicht als Prüfungsarbeit, bzw. als Dissertation an einer
anderen Hochschule eingereicht.
____________________
Jena, 28.04.2005
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