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Script Genexpression Sonnbert

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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
[If you paid for this, you've been ripped off]
In eigener Sache:
Sollten Fehler egal welcher Art in der Ausarbeitung zu finden sein (davon geh ich mal aus,
ich bin ein fauler Noob), bitte eine E-Mail an [email protected] schicken, damit ich's
ausbessern kann wenn Zeit ist und die Anfrage sinnvoll klingt. Ähm, in der E-Mail sollt
natürlich drin stehen wo was falsch ist …
Es wäre vielleicht noch zu sagen, dass man die hier eingefügten Bilder nur zum
Privatgebrauch verwenden sollte, weil oft keine Quelle angegeben ist und manche
Herausgeber das angeblich übel nehmen.
Texte aus den Folien zur Vorlesung sind durch eine andere Schriftfarbe gekennzeichnet,
damit man weis welchen Textteilen man eher misstrauen sollte.
Die Datei ist aus dem Grund schreibgeschützt, damit niemand den Kopf austauscht, die
Mitschrift kopiert und verkauft. Die Mitschrift soll für alle interessierten Personen gratis zu
haben sein – oder maximal eine gebrannte CD kosten.
Weiters ist noch zu sagen, dass ich in dieser meiner Mitschrift, eine weitere Mitschrift vor
allem für den Teil Bläsi verwendet hab (weil ich seine Vorlesung nicht durch'druckt hab…), es
finden sich eine ganze Menge Paraphrasen davon hier drin. Allerdings weis ich leider nicht
von wem die Mitschrift ist, ich kann daher weder um Erlaubnis fragen noch Credits geben.
Sorry, bitte nicht bös sein...
Aus den Bläsi Foliensätzen hab ich ein paar Bilder ausgelassen und durch Text ersetzt, weil
sie meiner Meinung nach nicht nötig sind.
So und jetzt genug mit dem unnötigen Gelaber.
Mitschrift zur Vorlesung
"Genexpression"
von Decker, Bläsi
Inhaltsverzeichnis:
Inhaltsverzeichnis: .................................................................................................... 1
Vorlesung Genexpression ........................................................................................... 3
Teil Decker: Transkriptionskontrolle ............................................................................. 3
Genexpression ....................................................................................................... 3
Proofreading durch RNA Polymerase ....................................................................... 8
Termination der Transkription................................................................................ 9
Der Promotor .................................................................................................... 10
DNAse I footprinting: ......................................................................................... 13
Systematische Analyse der Transkriptionskontrolle eines durch RNA Pol II transkribierten,
eukaryoten Gens .................................................................................................. 26
1. Welche Gene werden durch Stimuli aus der zellulären Umgebung reguliert?............ 26
2. Liegt Transkriptionskontrolle vor? ..................................................................... 29
3. Isolieren des Promoters .................................................................................. 29
4. Wo binden wichtige Transkriptionsfaktoren?....................................................... 34
5. Welche Transkriptionsfaktoren sind an der Regulation beteiligt? ............................ 35
6. Struktur-Funktionsbeziehung im isolierten Transkriptionsfaktor (wo sind funktionelle
Domänen?) ....................................................................................................... 37
7. Interaktion des Transkriptionsfaktors mit anderen Proteinen ................................ 38
Transkriptionsfaktoren........................................................................................ 39
Die Initiation der Transkription ............................................................................... 42
RNA Polymerase II Holoenzyme ........................................................................... 45
Bildung einer mRNA CAP Struktur ........................................................................ 47
mRNA Termination und Polyadenylierung .............................................................. 47
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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Genregulation durch DNA Methylierung.................................................................... 68
Mechanismen zur Regulation der Transkriptionsfaktor Aktivität ................................... 71
Genregulation durch cAMP .................................................................................. 76
Als abschließendes Beispiel Transkriptionskontrolle über Konzentrationsverteilung: ..... 84
Teil Bläsi: Translationskontrolle ................................................................................. 85
transfer RNA is the adapter ................................................................................. 87
tRNA processing ................................................................................................ 88
tRNA charging ................................................................................................... 89
Experiment: Strukturelle Kartierung der 16S tRNA durch Chemical probing. ............... 95
Correct translation initiation requires initiation factors ............................................100
Experiment: Bindungsort von IF1 mittels Chemical probing ermitteln .......................100
Experiment: Reportergen Assay zur Autoregulation von IF3 ....................................102
Toeprinting assay .............................................................................................103
Experiment: Aktivitätsmessung von IF3 ...............................................................103
Experiment: tRNA charging – welches Codon für welche AS ....................................105
Die Shine Dalgarno Sequenz...............................................................................107
Experiment: Biochemischer Nachweis der SD-Anti-SD-Interaktion durch footprinting..108
Experiment: Genetischer Nachweis der SD-Anti-SD-Interaktion ...............................108
Experiment: Biochemischer Nachweis der SD-Anti-SD-Interaktion durch chemical probing
......................................................................................................................109
Parameters affecting translation initiation of a canonical prokaryotic mRNA ...............110
Experiment: Isolierung von mRNA-Fragmenten die S1 binden und deren Sequenzierung
......................................................................................................................111
Experiment: Klärung ob S1 Primär oder Sekundärstrukturen der mRNA bindet ..........111
The downstream box .........................................................................................120
Autoregulation der Translation durch Protein S15 ..................................................122
Experiment: Repressorwirkung des Proteins S15 bei Translation ..............................123
Experiment: Ermittlung der hfq Chaperonaktivität mittels Toeprinting ......................130
Experiment: Spaltung des SodB-RhyB RNA Komplexes durch RNase E......................133
Leaderless mRNA ................................................................................................138
Experiment: Competition Assay zur leaderless mRNA .............................................140
Incorporation of unusual amino acids: the 21st and 22nd amino acids ......................149
Programmed frameshifting .................................................................................152
Experiment: Test auf +1 frame shift:...................................................................152
Experiment: Prinzipeller Test auf Frameshift: ........................................................153
Experiment: Test auf Translationale Introns..........................................................155
Abbau von mRNA ................................................................................................157
Experiment: Nachweis einer bestimmten mRNA in einer Zelle .................................158
Experiment: Nachweis von welchem Ende her mRNA abgebaut wird.........................159
Experiment: Test auf Zusammenhang zwischen effizienter Translation und mRNA
Stabilität .........................................................................................................165
Regulation of Gene Expression in Eukaryotes...........................................................168
mRNA processing: Nuclear Splicing .....................................................................168
Group I introns: ...............................................................................................173
3'-end formation...............................................................................................175
Die CAP Struktur ..............................................................................................177
Toeprinting bei Eukaryoten: ...............................................................................181
Experiment: Nachweis interner Initiation durch IRES..............................................183
Eukaryotic translational elongation and termination: ..............................................187
mRNA stability in Eukaryotes ..............................................................................188
Translation in Archaea..........................................................................................198
Experiment: Nachweis, dass Leadersequenz den Transport durch die Membran induziert.
......................................................................................................................205
Experiment: Prinzipielle Funktion des Sec Pathways...............................................208
Import into and export from the nucleus ..............................................................213
Prüfungsfragen ......................................................................................................215
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Decker Foliensatz 1
07.03.2006
Vorlesung Genexpression
Teil Decker: Transkriptionskontrolle
Thomas Decker, Institut f. Mikrobiologie und Genetik
Literatur:
• Lewin, B.; Genes VIII; Pearson/Prentice Hall
• Lodishet al.; Molecular Cell Biology, 4th edition; Freeman
• Watson et al.; Molecular Biology of the cell, 4th edition; Garland Science
• Watson, J. et al.; Molecular Biology of the gene, fifth edition; Pearson
Genexpression
All diejenigen Schritte, welche dazu führen, dass der DNA-Code in eine definierte Menge und
Aktivität eines Genprodukts (RNA, Protein) übertragen wird.
Die Expression von Genen ist über mehrere Ebenen steuerbar.
•
•
•
•
•
•
Transkriptionskontrolle
30-35.000 Gene codieren in menschlicher DANN für Proteine. Die Gene werden
unterschiedlich stark transkribiert.
Housekeeping genes sind wichtige Gene z.B. für Metabolismus oder Zellwachstum, die
ständig transkribiert werden.
Demgegenüber werden die meisten Gene situationsbedingt transkribiert, z.B. sind Gene
der Embryonalentwicklung im adulten Status nicht mehr nötig und werden stillgelegt.
Situationsspezifischer Einsatz von Genen
Vermeidet Koordinationsschwierigkeiten im Zellinneren und dient der Energieersparnis.
Transkriptprozessierung (Splicing, Transport)
In Eukaryoten ist Modifizierung (Splicing, PolyA-Schwanz, CAP) und Export der mRNA aus
dem Zellkern nötig.
Transkriptstabilität
Die Stabilität des Transkripts im Cytoplasma ist von mehreren Faktoren abhängig.
Translationskontrolle
Post-translationale Modifikation (Aktivität des Proteins)
Ein Protein kann je nach Verwendungszweck direkt nach der Translation aktiv sein oder
durch spätere Veränderung aktiv werden.
Proteinstabilität
Proteine selbst können stabil oder instabil sein.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Wie 'wachsen' Nukleinsäuren und Polypeptide während ihrer Synthese?
Transkription: Der 'template' (=nichtkodierende) Strang der DNA eines
Gens wird in 3'-5' Richtung abgelesen um eine 5'-3' mRNA Synthese
durchzuführen. Die Polarität und Sequenz der mRNA entspricht der des
kodierenden DNA Strangs.
Transkription chemisch: sowohl DNA als auch RNA können durch
chemische Gegebenheiten nur in 5'-3' Richtung synthetisiert werden.
Das 3' OH einer Nucleinsäurekette wird durch einen enzymatisch
(Polymerase) dirigierten nucleophilen Angriff unter
Abspaltung eines PPi mit dem 5' Ende eines neuen Nucleotids verknüpft.
Syntheseraten von Nukleinsäuren und Proteinen
•
•
•
Transkription (E. coli): ca. 40 Nucleotide/sec bei 37°C.
Translation (E. coli): ca 15 Aminosäuren/sec bei 37°C.
DNA Replikation (E. coli): 50.000bp/min; Eukaryoten ca. 2000bp/min.
1AS = 1 Codon = 3 Basen
RNA Synthese ist prinzipiell langsamer als die Replikation von DNA.
Prokaryoten weisen im Vergleich zu Eukaryoten keinen Nucleus auf. Dadurch kann die mRNA
bereits während der fortlaufenden Transkription translatiert werden.
Die ersten Schritte der mRNA Synthese:
(1) RNA Polymerase muss zunächst am DNA
Strang aus der Masse nichtkodierender Basenpaare
den Beginn eines Gens finden und an dieser Stelle
mit der DNA interagieren.
(2) Anschließend ist Trennung der beiden DNA
Stränge nötig, um am nichtkodierenden Strang
eine mRNA synthetisieren zu können.
(3) Das erste synthetisierte Basenpaar ist zumeist
eine CG Paarung.
(5) Bereits bei der Bindung des dritten Nucleotids
an die mRNA muss die RNA Polymerase beginnen,
sich am nichtkodierenden DNA Strang entlang zu
bewegen und die DNA weiter voneinander zu
trennen.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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Transkription lässt sich in distincte Phasen gliedern:
Initiation … Vorgang von
Erkennung und Bindung der
RNA Pol an die DNA bis zur
Synthese erster Nucleotide
ohne Fortbewegung.
Elongation … RNA Pol bewegt
sich an der DNA entlang und
fügt der mRNA Nucleotide
hinzu.
Termination … spezielle
Signale bewirken den Stopp
der Transkription und die
Lösung der RNA Pol von der
DNA.
Der beginn der Initiation lässt
sich thermodynamisch in
einzelne Schritte einteilen:
(1) Bildung eines "geschlossenen binären Komplexes" aus ungetrennter DNA und RNA
Polymerase. Die Konstante KB beschreibt, wie schnell der Komplex an die DNA bindet. Die
Affinität zwischen dem Promotor eines Gens und der RNA Polymerase kann um bis zu einem
Faktor 1000 schwanken (106 bis 109 M-1). Die Rückreaktionskonstante ist sehr klein, daher
läuft der nächste Schritt sehr schnell ab.
(2) Bildung eines "offenen binären Komplexes" in dem die DNA im Bereich des
Transkriptionsstarts aufgetrennt wird. Nach dem Aufschmelzen der DNA ist die Ablösung der
RNA Polymerase von der DNA von alleine biochemisch praktisch nicht mehr möglich.
(3) Bildung eines "ternären Komplexes" (abortive Initiation) indem das erste RNA Nucleotid
komplementär zur DNA gebunden wird, dieser Schritt dauert relativ lange.
(4) Die Freigabe des Promotors (Promotor clearance) dauert lange, da es sich um einen
biochemisch aufwendigen Prozess handelt.
Die Anatomie der E. coli RNA Polymerase
Das aus den β (rpoB
Gen in E.coli), β'
(rpoC) und 2α (rpoA)
Untereinheiten
bestehende 'core'
Enzym wird durch
Assoziation mit der σUntereinheit (=σFaktor, rpoG) zum
Holoenzym.
Ein Komplex aus den 2α, β und β' Untereinheiten wird als
core enzyme, mit weiteren UE inklusive σ als
Holoenzym (holos = ganz) bezeichnet.
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Die bakterielle RNA Polymerase
RNA Polymerase muss einen Kanal
zur Führung der DNA, einen Kanal zu
Aufnahme von Nucleotiden, einen
weiteren als Ausgang für die
synthetisierte mRNA sowie ein
aktives Zentrum besitzen, um
Nucleotide an der DNA zu mRNA zu
synthetisieren.
Der Bereich einer DNA, der die Signale und Information zur Synthese eines
vollständigen Transkripts enthält, wird als 'transcription unit' bezeichnet
Die transcription unit besteht aus einer Startregion über die die RNA Polymerase an die DNA
binden kann (Promotor), folgende Sequenzen die für ein (monocistronisch) oder mehrere
Gene codieren (polycistronisch), sowie eine Sequenz die der Termination der Transkription
dient (Terminator).
Als Initiationsstelle wird das Nucleotid bezeichnet, an dem die RNA Polymerase das erste
Nucleotid der mRNA bindet. Alles vor der Initiationsstelle, also in Richtung des 5' Endes des
nichtkodierenden DNA Stranges, wird als upstream, alles danach, also Richtung des 3'
Endes, als downstream bezeichnet.
Unterschiede zwischen prokaryotischer und eukaryotischer mRNA:
Prokaryotische mRNA kann polycistronisch sein, eukaryotische mRNA ist immer
monocistronisch, codiert also immer nur für ein Gen.
Die mRNA prokaryotische Gene ist fast immer durchgehend und ermöglicht es, dass
Transkription und Translation parallel ablaufen kann. Demgegenüber sind die codierenden
Bereiche eukaryotische mRNA (Exons) direkt nach der Transkription noch durch
nichtkodierende Bereiche (Introns) getrennt, die mittels Splicing erst entfernt werden
müssen um eine kontinuierliche RNA Sequenz für die Translation zu erhalten.
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Unterschiedliche Veränderung der DNA Topologie vor und hinter der
transkribierenden RNA Polymerase durch die Entwindung der DNA innerhalb der
'transcription bubble': positive und negative supercoils
DNA liegt innerhalb der RNA Polymerase in
einem Bereich von 25 bp geöffnet vor, die
Polymerase überdeckt vor und nach der
geöffneten Stelle einen jeweils 10bp langen
weiteren Bereich der DNA.
In entspanntem Zustand liegt DNA als
Doppelhelix mit etwa 10bp pro helikaler
Windung vor.
Im Zuge der RNA Synthese wird die DNA
geöffnet. Dadurch und durch die Bewegung
der RNA Polymerase entlang der DNA wird
die Windungszahl vor der Polymerase
verkleinert (mehr bp pro Windung),
während sie hinter der Polymerase größer
wird. Im Zuge dieser Spannungen
entstehen vor der Öffnungsstelle negative
und danach positive Supercoils.
Um diese Supercoils aufzulösen ist Energie notwendig, die die RNA Polymerase nicht
aufbringen kann. Sie werden daher durch eigene Enzyme, Topoisomerasen bzw. DNA
Gyrasen, wieder aufgelöst.
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Funktionsweise der Typ I und Typ II Topoisomerasen:
Topoisomerase I löst
negative Supercoils
auf. Sie schneidet
einen Strang der DNA
(Nick) und läßt
entweder den zweiten
rotieren, bis die
Spannung nachlässt
oder zieht den intakten
DNA Strang durch den
Nick. Anschließend
wird der geschnittene
Strang wieder ligiert.
Topoisomerase II
schneidet eine DNA
Doppelhelix, führt
einen anderen Teil der
DNA durch die Öffnung
und ligiert die
geschnittene DNA
Doppelhelix um
positive Supercoils
aufzulösen.
Proofreading durch RNA Polymerase
Proofreading dient der Erkennung fehlerhafter Paarung der mRNA Nucleotide mit der DNA.
• Pyrophosphorolytic Editing: Das letzte Nukleotid der wachsenden RNA wird durch
Pyrophosphat ersetzt.
Je länger die Polymerase sich an einer Stelle befindet, desto höher wird die
Wahrscheinlichkeit, dass das letzte Nucleotid ausgetauscht wird. Im Vergleich verweilt die
Polymerase länger an einem fehlerhaft gepaarten Nucleotid als an einem korrekt
gepaarten, die Polymerase unterscheidet dabei aber nicht aktiv zwischen fehlerhafter
oder korrekter Basenpaarung.
• Hydrolytic Editing: RNA Pol bewegt sich einige Nucleotide rückwärts und entfernt das
Stück RNA mit der Fehlpaarung.
RNA Viren besitzen eine eigene RNA Polymerase ohne Proofreading. Sie weisen dadurch eine
hohe Mutationsrate auf, die es den Viren ermöglichen durch Mutation dem Immunsystem zu
entgehen.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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Termination der Transkription
Termination der Transkription: rho-unabhängige Terminatoren bilden stem-loop
Strukturen, gefolgt von einer poly-U Sequenz.
In Prokaryoten finden sich zwei Möglichkeiten der
Termination.
Bei der rho-unabhängigen Termination bildet sich
in der mRNA eine so genannte Hairpin Struktur,
bei der ein Teil der mRNA mit sich selbst
Basenpaarungen ausbildet, die eine Reihe der
stabileren CG-Paare enthält.
Terminationsvorgang:
Direkt im Anschluss an die Hairpin Sequenz wird
eine Poly-U Sequenz synthetisiert, die nur schlecht
an der DNA bindet. Durch die nun folgende Bildung
der stabilen Hairpin Struktur werden die dynamisch
instabileren AU Bindungen zwischen DNA und RNA
aufgelöst und die mRNA von der DNA abgetrennt.
Rho-abhängige Termination der Transkription:
Die Rho-abhängige
Termination benötigt einen
zusätzlichen Faktor.
Es handelt sich dabei um
einen Proteinkomplex, der
eine bestimmte Sequenz der
mRNA binden kann.
Im Anschluss an die Bindung
bewegt es sich an unter ATP
Hydrolyse an der mRNA
entlang.
Am Ende der mRNA wird eine
Sequenz transkribiert, die mit
sich selbst binden kann und
dadurch eine weitere
Transkription durch die RNA
Polymerase stoppt.
Erreicht der Rho-Faktor die
RNA Polymerase und findet
die Terminationssequenz in
der mRNA vor, löst es unter
ATP Hydrolyse die mRNA von
der DNA ab, zieht sie aus der
RNA Polymerase heraus und
setzt sie frei.
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Der Phage λ benützt Proteine mit antiterminierender Wirkung (N, Q) als Schalter
für die frühen und späten Phasen der Genexpression.
Genexpression lässt sich auf allen
Ebenen regulieren.
Für den Lebenszyklus von Phagen ist
es essentiell, unterschiedliche
Produkte zur passenden Zeit
herzustellen. Vollständige Phagen
dürfen sich erst dann bilden können,
wenn alle Teile des Phagen bereits in
ausreichender Menge produziert
wurden.
Der Phage λ kann mittels spezieller
Proteine die Expression seiner Gene
auf Ebene der transkriptiven
Termination durch so genannte
Antitermination steuern.
Zunächst wird nur zu so genannten
"early genes" des Phagen mRNA
erzeugt und anschließend die
Transkription abgebrochen.
Ein "early gene" hat die Fähigkeit,
RNA Polymerase dazu zu bringen
Terminationssignal zu überlesen und
die Transkription fortzuführen, um
die nachfolgend liegenden "late
genes" zu transkribieren.
Erst wenn dieses Protein in
ausreichender Konzentration
vorliegt, sind ausreichend viele RNA
Polymerasen in der Lage, auch die "late genes" zu transkribieren.
Der Promotor
•
•
definiert den Transkriptionsstart eines Gens.
enthält DNA Sequenzen (Elemente), welche die Rekrutierung und Bindung der RNA
Polymerase an den Transkriptionsstart bewirken. Diese bilden meist Bindungsstellen für
Transkriptionsfaktoren.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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Wie findet RNA Polymerase einen Promoter?
Unterschiedliche Modelle:
Würde RNA Polymerase vollständig frei vorliegen und
durch freie Diffusion zu den Genen finden, bräuchte man
eine zu hohe Konzentration an Polymerasen um
ausreichende Transkription sicher zu stellen.
- 500-1000 RNA Polymerasen liegen als Core enzyme lose
mit DNA assoziiert vor.
- 500-1000 RNA Polymerasen liegen als Holoenzym mit
der DNA assoziiert vor, das durch den σ-Faktor in der
Lage ist, nach Promotoren zu suchen.
- Weitere 500-1000 Polymerasen liegen bereits als geschlossene oder offene Komplexe an
einem Promotor.
- Abschließend finden sich etwa 2500 Core enzyme die Gene transkribieren.
- Im Vergleich damit liegt nur eine kleine Anzahl an Polymerasen nicht mit DNA assoziiert
vor.
Die Bewegung der RNA Polymerase auf der DNA kann durch zwei Modelle beschrieben
werden.
1) Die Polymerase diffundiert nach ihrer Synthese nur so lange, bis sie einmal an DNA bindet
und wandert solange an ihr entlang, bis sie einen Promotor findet.
2) Die Polymerase diffundiert nach ihrer Synthese nur so lange, bis sie einmal an DNA
bindet. Anschließend bleibt sie lose mit der DNA assoziiert und bewegt sich durch binden und
lösen von einem DNA Stück zum nächsten bis es einen Promotor findet. Dieses Modell wurde
durch experimentelle Daten bestätigt.
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Die Assoziation mit σ-Faktor steuert die Fähigkeit von RNA Polymerase, Promoter
DNA von anderer DNA zu unterscheiden.
Der σ-Faktor erhöht die Affinität einer RNA
Polymerase zu spezifischen Promotorsequenzen.
Das Core enzym ist in der Lage mit niedriger
Affinität d.h. langsam an DNA zu binden.
Bindet ein σ-Faktor an das Core enzyme, so wird
die Affinität dieses Komplexes für Promotoren
erhöht und für zufällige DNA Sequenzen erniedrigt.
Der σ-Faktor ist für die Transkription nicht nötig
und wird im Zuge der Initiation vom Core enzyme
freigesetzt.
Der σ-Faktor selbst bewegt sich in freiem Zustand
wie RNA Polymerase an DNA entlang, bis es auf ein
Core enzym trifft, das nicht transkribiert.
Der σ-Faktor erkennt den Promotor eines Gens
über bestimmte Sequenzen auf der DNA. Diese
Sequenzen werden als Consensussequenzen
bezeichnet und finden in Bezug auf die
Initiationsstelle bei -10 und -35.
Die Anatomie bakterieller Promotoren: Konsensus Sequenzen und Mutationen
definieren die Bedeutung der -10 (TAATA) und -35 Bereiche:
Durch das TATAAT Motiv bei -10 wird
die Consensussequenz auch als
TATA-Box bezeichnet.
Bei Mutation in diesen Sequenzen
findet sich eine veränderte
Bindungsaffinität der RNA
Polymerase zu den Promotoren.
Down Mutation … Verschlechterung
der Bindung an den Promotor.
Up Mutation … Verbesserung der
Bindung an den Promotor.
Positionierung des RNA Polymerase Holoenzyms bei der Initiation der
Transkription:
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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Strukturelle Domänen des σ70 Faktors von E.coli
Es finden sich mehrere σ-Faktoren, die sich unter
anderem durch ihr Molekulargewicht
unterscheiden. σ70 weist beispielsweise ein
Gewicht von 70kDa auf.
Die einzelnen σ-Faktoren ermöglichen es der RNAPolymerase, an Promotoren mit sich
unterscheidenden Consensussequenzen zu binden.
Je nachdem welche σ-Faktoren vorliegen, können
so situationsabhängig unterschiedliche Gene
transkribiert werden.
σ70 ist der Faktor, der für die Sicherstellung des
normalen Stoffwechsels zuständig ist.
14.03.2006
DNAse I footprinting:
Ein Verfahren zur Bestimmung von
Proteinbindungsstellen auf der DNA:
Um zu prüfen, ob ein Protein eine bestimmte DNA
Sequenz bindet, wird DNase I Footprintig
eingesetzt.
DNase I ist ein Enzym, das DNA
sequenzunabhängig schneidet. DNA die eine
vermutete Proteinbindungsstelle enthält wird
vermehrt, mittels eines Enzyms wird am 5' Ende
ein radioaktiv markiertes Phosphat angehängt.
Anschließend wird die vermehrte DNA mit DNase I
in einem berechneten Verhältnis gemischt, so dass
jedes DNA Stück genau einmal an einer zufälligen
Stelle von DNase I geschnitten wird.
Dadurch erhält man unterschiedlich lange Stücke
DNA, die sich über ein Gel der Größe nach
auftrennen und durch die radioaktive Markierung
sichtbar machen lassen. Die DNA Fragmente lassen
sich sehr genau auftrennen, jede Bande ist um
genau ein nt kürzer als die vorherige.
Fügt man das vermutete Bindeprotein hinzu, deckt
das Protein seine Bindesequenz auf der DNA ab,
DNase kann an dieser Stelle nicht schneiden.
Die Gelelektrophorese zeigt im Bereich der
Bindesequenz keine Banden und erlaubt so eine
Ermittlung derselben.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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Kontaktpunkte der RNA Polymerase mit Promoter-DNA werden durch footprinting
Verfahren und durch Punktmutationen bestimmt:
graue Pfeile … werden diese Stellen verändert, kann RNA-Pol nicht mehr binden.
rote Pfeile … Punktmutation hier ändert Bindungsverhalten von Pol an Promotor.
Mittels footprinting wurde festgestellt, dass die Polymerase über den σ-Faktor nur an den -35
und -10 Sequenzen des Promotors wirklich fest gebunden ist.
Spezifische σ-Faktoren steuern die koordinierte Expression definierter Gengruppen:
Wie bereits erwähnt binden unterschiedliche σ-Faktoren jeweils verschiedene
Promotorconsensussequenzen, um Gengruppen ereignisgesteuert transkribieren zu können.
Unter stationärer Phase versteht man einen Zustand in dem dem Bakterium keine
Nahrungsquellen zur Verfügung stehen und der Stoffwechsel bis auf für das Überleben
essentielle Gene stillgelegt wird.
Phagenkodierte σ-Faktoren steuern das Umschalten von früher auf späte
Genexpression beim B. subtilis Phagen SPO1:
Für die Transkription der "early genes" dient der σ70-faktor des Wirtsbakteriums. Ein Produkt
der "early genes" ist ein phageneigener σ-Faktor. Erst wenn dieser σ-Faktor in ausreichender
Konzentration vorliegt, können die "middle genes" transkribiert werden, die einen weitern σFaktor für die "late genes" erzeugen.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Starke Promotoren haben ein zusätzliches UP-Element, welches mit der α-UE der
RNA Pol interagiert
Man unterscheidet
Promotoren je
nachdem, wie effektiv
sie die Transkription
"ihres" Gens
ermöglichen.
Starke Promotoren weisen zusätzlich zur -35 und -10 Sequenz eine weitere Sequenz auf (UP
Element), die mit der C-terminalen Domäne (CTD) der α UE der RNA Polymerase interagiert
und dadurch die Bindungswahrscheinlichkeit der Polymerase an den Promotor erhöht.
Transkriptionskontrolle in Bakterien: das Operon
•
•
•
Ist eine für Prokaryoten typische Anordnung von Genen.
Bezeichnet eine Gruppe von Genen, die in direkter Abfolge auf der DNA angeordnet sind.
Die im Operon kodierten Gene werden gemeinsam reguliert und in Form einer
gemeinsamen, polycistronischen mRNA transkribiert.
Operon … physische Abfolge von einander ergänzenden Genen, wodurch eine gemeinsame
Regulation ermöglicht wird.
Prinzipien der Transkriptionskontrolle: positive und negative Regulation
Negative Genregulation …
Durch einen starken Promotor
werden Gene im
Normalzustand transkribiert.
Erst die Bindung eines
Repressorproteins an den
Promotor verhindert eine
weitere Transkription, solange
das Protein gebunden bleibt.
Positive Genregulation …
Durch einen schwachen
Promotor werden Gene im
Normalzustand nicht von RNA
Polymerase erkannt. Die
Transkription wird erst durch
das Binden eines
Aktivatorproteins an den
Promotor ermöglicht.
"gene off by default"
"gene turned-on by activator"
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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Die Lac, Gal und Ara Operonen kodieren für Enzyme, welche Lac, Gal und Ara in die
Glykolyse einschleusen
Operons zur
Erschließung weiterer
Zuckerquellen.
Das Gal-Operon
ermöglicht die
einzelnen Schritte zur
Erschließung von
Glukose aus Galaktose.
Das Lac-Operon
benötigt den GalOperator.
Das Ara-Operon
ermöglicht es Pyruvat
aus dem 5er Zuckern
Arabinose herzustellen.
Regulation der Lac mRNA Synthese durch Zugabe oder Entzug des Inducers
Lactose:
E.coli bevorzugt Glucose als Zuckerquelle, da sie
ohne Energieaufwand der Glykolyse zugeführt
werden kann. Steht keine Glucose zu Verfügung,
können andere Zuckerquellen wie Lactose,
Galactose oder Arabinose erschlossen werden,
deren Operons aber nur aktiviert werden, wenn
Glucose nicht, aber die entsprechenden Zucker
vorhanden sind.
Lactose ist ein Heterodimer aus Galaktose und
Glucose, ß-Galactosidase spaltet Lactose in die
beiden Zuckereinheiten. Mittels weiterer Enzyme
des Gal-Operons kann Galaktose in Glucose
umgewandelt werden.
Betrachtet man das Lac Operon, so wird ohne
Lactosequelle nur eine sehr geringe Konzentration
an Lac mRNA transkribiert (basaler Wert). Als
Aktivator der Transkription dient Lactose selbst.
Wird dementsprechend eine Lactosequelle
erschlossen, steigt die Konzentration der Lac
mRNA und der dadurch translatierten
Galaktosidase innerhalb von Minuten stark an,
steht Lactose nicht mehr zur Verfügung, sinkt die
Lac mRNA Konzentration schnell wieder auf das
basale Level ab, während die Galaktosidase über
einen längeren Zeitraum stabil bleibt.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Die Struktur des Lac Operons
Das Lac Operon besteht aus mehreren Promotorsequenzen sowie den drei Genen lacZ, lacY
und lacA die für die Genprodukte ß-Galaktosidase, Permease und Transacetylase codieren.
ß-Galaktosidase … dient der Spaltung von Lactose in Galaktose und Glucose
Permease … dient der Aufnahme von Lactose in die Zelle
Transacetylase … modifiziert Lactose, um deren Diffusion aus der Zelle zu verhindern.
Der Promotor des Lac Operons weist eine Sequenz auf, die als Operator bezeichnet wird.
Operatoren sind Promotorsequenzen in Prokaryoten die vor allem der Bindung von
Repressorproteinen dienen.
Die Sequenz des Lac Operators liest sich von beiden Seiten her gleich (rotationssymmetrisch
palindromisch) und bindet über die beiden identischen, seitenverkehrten Sequenzen ein
homotetrameres Protein d.h. ein Protein das aus vier identischen, aneinander gebundenen
UE besteht.
Lactose wirkt als Inducer, welcher das Repressor-Tetramer in eine nicht an die
Operator-DNA bindende Konformation überführt (allosterischer Effekt)
Dieses Protein dient an den
Operator gebunden als
Repressor der Transkription.
Es können zwar sowohl RNA
Polymerase als auch
Repressor gleichzeitig an ihre
jeweiligen
Promotorsequenzen binden,
aber die RNA Polymerase ist
dann nicht in der Lage, die
DNA aufzutrennen.
Die Untereinheiten des
Repressortetramers werden
durch das Gen lacI erzeugt, das
sich nicht im Lac Operon
befindet. Die einzelnen UE lagern
sich zum Tetramer zusammen
und können anschließend den
Operator des Lac Operons
binden.
Lactose ist in der Lage, an die
einzelnen UE des Repressors
zu binden. Durch die Bindung
der Lactose ändert sich die
Konformation des
Repressorkomplexes
(allosterischer Effekt), er ist
nicht mehr in der Lage an
DNA zu binden.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Der Lac Repressor
•
•
•
•
Die wesentliche Bindungsstelle für lac Repressor, Operator 1 (O1), überlappt mit der
Bindungsstelle für RNA-Polymerase.
Die Abbildungen zeigen die Position der Repressorbindungsstelle O1. Es gibt zwei weitere
Bindungsstellen, O2 (+410) und O3 (-83). O1, O2 und O3 binden jeweils ein RepressorTetramer.
Maximale Repression entsteht dann, wenn ein Repressor Tetramer gleichzeitig an O1 und
entweder O2 oder O3 bindet.
Der lac-Repressor verhindert nicht die Bindung von RNA-Polymerase, er verstärkt sie
sogar.
Der lac Repressor verhindert die Trennung der Promoter DNA-Stränge, damit die
Initiation der Transkription.
Änderung der lac-Repressorstruktur durch Lactose:
Das Repressorprotein bindet die Furchen der DNA über
eine α-helicale Bindungsdomäne mit Helix-Loop-Helix
Struktur.
Bei Bindung von Lactose verändert sich die Konformation
des Repressorkomplexes, die Helices können räumlich
nicht mehr in den Furchen der DNA binden.
Positive Kontrolle der Ara, Gal und Lac Operonen durch das catabolite activator
protein (CAP oder CRP)
Der Promotor der Ara, Gal und Lac Operons weist
Bindungssequenzen für die Bindung eines
Aktivatorproteins, des CAP (catabolite activator
protein), auf.
Das CAP dient der positiven Kontrolle des Lac
Operons und steigert dessen Transkription, wenn
Lactose vorhanden und der Repressor bereits
durch Lactose inhibiert ist.
CAP liegt immer vor, wird aber nur dann aktiv und
bindet an die CAP binding sites, wenn die Zelle
hungert und weitere Zuckerquellen als Nahrung
erschließen muss. Als Aktivator für CAP dient das
Molekül cAMP.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Das Catabolite Activator Protein vermittelt Genregulation durch das 'Hungersignal'
cAMP.
Es ist vermutlich mit
verantwortlich für das
Phänomen der 'glucose
repression' von Operonen.
Es gibt ein Sensorsystem für
den aktuellen Nahrungszustand der Zelle. cycloAMP
ist indirekt proportional zur
ATP Konzentration und dient
so als Indikator für Hunger.
CAP selbst wird nur dann aktiv, wenn es cAMP gebunden hat.
Regulation des Lac Operons durch Glucose und Lactose:
Drei Regulationszustände
des Lac Operons:
Liegen Glucose und Lactose vor, wird
das Lac Operon nicht benötigt, kann
aber transkribiert werden.
Liegt nur Glucose vor, kann das Lac
Operon wegen des Repressors nicht
transkribiert werden.
Liegt nur Glucose vor, kann das Lac
Operon aktiviert werden, die
Transkription wird durch cAMP weiter
begünstigt.
Das CAP Protein führt eine Biegung in die Promoter-DNA ein und erleichtert die
Interaktion mit der α-UE der RNA Pol:
(1) Bindet in Gruben der DNA und bewirkt deren Krümmung. Die Krümmung dient dazu,
dass (2) die C-terminale Domäne der α UE der Polymerase in räumliche Nähe des CAP
kommt und mit ihm binden kann, wodurch die Gesamtbindung des RNA
Polymerasekomplexes an die DNA stabiler und die Transkriptionswahrscheinlichkeit erhöht
wird.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Expression des Lac Operons:
Glucose
+
+
-
Lactose
+
+
Transkription
+/+
++++
Importante:
Es findet keine volle Expression statt, wenn
Glucose vorhanden ist.
Das CAP Protein stabilisiert die DNA-Schlaufe, die sich durch Bindung des Lac
Repressors an die beiden Operatoren O1 und O3 bildet.
Deshalb ist die Repression durch Lac Repressor in
Abwesenheit von Glucose besonders effizient.
Der Lac Repressor hat drei verschiedene
Operatoren, die sich in ihrer Bindungsstärke
unterscheiden.
Ist weder Lactose noch Glucose vorhanden,
ermöglicht die Bindung des CAP eine effizientere
Bindung des Repressors an zwei Operatoren.
Durch die DNA-Schlaufe des CAP nähern sich die
Repressorprotein an und binden noch effizienter an
die Furchen der DNA.
Unterschiedliche Wege der positiven und negativen Transkriptionskontrolle durch
Inducer- und Korepressor-Moleküle
Inducer … Inaktiviert einen
Repressor oder aktiviert einen
Aktivator.
Corepressor … Inaktiviert
einen Aktivator oder aktiviert
einen Repressor.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Regulation des Trp Operons durch den Ko-Repressor Tryptophan
Enzymsynthese des Tryptophanoperons
Ist ausreichend Tryptophan vorhanden,
dann bindet es an den Repressor,
wodurch dieser aktiv wird und weitere
Transkription des Trp Operons verhindert.
Trp dient damit als Korepressor der
eigenen Synthese.
Es handelt sich hier um negative Kontrolle.
Regulation des Arabinose Operons durch das AraC Protein Repressive loop
Das Ara Operon weist
zwei voneinander
entfernte Aktivatoren
auf.
- ist Arabinose
vorhanden, wirkt es
selbst als Inducer des
dimeren araC Proteins,
das die Bindung der
RNA Polymerase
unterstützt.
- ist Arabinose nicht
vorhanden, für das
dimere AraC Protein
durch Bindung an entfernten Sequenzen der DNA eine Schleifen ein, die eine Bindung von
RNA Polymerase verhindert.
Das phoR-phoB zwei-Komponentensystem reguliert Gene im Falle einer
Erniedrigung der Konzentration an anorganischem Phosphat
Der transmembrane Rezeptor phoR dient
der Bindung von anorganischem Phosphat
im periplasmatischen Raum.
Bei Phosphatbindung ist phoR inaktiv, ist
kein Phosphat gebunden, ändert sich die
Konformation von phoR wodurch es in der
Lage ist mit dem cytoplasmatischen Teil
Phosphate von ATP abzuspalten.
Das freie Phosphat im Cytosol aktiviert
phoB, das jetzt als Aktivator weiterer Gene
dienen kann.
Man spricht in diesem Fall von einem ZweiKomponentensystem.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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Regulation der Glutamin-Synthase Gens durch Erniedrigung der Konzentration
organisch gebundenen Stickstoffs
•
•
•
•
Die Proteine NtrB und NtrC bilden ein zwei-Komponenten
System zur Regulation von Genen, die zur StickstoffFixierung notwendig sind.
Im Falle des glnA Gens ist die mit σ54 assoziierte
Polymerase bereits an den Promoter gebunden, kann
jedoch den Promoter nicht in eine offene Konformation
überführen.
Phosphorylierung von NtrC durch NtrB bewirkt Bindung an
DNA, Interaktion mit RNA Polymerase und Aktivierung
des glnA Promoters.
Ähnlich wie bei enhancers eukaryotischer Gene liegt die
NtrC Bindungsstelle weit entfernt vom Transkriptionsstart.
Bei der Interaktion mit RNA Polymerase bildet die
zwischen liegende DNA eine Schlaufe.
2. Bild ... NtrB und σ54 interagieren
und bilden DNA Loop. NtrB Protein löst
sich nach Transkriptionsbeginn.
In Anwesenheit von Quecksilber sorgt das MerR Protein für eine zur RNA Pol
Bindung notwendige topologische Positionierung der –35 und –10 Elemente
Mer ... Mercury (Quecksilber)
Erst durch die Drehung der DNA durch das
MerR Protein liegen die -35 und -10
Konsensussequenzen in einer Ausrichtung,
die von einer RNA Polymerase gebunden
werden kann.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Transkriptionskontrolle in Prokaryoten und Eukaryoten
Prokaryoten:
Eukaryoten:
•
•
•
•
•
•
•
•
1 RNA Polymerase
Polycistronische mRNA
Transkription/Translation gekoppelt
relativ einfach strukturierte Promotoren
Bindung und korrekte Positionierung
durch das RNA Polymerase Holoenzym
3 RNA Polymerasen
Monocistronische mRNAs
Translation erst nach mRNA Transport
und Prozessierung
• Komplexe Promoterstruktur,
Bindungsstellen für multiple
regulatorische Proteine
• Ein komplexer Initiationskomplex ist
notwendig um RNA Polymerase zu
rekrutieren und korrekt zu
positionieren.
In Prokaryoten ist die Promotorstruktur relativ einfach: -35 und -10 Consensussequenz, dazu
Sequenzen für positive oder negative Regulation (Operatoren und Inducer).
Eukaryotische Promotorstrukturen sind demgegenüber komplexer.
Man unterscheidet bei Eukaryoten zwischen gering regulierten "house keeping genes"
(laufend benötigte Gene für Proteine des Cytoskeletts, der Membran, der Organellen, etc.)
und Genen die situationsabhängig (Embryonalentwicklung, organspezifische Gene, Reaktion
auf Infektionen, etc.) transkribiert werden. Promotorstrukturen und Regulation dieser
Gruppen unterscheiden sich grundlegend.
Eukaryotische RNA Polymerasen
In Eukaryoten finden sich drei unterschiedliche RNA Polymerasen, die vom Aufbau her
ähnlich sind, sich aber in einigen Untereinheiten voneinander unterscheiden und dadurch
unterschiedliche Tätigkeiten durchführen können.
Im Vergleich mit Prokaryoten finden sich Homologe zu ß, ß' und α UE.
Nur die eukaryotische RNA Polymerase II weist eine ausgeprägte CTD auf.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Unterscheidungskriterien der 3 eukaryoten RNA Polymerasen
Zelluläre Lokalisation
Pol I
Nucleolus
Pol II
Nucleoplasma
Pol III
Nucleoplasma
Produkte
rRNA
Pre-mRNA, snRNAs
tRNA, 5SrRNA snRNAs
α-Amanitin-Sensitivität (IC50, μg/ml)
>1000
0.01-0.05
10-25
Mn2+/Mg2+ Verhältnis der relativen
Aktivität
1-2
5-10
2
RNA Polymerase I findet sich im Nukleolus, in dem vor allem die DNA ribosomaler Gene
vorliegt und dient, wie erstaunlich, der Transkription von rRNA.
RNA Polymerase II: findet sich im Nucleoplasma und transkribiert Gene, einerseits die für
Proteine transkribieren und andererseits snRNAs die für das Splicen essentiell sind.
Amanitin ist ein Bestandteil des Gifts des Knollenblätterpilzes und zielt auf RNA Polymerasen
ab. Pol I ist fast unempfindlich, für Pol II und Pol III ist eine geringe Konzentration
ausreichend um die Aktivität zu beeinträchtigen.
Über Amantinkonzentration kann so ermittelt werden, welche Polymerase welche Produkte
transkribiert.
Eine Unterscheidung der Polymerasen ist auch über Mn2+/Mg2+ Konzentration möglich.
Die Architektur der RNA Pol II aus Hefe
Cramer et al. (2000) Science 288: 640
Eukaryotische RNA Polymerase ist
komplizierter als prokaryotische RNA
Polymerase, aber schematisch ähnlich.
Es finden sich Kanäle für DNA und mRNA
und ein aktives Zentrum.
Strukturelle Ähnlichkeit zwischen der bakteriellen RNA Polymerase und RNA Pol II
aus Hefe
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Komplexität der Promotoren aus Eubakterien, Hefe und Säugerorganismen
-
-
Promotoren in Prokaryoten befinden sich
möglichst nah am Gen.
Hefepromotoren weisen bereits mehr
regulatorische Bindungsstellen auf und
sind weiter vom Transkriptionsstart
entfernt.
Promotoren höherer Eukaryoten weisen
extrem viele Regulatoren vor und nach
dem Transkriptionsstart auf,
regulatorische Sequenzen finden sich
auch in Introns.
Grundstruktur der Promotoren prokaryoter und eukaryoter Gene
Eukaryoten weisen keinen
einheitlichen σ-Faktor auf, es
wird stattdessen eine Vielzahl
anderer Proteine erzeugt, die
diese Aufgabe übernehmen.
Die Promotorstrukturen der
einzelnen eukaryotischen
Polymerasen lassen sich
unterscheiden.
Pol I Gene weisen einen so
genannten Core Promotor mit
einer einzigen URS (upstream
regulatory sequence) auf.
Es gibt zwei unterschiedliche
Pol II Promotoren:
- Promotoren für Gene die für
Proteine codieren weisen eine
der prokaryotischen -10
TATA-Box ähnliche Sequenz
bei -20 auf und haben
zusätzlich URS.
- Promotoren für Gene die für
snRNA codieren weisen URS
aber keine TATA-Box auf.
Pol III Gene werden in drei Gruppen geteilt.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
21.03.2006 gefehlt
Systematische Analyse der Transkriptionskontrolle eines durch
RNA Pol II transkribierten, eukaryoten Gens
1. Welche Gene werden durch Stimuli aus der zellulären Umgebung reguliert?
DNA-microarray, Northern blot, RT-PCR
2. Liegt Transkriptionskontrolle vor?
Nuclear run on assay
3. Isolieren des Promoters
Genomische Klonierung, Transiente Transfektion, Reportergen assay
4. Wo binden wichtige Transkriptionsfaktoren?
Mutations/Deletionskartierung des Promoters, Footprinting, electrophoretic mobility shift
assay (EMSA)
5. Welche Transkriptionsfaktoren sind an der Regulation beteiligt?
DNA Affinitätschromatographie, Proteinsequenzierung, cDNA Klonierung
6. Struktur-Funktionsbeziehung im isolierten Transkriptionsfaktor (wo sind funktionelle
Domänen?).
Deletions- und Punktmutagenese der cDNA, Ko-Transfektionsassays
7. Interaktion des Transkriptionsfaktors mit anderen Proteinen
Hefe 2-Hybrid-System, Biochemische Verfahren und Massenspektroskopie
1. Welche Gene werden durch Stimuli aus der zellulären Umgebung
reguliert?
Prinzipiell wird mRNA aus ruhenden, unbehandelten Zellen mit mRNA aus Zellen verglichen,
die Stimuli z.B. Wachstumshormone, immunologische Signale etc. ausgesetzt wurden.
Durch diesen Vergleich kann überprüft werden, ob die Expression eines bestimmten Gens
durch Umweltfaktoren beeinflusst wird.
mRNA Bestimmung durch Northern Blot
1. Zelluläre RNA auf Agarosegel auftrennen
2. Transfer der RNA auf nitrozellulose Membran
Die Übertragung erfolgt rein durch Saugkräfte.
3. Hybridisieren der Membran mit radioaktiv markierter,
genspezifischer Sonde.
Genspezifische Sonde ist eine zur mRNA komplementären
radioaktive DNA.
4. Ermitteln des Hybridisierungssignals durch Autoradiographie
Konnte die Sonde mit mRNA hybridisieren, schwärzt die
radioaktive Sonde einen Röntgenfilm und gibt Position und
Menge der gesuchten mRNA an.
So kann getestet werden, ob ein gesuchtes Gen durch Umweltfaktoren aktiviert, deaktiviert
oder die Konzentration des Transkripts verändert wird.
DNA Sonden können mit γ-32P-ATP und dem Enzym Polynukleotid Kinase
radioaktiv markiert werden
Für Nothern Blot essentiell ist die radioaktive Markierung der DNA Sonden. Das Enzym
Polynucleotide kinase fügt das γ-Phosphat eines ATPs an das 5' Ende von DNA
Einzelsträngen. Man verwendet dabei ATP, das radioaktives 32P enthält.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Reverse Transkription (RT)-PCR
RNA-Isolierung
Isolierung zwecks Vergleichs wieder aus behandelten und unbehandelten Zellen.
È
Reverse Transkription
d.h. Synthese einer zur RNA komplementären cDNA mittels reverser Transkriptase.
È
cDNA Amplifikation durch PCR mit genspezifischen Primerpaaren
È
Analyse des Amplifikationsprodukts durch Agarose-Gelelektrophorese
In Bezug auf Quantität einer RNA ist die Analyse mittels RT-PCR eher beschränkt, da sich
geringe Mengenunterschiede zwischen behandelter und unbehandelter Zelle nur schwer
feststellen lassen, wenn man die PCR zu viele Zyklen durchlaufen lässt. Ist andererseits die
Konzentration von mRNA prinzipiell niedrig, wird man bei zu wenigen PCR Zyklen kein
sinnvoll verwertbares Signal erhalten.
Quantitative, real-time RT-PCR
Real time RT PCR wird verwendet, um PCR auch für quantitative Analysen einsetzen zu
können.
• In die amplifizierte doppelsträngige DNA lagert sich ein Farbstoff ein.
Der Farbstoff wird der PCR in ausreichender Konzentration hinzugefügt.
• Die durch die Einlagerung in die DNA entstehende Fluoreszenz wird während der PCR in
Echtzeit gemessen.
Die Fluoreszenz des Farbstoffes entwickelt sich erst, wenn er sich in die dsDNA
eingelagert hat.
• Damit kann die lineare, quantitative Phase der PCR bestimmt und ausgewertet werden.
Die Intensität der Fluoreszenz wird gemessen, sie nimmt mit jedem PCR Zyklus zu, sie ist
direkt proportional zur erzeugten DNA Menge.
Da die Fluoreszenzintensität während laufender PCR gemessen wird, können die
Messwerte behandelter und nichtbehandelter Zellen direkt miteinander verglichen werden
und auch geringe quantitative Unterschiede ermittelt werden, während man bei normaler
RT-PCR nur das Endprodukt vergleichen kann.
Gene Microarrays
(=DNA Chips): Die Methode der Wahl zur Genomweiten Analyse von
Genexpression.
Beispiel: während Wachstums in Glucose bzw. in Ethanol exprimierte
Gene in Saccharomyces erscheinen grün bzw. rot.
Größe: 18x18mm, enthält alle 6400 Gene aus Saccharomyces an
definierten Positionen.
Für diese Methode muss das Genom des zu untersuchenden
Organismus bekannt sein. Es wird zu jedem Gen im Genom in
ausreichender Menge komplementäre DNA erzeugt. Diese komplementäre DNA jedes Gens
wird auf einer jeweils genau definierten Position eines Glaschips aufgebracht, sodass jede
Stelle dieses Chips einem Gen des Organismus entspricht.
Anschließend wird die mRNA einer mit einem Umweltfaktor behandelten Zellkultur isoliert
und in fluoreszierend markierte cDNA umgeschrieben. Diese cDNA wird auf den Chip
aufgebracht, die cDNA wird nur an den Stellen des Chips binden, die dem korrelierende Gen
entsprechen. Auf diese Weise kann einfach ermittelt werden, welche Gene aktiv sind und
welche nicht, durch die Intensität der Fluoreszenz ergibt sich die Quantität der Transkripte.
Stellt man Testreihen mit unterschiedlichen Umweltfaktoren an und markiert sie mit
Fluoreszenzmarkern unterschiedlicher Farbe, kann man auf demselben Chip vergleichen,
welche Gene wo wann aktiv sind – im oben genannten Bsp. Grün für Glucose und rot für
Ethanol. Mischfarben entsprechen dann einer einheitlichen Expression bei unterschiedlichen
Umweltfaktoren, im Bsp. Wäre das Gelb.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Fig. 1. 2-5A induces gene expression changes in DU145 prostate carcinoma cells in
a dose-and time-dependent manner
Copyright ©2005 by the National
Academy of Sciences
Malathi, Krishnamurthy et al. (2005)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102,
14533-14538
Im Menschen kann die Chiptechnik
dazu verwendet werden, mittels der
zelltypspezifischen Transkription von
mRNA zu Testen, ob es sich bei
einem untersuchten Gewebe um eine
bekannte Tumorart handelt.
Gen 'Cluster'-Analysen ermöglichen das Auffinden
zelltypspezifischer Gengruppen (hier gezeigt anhand von
Tumoren unterschiedlichen Ursprungs).
In den Zeilen befinden sich RNAs aus unterschiedlichen
Tumorarten.
Ein Patient kommt daher und hat einen Tumor z.B. in
einem Knochen. Dieser Tumor ist zumeist nicht der
Primärtumor! Prostatakrebs bildet z.B. oft Metastasen in
Knochen.
Die Zellen des Knochentumors unterscheiden sich aber
nicht von denen des Primärtumors … über Array kann
durch die auf die Tumorart spezifischen Marker
festgestellt werden, um welche Tumorart es sich handelt
und wo der Primärtumor sitzt, der im Moment noch gar
keine Beschwerden verursacht.
Ist der Primärtumor identifiziert, kann man die aus Erfahrungswerten am besten passende
Behandlung bzw. Medikation verschreiben.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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2. Liegt Transkriptionskontrolle vor?
Mit den bisher behandelten Methoden kann nur die "steady state" Menge an mRNA gemessen
werden d.h. die Menge mRNA die durch das Zusammenspiel an Transkription und mRNA
Abbau vorliegt. Man erhält dabei keine Informationen darüber, ob die mRNA eines Gen auf
der Ebene der Transkription oder des Abbaus reguliert wird.
Der 'nuclear run on assay'
Mittels Nuclear run on assay
kann geprüft werden, ob ein
Gen auf Transkriptionsebene
reguliert wird.
Dafür werden Zellkerne
isoliert und auf Eis gelegt,
wodurch die Transkription
durch die RNA Polymerasen
vollständig gestoppt wird
ohne sich von der DNA zu
lösen. Durch die Isolation der
Zellkerne wird weiters der
Abbau durch RNase im
Cytosol verhindert.
Die Kerne werden
anschließend auf 37°C
erwärmt und fügt ein Gemisch radioaktiv markierter Nucleotide hinzu, die in die mRNA
eingebaut werden, wenn die RNA Polymerasen ihre Tätigkeit wieder aufnehmen.
Diese mRNA wird isoliert und auf Makroarrays aufgebracht. Diese Makroarrays sind auf
dieselbe Art hergestellt wie Microarrays, mit dem Unterschied, dass sie nur wenige Gene
binden können.
Auf dem Makroarray wird ein Röntgenfilm aufgebracht, der je nach Konzentration der
radioaktiven mRNA schwach bis stark geschwärzt wird. Die Stärke der Schwärzung des
Röntgenpapiers ist dementsprechend proportional der Konzentration der mRNA die wiederum
proportional der Transkriptionsrate des zu untersuchenden Gens ist. Werden wieder
behandelte und unbehandelte Zellen verglichen kann man ermitteln, welche Umweltfaktoren
tatsächlich die Transkription und nicht den Abbau beeinflussen.
3. Isolieren des Promoters
Genomische Klonierung, Transiente Transfektion, Reportergen assay
Für die Isolation eines Promotors wird eine genomische Bibliothek benötigt.
Partieller Restriktionsverdau liefert überlappende Fragmente genomischer DNA
Zu diesem Zweck muss die genomische DNA zunächst partiell verdaut werden d.h. die
Konzentration der Restriktionsnucleasen wird so gewählt, dass man 20kbp lange Stück DNA
erhält.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Genomische DNA kann in λ-Phagen DNA kloniert und in λ-Virionen verpackt werden
Die partiell verdaute DNA wird in vitro mit den Armstücken des Phagen λ ligiert. Diese
Konstrukte lassen sich in vitro mit gereinigten Phagenproteinen verpacken, sodass man
infektiöse Phagenpartikel mit der gesamten genomischen DNA erhält und sich in Bakterien
vermehren können (so richtig?).
Die Phagen werden auf einen Bakterienrasen aufgebracht wo sie die DNA in Bakterien
einbringen. Infizierte Bakterien werden durch neu produzierte Phagen lysiert, an den Stellen
bilden sich Plaques im Zellrasen.
Auf den Zellrasen wird ein Nitrozellulosefilter aufgebracht, der Lysat und Phagen aufnimmt.
Mittels alkalischer Lösung werden die Phagen lysiert und die DNA in Einzelstränge
aufgetrennt.
Der Filter wird mit einer der mRNA entsprechenden radioaktiven Sonde versetzt, sie wird nur
bei dem Phagenplaque binden, die das entsprechende Gen enthält. Dabei ist zu sagen, dass
die 50nt für eine starke Bindung zwischen cDNA und genomischer DNA ausreichen. In
eukaryotischer DNA kann die Sonde stabil an die Exons der genomischen DNA binden.
Man erhält so ein 20kbp langes Stück DNA, das mit hoher Wahrscheinlichkeit auch den
Promotor des interessanten Gens enthält.
Dieser Vorgang ist nur dann notwendig, wenn das Genom des Organismus noch nicht als
Datenbank zur Verfügung steht.
Genomische Klonierung bei Genomen mit bekannter DNA Sequenz
•
•
•
DNA kann aus 'Banken' bezogen werden.
DNA wird meist als bacterial artificial chromosome (BAC) vermehrt. Diese enthalten die
Replikationssignale aus F Plasmiden und können inserts von bis zu 300kb vermehren.
BACs sind oft zu gross für klassische Kloniertechniken. Zur Rekombination wird daher
meist die Technik des 'Recombineering' verwendet.
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Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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S1 mapping und 'primer extension' sind zwei Verfahren zur Bestimmung des
Transkriptionsstarts
1) Primer extension: das 20kbp Stück wird
durchsequenziert, man kann kurze Primer von
unterschiedlichen Stellen des nichtkodierenden
Strangs synthetisieren. Diese Primer werden mit
mRNA versetzt und durch Reverse Transkriptase
bis an den Beginn der mRNA verlängert. Werden
die unterschiedlich langen Stücke über
Gelelektrophorese aufgetrennt, so entspricht das
kürzeste Stück dem Primer, der dem
Transkriptionsstart am nächsten liegt.
2) S1 nuclease mapping: Es werden längere
Stücke des nichtkodierenden Stranges der DNA
synthetisiert und mit mRNA vermischt.
War das synthetisierte Stück komplementär zur mRNA, wird sie binden können und
überstehende Enden erzeugen. Die überstehenden Einzelstränge können durch S1
Endonuclease geschnitten werden, dabei entspricht das Ende der synthetisierten DNA dem
Transkriptionsstart. Wird der verbleibende Doppelstrang denaturiert und das synthetisierte
Stück über Elektrophorese aufgetrennt, kann festgestellt werden, wie lang das DNA Stück ist
und damit wo in der synthetisierten Sequenz sich der Transkriptionsstart befindet.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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Deletionskartierung der funktionell wichtigen Promoter-DNA durch Exonuclease
Verdau und Religation
Promotor bashing: Die ermittelte Promotor wird mehrfach in Plasmide kloniert, wobei die
Promotorsequenz bei jedem Plasmid von beiden Enden her sukzessive weiter verkürzt wird.
Die Promotorsequenz dient als Promotor für ein Reportergen, das sich ebenfalls auf dem
Plasmid befindet.
Die einzelnen Plasmide werden in die Zellart eingebracht, in der er vermutlich reguliert wird
z.B. Leberzellen.
Je nachdem ob das Reportergen sehr gut, weniger gut oder gar nicht mehr exprimiert wird,
kann man erkennen, ab wann bei den verkürzten Sequenzen regulatorische Sequenzen dabei
waren, die für die Funktion des Promotors von Bedeutung sind.
Reportergen-Assays erlauben die Bestimmung der Promoter-Aktivität.
Gekoppelt mit gezielten Veränderungen der
Promoterstruktur erlauben sie das Auffinden
regulatorischer DNA-Sequenzen eines Promoters.
Unter einem Reportergen versteht man ein
Genprodukt, das sich einfach nachweisen lässt und
in der fraglichen Zelle nicht vorkommt.
Als Beispiel die Chloramphenicolacetyltransferase
(CAT) das normalerweise Bakterien vor dem
Antibiotikum Chloramphenicol schützt.
Das Reportergen wird mit einem eukaryotischen
Promotor in eine eukaryotische Zelle eingebracht
und dort exprimiert. Später wird die Zelle lysiert,
das Lysat mit radioaktiv markiertem
Chloramphenicol versetzt und in weiterer Folge
mittels Dünnschichtchromatographie das
acetylierte vom unveränderten Chloramphenicol
getrennt. Die Menge des acetylierten
Chloramphenicol hängt von der Stärke der
Transkription des eingebrachten Promotors ab.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
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Reportergen-assays
•
•
Reportergene kommen in der zur Promoteranalyse verwendeten Zelle nicht vor (meist
bakterielle oder Invertebratengene).
Häufig verwendete Reportergene:
o Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT)
o Luciferase (aus Glühwürmchen, erzeugt Licht bei der Substratumsetzung)
o Green fluorescent protein (GFP; kann zur Fluoreszenz angeregt werden,
Expressionsanalyse auch in lebenden Zellen möglich)
o β-Galaktosidase (oNPG-Farbreaktion)
X-Gal wird durch ß-Galaktosidase in Galaktose und einen blauen Farbstoff gespalten.
Gentransfer in Säugerzellen
•
•
•
•
•
CaPO4-Kopräzipitation
Es bilden sich Kalziumphosphatkristalle, die DNA mit einschließen. Zellen können die
Kristalle aufnehmen und auflösen, wodurch die DNA in der Zelle freigesetzt wird.
Elektroporation
Zellen werden in einer Küvette unter Spannung gesetzt wodurch die Membran kurzfristig
perforiert wird und DNA aus der Lösung in die Zellen eintreten kann.
Lipofektion
Es werden künstliche Lipidvesikel erzeugt, die DNA enthalten. Diese Vesikel können mit
der Zellmembran verschmelzen und die DNA in die Zelle entlassen.
Infektion (virale Vektoren)
(Mikroinjektion)
Sequenzvergleiche homologer DNA Abschnitte in verschiedenen Spezies kann zum
Auffinden regulatorischer DNA Bereiche führen
33
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
4. Wo binden wichtige Transkriptionsfaktoren?
Mutations/Deletionskartierung des Promoters, Footprinting, electrophoretic mobility shift
assay (EMSA).
DNase I footprinting und der electrophoretic mobility shift assay (EMSA)zeigen
spezifische Bindung eines Transkriptionsfaktors an Promoter DNA.
Über DNase I Footprintig kann überprüft werden, ob die RNA Polymerase oder ein
Transkriptionsfaktor tatsächlich im Bereich der fraglichen Sequenz bindet.
Mit EMSA (elektrophoretic mobility shift assay) kann diese Frage einfacher geklärt werden.
Man erzeugt radioaktiv markierte dsDNA des Bereichs, von dem vermutet wird, dass
Polymerase oder Transkriptionsfaktor daran binden. Anschließend werden die markierten
DNA Stücke mit Kernextrakt versetzt und auf einem Gel getrennt.
Handelt es sich tatsächlich um eine Bindungssequenz, werden die entsprechenden
Transkriptionsfaktoren aus dem Kern an die DNA binden und auf einem Röntgenfilm zwei
Bande hinterlassen – eine für freie DNA und eine für gebundene.
Handelt es sich nicht um eine Bindungssequenz, findet sich nur eine Bande für freie DNA.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Saturierende Punktmutagenese enthüllt multiple Bindungsstellen für
Transkriptionsfaktoren im Enhancer des SV40 Virus.
Durch Punktmutagenese wird
überall dort wo eine wichtige
Bindungsstelle vermutet wird
eine Punktmutation eingeführt
und anschließend die
Promotoraktivität gemessen.
Sinkt die Promotoraktivität
ab, war die veränderte Base
für die Bindung des
Transkriptionsfaktors von
Bedeutung.
5. Welche Transkriptionsfaktoren sind an der Regulation beteiligt?
DNA Affinitätschromatographie, Proteinsequenzierung, cDNA Klonierung
Hat man einen Promotor isoliert und sequenziert, kann man daran gehen beteiligte
Transkriptionsfaktoren zu isolieren.
28.03.2006
DNA Affinitätschromatographie
Reinigung von Transkriptionsfaktoren durch sequenzspezifische DNAAffinitätschromatographie
Zunächst wird ausreichender Zellextrakt erzeugt und die Proteine grob nach Größe getrennt.
Die DNA Bindungssequenz des TFs (Transkriptionsfaktors) ist bekannt. Es wird ein kurzes,
doppelsträngiges Stück dieser DNA Sequenz synthetisiert. Die synthetisierte DNA wird an
eine träge Matrix (meist Sepharose) gekoppelt.
Es wird der zuvor aufbereitete Zellextrakt hinzugefügt. Die Lösung wird so gewählt, dass die
Bindung anderer Proteine an DNA herabgesetzt wird, damit nur der die synthetisierte DNA
Sequenz bindende TF mit der DNA interagiert.
Anschließend wird die Säule mit Lösungen ansteigender Ionenstärke (viel Salz)
durchgewaschen, um an die DNA gebundene Protein zu lösen.
Mit jeder dieser Fraktionen wird ein DNase I Footprint der untersuchten Sequenz
durchgeführt. Erhält man einen Footprint (fehlende Banden im Gel durch an DNA
gebundenen TF), so enthält die korrelierende Fraktion einen hohen Anteil an gesuchtem TF
(im Beispiel entspricht das den Fraktionen 9-12).
Diese Fraktionen können mehrmals durch Säulenchromatographie gereinigt werden, um den
TF in möglichst reiner Form zu erhalten.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Klonieren einer cDNA durch Expression in E.coli und Detektion mit Hilfe eines
spezifischen Antiserums
Um das Gen zu finden, das den TF erzeugt wird zunächst das gereinigte Protein in einen
Hasen gespritzt, der AK (Antikörper) gegen das körperfremde Protein erzeugen wird. Einige
Zeit später wird dem Hasen Blut abgenommen und alle AK isoliert.
Es wird eine cDNA Bibliothek des zu untersuchenden Organismus erstellt, wobei jede dieser
cDNAs mit einem Promotor versetzt wird, damit die cDNA in Bakterien transkribiert werden
kann. Dieses Konstrukt wird mit λ-DNA verknüpft, damit die DNA in Phagenpartikel verpackt
werden kann.
Mit den Phagen wird wieder ein Zellrasen besprüht, infizierte Bakterien erzeugen nicht nur
Phagenproteine, sondern auch die Proteine, die durch die cDNA codiert werden. Es entstehen
Phagenplaques, die auch die erzeugten Fremdproteine enthalten. Die Plaques werden
abgestempelt und mit den aus dem Hasen gewonnenen AK vermischt. Die AK die im Hasen
gegen das eingespritzte Protein erzeugt wurden, werden bei dem Phagenplaque binden,
dessen cDNA für dieses Protein codiert. Es werden weitere, radioaktiv markierte AK
hinzugefügt, die die konstante Region von AK binden können und daher an zuerst
hinzugefügten "Hasen" AKs binden, die wiederum an den gesuchten Proteinen haften. Über
einen Röntgenfilm kann der Phagenplaque mit der gesuchten cDNA ermittelt und diese cDNA
isoliert, vermehrt und sequenziert werden.
Wurde eine cDNA einem TF zugeordnet, muss bewiesen werden, dass es sich dabei
tatsächlich um den gesuchten TF handelt.
Bestimmung von Transkriptionsfaktoraktivität
1. In vitro Transkription
Es wird eine Sequenz konstruiert, die einen Promotor mit
mehrfachen Bindungsstellen des ermittelten TFs aufweist.
Anschließend wird ein Zellkernextrakt hinzugefügt, der alle
notwendigen Faktoren für eine Transkription enthält. Wird der
untersuchte TF hinzugefügt, sollte die Transkription erhöht
werden bzw. erst überhaupt stattfinden können.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
2. Cotransfektionsassay mit einem Reportergen
Um zu prüfen, ob die ermittelte cDNA tatsächlich
für ein Protein codiert, das als TF für eine
bestimmte Sequenz dient, wird die cDNA dieses
Gens mit einem Promotor auf ein Plasmid kloniert.
Auf ein zweites Plasmid wird ein Reportergen
kloniert, dessen Promotor die fragliche
Bindungssequenz des gesuchten TF enthält.
Beide Plasmide werden in eine Zelle transfektiert.
Das Gen der cDNA wird in jedem Fall erzeugt,
handelt es sich dabei tatsächlich um den gesuchten
TF, wird er die Transkription des Reportergens auf
dem zweiten Plasmid ermöglichen, man erhält das
erfreuliche Signal, dass die Arbeit der letzten
Monate nicht vergebens war.
6. Struktur-Funktionsbeziehung im isolierten Transkriptionsfaktor (wo sind
funktionelle Domänen?)
TFs weisen zumindest zwei funktionelle Domänen auf. Die DNA bindende Domäne, die mit
der passenden Bindungssequenz interagiert und die so genannte transaktive Domäne, die
mit der RNA Polymerase in Kontakt tritt, um die Transkription zu steigern oder zu hemmen.
Im Beispiel des Lac Repressors ist eine weitere Domäne für die Funktion notwendig, die
Dimerisierungsdomäne, die ein Binden der einzelnen Proteine zur funktionellen Einheit
ermöglicht.
Struktur-Funktionsanalyse eines Transkriptionsfaktors durch gezielte
Deletionsmutagenese und Aktivitätsbestimmung im Reportergenassay
Um die einzelnen Domänen zu identifizieren, wird
Deletionsmutagenese eingesetzt.
Bsp. Der TF Gal4 der in Hefe im
Galactosemetabolismus reguliert. Mittels
Cotransfektion und EMSA wird zuerst bestätigt,
dass der TF an die UAS bindet und die
Transkription verstärkt.
Anschließend werden Plasmide mit der cDNA des
TF erzeugt, die um unterschiedlich lange Stücke
DNA am C-Terminus, am N-Terminus oder aus der
Mitte verkürzt sind. Wird mit diesen Plasmiden und
dem Reportergen erneut Cotransfektion und EMSA
durchgeführt, kann ermittelt werden, welche Teile
der cDNA für Interaktion mit DNA (kein EMSA
Signal bei Deletion und kein Reportergen) oder für
Interaktion mit der RNA Polymerase (EMSA Signal,
aber kein Reportergen) zuständig sind.
Mittels dieser Methode kann man mit ausreichenden Tests Lage und Länge der funktionellen
Domänen auf einige AS genau ermitteln.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Viele Transkriptionsfaktoren besitzen einen modulartigen Aufbau aus funktionellen
Domänen (DNA-Bindung, Transaktivierung)
Es gibt keine Regel, wo im TF sich die DNA bindende und
die transaktivierende Domäne befindet.
7. Interaktion des Transkriptionsfaktors mit anderen Proteinen
Hefe 2-Hybrid-System, Biochemische Verfahren und Massenspektroskopie
Yeast-Two-Hybrid System zur Ermittlung von Proteininteraktionen
Es handelt sich um ein Verfahren, bei dem die
Domänen eines Proteins getrennt und mit Hilfe von
interagierenden Proteinen wieder
zusammengesetzt werden.
Plasmid 1 codiert für die DNA bindende Domäne,
die mit einer so genannten Bait Domäne
verbunden ist. Die Bait Domäne selbst darf dabei
keine transaktivierende Eigenschaft haben.
Plasmid 2 codiert für die transaktivierende
Domäne, die mit einer so genannten Fish Domäne
verbunden ist.
Abschließend benötigt man ein Reportergen, dessen Aktivierungssequenz genau so weit von
der Bindungsstelle der RNA Polymerase entfernt ist, dass es nur über das Hybridprotein
transkribiert werden kann.
Das ganze wird in einen Hefestamm transfektiert, der Histidin nicht synthetisieren kann. Das
Reportergen sind in diesem Fall die Histidin synthetisierenden Gene.
Wird der Hefestamm auf ein Histidinarmes Medium überführt, werden nur die Hefezellen
überleben, die alle Plasmide aufgenommen haben und bei denen das Hybridprotein
tatsächlich als TF funktioniert.
Sollen Gene mit einer bestimmten DNA bindenden Domäne ermittelt werden, so stellt man
eine cDNA Bibliothek her, an jede cDNA wird eine Bait Domäne angefügt und in Plasmide
kloniert. Diese Plasmide werden gemeinsam mit den Plasmiden in den Reporterhefestamm
eingebracht, die für die transaktivierende + Fischdomäne codieren.
Codiert die cDNA auf einem Plasmid für ein Genprodukt, das die fragliche DNA Sequenz
binden kann, so wird der Hybrid aus Fish und Bait die Reportergene aktivieren können.
Dieser Vorgang kann umgekehrt auch dazu verwendet werden um eine cDNA Bibliothek mit
transaktivierenden Domänen zu erstellen.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Identifizieren von Proteininteraktionen: der proteomische Ansatz
•
•
•
•
•
Reinigung des Proteinkomplexes
Der zu untersuchende Proteinkomplex wird z.B.
mit Hilfe von AK gereinigt.
Auftrennen der einzelnen Komponenten (z.B.
Gelelektrophorese, 2-D Gelelektrophorese)
Im ersten Bild entsprechen die Flecken der
über Elektrophorese aufgetrennten
einzelnen Proteinkomponenten des
Komplexes.
In der 2-D Gelelektrophorese werden
Proteine einerseits nach ihrer Größe und
andererseits in der anderen Richtung nach
ihrem isoelektrische Punkt aufgetrennt, man
erhält keine Proteinbanden sondern "Spots".
Proteaseverdau … Peptide der einzelnen Proteine
Die Proteinkomponenten werden aus dem Gel geschnitten und einzeln verdaut. Es wird
dabei immer dieselbe Protease z.B. Trypsin verwendet, wodurch die Proteine in
eindeutige Stücke gespalten werden.
Auftrennen und Ansequenzieren der einzelnen Peptide
oder
Bestimmung der Peptidmassen durch Massenspektrometrie … charakteristischer
'fingerprint' an Peptidmassen … Datenbank … Zuordnung des Proteins.
Massenspektroskopie ermittelt das Verhältnis von Masse zu Ladung der einzelnen
Peptidstücke. Die Gesamtheit dieser Verhältnisse ergibt einen 'fingerprint' über den in
Datenbanken das zugehörige Protein ermittelt werden kann, wenn es bereits untersucht
wurde.
Transkriptionsfaktoren
Basale oder generelle TFs:
• sind Bestandteil des
Praeinitiationskomplexes, welcher die
RNA Polymerase an den
Transkriptionsstart positioniert.
Allgemeine TFs:
• binden an Bindungsstellen im
proximalen oder distalen
Promoterbereich (Enhancer).
• Beeinflussen die Frequenz, mit der der
Praeinitationskomplex gebildet wird,
entweder positiv (Aktivatoren) oder
negativ (Repressoren).
Häufig vorkommende Domänen (eukaryoter) Transkriptionsfaktoren
1. Helix-Turn-Helix Struktur: eine DNA-Bindungsdomäne die man oft in prokaryoten
Transkriptionsfaktoren findet (Beispiel: l-Repressor, Lac, Trp Repressoren), die aber auch
in eukaryoten Transkriptionsfaktoren vorkommt (Beispiel: HomeodomänenTranskriptionsfaktoren).
2. Zink-Finger Struktur: findet man in einer grossen Zahl eukaryoter Proteine (>1000). Die
Zn-Finger Struktur kann, muss aber keine DNA-Bindungsdomäne bilden. Es gibt zwei
Typen von Zn-Finger Strukturen. Beiden C2H2 Fingern wird das Zn-Atom durch zwei
Cysteine und zwei Histidine komplexiert, beiden C4 Fingern durch vier Cysteine.
3. Leucine-Zipper (LZ) Struktur: Eine amphipathische Helix, welche die Dimerisierung von
Transkriptionsfaktoren bewerkstelligt. Der LZ ist mit einer 'basic region' positiv geladener
Aminosäuren verbunden. Die basic region vermittelt die DNA Bindung.
4. Helix-Loop-Helix Struktur: Vom Prinzip her ähnlich den LZ Proteinen, jedoch ist die
Dimerisierungshelix durch eine Schlaufe (Loop) unterbrochen.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
1. Das helix-turn-helix motif der Homeodomäne des engrailed proteins:
Das helix-turn-helix motif als
wesentlicher Bestandteil einer
DNA bindenden Domäne.
Das Motif besteht aus drei
Helices; Helix 1 interagiert
basenspezifisch über den NTerminus in der kleinen
Furche, Helix 3 bindet
basenspezifisch in der großen
Furche der DNA
Diese Motif findet sich häufig in
Prokaryoten z.B. im λ Repressor, Lac
Repressor, Trp
Repressor, sowie vor allem in der entwicklungsbiologischen Genexpression bei Eukaryoten.
2. Die Zn-Finger Struktur: kompakte Anordnung von β-Faltblatt und α Helix durch
Komplexierung mit dem Zn2+ Atom
Proteine der Zn Finger
Struktur bilden die größte
Proteinfamilie im
eukaryotischen Genom. Das
Motif wird neben der DNA
Bindung für Protein-Protein
Interaktionen verwendet.
Die funktionelle Struktur ergibt sich durch die wechselnde Anordnung von Helices und
Faltblattstrukturen, die Anordnung wird durch die Bindung des Zn Atoms ermöglicht, das Zn
Finger Motif bindet DNA immer in der großen Furche.
Es gibt zwei unterschiedliche Zn Finger Strukturen, die DNA binden:
Die C2H2 Struktur, bei der ein Zn Atom durch zwei Cysteinen und zwei Histidine gebunden
wird und DNA als Monomer bindet.
Die C4 Struktur, bei der vier Cysteine ein Zn Atom binden und DNA als Dimer bindet.
C2H2 (GL1 Protein) und C4 (Glucocorticoid Rezeptor) Strukturen des Zn-Fingers.
•
•
C2H2 Proteine enthalten 3 oder
mehr Finger und binden als
Monomere an DNA. C4 Proteine
enthalten 2 Finger und binden als
Dimere.
Die Helix des Zn Fingers
kontaktiert die DNA
(a) C2H2
(b) C4 … die Bindung als Monomer
an DNA ist instabil.
40
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
3. Leucine-Zipper und basic region
•
•
Leucine-Zipper sind der Spezialfall einer durch
amphipathische Helices gebildeten coiled-coil
Struktur
Der L-Zipper dient der Protein Homo- oder
Heterodimerisierung In Transkriptionsfaktoren
kommen L-Zipper immer im Zusammenhang
mit einer basic region vor (basische, d.h.
positiv geladene Aminosäuren), welche die
Bindung an DNA bewirkt.
Die Leucine-Zipper Domäne wird durch eine amphipathische α Helix gebildet, über deren
hydrophoben Anteil sich zwei Leucine Zipper in wässriger Umgebung zusammenlagern
können.
Um DNA binden zu können, benötigt das Protein eine weitere Domäne, die basic region. Zur
Interaktion mit der negativ geladenen DNA weist die basic region ausgeprägt basische d.h.
positiv geladene AS auf.
4. Die helix-loop-helix Struktur
•
•
Eine durch einen Aminosäureloop unterbrochene Coiled-Coil
Struktur
Tritt in Transkriptionsfaktoren
ebenfalls gekoppelt an eine basic
region auf.
Die helix-loop-helix Struktur
entspricht dem Leucine Zipper,
nur dass die
Dimerisierungsdomäne durch
einen AS Loop unterbrochen ist.
Die SH2 Domäne P-SH2 SH2
•
verleiht einem Protein die Fähigkeit, an
tyrosinphosphorylierte Partner zu binden.
• vermittelt die Dimerisierung einer Familie von
Trankriptionsfaktoren, den STATS (signal transducers and
activators of transcription).
Die SH2 Domäne findet sich in Proteinen, die der
Signaltransduktion dienen. Die Transkription wird durch TFs mit
SH2 Domäne erst dann beeinflusst, wenn das Partnerprotein z.B.
als Reaktion auf Umwelteinflüsse phosphoryliert wurde und
dadurch ein Dimer gebildet werden kann.
Transaktivierungsdomänen (TADs)
•
•
•
•
Vermitteln Proteininteraktionen, die zur Initiation der Transkription führen
Besitzen meist keine klar definierten Sekundär-oder Tertiärstrukturen
Können durch das gehäufte Vorkommen bestimmter Aminosäuren klassifiziert werden:
- Saure TADs (viel Glu, Asp)
- Gln-reiche TADs
- Pro-reiche TADs
- Ser/Thr-reiche TADs
Unterschiedliche Klassen der TADs indizieren vermutlich unterschiedliche
Proteininteraktionen bei der Initiation der Transkription.
D.h. je nachdem welche AS gehäuft vorkommen, kann eine Aussage über die Partner
getroffen werden, mit denen die TADs interagieren werden.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Decker Foliensatz 2
Die Initiation der Transkription
•
Transkription lässt sich in folgende Phasen unterteilen:
- (Prae)Initiation: hier wird ein (Prae)Initiationskomplex gebildet, der RNA Pol an den
Promoter rekrutiert.
- Clearance: Übergang von einer statischen zu einer sich bewegenden RNA Pol.
- Elongation: RNA-Synthese
- Termination: Verlassen der DNA Matrize
Viele durch RNA Pol II transkribierte Promotoren enthalten eine TATA-Box
Basenhäufigkeit im –1/-35 Bereich von insges. 60 Promotoren von Vertebratengenen.
DNA Sequenzen, die in Pol II Promotoren an der Bindung des
Praeinitiationskomplexes beteiligt sind
TFIIB verstärkt basale
Transkriptionsfaktoren (TFII
bei Pol II).
Basale TF … TF die an der
Präinitiation beteiligt sind.
Viele der Gene die durch RNA Polymerase II transkribiert werden, enthalten eine Sequenz
von etwa -26 bis -35, die der TATA-Box in Prokaryoten ähnlich ist.
Die oben angeführten Sequenzen dienen der Bildung des Präinitiationskomplexes und können
einzeln oder in unterschiedlichen Kombinationen miteinander vorkommen; d.h. jede dieser
Sequenzen kann im Promotor eines Gens vorkommen, sie sind aber nicht obligatorisch.
Die Sequenzen dienen der direkten oder indirekten Bindung des TFIID Komplexes.
Basal (general) transcripton factors of RNA Pol II
Name
TFIIA
TFIID
TFIIF
TFIIB
TFIIE
TFIIH
Number of subunits
2
1 (TBP)+11 (TAFs)
3
1
2
9
Die meisten basalen TFs sind keine Einzelproteine
sondern Komplexe aus unterschiedlich vielen
Untereinheiten.
42
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Der (Prae) Initiationskomplex, (P)IC, von RNA PolII Promotoren
Der erste Schritt ist die Bindung des basalen
Transkriptionsfaktors TFIID an die TAATA-Box.
TFIID besteht aus dem TAATA-binding protein
(TBP) und den TBP-associated factors (TAFs).
-TBP führt eine Biegung in die DNA ein
-TFIIH phosphoryliert die carboxyterminale
Domäne der Pol II.
Neben der phosphorylierung der CTD der RNA
Polymerase hat TFIIH DNA Helicaseaktivität, die
für das Öffnen des Promotors essentiell ist.
Bindung eines TBP Monomers biegt die DNA im Bereich der Initiationsstelle.
TBP bindet an die große Furche der DNA, die Bindung führt zu
einer Krümmung der DNA, die für die Bindung der RNA
Polymerase Voraussetzung ist.
Der TBP-TFIIB Komplex mit DNA
TBP wird nach der Bindung an die DNA von TFIIB
gebunden. TFIIB dient in weiterer Folge als Brücke
zwischen TBP, DNA und RNA Polymerase.
43
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
TFIIB verbindet TBP mit der RNA Pol II
Nachweis der RNA Pol II CTD Phosphorylierung an polytaenen Chromosomen in
Drosophila:
phosphorylierte RNA Pol II (rot) findet sich in den
puffs, unphosphorylierte RNA Pol II hauptsächlich
in den wenig transkribierten Bereichen
TFIIH phosphoryliert die CTD von RNA Pol II. In
den polytänen Chromosomen der Speicheldrüsen
von Drosohiphila finden sich die phosphorylierten
RNA Polymerasen vor allem in den stark transkribierten
Bereichen, den so genannten Puffs.
Demnach ist phosphorylierte RNA Polymerase für die
Transkription von Genen verantwortlich.
Sichtbar gemacht wurden sie durch Antikörper, die spezifisch nur an
phosphorylierte RNA Polymerase binden. Die AK selbst wurden rot
fluoreszierend markiert, die rote Farbe findet sich an den
Transkribierten Stellen.
Wie ist das Holoenzym der eukaryoten RNA Pol II beschaffen?
•
•
•
Im Labor experiment ergibt sich ein stufenweiser Aufbau des PIC aus den basalen
Transkriptionsfaktoren.
Biochemische Analyse der aus Zellen isolierten Pol II legt jedoch den Schluss nahe, dass
das Holoenzym ein riesiger Proteinkomplex aus Core-Polymerase, basalen
Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren ist.
Es besteht die Möglichkeit, dass nur TFIID und TFIIA unabhängig an den Promoter binden
und dass dieser Komplex nachfolgend das RNA Pol II Holoenzym mit allen weiteren
Komponenten rekrutiert.
44
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
04.04.2006
Die sequentielle Bildung des PIC aus basalen Transkriptionsfaktoren kann
experimentell mit dem'electrophoretic mobility shift assay' (EMSA) untersucht
werden.
DNA weist bei einer
Gelelektrophorese eine
bestimmte Wanderungsgeschwindigkeit (mobility)
auf.
Wird DNA durch Proteine
gebunden, gibt es eine
charakteristische Änderung
der Wanderungsgeschwindigkeit (mobility
shift).
Durch diesen Test konnte
ermittelt werden, in welcher
Reihenfolge die einzelnen
Faktoren aneinander bzw. an
die DNA binden – wurden die
Faktoren nicht in der
korrekten Reihenfolge
hinzugefügt, kam es zu keiner
Bindung an die DNA und zu
keinem mobility shift:
Reihenfolge: TFIID, dann TFIIA, erst dann
RNA Polymerase II Holoenzymkomplex.
RNA Polymerase II Holoenzyme
Aus: Holstege and Young (1999) PNAS 96:2
Die Bindung des TFIID ist der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt.
SRB Mediatorkomplex ... Proteinkomplex aus
vielen Proteinen
SWI / snf ... Chromatin remodelling complex
TFIIH Komplexe spielen eine Rolle bei der promoter clearance und der DNA
Excisions-Reparatur
Es gibt drei unterschiedliche TFIIH Komplexe.
Core TFIIH: XBP (3'-5'Helicase)
Der Core TFIIH Komplex ist das Homolog zur
XPD (5'-3'Helicase)
Core Polymerase der Prokaryoten.
p44, Tfb1, Tfb2
Holo TFIIH 1 (Promoter Clearance):
Die CTD Kinase besteht aus zwei UE
Core TFIIH+CTD Kinase
(CDK7/CycH). CDK7 ist mit
(CDK7/CycH)
Zellzykluskinasen, CycH mit Zyclinen
verwandt. Die Kinase ist für die Phosphorylierung der CTD der RNA
Polymerase verantwortlich.
Holo TFIIH 2 (DNA-Reparatur):
Es gibt einen Zusammenhang zwischen
Core TFIIH+Reparaturproteine Transkription und Reparatur, stark
(Rad, XPG)
transkribierte Bereiche werden schneller
repariert als schwach transkribierte. Der Holo TFIIH 2 Komplex dient der
Initiation und Durchführung der Reparatur von DNA.
45
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
TFIIH Komplexe bei der promoter clearance und DNA Reparatur
Bei der Initation liegt der Komplex
als Holo TFIIH 1, bei der Elongation
als Holo TFIIH 2 zwecks Reparatur
vor. Erreicht die Polymerase im Zuge
der Transkription einen beschädigten
DNA Bereich, kommt es durch den
Komplex aktiv zur Rekrutierung
eines größeren Reparaturkomplexes.
Phosphorylierung der CTD durch TFIIH und die P-TEFb Kinase reguliert die Bindung
von Proteinen, die an der mRNA Prozessierung beteiligt sind
Die CTD (carboxyterminale Domäne) wird je nach Phase der Transkription durch die Kinase
des Holo TFIIH I Komplex unterschiedlich Phosphoryliert und bindet entsprechend
verschiedene Proteinkomplexe, wichtige Phosphorylierungsstellen sind Serine 2 und 5.
Die variable Phosphorylierung
der CTD erklärt das
Assoziieren von Komplexen
die an Elongation, RNA
Prozessierung und
Termination der Transkription
beteiligt sind.
Ist die RNA Pol II an den Transkriptionsstart gebunden,
stimuliert ein Mediatorkomplex die Kinaseaktivität des TFIIH, die
CTD wird an Ser5 phosphoryliert. Dadurch können
Elongationskomplex und mRNA Cappingkomplex binden. Es kommt zur Promotor clearance
und transkription des 5' Endes, gefolgt von einer kurzen Pause in der der mRNA CAP
synthetisiert wird. Nach dem Capping wird Ser2 des CTD durch CDK9 phosphoryliert,
wodurch die Elongation beginnen kann.
Die CTD kommt nur in der RNA Pol II vor, sie kann daher stärker reguliert werden als andere
Polymerasen.
46
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Bildung einer mRNA CAP Struktur
Das γ-Phosphat einer mRNA wird durch eine Triphosphatase
gespalten.
Mittels Guaninyltransferase erfolgt ein dirigierter nucleophiler
Angriff des ß-Phosphats der mRNA auf das α-Phosphat eines
Guanins wodurch eine 5'-5' Phosphodiesterbindung entsteht.
Abschließend wird das Guanin wird an Position 7 methyliert.
Diese CAP Struktur schützt einerseits die mRNA vor Abbau durch
Nucleasen vom 5' Ende her und spielt andererseits in der
Translationskontrolle eine Rolle.
mRNA Termination und Polyadenylierung
Die Termination in Eukaryoten unterscheidet sich
von der in Prokaryoten.
Die transkribierte mRNA weist am 3' Ende nach
dem codierenden Teil des Gens spezielle
Sequenzen auf (sog. Polyadenylierungssequenzen), an welche die Faktoren CstF und CPSF
binden können.
Diese Faktoren sind zunächst mit der wiederum
spezifisch phosphorylierten CTD assoziiert und
wechseln aufdie Poly A Sequenzen.
CstF schneidet die mRNA los, es entsteht ein 3'
Ende an das mittels CPSF eine spezielle
Polymerase binden kann.
Diese Poly A Polymerase (PAP) fügt bis zu 200 A
Nucleotide an das 3' Ende der mRNA an, bevor PAP
und CPSF sich von der mRNA lösen.
Am sog. Poly A Schwanz binden Poly A binding
Proteins, die die Stabilität der Struktur erhöhen.
47
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Struktureller Aufbau RNA PolIII abhängiger Promotoren
RNA Pol III transkribiert 5S rRNA sowie tRNAs und
erkennt drei unterschiedliche Promotorsequenzen.
Eine dieser Promotorsequenzen ähnelt dem RNA
Polymerase II Promotor, die anderen beiden liegen
bereits in der codierenden Sequenz.
Deletionsanalyse des RNA Pol III abhängigen 5S rRNA Promoters ergibt, dass der
kodierende Bereich wichtige regulatorische DNA Sequenzen beinhaltet.
Deletionsanalyse: Das Gen für 5S rRNA wurde isoliert und
systematisch zerschnitten und mittels Reportergenassay
überprüft ob noch Transkription stattfand.
Die Analyse ergab, dass das Gen auch noch
transkribiert wurde, obwohl bereits ein Teil des
Gens deletiert worden war.
Der Promotor musste daher innerhalb des Gens
liegen.
Rolle der Transkriptionsfaktoren TFIIIA, B und C bei der Initiation RNA Pol III
abhängiger Transkription von internen Promotoren
Es gibt zwei unterschiedliche interne
Promotoren.
TFIII … Transkriptionsfaktor der RNA
Pol III
Promotor mit Box A und C:
Erst wenn TFIIIA gebunden hat,
kann TFIIIC binden.
TFIIIC bleibt so lange gebunden, bis
oberhalb des Transkriptionsstarts
TFIIIB gebunden hat, an das
wiederum RNA Pol III binden kann.
Promotor mit Box A und B:
Es bindet nur TFIIIC an beide
Sequenzen, deren Bindung ebenfalls
zur Rekrutierung von TFIIIB und
weiters zur Bindung der RNA Pol III
führt.
48
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Initation der Transkriptionvon RNA Pol I abhängigen Promotoren
RNA Pol I Promotoren bestehen aus
zwei Sequenzen.
Einem upstream control element
(UCE) und dem core promotor.
Jeweils ein Transkriptions-faktor
UBF1 bindet an UCE und core
promotor und rekrutiert anschließend
an beiden Sequenzen weitere
Faktoren, die den SL1 Komplex
bilden.
Nur wenn beide Komplexe
ausgebildet sind, kann die RNA Pol I
am core promotor binden.
Das TAATA-binding protein (TBP) kann an der Initiation der Transkription durch
alle drei eukaryoten RNA Polymerasen beteiligt sein, auch wenn deren Promotoren
keine TAATA-Sequenz beinhalten
Das TBP findet sich in den Komplexen aller drei eukaryotischen RNA Polymerasen, auch wenn
sich in den jeweiligen Promotoren keine TATAA Sequenz findet.
Vermutlich wird die Fähigkeit des TBP DNA zu krümmen bei der Bindung aller drei RNA
Polymerasen benötigt.
49
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Wie beeinflussen Trankriptionsfaktoren die Transkriptionsrate eines Gens?
•
•
Aktivatoren müssen die Bildung des (P)IC und die Rekrutierung der RNA Polymerase
fördern, Repressoren müssen sie unterdrücken.
(P)IC ... (pre) initiation complex
Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, wie die Bildung des (P)IC durch
Transkriptionsfaktoren beeinflusst werden kann:
- direkter Kontakt mit Komponenten des (P)IC.
- indirekt Kontakt mit dem (P)IC über Kofaktoren oder weitere Transkriptionsfaktoren.
- Beeinflussung der Chromatinstruktur.
DNA liegt in Eukaryoten meist als DNA-Proteinkomplex vor, es gibt TF die mit den
Proteinen der Chromatinstruktur interagieren und sie lockern oder festigen.
Direkter und indirekter Kontakt zwischen Transkriptionsfaktoren und dem PIC
Kontakt zwischen Transkriptionsfaktoren und RNA Pol II
•
•
•
Der (Prae) Initiationskomplex enthält hochmolekulare Proteinkomplexe aus vielen
Untereinheiten, die als Kontaktstellen für Transkriptionsfaktoren dienen können.
Ein solcher Komplex ist TFIID, der außer TBP die TBP-associated factors (TAFs) enthält.
Ein weiterer ist der mit der RNA Pol II CTD assoziierte Mediator Komplex
Zwischen Hefe- und humanem Mediatorkomplexen gibt es Nomenklaturunterschiede, weil
Proteine durch unterschiedlcihe Versuchsreihen und Experimente entdeckt wurden.
Die Menge der UE des Mediatorkomplexes ergibt sich daraus, dass so mit einer hohen Anzahl
weiterer unterschiedlicher TFs Interaktionen eingegangen werden können. Dadurch kann
eine ausreichend unabhängige Regulation der einzelnen Gene im Genom ermöglicht werden.
50
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Viele Transkriptionsfaktoren, binden weit entfernt
vom Transkriptionsstart an 'enhancer' Elemente.
Sie können die Bildung des PIC durch direkten
Kontakt beeinflussen, wenn die zwischenliegende
DNA flexibel ist und die Bildung einer Schlaufe
erlaubt.
Multiple Kontakte zwischen Transkriptionsfaktoren und Komponenten des PIC am
Beispiel des spezifisch in der Lebertranskribierten TTR Gens
Im Vergleich zur Anzahl der Gene exisitert
eine relativ kleine Anzahl unterschiedlicher
TF.
Um die Gene unterschiedlich regulieren zu
können, werden die TFs in unterschiedlicher
Kombination miteinander zur Genregulation
eingesetzt.
Zu diesem Zweck finden viele gleichzeitige
Interaktionen statt. DNA ist flexibel und
liegt in Schlaufen vor, daher können auch
weiter entfernte Stellen Interaktionen mit
dem Komplex eingehen (Enhancer
Sequenzen).
Wie beeinflussen Transkriptionsfaktoren oder Repressoren die Bildung des
Initiationskomplexes?
•
•
•
Direkte Interaktion mit basalen Transkriptionsfaktoren
Interaktion via Cofaktoren/Coaktivatoren (TAFs, Mediatorproteine, andere)
Beeinflussung der Chromatinstruktur:
- Binden von Coaktivator/Corepressor-Komplexen mit enzymatischer Aktivität zur
Modifikation von Histonen.
Modifikationen ... Hinzufügen chemischer Gruppen (Phosphorylierung, Methylierung,
Acetylierung)
- Umlagern oder Auflösen von Nukleosomen (Chromatin remodelling).
51
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Elektronenmikroskopische Darstellung von mitotischer und Interphasen DNA
Rechtes Bild … Chromosom in
Metaphase ... maximale
Verpackung (1m auf 0,1µm
kompaktiert).
Übergeordnete DNA Strukturen
Das Nukleosom
•
•
•
Im Nukleosom sind 146bp DNA knapp 2 mal um ein
Histon-Oktamer gewunden.
Das Histon ist ein oktamerer Proteinkomplex aus 2x4
UE (2 x H2A, H2B, H3, H4).
Zwischen zwei Nukleosomen befindet sich ein DNA
'spacer' von-je nach Species 15 bis 55bp Länge.
Histon H1 kann im Bereich der Spacer DNA binden
und eine kompaktere Anordnung der Nukleosomen
bewirken.
Das Protein H1 ist nicht Teil des Nucleosoms, es
bindet an DNA und Histon und ist für die
Kompaktierung von 10nm auf 30nm Struktur
verantwortlich (so richtig?).
52
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Struktur der am Aufbau des Nukleosoms beteiligten Histone H2A, H2B, H3 und H4
Die Strukturen der einzelnen UE sind sich
sehr ähnlich.
Die N-terminalen Enden der einzelnen UE
ragen aus dem Histon heraus und sind so
für Modifikationen zugänglich.
Geordneter Aufbau eines Nukleosoms
Die Bildung eines Nucleosoms läuft geordnet ab, zunächst bindet ein H3/H4 Tetramer an die
DNA, anschließend binden zwei H2A/H2B Dimere.
Die Anlagerung von H1 führt zu einer kompakteren Struktur nukleosomaler DNA
Die Anlagerung von H1 bringt benachbarte Histone
so nah zusammen, dass deren N-terminale Enden
miteinander interagieren können. Diese beiden Effekte
zusammen ergeben die 30nm Struktur.
53
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Was ist Chromatin Remodelling?
•
Jede Änderung einer vorgegebenen Chromatinstruktur:
- Überführung von Eu- in Heterochromatin oder umgekehrt
- Auflösen, Bildung oder Umlagerung von Nukleosomen
- Einfügen varianter Histone
- Chromatin remodelling ist eng an die postranslationale Modifikation von Histonen
gekoppelt.
Zusätzliche Literatur zum Thema Chromatin: Cell 128: Heft vom 23. Feb. 2007
Remodelingkomplexe müssen in der Lage sein, die Tätigkeit im zweiten Punkt durchzuführen.
Histone Variants Involved in Transcription Regulation
Histone
H3
Variant
Forms
H3.3
Role(s) in
Transcription
Transcription
activation
X
chromosome
inactivation
Localization
Structural Features
Transcribing
region
Inactive X
chromosome
Different from canonical H3 in only
four amino acids.
H2A
macroH2A
C-term nonhistone-like region is
responsible for most of functions;
histone-fold prevents sliding;
prefers to form hybrid nucleosome.
H2AZ
Transcription
Promoter,
Loop1 differs from H2A, disfavors
activation/
heterochromatin formation of hybrid nucleosome;
repression
boundary
C-term α helix is essential for
recognition.
H2ABbd
Transcription
Active X
Lack of C term; it only organizes
activation
chromosome
118–130 bp pf DNA and leaves
and autosomes
each side 10 bp free DNA.
H2A.X
Repression
Canonical in
A conserved C-term SQ(E/D) motif
yeast, generally that becomes phosphorylated upon
distributed
DNA damage.
Histonvarianten kommen nur in speziellen Bereichen der DNA vor. Diese Varianten werden
nicht bei der normalen Bildung von Nucleosomen eingebaut, sondern werden durch spezielle
remodelling complexe in bereits bestehende Nucleosome eingefügt.
Veränderung der DNA Eigenschaften durch variante Histone
Die Histonvarianten H3.3 findet man in
transkriptionell aktiven Genen.
Die H2AZ Variante in Promotoren oder
boundary Elementen.
Möglicherweise verhindern sie die Bildung
von Heterochromatin.
Der Austausch varianter Histone erfolgt
durch remodelling complexes (z.B. Tip60
Komplex)
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Biochemische Aktivitäten von Chromatin Remodelling Komplexen
Chromatin remodelling … DNA liegt in einer
bestimmten Form Chromatin vor. Soll ein
hier liegendes Gen exprimiert werden, muss
die Chromatinstruktur verändert werden.
Es kann Eu- in Heterochromatin und
umgekehrt überführt werden, sowie
lediglich bestimmte Nucleosome umgelagert
werden.
(a) DNA gleitet am Octamercomplex entlang
wodurch Transkriptionsstellen freiwerden.
(b) Transfer von Nucleosomen
(c) Drehung der DNA vom Nucleosom weg
Chromatin Remodelling Komplexe
Type
SWI / SNF
Subunit No
Bromodomain /Chromodomain Slide Transfer Restructure
8-11
Bromodomain
Yes
Yes
Yes
Kann direkt mit RNA Polymerase assoziiert sein.
ISWI
2-4
No
Yes
No
No
Mi2 / NuRD 8-10
Chromodomain
Yes
No
No
Bromodomain / Chromodomain … Vermittelt die Bindung des Komplexes an Histone.
Remodelling Komplexe erkennen Nucleosomen nur dann, wenn die Histone passend
modifiziert sind.
Rotational und Translational Positioning der DNA um das Nukleosom bestimmen
die Zugänglichkeit von Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren
Die Positionierung der DNA in Bezug auf die
Histone ist in der Hinsicht wichtig, ob die
Transkriptionsbindungsstelle nach außen weist und
zugänglich ist oder nicht.
Rotational positioning beschreibt eine Drehung der
DNA im Hinblick auf die Octameroberfläche.
Translational positioning … Histone können so
verschoben werden, dass unterschiedliche Teil der
DNA als Spacer DNA (und damit darin liegende
Bindungssequenzen) zugänglich wird.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Enzymatische Modifikation der Histone N-Termini durch Phosphorylierung,
Acetylierung und Methylierung.
Die N-Termini der Histone ragen aus dem
Nukleosom und sind von außen her zugänglich
Acetylierung und Deacetylierung von Histonen
Histone weisen eine Vielzahl an Lysinen und Argininen auf, die im unmodifizierten Zustand
bei neutralem pH positiv geladen vorliegen. Da DNA durch die Phosphatgruppen bei
neutralem pH negativ geladen vorliegt, finden sich eine starke elektrostatische Anziehung
zwischen DNA und Histonen die eine kompakte Struktur erzeugt.
• Histon-Acetyltransferasen (HATs) neutralisieren die positive Ladung von Lysinen. Daher
wird die Interaktion mit DNA, geschwächt, die nukleosomale Struktur aufgelockert. Der
Promoter wird für Transkriptionsfaktoren zugänglicher.
• Histon-Deacetylasen (HDACs) bewirken einen gegenteiligen Effekt und daher
transkriptionelle Repression eines Gens.
Different Classes of Modifications Identified on Histones
Die wichtigsten modifizierbaren AS in Histonen sind Lysin (Acetylierung, Methylierung), Serin
(Phosphorylierung) und Arginin (Methylierung).
Chromatin Modifications
Acetylation
Residues Modified
K-ac
Methylation (lysines)
Methylation (arginines)
Phosphorylation
K-me1 K-me2 K-me3
R-me1 R-me2a R-me2s
S-ph T-ph
Ubiquitylation
Sumoylation
ADP ribosylation
Deimination
Proline Isomerization
K-ub
K-su
E-ar
R > Cit
P-cis > P-trans
56
Functions Regulated
Transcription, Repair,
Replication, Condensation
Transcription, Repair
Transcription
Transcription, Repair,
Condensation
Transcription, Repair
Transcription
Transcription
Transcription
Transcription
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Sonnbert
Modifikationen der Histone und ihre Korrelation zur Transkription des
korrespondierenden Genlocus
Histon Code Hypothese: Je nachdem in
welcher bestimmten Art die N-Terminis
eines Histons modifiziert sind, ergeben sich
unterschiedliche zugeordnete Auswirkungen
auf die Funktion des Histons.
Ist beispielsweise der H3 N-Terminus nicht
modifiziert, findet keine Transkription statt,
das gebundene Gen ist stillgelegt. Ist er
Terminus an Lysin 14 modifiziert, ist das
Gen aktiv. Ist es an Lys9 methyliert, wird
Heterochromatin gebildet und dadurch das
Gen nicht nur abgeschaltet sondern auch
die DNA Struktur zusätzlich kompaktiert.
Ist es doppelt phosphoryliert, dient das der
Chromosomenkondensation während der
Mitose. Ist es phosphoryliert und acetyliert,
dient das der Expression des Gens usw.
Histone modifying enzymes
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
HAT Complex
Subunit No
Catalytic Subunit
SAGA
PCAF
NuA3
NuA4
P300/CBP
15
11
3
6
1
GCN5
PCAF
SAS3
ESA1
P300/CBP
HDAC Complex
Subunit No
Catalytic Subunit
Sin3 Complex
NuRD
SIR2 Complex
7
9
3
HDAC1/HDAC2
HDAC1/HDAC2
Sir2
Histone Methylases
SUV39
SET1
PRMT
Target Histone
H3 (Lysine 9)
H3 (Lysine 4)
H3 (Arginine 3)
Bromo/
Chromodomain
Bromo
Bromo
Chromo
Bromo
Sonnbert
Target Histone
H3, H2B
H3, H4
H3
H4
H2A,H2B,H3,H4
Bromo/
Chromodomain
Chromo
-
Bromo/ Chromodomain
Chromo
-
Bestimmung der Histonacetylierung durch Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)
Die Analyse dient dazu, DNA Bereiche zu
isolieren, deren Histone in einer Zelle
acetyliert vorliegen.
Zunächst wird die DNA des Zellkerns
chemisch behandelt, um eine Lösung von
DNA und Histonen zu verhindern ("cross
linking").
Anschließend werden die Chromosomen
mittels Ultraschall (Scherkräfte) in 300 bis
1000bp lange Stücke zerteilt.
Die Stücke werden mit speziellen
Antikörpern versetzt, die spezifisch an
acetylierte Histone binden.
Das Gemisch wird weiters mit einer
Verbindung versetzt, die an den Antikörper
binden und dadurch dem Komplex
zusätzliches Gewicht verleihen.
Unter Immunipräzipitation versteht man das Isolieren dieses schwereren Komplexes durch
Zentrifugation.
Anschließend wird der isolierte Komplex durch bestimmte Bedingungen so weit aufgelöst,
dass die bisher gebundene DNA frei vorliegt.
Abschließend wird mit der isolierten DNA PCR durchgeführt, wobei Primer verwendet werden,
die auf Promotoren abzielen, um festzustellen, welche Gene acetyliert vorlagen.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Modifikationen der Histone können durch Proteine mit Bromo-und Chromodomänen
biologisch umgesetzt werden
Eine Bromodomäne
bindet spezifisch an
acetylierte, eine
Chromodomäne
spezifisch an
methylierte Histone.
Über diese beiden
Domänen können
weitere Proteine
spezifisch mit
acetylierten oder
methylierten Histonen
interagieren.
Wird ein Histon
acetyliert, wird dessen
Interaktion mit der
DNA geschwächt.
Weiters kann dieses Histon von Chromatin Remodelling Komplexen mit Bromodomäne
erkannt werden, die die Struktur weiter lockern oder das Nucleosom verschieben.
Die Methylierung von Histonen kann Transkription ermöglichen wie verhindern, abhängig
davon, welches Lysin bzw. Arginin methyliert wird.
Mit modifizierten Histonen interagierende Proteine und ihre Bindungsdomänen
Histonmodifikationen regulieren alle biologischen Prozesse an der DNA
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Rekrutieren von histonmodifizierenden Enzymkomplexen erfolgt durch
transaktivierende und transreprimierende Domänen
Zusammenwirken von Transkriptionsfaktoren, Chromatin Remodelling Komplexen
und Histonmodifizierenden Komplexen bei der Aktivierung der Transkription
60
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Transkriptionsfaktorbindung kann Voraussetzung oder Konsequenz von
Chromatinremodelling und/oder Modifikation sein
Ad (a) Ein Aktivator bindet an
das kompakte Chromatin und
dient dazu, einen HAC zu
rekrutieren, der wiederum die
folgenden Histone acetyliert
und dadurch das kompakte
Chromatin auflockert,
wodurch TF binden und die
Transkription initiieren
können.
Ad (b) Ein Aktivator bindet an
das kompakte Chromatin und
dient dazu, einen chromatin
remodelling complex zu
binden, der in der Lage ist, die Nucleosome so zu verändern, dass TF Zugang zum Promotor
erhalten.
In diesem Beispiel sind beide Komplexe nötig. DNA binding Protein 1 rekrutiert den
chromatin remodelling complex, der das Nucleosom soweit verändert, dass DNA binding
protein 2 binden kann, das wiederum HAC binden kann, das die Histone acetyliert und die
Struktur auflockert.
Chromatin remodelling kann zur kooperativen Bindung von Transkriptionsfaktoren
notwendig sein
Kooperative Bindung … die Bindung eines
Faktors erleichtert bzw. ermöglicht erst die
Bindung eines zweiten Faktors.
Ad (c) … Die Bindung von Faktor A
ermöglicht die Bindung eines Remodelling
Komplexes, durch dessen Aktivität die
Bindungsstelle für Faktor B frei wird.
Ad (d) … Der Faktor A dient selbst dem
Remodelling, indem es DNA vom Histon löst
und dadurch die DNA Bindungsstelle für den
Faktor B freisetzt.
61
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Bildung eines Enhancesomes am Beispiel des IFN-beta Promoters
Die nucleosomale Struktur muss so
verändert werden, dass ein
Initiationskomplex überhaupt binden kann.
Das Nucleosom wird zugunsten eines sog.
Enhanceosoms verschoben, dieses bietet
Bindungsstellen für RNA Pol Proteine.
Alle Proteine gemeinsam bilden das
Enhanceosom, das eine Krümmung der DNA
bewirkt, damit RNA Pol binden kann bzw.
TFs leichter an die DNA binden können.
Interferone (IFN) sind Substanzen, die das Immunsystem produziert, um die Replikation von
Viren in Zellen zu unterdrücken. IFN-ß soll daher nur dann gebildet werden, wenn eine Zelle
infiziert ist.
Rekrutierung von histonmodifizierenden und chromatinremodellierenden
Komplexen durch das IFN-beta Enhancosom
Rekrutierung von Koaktivatoren, GTFs und RNA Pol II durch den
Transkriptionsfaktor PPARγ
62
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Im Promoter des HO Gens (S. cerevisiae
cerevisiae) führt die die Bindung von SWI5 zur
Auflösung der Nukleosomenstruktur über der SBF
Bindungsstelle. Hierdurch kann SBF binden und
RNA Pol II über Assoziation mit Mediator dem
Promoter zuführen.
SWI5 dient sowohl der Rekrutierung eines
chromatin remodelling complexes als auch eines
HAC, wodurch Bindungsstellen im Promotor des HO
Gens frei werden.
Im Falle des MMTV Promoters bewirkt die Bindung
des Glucocorticoidrezeptors (GR) an nukleosomale
DNA eine Änderung des rotational positioning,
sodass die Bindungsstellen für NF1 und weitere GR
zugänglich werden.
MMTV ist ein Retrovirus, das sich in Mäusen in das
Genom integrieren und unter entsprechenden
hormonellen Bedingungen Krebs hervorrufen kann.
In der linear vorliegenden Form der DNA kann der
GR nicht binden, ist die DNA des Virus in ein
Nucleosom verpackt, kann GR binden. Durch diese
bindung findet rotational positioning statt und der
TF NF1 kann mit der DNA interagieren und eine
Transkription einleiten.
Wirkungsweise von transkriptionellen Repressoren
Ad (d) … Ein an ein Nucleosom gebundener
Repressor kann eine HDAC rekrutieren, die durch
Deacetylierung von weiteren Nucleosomen die
Chromatinstruktur kompakter und dadurch inaktiv
werden läßt.
63
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
-
Sonnbert
Während der Elongation der Transkription wird die
Nukleosomenstruktur nicht vollständig aufgelöst.
Das Histon Oktamer löst sich kurzfristig von der
DNA um Transkription durch RNA Pol zu
ermöglichen.
Zusammenspiel der Proteine Fact und PAF während der transkriptionellen
Elongation nukleosomaler DNA
Epigenetische Genregulation
Epigenetic: describing mitotically heritable but reversible modifications to DNA or chromatin
that lead to changes in gene expression in the absence of genetic alterations.
• Ist Genregulation, die bei identischer DNA in unterschiedlichen Zellen/Organen
unterschiedliche und mitotisch stabile Genexpression erzeugt.
• Wird bewirkt u.a. durch die Chromatinstruktur und durch DNA –Methylierung.
Unter epigenetischer Genregulation versteht man Regulation, die nicht direkt über die DNA
Sequenz erfolgt sondern z.B. durch DNA Methylierung bei genetic imprinting.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Eu- und Heterochromatin
•
•
•
Euchromatin enthält transkribierte Bereiche der DNA
Heterochromatin
- ist der transkriptionell inaktivere Bereich des Genoms mit dichter Packung des
Chromatins.
- kann konstitutiv sein (Telomer- und Centromerbereiche) oder induziert (XChromosom Inaktivierung; Silencing der mating-type loci in Saccharomyces).
- die Verpackungsform der DNA ist nicht in jedem heterochromatischen Abschnitt gleich
- niedriger Gehalt an acetylierten Histonen.
Spezielle DNA Sequenzen (locus control region (LCR), insulator, boundary elements)
regulieren die Eingrenzung der Eu- und Heterochromatin Bereiche.
Chromosomale Domänen definieren transkribierte und nichttranskribierte Bereiche
Insulator: 'isoliert' Heterochromatin von
Euchromatin
MAR = matrix-attachment region
LCR = locus control region
Chromosomale Domänen bezeichnen
Abschnitte auf dem Chromosom, die
entweder als Eu- oder als Heterochromatin
vorliegen, die Domänen sind durch
"Insulators" voneinander getrennt.
LCRs dienen der epigenetischen Kontrolle der Transkription aller Gene innerhalb einer
Domäne. Insulators können einem LCR dienen, indem sie Enhancer Sequenzen eines Gens
stillegen.
Ein Beispiel für LCR sind die unterschiedlichen Hämoglobinklassen, die in den verschiedenen
Stadien der Embryogenese exprimiert werden. Hämoglobine eines Stadiums müssen
vollständig abgeschalten, die des nächsten Stadiums vollständig aktiviert werden. Führt man
in die LCR eines Clusters eine Deletion ein, wird der gesamte Cluster nicht mehr exprimiert.
Isolator (Insulator) Elemente
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Methylierung des H3K9 durch die Suv39 Methyltransferase bewirkt Bindung des
Heterochromatinproteins HP1
•
•
Die SET Domäne von Suv39
enthält Methyltransferase
Aktivität.
Die Chromodomäne von HP1
erkennt methyliertes H3.
Bildung von Heterochromatin am Beispiel der Rap/Sir Proteine aus Saccharomyces
Im Telomerbereich der DNA von Hefe
bindet das Protein Rap1, das selbst
einen Sir2/3/4 Proteinkomplex
bindet. Sir2 ist eine HDAC, die
naheliegende Histone deacetyliert.
An diesen Histonen können in
weiterer Folge weitere Sir2/3/4
Komplexe binden, die in
ausreichender Menge miteinander
Binden können und so eine
kompakte DNA Struktur bilden.
Heterochromatinbildung durch Drosophila Polycomb (Pc-G) Proteine
Pc-G Proteine in Drosophila
dienen der dauerhaften
Aufrechterhaltung einer
bestehenden Repression. Pc-G
Mutanten können den
Repressor nicht mehr binden,
es kommt zu keiner
Akkumulierung von Pc-G und
es kann in weiterer Folge
Transkription stattfinden,
wenn der Repressor verloren
geht.
66
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Modelle für die reprimierende Wirkung (gene silencing) durch Polycomb (Pc-G)
Proteine
Prozesse im Zellkern sind kompartimentiert (factories):
dynamische Interaktion mit dem
Nucleoplasma und Konzentration der
beteiligten Proteine.
Einfluss von DNA Schlaufen (loops) auf die Transkription
•
•
•
LCRs beeinflussen Transkription von einem oder
mehreren Genen durch direkte Interaktion
zwischen an LCR gebundenen proteinen und an
enhancer gebundenen Proteinen.
Interaktion der 3' und 5'Enden erklärt den Einfluss
von Terminantionsfaktoren auf die Initiation der
Transkription.
Interaktionen von boundary (insulator) Elementen
können die zwischenliegenden aktiven bereiche
von Heterochromatin isolieren.
67
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Interchromosomale Genregulation
In einigen Beispielen konnte eine durch
Differenzierungs-prozesse gesteuerte Interaktion
zwischen Genloci auf unterschiedlichen
Chromosomen beobachtet werden, die mit
veränderter Genexpression korreliert ist
(Erythrocyten, Lymphocytendifferenzierung).
02.05.2006
Genregulation durch DNA Methylierung
•
•
Die meisten Cytosinbasen innerhalb einer CpG Sequenz sind in Säugerzellen am C5-Atom
methyliert. Eine Ausnahme bilden die CpG islets, die man oft in den Promotoren von
housekeeping Genen findet.
Methylierung von DNA korreliert meist (nicht immer) mit transkriptionell inaktiver DNA.
DNA Methylierung findet sich sowohl in Pro- als
auch in Eukaryoten. In Prokaryoten dient die
Methylierung der DNA der Markierung der eigenen
DNA, nicht korrekt methylierte DNA wird durch
Restriktionsenzyme geschnitten.
Demgegenüber dient die Methylierung in
Eukaryoten der Genregulation.
ad 21.30 … CpG Sequenzen sind rot markiert.
Methyliertes Cytosin ist chemisch instabil, durch
Deaminierung entsteht aus einem Cytosin ein
Uracil. Uracil paart mit Adenin, eine nicht
reparierte Deaminierung führt damit eine Mutation
ein. CpG Sequenzen finden sich entgegen der
Statistik damit nur dort gehäuft im Genom, wo sie
einerseits essentiell sind oder andererseits nicht
methyliert vorliegen. Nicht methyliert liegen sie in
so genannten Housekeeping Genes vor, die laufend
transkribiert aber wenig reguliert werden.
ad 19.51 …
Die "de novo Methylase" Methyliert CpG
unabhängig von der DNA Replikation, ist im Zuge
der Embryogenese aktiv und inaktiviert im Zuge
der Entwicklung nicht mehr benötigte Gene.
Die "perpetiation Methylase" fügt im Zuge der DNA
Replikation eine Methylierung am neu
synthetisierten Strang ein, wenn der ursprüngliche
Strang eine Methylierung aufweist und erhält so
eine Inaktivierung aufrecht.
DNA Demethylasen entfernen Methylierungen z.B.
in Gameten, um für Embryogenese wichtige Gene
erneut zu aktivieren.
Bei der Inaktivierung von Genen durch
Methylierung der DNA handelt es sich um
epigenetische Genregulation.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
DNA Methylation and transcriptional repression
(1) Direct interference von transcription activation factor binding.
a) active Transcription [Bild]
b) Repression by inhibition of TF binding [Bild]
(2) specific transcriptional repressors
a) active Transcription
Biologische Funktion der DNA Methylierung
•
•
•
DNA Methylierung korreliert mit 'gene silencing' aber die Faktenlage (z.B. MeCPkos, DNAMethylaseko) spricht gegen eine direkte kausale Beziehung.
Dieselben Mauskos sprechen dafür, dass DNA Methylierung wichtig für das Stilllegen
fremder DNA ist (Retrotransposonen, Retroviren, Transgene). Z.B. führt die Abwesenheit
von DNA Methylierung zur Aktivierung endogener Retroviren.
DNA Methylierung ist positiv mit gene silencing von 'imprinted' loci. In einem Beispiel
INHIBIERT Methylierung die Expression der AIR ncRNA, die 'silencing der Gene des
'imprinted' Locus in cis bewirkt.
DNA Methylierung ist am Phaenomen des genomic imprinting beteiligt
Unterschiedliche imprinted loci unterscheiden sich
dadurch, dass entweder das paternale oder das
maternale Allel methyliert werden.
Bestimmte maternale und paternale Allele liegen in
unterschiedlicher Methylierung vor.
Es ist immer jeweils ein Allel methyliert und damit
inaktiv, um die Gendosis zu kontrollieren, da eine
Transkription von beiden Allelen negative
Auswirkungen z.B. auf die Embryogenese hätte.
Gameten enthalten nur den einfachen
Chromosomensatz, damit imprinting korrekt
weitergegeben wird, werden alle männlichen Allele
durch imprinting deaktiviert, während imprinting in
allen weiblichen Allelen entfernt wird. Dadurch ist
sichergestellt, dass in einem Embryo erneut ein
aktives und ein inaktives Allel vorliegen.
69
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Genomic Imprinting:
Methylierung der imprinting
control region des paternalen
Allels bestimmt die Bindung
des CTCF Proteins und damit
die Expression der Gene Igf2
und H19.
Das maternale Allel liegt nicht
methyliert vor, das
Isolatorprotein CTCF kann
binden. Dadurch wird
verhindert, dass die TFs an der Enhancersequenz auf das Gen Igf2 wirken. Gen Igf2 wird
nicht transkribiert, der Enhancer wirkt stattdessen auf das Gen H19, das transkribiert werden
kann.
Das paternale Allel liegt methyliert vor, dadurch steht einerseits der Promotor des H19 Gens
nicht für Transkription zur Verfügung, andererseits kann an der Isolatorsequenz das CTCF
Protein nicht binden, die TFs an der Enhancersequenz wirken auf Gen Igf2, das transkribiert
werden kann.
70
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Mechanismen zur Regulation der Transkriptionsfaktor Aktivität
Genexpression kann durch Umweltfaktoren reguliert werden, in diesem Fall spricht man von
Signaltransduktion. Die zugehörigen Transkriptionsfaktoren liegen nur dann in aktiver bzw.
inaktiver Form vor, wenn die entsprechende Umweltsituation vorherrscht.
Folgende molekularen Vorgänge können zur Aktivierung oder Deaktivierung von
Transkriptionsfaktoren führen:
• Phosphorylierung/Dephosphorylierung (Serin oder Tyrosin)
Die am häufigsten vorliegende Modifikation, findet sich auch oft an der AS Threonin.
• Proteolyse
Durch Spaltung eines Proteins wird seine Aktivität beeinflusst.
• Interaktion mit Partnerproteinen
Es ist sowohl Aktivitätssteigerung als auch Deaktivierung möglich.
• Binden intrazellulärer Liganden (z.B. Steroidhormone)
Regulation durch Wechsel des Dimerisierungspartneres am Beispiel des bHLH
Proteins Myo D
Fehlen der basic region im Id Protein bewirkt mangelnde Affinität zur DNA im
MyoD/Id Heterodimer
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Aktivierung der Transkriptionsfaktoren TCF (Elk1) und SRF durch
Wachstumsfaktoren und den MAPK-Signaltransduktionsweg
Serum (aus Rindern
hergestellt) war früher
beste Möglichkeit
Zellkulturen zum
Wachsen zu bringen,
da es viele
Wachstumsfaktoren
enthält.
Serum wird
hergestellt, indem man
Blut soweit erhitzt,
dass die enthaltenen Zellen gerinnen und dabei Wachstumsfaktoren freisetzen, anschließend
werden die Zellen durch Zentrifugation vom Serum getrennt.
Das Wachstum (Größe, Zellteilung) von Zellen wird durch Bindung von Wachstumsfaktoren
an unterschiedliche Rezeptoren an der Zelloberfläche reguliert.
Die unterschiedlichen Rezeptoren vermitteln die Phosphorylierung der MAPK (mitogen
activated protein kinase) im Zellinneren. MAPK phosphoryliert eine weitere Kinase (pp90rsk),
beide Kinasen wandern in den Nucleus, wenn sie phosphoryliert sind.
Im Kern phosphorylieren sie einen an SRE (Serum response element) gebundenen
Transkriptionsfaktorkomplex (TCF + SRF), wobei TCF von MAPK, SRF von pp90rsk
phosphoryliert wird.
Erst wenn dieser Komplex phosphoryliert ist, kann Transkription damit verbundener Gene
stattfinden.
Die drei Haupt-MAPK Signaltransduktionswege (Erk, Jnk, p38MAPK)
werden durch unterschiedliche Stimuli aktiviert
(Wachstums bzw. Stresssignale) und verursachen
die Phosphorylierung unterschiedlicher
Transkriptionsfaktoren.
Es sind drei vorherrschende Wege der MAPK
Signaltransduktion bekannt.
Wege 2 und 3 werden durch Stresssignale (UV,
Veränderung osmotische Milieu, etc) ausgelöst.
Weiters ist hier zu bemerken, dass es sich bei den
Signaltransduktionswegen um Kaskaden handelt.
Eine Kinase wird durch eine kleine GTPase (z.B.
Ras) aktiviert (MAPKKK z.B. Raf) und aktiviert eine
Vielzahl weiterer Kinasen (MAPKK z.B. MEK1), die
ihrerseits wiederum viele Kinasen aktiviert (MAPK
z.B. ERK … extracellular regulated kinase).
Durch die Kaskade erhält man auch bei niedriger
Konzentration extrazellulären Liganden bzw.
Rezeptoren oder G Proteinen an der Zellmembran
eine hohe Konzentration an aktiven TFs im
Nucleus.
72
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
•
•
•
Sonnbert
Wachstumsfaktorrezeptoren sind
Tyrosinkinasen.
Bindung des Wachstumsfaktors verursacht
Dimerisierung des Rezeptors.
Dimerisierte Rezeptoren phosphorylieren sich
gegenseitig und erhöhen somit ihre
enzymatische Aktivität.
Prinzipieller Aufbau eines
Wachstumsfaktorrezeptors:
Extrazelluläre Domäne zur Bindung des Wachstumsfaktors, transmembrane Domäne zur
Verankerung in der Zellmembran, cytosolische Domäne mit katalytischer Sequenz, die bei
Bindung des Wachstumsfaktors durch Konformationsänderung weitere Aktionen vermitteln
kann z.B. Phosphorylierung weiterer Proteine, im abgebildeten Beispiel kommt es bei
Ligandenbindung zunächst zu Dimerisierung und wechselseitiger Phosphorylierung, bevor die
eigentliche Aktivität beginnt.
Rezeptor-Phosphotyrosine sind Andockstellen für Signaltransduktionsproteine mit
SH2 Domänen
Proteine mit PTB- und SH2- Domänen erkennen
Proteine, wenn diese an bestimmten Tyrosinen
phosphoryliert sind und können dadurch
Interaktion vermitteln.
•
•
Aktivierte Wachstumsfaktorrezeptoren werden durch
Adapterproteine mit dem guanine nucleotide exchange factor
SOS verbunden.
Das Ras Protein bindet G-Nukleotide und besitzt GTPase
Aktivität. SOS sorgt für einen GDP-GTP Austausch.
Durch Bindung des EGF (Epidermal growth factor) an
Rezeptoren kommt es zur Bildung eines aktiven dimeren
Rezeptorkomplexes, das phosphorylierte Tyrosine aufweist.
Diese Tyr-P können durch Proteine mit SH2 Domänen
erkannt werden, in diesem Fall durch GRB2. GRB2 weist eine
weitere Domäne auf (SH3) über die es ein weiteres Protein
(SOS) bindet.
Über SOS kommt es zur Bindung an die membrangebundene
GTPase Ras.
Vor der Komplexbildung hat Ras GDP gebunden und ist in
diesem Zustand inaktiv. SOS dient als GEF (guanine
nucleotide exchange factor) und tauscht bei Bindung an Ras
dessen GDP mit GTP aus, wodurch Ras in die aktive Form
überführt wird.
73
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Regulation der Ras Aktivität durch guanine nucleotide exchange proteins (GEFs)
und GTPase activating proteins (GAPs)
GDP gebundenes Ras ist inaktiv, durch GEFs wird
GDP mit GTP vertauscht und Ras in die aktive Form
überführt.
In aktiver Form kann es GAPs binden und aktiviert
damit seinerseits GTPase Aktivität in den GAPs.
Ras wird durch Spaltung des GTP in GDP + Pi
inaktiviert.
Diese Spaltung kann erfolgen, wenn Ras GTP über
einen längeren Zeitraum gebunden hat und keinen
Interaktionspartner findet.
Hat aktives Ras hingegen ein GAP gebunden,
erhöht sich durch einen allosterischen Effekt die
GTPase Aktivität des Ras, wodurch es schneller in
die inaktive Form überführt wird.
Die MAPK Erk wird durch Phosphorylierung an sowohl Tyrosin als auch Serin durch
die dual-specificity kinase Mek (=MAPKK) aktiviert
Aktives Ras bindet das GAP Raf. Die GTPase Aktivität von
Ras wird erhöht, wenn GTP in GDP gespalten wird, wird
Ras in die inaktive und gleichzeitig Raf in die aktive Form
überführt.
Das aktive Raf aktiviert seinerseits das Protein MEK durch
Phosphorylierung. MEK ist selbst eine Kinase und aktiviert
nun die MAP Kinase durch Phosphorylierung an einem Tyr
und einem Ser.
Ein aktiviertes Raf kann viele MEK aktivieren, ein
aktiviertes MEK kann eine Vielzahl MAPK aktivieren, man
spricht in diesem Zusammenhang von einer
Signaltransduktionskaskade.
Weiters wird Raf als MAPKKK (MAPK Kinase Kinase) und
MEK als MAPKK (MAPK Kinase) bezeichnet, da Raf an der
dritten und MEK an der zweiten Stelle über der
eigentlichen MAP Kinase stehen.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors Elk1 durch MAPK verstärkt die
Interaktion mit dem Mediator Komplex
Kooperation von MAPK Signaltransduktionswegen:
-
Der JNK-Signaltransduktionsweg verursacht die
Phosphorylierung des c-Jun Proteins (bZip).
Der Erk-Signaltransduktionsweg stimuliert die Synthese
des c-Fos Proteins (bZip).
Durch Dimerisierung beider Proteine entsteht der
Transkriptionsfaktor AP-1
c-Jun und c-Fos sind Leucin Zipper Proteine. Sind beide durch
Phosphorylierung aktiviert, können sie Heterodimere bilden
und als TF dienen.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Genregulation durch cAMP
Als Beispiel für Signaltransduktion mittels der häufig
vorkommenden 7-transmembran Rezeptoren. Diese Art
Rezeptoren weisen sieben α-Helices auf, die dadurch mehrmals
die Zellmembran durchqueren. Die Loops zwischen den Helices
dienen extrazellulär der Bindung der Liganden während sie
intrazellulär mit Signaltransduktionsproteinen interagieren.
Eine Vielzahl an Botenstoffen des Immunsystems (Cytokine)
sowie viele endokrine Hormone (z.B. Glucagon oder Adrenalin) benutzen diese Rezeptoren.
Alle dieser Rezeptoren haben gemein, dass sie nach Ligandenbindung über ein ebenfalls
membrangebundenes G Protein das membrangebundene Enzym Adenylatcyclase aktivieren,
das im aktiven Zustand cAMP erzeugt.
Phosphorylierung des bZip Transkriptionsfaktors CREB durch die cAMP-stimulierte
Serinkinase PKA
cAMP aktiviert unter anderem
eine Proteinkinase, die in den
Nucleus wandert und dort den
DNA gebundenen TF CREB
phosphoryliert. CREB liegt
mittels Leucine Zipper an die
DNA gebunden als Dimer vor
und wird an Serine
phosphoryliert.
CREB kann im
phosphorylierten Zustand mit
weiteren Faktoren
interagieren (CBP dient als
Histonacetylase) und dadurch
Transkription einleiten.
CRE ... cAMP response element CREB.
Seven transmembrane Rezeptoren stimulieren cAMP Synthese durch trimere GProteine und Adenylatcyclase
Struktur der Adenylatcyclase
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Mechanismus der Adenylatcyclase Aktivierung durch trimere G-Proteine
Trimere G-Proteine
bestehen aus α, β und
γ-UE. Es existieren
zwei Typen
(stimulatorisch und
inhibitorische GProteine; Acetylase
wirkt stimulatorisch).
Das G Protein der
Adenylatcyclase hat im
inaktiven Zustand
GDP, im aktiven GTP
gebunden. Das G
Protein weist GTPase
Aktivität auf, nach
einer gewissen Zeit
wird gebundenes GTP
so in GDP + Pi
gespalten und
inaktiviert sich dadurch
selbst.
Mittels des β γ Dimers können seven transmembrane Rezeptoren auch den ERK
Signaltransduktionsweg aktivieren.
Bestimmte 7 transmembran Rezeptoren aktivieren
über G Proteine eine MEK Kinase, die der
Aktivierung von MEK dient. Diese Rezeptoren
greifen somit auf den MAPK Pathway zurück, wobei
sie eine Kaskade der MAPK Phosphorylierung
umgehen (Raf).
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Viele Cytokinrezeptoren (z.B. für Interferone) verursachen Jak-Stat
Signaltransduktion
•
•
Stats sind die einzigen
Transkriptionsfaktoren mit SH2
Domäne.
Erst nach Dimerisierung können
Stats in den Zellkern
translozieren.
Cytokine regulieren Zellen des
Immunsystems.
JAK (Januskinase) ... Familie aus vier
unterschiedlichen Tyrosinkinasen.
JAKs sind an Cytokinrezeptoren
gebunden und phosphorylieren bei
Cytokinbindung Tyrosine am
cytoplasmatischen Teil der
Rezeptoren.
Der TF Stat (Signal transducer and
activator of transcription) weist eine
SH2 Domäne auf, über die
phosphorylierte Cytokinrezeptoren
gebunden und durch JAK selbst phosphoryliert werden können.
Zwei phosphorylierte Stats können ein Dimer bilden, wandern in den Nucleus und dienen in
dieser Form als Aktivator für ein Response element.
Diese Antwort funktioniert sehr schnell, da aktivierte Stats sofort in den Nucleus wandern.
Dieser Signaltransduktionsweg dient meist dem Immunsystem als Antwort auf eine
Infektion.
Stat SH2 Domänen dienen zum Andocken an Rezeptoren und zur Dimerisierung
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Der TGF-beta (SMAD) Signaltransduktionsweg
•
Cytokine der TGF-beta Familie besitzen
Rezeptoren mit Serinkinase-Aktivität.
Manche SMADs werden direkt durch den
Rezeptor phosphoryliert.
• Um in den Kern zu gelangen müssen sie mit
SMAD4 (=common SMAD) dimerisieren.
• Zur Genaktivierung muß das SMAD Dimer
mit weiteren Transkriptionsfaktoren
interagieren.
TGF β ist ein vielfältiges Cytokin mit mehreren
Funktionen z.B. Blutgerinnung.
Cytokine der TGF ß Familie binden an den Rezeptor
Typ II und aktivieren dadurch dessen SerinThreonin-Kinaseaktivität. Die Kinase phosphoryliert
den Rezeptor Typ I, wodurch dessen
Kinaseaktivität (ebenfalls Ser-Thr) aktiviert wird.
Der Rezeptor Typ I kann die TFs SMAD3 bzw
SMAD4 phosphorylieren.
Sind diese phosphoryliert, können sie jeweils mit
SMAD4 ein Dimer binden, das Dimer kann
in den Nucleus wandern und dient dort der
Aktivierung bestimmter Gene.
Der TGF-beta (SMAD) Signaltransduktionsweg II
Das Interaktom des TGF-β
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Transkriptionsfaktor NFκB wird durch Serin Phosphorylierung und Proteolyse des
Inhibitors I-κB aktiviert.
NFκB ist an einer Vielzahl
immunologischer Prozesse beteiligt.
In nicht stimulierten Immunzellen
liegt NFκB mittels IκB inaktiviert vor.
Durch Stress (UV-Bestrahlung,
osmotische Fehlverteilung), Infektion
oder Cytokine wird eine Kinase
aktiviert, die IκB phosphoryliert.
Durch die Phosphorylierung wird IκB
für den Abbau markiert, durch den
Abbau wird NFκB freigesetzt.
Signaltransduktion durch Wnt Liganden
Wnt Signaltransduktion ist sowohl
entwicklungsbiologisch als auch im
adulten Stadium von Bedeutung.
Als Signalprotein dient ß Catenin. In
der Zelle findet sich ohne aktivierten
Pathway der GSK Proteinkomplex
(rot, Glykogen Synthase Kinase), der
ß Catenin durch Ser-Thr
Phosphorylierung für den Abbau
markiert.
Im Wnt Pathway dient Wnt als
extrazellulärer Ligand, der vom
"frizzled" Rezeptor gebunden wird.
Durch die Bindung von wnt an den
Rezeptor kommt es intrazellulär zur
Aktivierung des Proteins
"Dishevelled", das in der aktiven
Form den GSK Komplex inhibiert. Durch diese Inhibierung wird ß Catenin nicht mehr zum
Abbau markiert und kann in den Nucleus wandern. Im Nucleus findet sich an Wnt-Pathway
abhängigen Genen gebunden ein Proteinkomplex, der eine Histon-Deacetylase ("Groucho")
beinhaltet und dadurch die entsprechenden Gene inaktiviert. Wandert ß Catenin in den
Nucleus, bindet es an LEF/TCF (T cell factor) des Inhibitorkomplexes, wodurch wiederum die
Histon-Deacetylase aus dem Komplex entlassen wird und der verbleibende Komplex als
Aktivator dient.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Notch Signaltransduktion
Notch ist ein Rezeptor, der in entwicklungsbiologischen
Prozessen eine Rolle spielt.
Notch ist selbst an die Zellmembran gebunden und interagiert
mit Liganden die sich ihrerseits in der Zellmembran befinden. Bei
einer Interaktion des Rezeptors mit einem Liganden wird
zunächst der extrazelluläre und anschließend der intrazelluläre
Teil des Notch Rezeptors abgespalten.
Das Peptid im Cytosol wandert in den Nucleus, wo es mit
weiteren Proteinen einen Komplex bildet. Dieser Komplex ist in
der Lage an bestimmte DNA Sequenzen zu binden und
Transkription zu ermöglichen.
Wichtig in diesem Zusammenhang ist, dass durch Notch
aktivierte Gene durch einen Proteinkomplex gebunden sind, der
eine Transkription der Gene inhibiert. Erst wenn Notch an diesen
Komplex bindet, wird die Repressorfunktion dieser Proteine in
eine Aktivatorfunktion umgewandelt.
Aktivierung des SREBP durch Proteolyse
•
•
•
SREBP reguliert Gene, die zur Aufnahme und
Synthese von Cholesterol benötigt werden.
Der Sterolsensor SCAP reguliert die Proteolyse
von SREBP.
Proteolyse sorgt für die Freisetzung des aktiven
Transkriptionsfaktors aus der Membran eines
Vesikels des Golgi-Apparats.
SRE ... Sterole response element, SREBP … SRE
Binding Protein.
SREBP wird inaktiv in der Membran des ER erzeugt
und bleibt hier gebunden.
In der Membran des ER finden sich Rezeptoren für
Sterole (SCAP), die eine ebenfalls ER Membran
gebundene Protease inaktivieren.
Weist die Zelle eine niedrige Sterolkonzentration
auf, wird die Protease durch SCAP nicht mehr
inaktiviert und schneidet SREBP an einer
bestimmten Stelle.
Durch diese Proteolyse wird eine weitere Schnittstelle an SREBP zugänglich, durch eine
zweite Protease wird ein ein Teil des SREBP im Cytosol freigesetzt. Dieser Teil kann in den
Nucleus wandern und dort als TF zur Aktivierung von Genen mit SRE dienen.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
-
Sonnbert
SREBP ist ein bHLH Protein.
SCAP inhibiert seine Proteolyse in Anwesenheit von
Sterolen.
In Abwesenheit von Cholesterol erfolgt Proteolyse
durch zwei aufeinander folgende Proteasen.
09.05.2006
Grundstruktur der Steroidhormone
Die Grundsstruktur aller Steroidhormone entspricht dem
Cholesterin.
Zur Familie der Steroidhormone gehören unter anderem
Cortison, Östrogen, Progesteron und Testosteron.
Beispiele für Liganden intrazellulärer Rezeptoren aus der Familie der
Steroidrezeptoren
Steroidrezeptoren können auch Liganden binden, deren
Grundstruktur nicht der von Cholesterin entsprechen, so z.B.
Retinsäure (aus Vitamin A) und Thyroxin (Schilddrüsenhormon).
Die Gemeinsamkeit dieser Liganden liegt in ihrer lipophilen Natur
d.h. sie sind in der Lage, ohne Rezeptor durch die Zellmembran
zu wandern und intrazelluläre Rezeptoren binden.
Cortisol (ein Glucocorticoid) bindet an ligandbindende Domäne (LBD) des
Glucocorticoid-Rezeptors und bewirkt die Dissoziation von Hsp90
Hsp90 verhindert, dass der Komplex in den
Nucleus wandert. Durch seine lipohilen
Eigenschaften kann Cortisol in die Zelle
eindringen, die Bindung an den Komplex
verdrängt Hsp90 und er kann in Kern
wandert.
82
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Steroidhormon-Rezeptoren
•
•
Können im Cytoplasma sein und dort ihren Liganden binden (Beispiel: Glucocorticoidrezeptor, GR).
Können im Zellkern und an DNA gebunden vorliegen und dort ihren Liganden binden
(Beispiele: RXR-Heterodimere wie TR/RXR, RAR/RXR, VDR/RXR).
Grundstruktur der Steroidrezeptor Familie
Gelb … strukturell
verwandte, DNA
bindende Domäne und
C-terminal die
Liganden-bindende
Domäne.
Die transaktivierende
Domäne am Nterminalen Ende ist in
ihrer Länge variabel.
Die DNA Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren der SteroidhormonRezeptorfamilie
•
können entweder inverted repeats (Palindrome) oder direct
repeats bilden.
Es finden sich zwei verschiedene Arten Steroidhormonrezeptoren:
• inverted repeats binden homodimere Rezeptoren (z.B. GR,
ER).
Die erste Art bindet als Homodimer palindromische
Sequenzen auf der DNA d.h. sie binden DNA von beiden
Seiten her. Beispiele sind Glucocorticoidrezeptor und
Östrogenrezeptor.
• direct repeats binden Heterodimere eines Rezeptors (z.B. TR)
mit einem weiteren Mitglied der Rezeptorfamilie, RXR. Dabei
entscheidet die Anzahl an Basenpaaren zwischen den repeats
über die Spezifität.
Die zweite Art bindet als Heterodimer zwei hintereinander liegende DNA Sequenzen. (c), (d),
und (e) unterscheiden sich nur durch den Nucleotidabstand zwischen den beiden
Bindungsequenzen. Beispiele sind der Vitamin D-, Thyroxin- oder der Reinsäure-Rezeptor,
die jeweils gemeinsam mit RXR das Heterodimer bilden.
Alle Rezeptoren dieser Art dienen selbst als TF.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Die Bindung des Liganden Retinsäure (RA)
and den Rezeptor (RAR; gleiches gilt für
den T3 Rezeptor) bewirkt die Dissoziation
eines Korepressor /HDAc Komplexes und
die Assoziation eines Koaktivator/HAT
Komplex.
Ad (A) .... in Abwesenheit des
Hormons bindet das Heterodimer
einen Komplex mit Sin3. Sin3
deacetyliert Histone und dient damit
ohne Hormon als Repressor der
Transkription.
Ad (B) ... Liegt Ligand an den
Rezeptor gebunden vor, so ist das
Heterodimer in der Lage einen HAT
Komplex zu rekrutieren, der Histone
acetyliert und dadurch DNA für
Transkription zugänglich macht.
Als abschließendes Beispiel Transkriptionskontrolle über
Konzentrationsverteilung:
Die Proteine MyoD und E12 weisen ein Helix-Loop-Helix Motiv auf, über das sie in der Lage
sind, miteinander ein Heterodimer zu bilden.
Sowohl MyoD als auch E12 besitzen weiters eine Region für DNA Bindung. Die Bindung an
DNA ist allerdings nur dann möglich, wenn die beiden Proteine als Heterodimer vorliegen,
eine einzelne DNA Bindungsdomäne ist für eine Bindung nicht ausreichend.
MyoD hat nun die Fähigkeit, mit einem weiteren Protein, Id, ebenfalls ein Heterodimer zu
bilden. Nachem Id aber keine Domäne für DNA Bindung aufweist, kann dieses Heterodimer
nicht an DNA binden und folglich auch keine Transkription einleiten.
Je nachdem in welcher Konzentration also E12 bzw. Id vorliegen, wird das aktive oder das
inaktive Heterodimer mit MyoD vorliegen und Transkription stattfinden oder nicht.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Bläsi Foliensatz 1
Teil Bläsi: Translationskontrolle
Genexpression II: Post-transcriptional Regulation
Lit: Lewin / Genes VII - indicated Literature
Content:
Prokaryotes
Eukaryotes
Components of the translation machinery
30S/50S ribosomes
tRNA
Genetic code
Translation initiation
Elongation
Termination
mRNA stability
protein transport
mRNA processing
40S/60S ribosomes
tRNAi
Translation initiation
Elongation
Termination
mRNA stability
protein transport
Wir erinnern uns: in Prokaryoten laufen
Transkription und Translation gekoppelt ab,
während sie bei Eukaryoten getrennt durchgeführt
werden.
Cistron … Gen. Unter
polycistronischer DNA
versteht man mehrere
hintereinander liegende Gene,
die gemeinsam auf eine
mRNA transkribiert und erst
durch die den einzelnen
Genen zugehörigen ORFs
(open reading frames) in die
eigenständigen Genprodukte
translatiert werden.
Funktionell zusammengehörige Gene sind bei Prokaryoten in solchen so genannten Operons
zusammengefasst.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
In Eukaryoten findet
Transkription und
Prozessierung von mRNA im
Kern statt. Die RNAs, die
zunächst transkribiert
werden, können nicht direkt
in ein Protein translatiert
werden. Sie müssen
prozessiert werden, bevor sie
ins Cytoplasma transportiert
werden können, wo die
Translation stattfindet.
Der Exportschritt der mRNA
vom Kern ins Cytoplasma ist
ein wichtiger regulatorischer
Schritt.
Alle Komponenten der Transkriptionsmaschinerie müssen in den Kern transportiert werden.
Gelangen bestimmte Transkriptionsfaktoren nicht hinein, können mit ihnen assoziierte Gene
nicht transkribiert werden.
Translation Systems
Prokaryoten weisen im
Vergleich mit Eukyaroten
wenige Proteine bei der
Initiation, aber mehr Proteine
bei der Termination auf.
Der eigentliche Prozess der
Translation ist in Pro- und
Eukaryoten relativ ähnlich,
der Prozess ist hoch
konserviert. Sie unterscheiden
sich vor allem durch
Regulationsmechanismen,
Eukaryoten weisen hier mehr
Faktoren auf.
Ribosomal recruitment to mRNA in Pro-and Eukaryotes
rRNA/mRNA
protein/protein
AGGAGGU ... Shine
Dalgarnosequenz, das auf diese
Sequenz folgende AUG dient als
Startcodon für die Translation.
(Reminder Codon … drei aufeinander
folgende Nucleotide, die für eine
Aminosäure oder ein Start bzw.
Stopsignal codieren).
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Translation in Prokaryotes
Components
Initiation
Elongation
Termination
mRNA
tRNA
ribosomes
IF 1-3
Regulatory mechanisms
EF: EfTu, EFTs, EFG
RF: RF 1-3
RRF
Ein kurzer Überblick über die Translation in Prokaryoten:
Transkripte in Prokaryoten sind in der Regel polycistronisch, d.h. sie enthalten mehrere
Genen (= Cistrons). Die einzelnen Gene werden mittels Ribosomen in Protein translatiert.
Ribosomen erkennen Gene an bestimmten, üblicherweise zu Beginn liegenden Sequenzen.
Anm.: Im Gegensatz dazu wird bei vielen Viren die virale mRNA in ein Polyprotein
umgesetzt, das anschließend so prozessiert wird, dass verschiedene funktionelle
Proteineinheiten entstehen.
Die Translation dient der Umsetzung des Transkriptes in Protein, man kann drei wichtige
Stadien unterscheiden: Initation (geschwindigkeitsbestimmender Schritt), Elongation,
Termination.
• Bei der Initiation muss das Ribosom die Stelle finden, an der die eigentliche
Proteinsequenz beginnt (AUG). Nachdem AUG nicht nur als Startcodon dient, sondern
auch für die AS Methionin codiert, kann es mehrfach in einer mRNA vorkommen. Es muss
daher in der Umgebung des AUG als Startcodon Signale in der Umgebung geben, durch
die das Ribosom das Startcodon erkennen kann. In diesem Zusammenhang sind weiters
Phosphorylierungsvorgänge nötig, damit das Ribosom an das Startcodon binden kann.
• Während der Elongation werden die Codons der mRNA durch das Ribosom mittels tRNA in
die zugehörigen AS umgesetzt und die aufeinander folgenden AS zu einem Polypeptid
verknüpft. Auf dieser Ebene finden sich nur wenige Regulationsvorgänge.
• Zur Termination kommt es, wenn das Ribosom zu einem Stopcodon gelangt, die nicht in
AS übersetzt werden, da für sie keine tRNAs exisiteren. Im Zuge der Termination werden
die UE des Ribosoms so zerlegt, dass sie im Anschluss erneut für Translation zur
Verfügung stehen.
transfer RNA is the adapter
Initiator and elongator methionineaccepting tRNAs.
Cloverleaf representation of methionineaccepting tRNAs: (A) initiator tRNA and (B)
elongator tRNA. The regions important for
initiator tRNA identity are highlighted.
Jede tRNA bindet über das Anticodon das
passend komplementäre Codon auf einer
mRNA und stellt damit die Verbindung
zwischen Codon und zugehöriger AS her.
tRNA wird über das 3' Ende kovalent mit
der passenden AS verbunden, eine so
beladene tRNA wird als Amino-Acyl-tRNA
bezeichnet.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Chromosomal location of tRNA genes in E.coli
tRNAs werden in der Regel gemeinsam mit
anderen Teilen der Translationsmaschinerie
transkribiert, sie liegen meist in der Mitte
oder am Ende dieser DNA Sequenzen.
Für die meisten AS gibt es mehrere
unterschiedliche tRNAs (haben voneinander
verschiedene Anticodons), die für sie
kodieren.
Die tRNA-Codierung in
Bakterien ist weiters nicht
einheitlich:
Sie können einzeln im
Chromosom codiert sein oder
wie im rrnB Operon (E.coli)
zusammen mit der 16S rRNA
(Teil der 30S UE) oder der 23S rRNA (Teil der 50S UE) transkribiert und anschließend
prozessiert werden.
Beim rrnB Operon liegt eine tRNA (2Glu) zwischen der 16S und der 23S RNA, es wird somit
eine tRNA gemeinsam mit zwei rRNAs transkribiert.
Auf dem E.coli Chromosom finden sich insgesamt sieben vergleichbarer Operons, in jedem
dieser Operons liegen einige der tRNAs.
tRNA processing
[red arrow] RNaseP determines 5'-end.
[green arrow] RNaseD determines 3'-end, digests until
CCA end is reached.
In E.coli dienen die RNasen P und D der tRNA Prozessierung. RNAse P schneidet das 5' Ende,
RNase D das 3' der tRNAs aus dem Gesamttranskript frei.
tRNAs werden in Pro- und Eukaryoten ähnlich den rRNAs als große Vorläufer-RNAs
synthetisiert.
Diese Vorläufer-RNA werden anscheinend nach der Ausbildung ihrer Kleeblattstruktur am 5'
Ende durch RNase P und am 3' Ende durch RNase D geschnitten.
in
•
•
•
Prokaryoten:
tRNAs werden oft an Nucleotiden modifiziert.
tRNAs sind oft am 2' OH methyliert.
alle tRNAs weisen am 3' Ende des Akzeptor-Armes eine ACC-Sequenz auf, über die zwei
Arten unterschieden werden:
o e, die ACC Sequenz wird durch das Gen der tRNA codiert.
o l, die ACC Sequenz wird nachträglich durch Nucleotidyl-Transferase angehängt.
88
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
in Eukaryoten:
tRNA weisen Introns auf, es ist splicing nötig, das sich vom normalen prä-mRNA splicing
unterscheidet. Das Splicing ist ATP abhängig, eine Nuclease schneidet Introns heraus. Die
freien Enden der beiden Exons werden durch eine Ligase verknüpft.
tRNA charging
Das 3' Ende der tRNA wird kovalent an die
Carboxylgruppe der zugehörige AS gebunden.
Die tRNA wird mit Hilfe von Enzymen, so genannten
Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, mit der passenden AS
beladen; für jede tRNA existiert ein korrelierendes Enzym,
das nur die passende AS verarbeitet.
Die Synthetase erkennt die zugehörige tRNA über das
Anticodon bzw. weiteren eindeutigen Nucleotidsequenzen
und verknüpft deren 3' Ende kovalent mit der
Carboxylgruppe der passenden AS.
Die bereits an die tRNA gebundenen AS können
nachträglich verändert werden, nachdem sich das
Anticodon der tRNA dabei natürlich nicht ändert
wird eine fehlerhafte AS eingebaut.
89
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Glutaminyl-tRNA-synthetase-tRNA-complex
Green Arrow … Identity element for
tRNAGlu.
ad 2. Bild … eingekastelte Stellen
sind Identifikationsstellen, die von
Enzymen erkannt werden.
Der Glutaminyl-tRNA-SynthetaseKomplex ist einer der ersten
Komplexe, die röntgenstrukturanalytisch erfasst wurden.
tRNA synthetases
tRNA Synthetasen beladen tRNAs mit AS. Sie
bestehen aus 4 Domänen, die jeweils
unterschiedliche Funktionen wahrnehmen.
Class I und Class II Synthtasen sind keine
Homologe, sie unterscheiden sich beträchtlich.
Funktionelle Abschnitte der Synthetase:
- tRNA Bindungsdomäne (tRNA Akzeptorhelix)
- katalytische Domäne für ATP Bindung
- AS Bindungsstelle
Class I and Class II Aminoacyl-tRNA synthetases
90
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Synthetasen liegen zwar meist als Monomere oder
Homodimere vor, es sind aber auch Heterodimere und
Heterotetramere bekannt.
Man unterscheidet zwei Synthetase Klassen: Klasse I und
Klasse II Synthetasen unterscheiden sich dadurch, auf
welcher Seite die tRNA gebunden wird.
Klasse I Synthetasen
• liegen meist als Monomere vor, kommen aber auch als
Homodimere vor.
• kontaktieren tRNA über die kleine Furche des
Akzeptorarms und am Anticodon, die jeweils in das
Protein hineinragen.
Klasse II Synthetasen
• liegen vorwiegend als Homodimere vor, manche auch
als Heterodimere.
• kontaktieren tRNA über die große Furche des
Akzeptorarms und am Anticodon, die jeweils in das
Protein hineinragen.
Steps during tRNA charging
Die Synthetase enthält Stellen, die eine bestimmte AS
sowie die über das Anticodon erkannte tRNA binden.
Die Synthetase aktiviert die AS durch Bindung mit ATP, es
entsteht ein AS-AMP.
Erst jetzt kann ein dirigierter nukleophiler Angriff des 3'
OH der tRNA auf die an das AMP gebundene
Carboxylgruppe stattfinden und die AS durch Freisetzung
von AMP kovalent an die tRNA gebunden werden.
Die Synthetase ist in der Lage Fehler zu erkennen und die
Bindung zwischen AS und tRNA zu lösen.
Beladung einer tRNA:
• Bildung von Aminoacyl-AMP
• Veresterung der AS mit AMP
• Bindung der tRNA an Aminoacyl-AMP
• Veresterung der AS mit dem 3' Ende der tRNA
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Kinetic Proofreading
Kinetic proofreading … Regulation über die Geschwindigkeit, mit
der die Reaktion abläuft.
"linker Weg" … die Synthetase weist Affinität für eine bestimmte
("ihre") tRNA auf. Die Assoziierung und Komplexbildung (tRNA
mit Synthetase) erfolgt schnell, die Dissoziierung langsam.
Durch Komplexbildung kommt es zu einer
Konformationsänderung der Synthetase, die gebundene tRNA
kann ebenfalls schnell mit einer AS beladen werden.
"rechter Weg" … Synthetase hat eine schlechtere Affinität zu
anderen tRNAs, die Bindung der tRNA ist schwach und führt zu
keiner Konformationsänderung. Dadurch kommt es zu einer
langsamen Bindung der AS an die tRNA, es besteht die Chance,
dass die tRNA vor einer Bindung mit der AS den Komplex
verlässt.
Das Proofreading der Aminoacyl-tRNA-Synthetasen ist
ausgezeichnet: Die Fehlerrate liegt bei nur 1:60000.
Dafür gibt es die oben genannten Gründe:
• nicht mit dem Enzym assoziierende tRNAs dissoziieren nach
anfänglicher Bindung schnell wieder ab, da die Bindung zu
unspezifisch ist. Die mit dem Enzym assoziierte tRNA bindet
demgegenüber stark und dissoziiert nur schwer wieder ab.
• weiters führt die Bindung der assoziierten tRNA an "sein"
Enzym zu einer Konformationsänderung desselben, diese
Änderung leitet die Aminoacylierung ein.
Chemical Proofreading
Kommt es zu einer fehlerhaften Bindung einer AS
an eine tRNA, kann das durch die Konformation
der Synthetase erkannt und die Bindung
hydrolysiert werden, zur Fehlererkennung gibt es
mehrere Checkpoints.
Die tRNA mit passender AS hat im Komplex eine
höhere Affinität, es passiert eher selten, dass eine
falsche AS an die tRNA angehängt wird.
Kommt das trotzdem vor, zerfällt die falsch
gekoppelte tRNA schneller als eine korrekte.
Warum ist trotzdem nicht schlimm, falls eine
inkorrekte AS eingebaut wird?
• es gibt viele Proteine eines Transkripts
• es gibt nur wenige AS in aktiven Zentren, die
Wahrscheinlichkeit das dort eine fehlerhaft
beladene tRNA verwendet wird ist gering.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Nonsense suppression
Die ersten beiden Nucleotide eines Codons einer AS sind
in der Regel konserviert.
Gene können nur unter ganz speziellen Bedingungen
exprimiert werden.
Bei Nonsense Mutation zu einem Stopcodon wird die
Translation vorzeitig abgebrochen, das Protein wird nicht
vollständig erzeugt.
Unter Nonsense Supression versteht man ebenfalls
mutierte tRNAs, die per Anticodon ein Stopcodon
erkennen, aber mit einer AS beladen sind. Wird diese
tRNA eingebaut, kommt es zu keinem Stop der
Translation. Allerdings ist es höchst wahrscheinlich, dass
dadurch an der mutierten Stelle eine fehlerhafte AS
eingebaut wird. Weiters ist es möglich, dass das
eigentliche Stopcodon des Gens durch die mutierte tRNA
überlesen und die Translation des Gens nicht korrekt
abgebrochen wird.
Suppression:
Findet eine Mutation in einer codierenden Sequenz statt,
kann ein normales Triplett in ein Nonsense codon
verändert werden (z.B. von einer AS in ein Stopcodon). In
einem normalen Bakterienstamm kann diese mRNA nicht
mehr korrekt translatiert werden (das Genprodukt wird zu kurz).
Einige Bakterienstämme weisen eine Mutation im Anticodon bestimmter tRNAs auf, diese
tRNAs codieren durch die Mutation für das Stopcodon, die Nonsense Mutation kann
translatiert werden, das Genprodukt wird erzeugt, auch wenn eine AS fehlerhaft ist.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Ribosomes
Ribosomen bestehen
im Vergleich aus mehr
RNA als Protein, es ist
allein die RNA für die
katalytische Funktion
verantwortlich. Die
Proteine in Ribosomen
haben keine
enzymatische Funktion
sondern tragen zur
Genauigkeit bei.
Ribosomen bestehen
aus einer kleinen und
einer großen
Untereinheit und
finden sich im
Cytoplasma einer
Zelle.
Die große Untereinheit
dient der Verknüpfung
der AS mit der
Polypeptidkette.
Die kleine Untereinheit dient der Führung der mRNA.
Prokaryoten: 70S bestehend aus
50S (5S + 23S rRNA) + 30S (16S rRNA) Untereinheiten.
Eukaryoten: 80S bestehend aus
50S (5S + 5,8S + 28S rRNA) + 40S (18S rRNA) Untereinheiten.
Ribosomen:
Das eukaryotische Ribosom ist größer als das prokaryotische und weist weniger RNA Anteil
(etwa 60%) auf als das prokaryotische, es wurden mehr Funktionen von Proteinen
übernommen.
Ribosomen weisen eine A- eine P- und eine E-Site auf. An der A-Site docken neue, beladene
tRNAs an, an der P-Site befindet sich die tRNA, welche die Polypeptidkette gebunden hat,
von der E-Site aus verlässt die nunmehr unbeladene tRNA das Ribosom.
Crystal Structure of the ribosome at 5.5Å resolution
Kristallstrukturen sind
für die Entwicklung
massgeschneiderter
Antibiotika von
Bedeutung.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Structural mappingof 16S rRNA by chemical probing
Die Strukturen der rRNA von
Prokaryoten und Eukaryoten
sind stark vergleichbar. Viele
Teile sind hoch konserviert,
nur einzelsträngige Bereiche
der rRNA können im
Gegensatz zu Loops oder Helices katalytisch sein.
Experiment: Strukturelle Kartierung der 16S tRNA durch Chemical probing.
Bestimmte Reagenzien modifizieren eine bestimmte Base, wenn sie nicht gepaart vorliegt,
z.B. methyliert Kethoxal Guanin, wenn es Einzelsträngig vorliegt:
• Kethoxal modifiziert G
• DMS modifiziert A
• CMTC modifiziert U
- Ein Extrakt der Ribosomen enthält, wird mit einer der angeführten Reagenzien versetzt,
dadurch werden alle Basen der Ribosomen modifiziert, die einzelsträngig vorliegen. Wird
beispielsweise DMS zugesetzt, werden alle freien A modifiziert.
- Der Extrakt wird von Proteinen gereinigt und die rRNA denaturiert.
- Ist die RNA Sequenz des zu untersuchenden Ribosoms bekannt, werden Primer erzeugt, die
an mehreren unterschiedlichen Stellen der rRNA binden. Es werden radioaktiv markierte
Oligonucleotide sowie reverse Transkriptase (RT) hinzugefügt, die an den Primern beginnend
zur rRNA komplementäre DNA erzeugt.
An den modifizierten Basen, im Bsp. A durch DMS, wird die RT die Synthese abgebrochen, es
entstehen so unterschiedlich lange DNA Sequenzen.
- Die rRNA wird abgebaut, die DNA wird mittels Southern Blot über ein Gel analysiert. Die
unterschiedlich langen Stücke der erhaltenen DNA kann ermittelt werden, welche Teile der
rRNA doppelsträngig vorliegen, da diese im Gegensatz zu den einzelsträngigen Bereichen
vom Primer aus immer vollständig vorliegen. Mittels dieser Informationen kann eine Karte
der gepaarten und ungepaarten Regionen der rRNA erstellt werden.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
23S rRNA
Binding of antibiotics to the 30S subunit
50% der Energie in der Zelle wird für die ribosomale Maschinerie aufgewendet.
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Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
… Für Translation benötigte Komponenten.
Ein paar lustige Zahlen:
Pro E.coli Zelle findet man:
• 19.000 Ribosomen
• 200.000 tRNAs – jeweils 3000 einer Art
• 1500 mRNAs – jeweils 2-3 einer Art
Auf jede mRNA kommen somit etwa 12
Ribosomen. Daraus ergibt sich, dass eine mRNA
nicht einmal sondern vielfach translatiert wird.
Nachdem die Erzeugung dieses Apparats
energieaufwenig ist und Bakterien in der Regel
auch die AS selbst herstellen (autotroph), muss die
Synthese entsprechend reguliert sein, wenn dem
Bakterium zu einem Zeitpunkt keine ausreichenden
Energiequellen zur Verfügung stehen.
Diese Regulation ist sowohl transkriptionell als auch translational realisiert.
Adjusting ribosomes and tRNA to the physiological needs
The guanosine tetraphosphate
cycle
relA: ppGpp Synthetase I
spoT: ppGpp Synthetase II
3' Pyrophospohydrolase
gpp: Phosphohydrolase
Die Produktion von Ribosomen und tRNA wird durch den Guanosintetraphosphatzyklus
gesteuert.
Ist eine AS und damit eine tRNA nicht in ausreichender Konzentration vorhanden, stoppt das
Ribosom während der Translation ("iceing reaction"?).
Mit dem Ribosom ist ein spezieller Faktor, relA, assoziiert, das pppGpp
(Guanosinpentaphosphat) aus GTP erzeugt, wenn das Ribosom stoppt. pppGpp wird in
weiterer Folge zu ppGpp (Guanosintetraphosphat) umgewandelt.
Ein weiteres Enzym, Guanosintetraphosphatase 2 erzeugt bei niedrigem Kohlenstoffspiegel
(vorliegendem Zucker) ebenfalls ppGpp.
ppGpp wandert in den Nucleus und inaktiviert Gene die mit der Transkription von rRNA, tRNA
sowie der Synthese von AS assoziiert sind; im Beispiel den P1 Promotor des rrnB Operons.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Translational autoregulation of ribosomal protein genes
S7 ist ein ribosomales Protein,
dess Repressoren
autoreguliert sind.
Ist ausreichend rRNA
vorhanden, assoziiert S7 mit
einer Sekundärstruktur der
16S rRNA.
Ist die S7 Konzentration
höher als die der 16S rRNA,
bindet das freie S7 an die
eigene mRNA an einer der
16S rRNA ähnlichen
Sekundärstruktur und
inhibiert so die eigene
Translation.
Dabei ist zu beachten, dass S7 eine
höhere Affinität zur 16S rRNA als zur
eigenen mRNA aufweist, dadurch
wird S7 immer an 16S rRNA
gebunden sein, wenn sie in
ausreichenden Mengen vorliegt.
Translation initiation in Prokaryotes:
requires formylated fMet-tRNAfMet
Bei Prokaryoten gilt:
AUG als Start-Codon, selten auch GUG oder UUG.
Für AUG werden zwei unterschiedliche tRNAs
erzeugt: eine für das normale AUG-Met sowie eine
tRNA mit modifiziertem Met für das ein AUG als
Initiationscodon.
Diese Initiatior-tRNA (N-formyl-met-tRNA) ist am
Akzeptorende im Gegensatz zu anderen tRNAs
nicht gepaart. Am Anticodon weist sie drei GC
Paare auf, was für tRNAs ebenfalls untypisch ist.
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
2. tRNAmMet … erkennt interne AUGs für Elongation
Das Anhängen der Formyl-Gruppe ist nicht unbedingt
notwendig. Die Formyl-Gruppe erhöht jedoch die
Bindungseffizienz von IF2 an die fMet-tRNA.
Formylmethionin hat eine wichtige Funktion in der
Immunabwehr (Interaktion mit Neutrophilen). Es ist ein
Alamon für das Immunsystem, das dadurch eine
bakterielle Infektion erkennen kann.
In Eukaryoten ist die
tRNA an die 40S
ribosomale UE
gebunden, bevor das
Ribosom über Protein
Wechselwirkungene an
die mRNA bindet. Bei
Prokaryoten bindet die
30S UE zunächst
mittels RNA-RNA
Wechselwirkungen an
die mRNA, bevor die
fmet tRNA mit Ribosom
und 30S UE
interagiert.
Deformylase ist ein
Enzym, das die
Formylgruppe nach der
Proteinsynthese vom
translatierten Protein
entfernt.
99
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Correct translation initiation requires initiation factors
Functions of IF1-IF3.
IF1 occupies the A-site.
IF2 tRNAi binding /selection for tRNAi.
IF3 kinetic discrimination against elongator tRNAs.
conformational changes in 30S subunit prevents
association of 30S/50S subunits.
Prinzipieller Ablauf der Initiation:
• 30S UE komplexieren mit IF1 und IF3.
• Bindung von IF2-GTP an den Komplex
• IF2 überwachte Bindung von fmet-tRNA an die P-Site.
• Bindung der 50S UE, Bildung des 70S Ribosoms unter
GTP-Hydrolyse und Konformationsänderung, IF2-3
werden freigesetzt.
-)
•
•
•
IF1:
blockiert mit IF2 die ribosomale A-site
IF1 ist essentiell, ein Knockout lethal.
Nachweis mittels Chemical probing: Basen in der ASite werden nicht modifiziert, IF1 sitzt folglich hier.
-)
•
•
•
IF2:
erkennt fMet-tRNA Formylgruppe.
kontaktiert die tRNAi über die C-terminale Domäne.
stimuliert deren Bindung an die P-Site.
IF2 ist evolutionär über alle Systeme als Protein konserviert, hat unterschiedliche Funktionen
in den einzelnen Systemen.
-)
•
•
•
IF3:
bindet in der Nähe der P-Site Umgebung.
diskriminiert gegen alle tRNAs außer tRNAi.
diskriminiert gegen alle Startcodons außer AUG
IF1 blocks together with IF2 the ribosoA-site during translation initiation
IF1 protects sites which are
also protected by A-site tRNA.
A-Site (Akzeptor) ...
Eintrittstelle neuer tRNAs in
das Ribosom mit Ausnahme
der Initiator-tRNA, wird durch
IF1 blockiert.
P-Site (Peptidyltransferase) ...
beherbergt die tRNA, welche
die wachsende Polypeptidkette trägt. Hier bindet die
Initiator-tRNA.
E-Site (Exit) ... von hier aus wird die tRNA ohne AS aus dem
Ribosom entlassen.
Experiment: Bindungsort von IF1 mittels Chemical probing ermitteln
Durch Chemical Probing kann ermittelt werden, dass IF1 die A-Site besetzt:
IF1 zu Ribosomen hinzufügen, DMS dazu, Reverse Transkription, man findet keine
Methylierungen an der A-Site der 16S rRNA ... IF1 muss also dort binden.
100
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
IF1 and structural homologues
IF2 recognizes fMet tRNA fMet, stimulates binding of it to the P-site and
discriminates by virtue of the formyl group
IF2 contacts tRNAi via its Cterminal domain.
IF2: Mw ~ 80.000
IF2 stimuliert die Bindung der
tRNAi an das Ribosom, es
bindet die tRNAi über seine Cterminale Domäne.
Translation initiation factor 3
MW. 21.700
discriminates against:
-non-canonical start codons
AUU (start codon of IF3)
Dallas and Noller, Molec.Cell (2001)
Unterscheidung zwischen Startcodon und NichtStartcodon.
Herausgefunden mittels Toeprinting-Assay.
101
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
IF3 translational autocontrol
IF3 diskriminiert gegen AUU (bzw. alle
Startcodons außer AUG).
Eine Bindung von IF3 führt zu
Konformationsänderung im Ribosom, AUU
wird dadurch nicht mehr als Startcodon
erkannt. IF3 diskriminiert gegen alle
Startcodons mit Ausnahme von AUG, durch
die Konformationsänderung kann nur noch
fMet-tRNA an der P-Site binden.
Ist die IF3 Konzentration in der Zelle hoch
ist, wird AUU als Startcodon nicht
akzeptiert. Ist die Konzentration niedrig,
wird auch AUU als Startcodon akzeptiert.
Nachdem die mRNA die für IF3 codiert
selbst ein AUU als Startcodon verwendet,
reguliert sich die Synthese von IF3 somit
selbst.
Experiment: Reportergen Assay zur Autoregulation von IF3
Es wird ein Plasmid mit LacZ-Gen mit AUG als Startcodon in einen WT eingebracht, dadurch
wird ß-Galaktosidase erzeugt.
Bringt man das Plasmid in eine IF3-Mutante ein, wird ebenfalls ß-Galaktosidase erzeugt.
Ändert man das Startcodon des LacZ Gens von AUG auf AUU und bringt es ein:
Im WT findet so gut wie keine Translation des LacZ Gens statt.
In der IF3 Mutante findet sich etwa ein Drittel so viel Translation wie mit dem ursprünglichen
AUG Startcodon.
IF3 diskriminiert also gegen alle Startcodons außer AUG - in der IF3 Mutante mit AUU
Startcodon findet man aus dem Grund weniger ß-Galaktosidase, weil IF3 im WT eine
Konformationsänderung durchführt, durch die AUG viel stabiler gebunden wird. Findet die
Konformationsänderung nicht statt, kann AUU zwar binden und die Translation initiieren,
allerdings nie so effektiv wie AUG im WT.
102
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Toeprinting assay
•
•
•
•
•
•
Eine mRNA mit bekannter
Sequenz und rRNA
Bindungsstelle verwenden
Passend dazu einen Primer
mit 32P Markierung
synthetisieren.
eine hohe Konzentration
mRNAs (1012) mit 30S UE und
fMet-tRNA mischen und
Reverse Transkriptase (RT),
markierte Primer und
Nucleotide hinzufügen.
Die 30S UE bildet mit fMet-tRNA und mRNA einen ternären Komplex. Dieser ist so stabil,
dass die Reverse Transkriptase an der Bindungsstelle des Ribosoms abbricht. Ist keine
30S UE an die mRNA gebunden, erhält man mittels der RT eine cDNA, die der Länge der
mRNA entspricht. Mit 30S UE und fMet-tRNA erhält eine kürzere cDNA und als Toeprint
Signal bezeichnet wird. Das 3' Ende der verkürzten cDNA enspricht der Position, an der
die 30S UE an die mRNA gebunden ist.
Über Southern Blot kann die verkürzte cDNA mit der normalen cDNA verglichen und die
Position bestimmt werden.
Je nachdem wie hoch die Ribosomenkonzentration gewählt wird, wird die Masse der
mRNAs mehr oder weniger mit einem ternären Komplex besetzt sein. Das wiederum
resultiert in unterschiedlichen Toeprinting Signalen.
Experiment: Aktivitätsmessung von IF3
Selection of the initiatior tRNA by Esacherichia coli initiation factors
Genes and Development
(1989) 3:1899
Führt man einen Toeprint-Assay mit
30S UE und einem tRNA-Mix durch,
so erhält man viele unterschiedlich
lange cDNA-Stücke durch die
Reverse Transkriptase, da die 30S
UE mit jeweils verschiedenen tRNAs
irgendwo auf der mRNA an den den
tRNAs passenden Codons einen
Komplex bildet.
Fügt man zu 30S UE und tRNAs
zusätzlich IF3 in ausreichender
Konzentration hinzu, erhält man fast
ausschließlich gleich lange cDNA
Stücke, da IF3 für fMet-tRNA
diskriminiert und sich der ternäre Komplex daher nur über dem AUG Startcodon der mRNA
bilden wird.
Mit Hilfe dieses Tests kann auch auf andere in trans agierende Proteine in Bezug auf
translationale Initiation getestet werden.
Das abgebildete Experiment zeigt, dass IF3 auch gegen AUGs ohne SD Sequenz diskriminiert
und somit tatsächlich nur AUGs als Startcodon zulässt (?).
103
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
mRNA bound to the 30S ribosomal subunit.
(A) A 36-nucleotide mRNA is
bound to the 30S ribosomal
subunit. rRNA is shown in
grey, mRNA is shown in
yellow, and protein is shown
in cyan. The ASD sequence of
the 16S rRNA is shown in red
to indicate the SD-ASD
interaction. The P-site
initiation codon is shown in
green, and the A-site codon is
shown in magenta. Note the
kink in the mRNA between the two codons. (B) Close-up of the region indicated in panel A.
The upstream and downstream tunnels are marked by arrows. Colors are the same as in
panel A.
Kinetic discrimination by IF3
104
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Interactions of the initiator tRNA
(A) Surface representations of the initiator tRNA. The
regions that interact with the indicated component of the
translational machinery are highlighted in red, and the
nucleotide positions on the tRNA are indicated next to the
structure. The structure of the initiator tRNA is derived
from PDB entry 2FMT. (B) Detailed view of the interaction
between the initiator tRNA and the ribosome. On the left
is a surface representation showing the important sites of
interaction in red. On the right is the initiator tRNA on the
70S ribosome. The tRNA is shown in red, the mRNA is
shown in yellow, and the 16S and 23S rRNA are shown in
cyan and grey, respectively. The codon-anticodon interaction is shown.
Experiment: tRNA charging – welches Codon für welche AS
Deciphering the gentic code
Drei Basen = ein Codon = eine AS
Durch die 4 Basen erhält man 64
Möglichkeiten der Codierung.
Zunächst wird das Enzym
Polynucleotidphosphorylase benötigt,
das Nucleotide miteinander
verknüpft.
Nachdem bei einem Gemisch aller
vier RNA Basen (A, G, C, U) nicht
vorhersagbar ist, welche Sequenz
man erhält, wurde zunächst mit
homogenen Nucleotiden gearbeitet.
Im konkreten Fall mit U, man erhielt
Poly U-RNA Sequenzen.
Aus E.coli wurden Extrakte isoliert,
welche die gesamte
Translationsmaschinerie enthielten,
mit den Poly U Sequenzen vermischt
und anschließend jeweils eine
radioaktiv markierte AS hinzugefügt.
mRNA!!
Daraufhin wurde geprüft, welche AS mit den Poly U-RNAs
translatiert wurde indem das Gemisch nach einiger Zeit
durch einen Nitrozellulosefilter geschickt wurde. Nicht
gebundene tRNA passiert Filter, gebundener ternärer
Komplex (Ribosome, tRNA, mRNA) passierten den Filter
nicht. Durch radioaktiv markierte AS konnte der Komplex
nachgewiesen werden.
So wurde ermittelt, dass Poly U für die AS Phe codiert.
105
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
The genetic code
Codons sind der universelle
genetische Code, er ist bis auf
wenige Ausnahmen in jedem
Organismus gleich.
Der genetische Code ist
redundant, es gibt meist
mehrere tRNAs die für eine
AS codieren.
Es gibt 64 tRNAs … 61 tRNAs
für AS sowie 3 tRNAs (UAA,
UAG, UGA) die als Stopcodons
dienen.
Nicht jedes Codon wird in
gleicher Anzahl verwendet
bzw. übersetzt. AGA wird im
Vergleich mit AGG zu 0,1% zu
Arg translatiert.
- häufig gebrauchte Produkte
… werden häufig
vorkommende Codons
kodiert.
- selten oder in geringer Konzentration benötigte Produkte (z.B. Repressoren) … werden
durch selten vorkommende Codons kodiert, es findet sich auch eine entsprechend geringe
tRNA Konzentration für dieses Codon (bei Versuchen zu beachten).
Wobble Hypothese:
An der dritten Stelle des Codons / Anticodons sind neben den normalen GC bzw. AU
Bindungen noch andere Paarungen möglich. Aus diesem Grund hat die letzte Stelle eines
Codons die geringste Aussage über die zugehörige AS.
106
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Foliensatz 2 Bläsi
Die Shine Dalgarno Sequenz
Ribosome recruitment signals
on prokaryotic mRNA:
How to find the right start /
reading frame?
Die Gene einer polycistronischen
mRNA müssen unter Umständen
unterschiedlich stark
exprimiert werden. Jedes Gen auf
der mRNA muss zu diesem Zweck
eine Startsequenz und eventuell
individuelle Enhancerelemente
aufweisen um individuell translatiert
werden zu können.
AUG dient den meisten Genen als Startcodon. Für das Auffinden des Startcodons eines Gens
durch das Ribosom dient die Shine-Dalgarno Sequenz (SD, 5' AGGAGGU 3' als Consensus
Sequenz), die bei Prokaryoten immer upstream (5'-seitig) vom eigentlichen Startcodon liegt.
Die SD-Sequenz ist komplementär zum 3' Ende der 16S rRNA (Anti-SD-Sequenz) und
ermöglicht es dadurch der 30S UE an der passenden Stelle an die mRNA zu binden. Durch
diesen Umstand ist es auch möglich, dass sich überlappende Gene translatiert werden, wie
es bei Phagen (z.B. Phi) oft der Fall ist.
The Shine and Dalgarno / anti-SD Interaction
107
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Experiment: Biochemischer Nachweis der SD-Anti-SD-Interaktion durch
footprinting
Footprinting mRNA-ribosome complexes
with chemical probes
The EMBO Journal
vol.13 no.16 pp3892-390? - 1994
Reagiert Sauerstoff mit Fe3+-Ionen,
erhält man Wasserstoffperoxid, das
weiter zu Wasserstoffhydroxylionen und
Hydroxyradikalen reagiert.
Hydroxyradikale spalten Ribose an C1
und C4 und greifen damit auch das
Rückgrat der RNA an. Mittels
Hydroxyradikalen kann dadurch
ungeschützt vorliegende RNA an
zufälligen Stellen gespalten werden.
mRNA wurde an einem Ende markiert und mit Ribosomen und Radikalen vermischt.
Aus der erhaltenen Lösung wurden die mRNA Fragmente isoliert und mittels Gel getrennt.
Dabei zeigte es sich, dass Banden in einem bestimmten Bereich fehlten – in diesem
Bereich also keine Spaltung der mRNA stattgefunden hatte und nur größere oder kleinere
mRNA Fragmente vorlagen. Dieser Bereich wurde durch das Ribosom überdeckt und war
für die Radikale nicht zugänglich.
Der Bereich der vom Ribosom verdeckt war erstreckte sich von -35 bis +20 in Bezug auf
das AUG Startcodon der mRNA
•
•
•
Experiment: Genetischer Nachweis der SD-Anti-SD-Interaktion
Specialized ribosome system: Preferential
translation of a single mRNA species by a
subpopulation of mutated ribosomes in
Escherischia coli
Proc.Natl.Acad.Sci.USA
Vol.84 pp 4762-4766 July 1987
Zum Nachweis der direkten Interaktion von SD und AntiSD wurde eine komplementäre Mutation in vitro
durchgeführt.
Es wurde das rru-Operon auf ein Plasmid kloniert. Dabei
wurde die Anti-SD Sequenz der 16S rRNA zu einer SD
Sequenz verändert.
E.coli besitzt sieben Operons für die Transkription von
rRNA, es sollen aber nur die durch das Plasmid
eingebrachten rRNA Transkripte funktionsfähig sein. Zu
diesem Zweck wurde ein weiterer Basenaustausch auf der
16S rRNA des Plasmids vorgenommen (Mutation C → U an Position 1192). Dieser vermittelt
eine Resistenz gegen Spectinomycin.
Abschließend wurde dem Plasmid ein Reportergen (hGH, menschliches Wachstumshormon)
mit einer eine Anti-SD Sequenz hinzugefügt.
108
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Wurde nur das Reportgen mit Anti-SD Startsequenz in wt E.coli eingebracht, fand keine
Translation statt, die wt Ribosomen interagierten nicht mit der Anti-SD Sequenz.
Wurden Reportergen mit Anti-SD Startsequenz und 16S rRNA mit SD Sequenz und
Basenaustausch wt E.coli eingebracht und diese auf Medium mit Spectinomycin gezüchtet, so
erhielt man das Hormon. Durch das Spectinomycin waren nur die eingebrachten Ribosomen
funktionsfähig, weiters konnte die SD Sequenz auf der 16S rRNA mit der Anti-SD Sequenz
des Reportergens interagieren und Translation stattfinden.
Ähnlich kann man Protein-Protein-Interaktionen identifizieren. Findet man in einem Protein
eine Mutation, die nur mit einer Mutation in einem anderen Protein funktionsfähig ist, kann
man Annehmen, dass an dieser Stelle zwischen den beiden Proteinen Interaktion stattfindet.
Experiment: Biochemischer Nachweis der SD-Anti-SD-Interaktion durch
chemical probing
•
•
•
Zunächst werden in
ausreichender Menge mRNA
(1012-1014) und 30S UE
vermischt, es bilden sich
Komplexe durch Bindung der SD
+ Anti-SD Sequenzen auf 30S UE
und mRNA.
• Anschließend werden Reagenzien
hinzugefügt, die nur ungepaarte
Nucleotide modifizieren können
(sounds familiar). An der Stelle
an der mRNA und 30S einen Komplex bilden kann die mRNA nicht
modifiziert werden.Dazu ist zu sagen, dass zufällige, einzelne Basen
modifiziert werden, es werden nicht alle ungepaarten Basen einer
mRNA modifizert.
Modifizierung: DMS – A, CMTC – U, Kethocal - G
Werden anschließend die Komplexe getrennt und zur mRNA Primer
und Reverse Transkriptase hinzugefügt, erhält man je nachdem wo
die Transkriptase durch eine zufällige Basenmodifikation abbrechen
muss, unterschiedlich lange Stücke cDNA.
Wird die cDNA auf einem Gel ausgewertet, erhält man durch die
unterschiedliche Länge eine Vielzahl an Banden, allerdings wird sich
keine Bande an der Position der SD Sequenz finden, da hier die
Reagenzien niemals modifizieren konnten und die Reverse
Transkriptase daher hier auch niemals abbrechen musste.
Textbook view
Translationale Initiation in Prokaryoten:
• Bindung der 30S rRNA an die mRNA
• Bindung zusätzlicher Faktoren
• Bindung der Initiator tRNA
• Bindung der 50S rRNA und Bildung des 70S ribosomalen
Komplexes
109
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Parameters affecting translation initiation of a canonical prokaryotic mRNA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Start codon
SD
S1
SD < > AUG
Secondary stuctures
Sequences surrounding the
TIR
7. Translational repressors
8. Riboregulation
9. Other control mechanisms
Die wichtigsten Parameter, die bei der translationalen Initiation eine Rolle spielen:
Das Startcodon, der Abstand zwischen Startcodon und SD Sequenz, Sekundärstrukturen die
die Ribosomenbindungsstelle unzugänglich machen können sowie vom Gen abhängig
Proteine, die als Aktivatoren oder Repressoren dienen.
1. Flexibility in start codons
•
•
•
•
> 90% start codons are ATG.
Codons other than ATG are found initiating coding sequences.
Can infrequently be GTG ("Valine") and TTG ("Leucine").
A methionine is still incorporated as the first amino acid.
2. The strength of the Shine and Dalgarno sequence
3. Ribosomal protein S1 (only r-protein with an assigned function)
Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for
ribosomal protein S1
Nucl. Acids Res. (1991) 19:155
• essential in E.coli
• 61.2 kD protein with an elongated shape
• weakly bound to the ribosome by the means of
protein-protein interactions
• 6 RNA binding domains at the C-terminus
• RNA unfolding capacity
• required for translation of mRNAs with a canonical
RBS
S1 ist das größte Protein der 30S UE, ist über Protein S2 mit dem Ribosom verbunden und
geht über sechs Domänen Bindungen mit der mRNA eingeht.
S1 weist sogenannte RNA unfolding capacity auf, es wird angenommen, dass es einfache
mRNA Sekundärstrukturen auflösen kann.
Trennt man S1 vom Ribosom, kann dieses nicht mehr an die mRNA binden, es findet keine
Translation statt.
110
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Experiment: Isolierung von mRNA-Fragmenten die S1 binden und deren
Sequenzierung
•
•
•
mRNA, 30S UE, fMet-tRNA und IF3
werden vermischt, es bilden sich stabile
Komplexe.
• Anschließend wird Crosslinking mittles
UV durchgeführt: Aminogruppen die
eine WW mit mRNA gehen werden
dadurch permantent mit der mRNA
verbunden.
• Durch Zugabe von SDS oder EDTA wird
der ternäre Komplex aufgetrennt, nur
Proteine die im Zuge des Crosslinkings
fix mit mRNA verbunden wurden bleiben
an der mRNA.
• Aus der Mischung wird die mRNA grob
über einen Succrosegradienten
abzentrifugiert und die mRNA aus dieser
Fraktion über eine Sepharose-Protein-A
Säule mittels Antikörper gegen Protein
S1 getrennt.
• Freiliegende mRNA wird durch RNase
zernichtet, durch S1 gebundene und
damit unzugängliche mRNA bleibt dabei
intakt.
Die verbleibende mRNA wird am 5' Ende markiert, es wird erneut SDS oder Harnstoff
hinzugefügt, wodurch sich S1 mit der mRNA vom Antikörper löst, S1 + mRNA werden
isoliert.
Abschließend wird die Lösung mit Proteinase K versetzt, die das Protein S1 abbaut, die
verbleibende mRNA Sequenz wird sequenziert.
Die Sequenzierung der erhaltenen mRNA ergab, dass die Sequenz an der S1 bindet eine Ureiche Sequenz ist, die upstream des translationalen Startpunktes (der SD Sequenz) liegt.
Experiment: Klärung ob S1 Primär oder Sekundärstrukturen der mRNA
bindet
Durch ein spezielles Verfahren (Selex) wird bestimmt, welche Liganden an beispielsweise S1
binden. Es werden verschiedene Liganden erzeugt und deren Bindungseigenschaften geprüft.
Das liefert Rückschlüsse auf die bevorzugte Bindungsstelle von S1 durch den Vergleich der
Gemeinschaften einzelner Liganden.
• Zunächst wird S1 gereinigt.
• Es werden Oligonucleotide zufälliger Sequenz erzeugt, Protein S1 wird mit ihnen
vermischt.
• Komplexe aus S1 und Oligonucleotiden werden durch Filtration gewonnen.
• Die Oligonucleotide werden von S1 gelöst und deren analysiert.
Das Experiment ergab, das S1 an Pseudoknoten der mRNA und damit Sekundärstrukturen
bindet.
S1 ist für die translationale Initiation in Bakterien extrem wichtig. Allerdings weisen nicht alle
Bakterien S1 auf, diese müssen andere Mechanismen haben, wie die Initiation stabilisiert
wird.
Es ist auch von der mRNA abhängig, ob sie ohne S1 translatiert werden kann oder nicht.
mRNAs die S1 nicht zur Translation benötigen, werden als leaderless mRNA bezeichnet, sie
starten direkt mit einem AUG.
111
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Visualization of protein S1 within the
30S ribosomal subunit and its
interaction with messenger RNA
PNAS (2001) 98:1191
S1 is required for translation initiation of mRNAs with a structured 5'-UTR
--------> Steigende Konzentration
UTR … untranslated region
ompA … Banden werden mit
zunehmender S1
Konzentration intensiver.
cI … Banden bleiben bei
steigender S1 Konzentration
in etwa gleich.
ompA mRNA … S1 abhängig; Sekundärstruktur an 5' UTR.
cI mRNA … S1 unabhängig; keine Sekundärstruktur in 5' UTR.
4. SD < > Start codon
Influence of mRNA Determinants on translation
inititation in Escherichia coli
J. Mol. Biol. (1991) 218, 83-97
Der Abstand zwischen SD und Startcodon beeinflusst die
Translation, da das Ribosom mit beiden Sequenzen
wechselwirken muss. Der optimale Abstand wäre 1nt
In Experimenten wurden Basen zwischen SD Sequenz und
Startcodon eingeführt und ermittelt, dass die optimale Distanz 78 Basen beträgt, in der Realität kann Ribosomenbindung in
einem Bereich von 4-11 Basen Abstand erfolgen.
Toeprint: zwischen Startcodon und SD werden unterschiedlich
viele Basen eingesetzt, das stärkste Signal bei 7 Basen.
112
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
5. mRNA 2nd structures can inhibit translation initiation by masking the SD and / or
the start-codon
Regulation of expression of bacteriophage T4 lysozyme
Formation of 2nd structure depends
on transcriptional start.
Inhibitory stem-loop structures: Different stimuli for opening / closing
"Breathing", Bläsi et al., 1989
Sekundärstrukturen sind häufig für die Modulation
der translationalen Initiation verantwortlich.
Sekundärstrukturen können sich öffnen und wieder
schließen, man spricht in diesem Zusammenhang
von "Breathing".
"Thermosensor", Johansson et al., 2002
"Vitamin perception",
Ravnum and Andersson, 2001
113
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
The dual-start motif in λS
Dual translational initiation sites of the λ S gene
The EMBO Journal vol.8 no.11 pp.3501-3510 1989
Das λ S Gen weist zwei Initiationsstellen auf, wodurch zwei unterschiedliche Genprodukte
erzeugt werden können.
Die Regulation erfolgt über 2 SD Sequenzen:
SD-Met1 und SD-Met5 sind unterschiedlich gut für Ribosomen zugänglich; SD-Met1 liegt in
einer Sekundärstruktur. Das führt zu unterschiedlicher Expression der zwei Produkte.
Im Phagen Lambda liegt die SD Sequenz des Lysegens S in einer solchen Sekundärstruktur,
Lyse kann nur stattfinden, wenn die Sekundärstruktur aufgelöst wird.
Translational regulation by an RNA thermosensor
114
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Translational regulation by temperature mediated changes in mRNA structure of
the L. monocytogenes prfA gene
Listeria monocytogenes is a human pathogenic bacterium that causes food poisoning.
• Listeria regulates virulence genes so they are expressed only within the host (this is true
for other pathogens also).
• One key feature of being within the host environment is temperature.
• PrfA is a transcription factor that activates expression of virulence genes. PrfA is
expressed at 37°C but not at 30°C.
• Control is at the level of translation, not transcription, by changing the structure of the
prfA mRNA.
mRNA structure represses prfA translation. The inhibitory structure melts at 37°C
1. 30°C or less, Shine-Dalgarno
(SD) sequence paired -no
translation.
2. 37°C base pairing melts,
ribosome can now bind SD.
3. Translation of prfA can now
proceed.
4. Unusual as required no proteins
at all for regulation.
Neisseria erzeugt als Virulenzgen eine Protease, deren SD Sequenz bei 30° in einer
Sekundärstruktur liegt und unter diesen Bedingungen nicht translatiert wird.
Wird das Bakterium beispielsweise in einen Wirt aufgenommen, in dem höhere Temperaturen
herrschen, öffnet sich die Sekundärstruktur, die Protease kann translatiert werden und seine
greuliche Wirkung entfalten.
Molecular basis for temperature sensing by an RNA thermometer
The ROSE (repressor of heat-shock
gene expression) element is present
in the 5'-UTR of small heat-shock
genes in many Gram- bacteria
including Rhizobia, Escherichia coli
and Salmonella.
The EMBO Journal (2006) 25
Riboswitches
transcriptional /
translational
attenuation
! without protein
factors or tRNA
molecules !
115
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Organization of riboswitches
Binding domain (Aptamer):
• structured binding pocket
• high affinity
• high specificity
Regulatory domain (Expression
platform):
• reacts upon ligand binding by the
aptamer
• conformational change alters
gene expression
Riboswitch Classes
e.g.:
• vitamin biosynthesis
• amino acid metabolism
• purine metabolism
SAM has different roles in the regulation of methionine biosynthesis
gram negative bacteria
gram positive bacteria
116
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Confirmation of the
transcriptional attenuation
model in the metI riboswitch
transcriptional attenuation
The thi box
Thiamine pyrophosphate (TPP), also known as cocarboxylase, is
the cofactor of key enzymes of carbon metabolism such as
pyruvate dehydrogenase, a-ketoglutarate dehydrogenase,
transketolase, pryuvate decarboxylase, and others.
Regulation of thiamine (B1) biosynthesis in Escherichia coli (translational control)
117
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Thiamine biosynthetic genes and possible mechanisms of riboswitch control
In-Line Probin
6. Secondary structures in TIR
Influence of mRNA Determinants on translation
initiation in Escherichia coli
J. Mol. Biol. (1991) 218, 83-97
118
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sequences of the TIR that affect the translation initiation frequency
Bimacombe and McCarty, 1994
119
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
The downstream box
The initiation of translation in
E.coli: apparent base pairing
between the 16srRNA and
downstream sequences of the
mRNA
Nucleic Acids Research,
Vol.18, No.7 1719 (1990)
Mit Hilfe von Mutationen
wurde downstream des AUG
Startcodons eine Region
ausgemacht, die als
"downstream-box" bezeichnet
wurde.
Es wurde postuliert, dass diese mit einem
speziellen Bereich (stem-loop) der 16S
rRNA interagieren kann; dieser Bereich auf
dem Ribsosom wurde als anti-downstreambox bezeichnet.
Die downstream-box sollte die Interaktion
zwischen SD und Anti-SD Sequenz
erleichtern.
Es ergeben sich dabei aber zwei logische Probleme:
Die Anti-SD Sequenz liegt ungepaart und frei zugänglich vor, während die Anti-downstreambox bereits gepaart in einer Sekundärstruktur vorliegt. Rein aus sterischen Gründen ist damit
eine Interaktion zwischen downstream-box und 16S rRNA nicht möglich.
Functional importance of RNA
interactions in selection of
translation initiation codons
Molecular Microbiology (1997)
24(1), 19-28
120
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
The downstream box does not exist!
Evidence angainst an
Interaction between the
mRNA Downstream Box and
16S rRNA in Translation
Inititation
Journal of Bacteriology, June
2001, p3499 – 3505 Vol.183
No.11
Eine Röntgenstudie zeigt, dass eine räumliche Interaktion zwischen DS Box und 16S rRNA
nicht möglich ist.
Durch komplementäre Mutationen in DS Box und 16S rRNA konnte die Existenz dieser Box
ausgeschlossen werden.
Durch chemical probing kann ebenfalls bewiesen werden, dass es keine Interaktion zwischen
DS Box und 16S rRNA gibt.
7. Translational repressors and activators
Repressorsysteme:
Es lagern sich solange Monomere an
die mRNA an bis SD überdeckt ist. Es
kommt zu Pseudoknotenbildung (bei
Protein Sn15), Ribosome können
nicht mehr binden.
Aktivatorsysteme:
Es kommt zur Bindung von Proteinen
upstream eines Hairpins in dem sich
SD-Sequenz befindet.
SD Sequenz wird frei, Ribosomen
können binden.
Die SD Sequenz kann auch durch
endonucleolytische Schnitte
freigesetzt werden.
121
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
T4 gene 32 autoregulation
T4 gene 32 encodes a
single-stranded nucleic
acid-binding protein
involved in T4 DNA
replication,
recombination and
repair.
Translationale Repressoren dienen häufig der Reglation von akzessorischen Elementen.
Bsp: Gen 32 des Phagen T4 codiert für ein Einzelstrangprotein. Dieses Gen ist auf mRNAEbene autoreguliert. Wurden ausreichend Protein 32 Monomere erzeugt, binden diese an
sogenannte Pseudoknoten (speziell gefaltete RNA-Strukturen).
Nach der Bindung an den Pseudoknoten können weitere Monomere binden, bis die SD
Sequenz erreicht wurde, dadurch das Ribosom nicht mehr binden kann und die Translation
inhibiert wird.
Autoregulation of translation balances ribosomal protein levels with rRNA
synthesis
Ribosomal protein operons
1. Ribosomal protein genes are organised in
operons.
2. Most operons contain genes for both small and
large subunit proteins.
3. Some non-ribosomal proteins that have roles in
translation process also encoded in these
operons.
4. One gene in each operon (dark colour) acts as
a regulator.
5. In each case the regulatory protein is an rRNA
binding protein.
6. Genes marked + are under translational
feedback regulationby the dark coloured gene.
Autoregulation der Translation durch Protein S15
Autoregulation of translation balances ribosomal protein levels with rRNA
synthesis
For each operon there is a regulatory sequence in the ribosomal
protein operon that is similar to the sequence on the rRNA.
Liegt S15 in höherer Konzentration als die der 16S rRNA vor,
inhibiert es seine eigene Translation.
122
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Ribosomal protein S15 from
Escherichia coli modulates its
own translation by trapping
the ribosome on the mRNA
initiation loading site
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Vol.90, pp.4394-4398, May
1993
Links ternärer Komplex aus Protein 15 mRNA, tRNA und Ribosom.
Rechts binärer Komplex, das Ribosom kann zwar binden, aber kein Komplex mit tRNA.
S15 bindet bei hoher Konzentration an die eigene mRNA, sodass sich ein Pseudoknoten
ausbildet, der AUG und SD Sequenz für das Ribosom unzugänglich macht.
Experiment: Repressorwirkung des Proteins S15 bei Translation
Verhindert S15 lediglich die Bindung des Ribosoms oder wirkt es anders.
Prinzip des Toeprint Assays:
• In vitro bindet ein Ribosom an mRNA und bildet
gemeinsam mit der fMet-tRNA einen stabilen ternären
Komplex.
• Fügt man Reverse Transkriptase sowie Primer die am
3' Ende der mRNA binden hinzu, erhält man ein cDNA
Signal, das in der Regel 15nt vom A des AUG
Startcodons entfernt ist. Je nachdem wie lang das
Signal tatsächlich ist, kann ermittelt werden, wie gut
das Ribosom gebunden hat.
•
•
•
Mischt man lediglich mRNA und 30S UE und fügt keine
Initiator tRNA hinzu, bindet die 30S UE nur aufgrund
der SD-Anti-SD Interaktion auf der mRNA (binärer
Komplex). Mittels Reverser Transkriptase erhält man
hier eine cDNA, die bis +10 an das AUG heranreicht
(im Gegensatz zu +15 des ternären Komplexes mit
Initiator tRNA).
Fügt man 30S UE und fMet-tRNA hinzu, erhält man ein
Signal bei +17 - es konnte ein stabiler ternärer
Komplex gebildet werden.
Fügt man 30S UE, fMet-tRNA und S15 hinzu, erhält
man ein Signal bei +10, es wird also kein stabiler
ternärer Komplex gebildet, aber die 30S UE selbst
kann noch an die mRNA binden.
binary complex
tertiary complex
S15 verhindert also die Codon-AnticodonInteraktion der tRNA in der P-Site.
Es kann dadurch zu keiner translationalen
Initiation kommen.
123
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Prinzipieller Nachweis von Repressorwirkung bzw. Baseninteraktion:
1) Biochemisch:
- Hydroxyradikalfootprinting
- Toeprinting
- RNA Verdau
- Reagenzien dazu … wenn Basen nicht modifizierbar … Repressor dran
- über Gewicht … Gelelektrophorese
2) Genetisch:
- Mutation
- Plasmide
Threonyl-tRNA-synthetase
Jenner et al.
Science 1.April 2005, Vol.308
124
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
The glgCAP operon
The synthesis of ADP-glucose by ADP
glucose pyrophosphorylase encoded by the
E.coli glgC gene defines both the first
committed step of glycogen synthesis and
the major rate-controlling step of the
pathay:
Glucose-1-P + ATP ↔ ADP-glucose + PPi
The glg leader
Inactivation of CsrA by the non-coding regulatory RNA CsrB
Secondary structure prediction for CsrB RNA
125
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
CsrB RNA functions as an antagonist of CsrA action
8. Riboregulation
Regulation by antisense RNAs
126
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Two types of riboregulators: cis- and trans-antisense RNAs
Cis-encoded small RNAs
•
•
are encoded by the same genetic loci as their target.
have the potential to form perfect duplexes.
Cis-encoded regulatory RNAs are often used by
• plasmids
• phages
• transposons
to
•
•
•
•
•
regulate:
plasmid copy number
conjugation
post-segregational killing
temperate phage development
transposition
Tn10 achieves antisense copy control by overlapping promotors
Antisense copy control
127
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Cis-antisense mechanisms: negative regulation
Unter Cis-Antisense versteht man, dass zwei RNAs
von Promotoren transkribiert werden, die
konvergent liegen und dadurch eine sich
ergänzende Sequenz aufweisen.
Es wird in so einem Fall eine funktionelle mRNA
von einem Promotor aus transkribiert. Zusätzlich
wird eine weiter RNA von einem weiteren Promotor
aus in Gegenrichtung transkribiert, die durch
überlappende Sequenzen an die mRNA binden
kann und eine Interaktion mit Ribosomen
verhindert (negative Regulation).
Beispiel: Replikationskontrolle von R1-Plasmiden
durch die Antisense RNA copA. Das R1 Plasmid
codiert über das Gen repA die eigene Replicase.
Upstream des repA Gens liegen die Gene copB
sowie tap, es wird von allen drei Genen eine mRNA
erzeugt, die als copT bezeichnet wird. In
Gegenrichtung wird die Antisense RNA copA
transkribiert.
copT und copA bilden Sekundärstrukturen aus,
über die sie zunächst interagieren, um
anschließend eine stabile Doppelstrangbindung
einzugehen, wodurch die Translation der Gene tap
und repA verhindert wird.
Die Translation von repA ist an die Translation von tap gebunden, es findet sich also sowohl
Antisense Regulation als auch auch translative Kopplung.
Cis-acting antisense RNA mechanisms
Antisense RNAs binden oft nicht in
linearer Form an die zugehörige
mRNA, sondern bilden wie bei der
Regulation von repA durch
Ausbildung von Sekundärstrukturen
sogenannte "kissing loops", über die
Antisense und zugehörige mRNA
aneinander binden.
Ein Beispiel für Antisense RNA findet
sich in Bakterien bei der Kontrolle
von Toxingenen die sich auf
Plasmiden befinden. Es wird dabei
sichergestellt, dass nur Bakterien
überleben, die das Plasmid behalten.
Das als hok bezeichnete Gen kodiert für ein Toxin, das die Zellmembran zerstört. Für die
Translation von hok ist ein Upstream liegendes, als mok bezeichnetes Gen notwendig
(positive translationale Kopplung). Zu der mok mRNA wird vom Plasmid eine als sok
bezeichnete Antisense RNA erzeugt, die an mok bindet und dadurch die Translation von hok
verhindert.
Im Gegensatz zur mok-hok mRNA ist die sok Antisense RNA sehr instabil und muss vom
Plasmid ständig neu transkribiert werden. Geht das Plasmid verloren, wird die sok Antisense
RNA schneller abgebaut als die mok-hok mRNA, hok kann translatiert werden and the cell
meets the grim reaper.
128
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Trans-encoded regulatory RNAs
•
are not genetically linked to the loci
of their targets
• form imperfect duplexes and can
affect multiple targets via alternative
base pairing.
S.aureus erzeugt ein Hämolysin, das Erythrocyten lysiert.
Dieses Enzym wird durch das Gen HLA erzeugt. Die HLA
mRNA weist im Normalfall eine Sekundärstruktur auf, die
die SD Sequenz verbirgt, wodurch das HLA Gen nicht
translatiert werden kann und die mRNA schnell wieder
abgebaut wird.
RNA III kann an die HLA mRNA binden und löst dadurch Bindung die Sekundärstruktur auf,
wodurch Translation stattfinden kann.
RNA III und HLA mRNA sind nicht überlappend, deswegen wird RNA III als Trans-Antisense
RNA bezeichnet.
Bacterial stress responses are often mediated by trans-encoded regulatory RNAs
Small RNA regulators in bacterial stress responses
Small RNAs spielen bei der Genregulation
auf translationaler Ebene eine wichtige
Rolle. Wird die Zelle Stress ausgesetzt,
werden sie transkribiert und dadurch
bestimmte Gene im Gegensatz zu RNAi
sowohl aus- als auch eingeschalten.
Beispiel: RpoS codiert für den Faktor σ38,
der in der stationären Phase erzeugt wird
und notwendig ist, verschiedene
Virulenzfaktoren zu aktivieren. Die rpoS
mRNA weist bei der
Ribosomenbindungstelle eine
Sekundärstruktur auf die Translation verhindert. Die kleine regulatorische RNA DsrA löst die
Sekundärstruktur auf und ermöglicht die Synthese von RpoS (positive Translationskontrolle
durch DsrA).
Beispiel: FlhA mRNA translatiert für einen transkriptionalen Aktivator. Die kleine
regulatorische RNA OxyS bindet an die Ribosomenbindungsstelle von FlhA, wodurch dieses
nicht mehr translatiert werden kann (negative Translationskontrolle durch OxyS).
Kleine regulatorische RNAs spielen in der Kontrolle der Initiation der Translation eine
wichtige Rolle, Vorkommen und Wirkungsziele sind dabei nur schwer zu ermitteln.
DsrA beispielsweise ermöglicht nicht nur die Translation von RpoS, sondern inhibiert auch die
Translation eines transkriptionalen Aktivators (hns), der eine Reihe weiterer Gene in der
stationären Phase aktiviert.
129
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
hfq (Host factor Q in E.coli)
•
•
hfq is an Sm-like RNA binding protein
It is an abundant, heat-stable, doughnut-shaped hexameric protein
hfq was shown to:
• interact with several small RNA molecules
(i) affect RNA stability
(ii) mediate RNA-RNA interactions
• interact with RNAP and the ribosomal protein S1
Der Phage Qß benötigt dieses Wirtsenzym, um die eigene RNA zu
replizieren.
hfq interagiert mit einer Vielzahl kleiner RNAs wie beispielsweise DsrA. In E.coli konnten
einige dieser RNAs identifiziert werden, indem hfq in einer Säule gebunden wurde und die
RNAs von E.coli durchgeschickt wurden.
Experiment: Ermittlung der hfq Chaperonaktivität mittels Toeprinting
Das Gen OmpA codiert für das äußere Membranprotein A von E.coli. Mischt man OmpA
mRNA mit hfq und führt einen Toeprint Assay durch, so erhält man ein immer geringeres
Toeprintsignal, je mehr hfq hinzugefügt wird. hfq behindert demnach das Ribosom bei der
Bindung an die mRNA.
Dabei sind zwei Ansätze denkbar, wie die ribosomale Bindung verhindert wird. Entweder das
Protein besetzt die ribosomale Bindungsstelle oder es verändert die Konformation der mRNA
so, dass das Ribosom nicht mehr binden kann.
• Zunächst wird ein Toeprint Assay mit OmpA mRNA durchgeführt, indem der mRNA
radioaktiv markierte Primer und reverse Transkriptase hinzugefügt wird. Man erhält ein
Toeprint Signal, das die Bindung der 30S UE an die mRNA wiederspiegelt. (RT bricht ab,
wo 30S UE an mRNA gebunden ist).
• Weiters wird OmpA mRNA mit hfq versetzt, hfq wird anschließend mittels Proteinase K
wieder abgebaut und in Folge ein Toeprint Assay durchgeführt. Das Signal unterscheidet
sich vom ersten Versuch, die 30S UE konnte trotz Abbau von hfq nicht an die mRNA
binden. Demnach verändert hfq dauerhaft die Konformation der mRNA.
• Um diese Erkenntnis abzusichern wird eine durch hfq in ihrer Konformation veränderte
mRNA erhitzt (80°) und langsam abgekühlt, wodurch mögliche Sekundärstrukturen
aufgelöst werden. Im Anschluß wird wieder ein Toeprint Assay durchgeführt. Das Signal
ergibt, das die 30S UE an mRNA binden kann. Damit steht fest, dass hfq die Struktur von
mRNA verändert und nicht durch Bindung an die mRNA Translation verhindert.
Hfq protects sRNAs from RNase E cleavage
130
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Hfq acts as an RNA chaperone
Hfq stimulates annealing
Functional activation and inactivation by trans-encoded regulatory RNAs
Inactivation
activation
131
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
mRNA silencing: the sodB-RyhB paradigm
Wie erwähnt ist Eisen als Cofaktor
für aktive Zentren multipler Enzyme
essentiell. Entzieht man Bakterien
Eisen (z.B. durch Chelierung mittels
EDTA), werden sie sich bald den
unsichtbaren Engelschören
anschließen, denn:
Das Gen sodB codiert für das Enzym
Superoxid-Dismutase. Dieses
wandelt Superoxid in H2O2 um, um
die Zelle vor oxidativem Stress zu
bewahren. Superoxid-Dismutase
benötigt dazu Fe3+. Anm: das
produzierte H2O2 wird durch andere
Enzyme weiter abgebaut, da H2O2
DNA schädigt.
Die Aufnahme von Eisen wird durch
das Protein Fur reguliert. hfq
reguliert die Translation von Fur und
dadurch indirekt die Produktion der Superoxid-Dismutase, die Eisen benötigt.
In einem hfq- Stamm ist sowohl die Konzentration von Fur als auch von SuperoxidDismutase erhöht.
Bei langsamem Wachstum wird viel hfq produziert, dadurch wird die Konzentration von Fur
niedrig gehalten. Eine niedrige Fur Konzentration aktiviert Oberflächenrezeptoren, die Eisen
aus der Umgebung aufnehmen.
Liegt wenig Eisen und damit inaktives Fur vor, kann die small RNA RhyB transkribiert
werden. RhyB inaktiviert Gene, deren Produkte Eisen benötigen z.B. bindet es an die
Ribosomenbindungsstelle von sodB und verhindert dessen Translation.
Ist RhyB an SodB gebunden, wird sodB leicht durch RNase E gespalten und abgebaut
werden.
RyhB-SodB base-pairing creates a new RNase E cleavage site in the SodB 5' coding
region
132
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Experiment: Spaltung des SodB-RhyB RNA Komplexes durch RNase E
In RNase E Mutanten sind beide RNAs stabiler.
• Zunächst wird geprüft, wo sodB ohne RhyB gespalten wird. sodB mRNA wird mit
Ribosomen und RNase E sowie speziell erzeugten Sonden vermischt. Diese Sonden sind
komplementär zu kurzen Strecken der mRNA. Kann eine Sonde nicht an die mRNA
binden, fand an dieser Stelle ein Schnitt durch die mRNA statt, die Sequenz der Sonde ist
damit Komplementär zur RNase E Schnittstelle. Es fand sich eine Spaltstelle bei Codon
30.
• Dem Gemisch werden hfq und RhyB hinzugefügt und erneut mit Sonden geprüft. Es fand
sich dabei in sodB eine andere Spaltstelle bei +12 (nahe am Startcodon). Durch Bindung
von hfq und RhyB an die mRNA wird Ribosomenbindung verhindert, eine neue Spaltstelle
für RNAse E freigelegt und dadurch die Wahrscheinlichkeit einer Spaltung erhöht.
RNaseIII cleavage of RyhB is stimulated by base-pairing with SodB mRNA
RhyB kann durch RNase III
gespalten werden, wenn es an
sodB mRNA gebunden ist. In
einem RNase III- Stamm, in
dem durch eine Mutation
RNase III bei
Temperaturerhöhung
inaktiviert wird, wird die RhyB
RNA bei erhöhter Temperatur
wesentlich stabiler im
Vergleich zu Temperaturen in
denen RNase III funktioniert.
Model for sRNA/mRNA turnover
Wie werden RNA Komplexe
wieder gelöst, nachdem eine
Stresssituation erfolgreich
überwunden wurde (we shall
overcome und so)?
Masse et al., 2003
Both sRNA and mRNA are
degraded in an RNase E
dependent manner
133
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Initial events in sodB and RyhB inactivation
RhyB-regulated genes
•
•
•
•
bfr and ftn encode bacterial ferritins (iron storage proteins)
sdhCDAB operon encodes succinate dehydrogenase
acnA and fumA encode aconitase and fumarase.
sodB encodes an iron-containing superoxide dismutase.
Activation by a non-coding RNA
3. mRNA activation: the RpoS-DsrA paradigm
134
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
A network of small non-coding RNAs controls synthesis of outermembrane proteins
Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane
Current Opinion in Microbiology Vol.9, Iss.6, Dec. 2006, pp.605-611
Basepairing between the homologous regions of RprA and rpoS mRNA opens the
hairpin permitting translation
9. Other mechanisms
Translationale Kopplung erfolgt
häufig bei überlappenden Genen.
Negative translationale Kopplung:
Liegen die Gene A und B
überlappend vor und weist Gen A
eine stärkere
Ribosomenbindungsstelle als Gen B
auf, wird Gen A verhältnismäßig
stärker translatiert werden als Gen
B.
Positive translationale Kopplung:
Die Translation eines Gens ist für die
Translation eines weiteren Gens
notwendig.
Beim Phagen Lambda liegen einige Gene nicht überlappend vor, allerdings befinden sich
Start und Stopcodon eines Gens in unmittelbarer Nähe des Startcodons eines zweiten Gens,
dessen SD Sequenz durch eine Sekundärstruktur der mRNA zunächst nicht zugänglich ist.
Wird das erste Gen translatiert, öffnet das Ribosom diese Sekundärstruktur in der sich die
SD des zweiten Gens befindet. Dadurch kann das zweite Gen erst translatiert werden,
nachdem das erste Gen translatiert wurde (positive translationale Kopplung).
135
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Translational control in MS2 phage
Translational Attenuation
ermC (23S rRNA methylase) →
erythromycin resistance
cat, cmlA (chloramphenicol acetyltransferase) →
chloramphenicol resistance
Erythromycin binds to domain V of the 23S rRNA
(hydrogen bonds with nucleotides 2058 and 2059) in the
50S subunit of the ribosome and inhibits translocation.
Chloramphenicol
- Binds to the 50S subunit (23S rRNA) of the ribosome.
- Inhibits binding of the amino acid end of the tRNA and
formation of the peptide bond.
- Toxicity particularly in bone marrow as a result of
inhibition of mitochondrial protein synthesis.
Translationale Attenuation findet sich häufig bei
Resistenzgenen z.B. beim CAT-Gen von B.subtilis.
CAT codiert für Chloramphenicolacetyltransferase, das
Chloramphenicol inaktiviert, indem es einen Acetylrest
anhängt. CAT mRNA liegt immer in ausreichender
Konzentration in der Zelle vor, um sofort reagieren zu
können, wenn das Bakterium mit Chloramphenicol in
Berührung kommt. Würde die mRNA allerdings in
Abwesenheit von Chloramphenicol translatiert, würde die
Zelle ständig Energie aufwenden müssen.
zur Kontrolle der Translation besitzt die mRNA eine
Leader Sequenz, die für 6-7 AS codiert. Das Ribsom
translatiert diese kurze Sequenz und löst sich
anschließend wieder von der mRNA ab.
136
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Chloramphenicol bindet an 23S rRNA und
stoppt die Elongation, da es eine Bindung
von weiteren tRNAs verhindert. Im Fall der
CAT mRNA bewirkt der Stop des Ribosoms,
dass eine nachfolgende Sekundärstruktur
der mRNA aufgelöst wird, die die SD
Sequenz des eigentlichen CAT Gens enthält,
dadurch für weitere Ribosomen zugänglich
wird und Chloramphenicolacetyltransferase
synthetisiert werden kann.
Ein ähnlicher Mechanismus findet sich bei
der Erythromycin Resistenz.
Transcriptional attenuation
Transkriptionale Attenuation findet sich häufig bei
Genen und Operons, die mit der Biosynthese zu
tun haben.
Diese Gene bzw. Operons besitzen eine
Leadersequenz, die mehrfach für die AS codiert,
deren Biosynthese durch die nachfolgenden Gene
erfolgt.
Bsp: Trp-Operon. Die mRNA des Operons bildet
nach der Leader Sequenz eine Sekundärstruktur.
Ist ausreichend Trp vorhanden, translatiert das
Ribosom die Leadersequenz und löst sich durch die
folgende Sekundärstruktur wieder ab.
Steht wenig Trp zur Verfügung, ist auch die TrptRNA Konzentration niedrig und das Ribosom muss
die Translation der Trp-Leadersequenz stoppen.
Der Stop bewirkt eine Konformationsänderung der
bereits translatierten mRNA, wodurch sich
wiederum die folgende Sekundärstruktur auflöst.
Nach dem Auflösen der Sekundärstruktur löst sich
das Ribosom nicht von der mRNA sondern
translatiert weiter und kann so die Enzyme zur
Trp-Biosynthese erzeugen.
Es handelt sich hier um eine Mischung zwischen
translativer und transkriptiver Attenuation.
Summary
137
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Bläsi Foliensatz 3
Leaderless mRNA
Leaderless mRNA and ribosomal recruitment?
•
•
•
•
5'-AUGNNNNNNN-//-3'
Bacteria
Gram-negative bacteria
E. coli (λcI; tetR),C. crescentus, T. thermophilus
Gram-positive bacteria
Streptococci, Lactococci, Streptomyces, Corynebacteria
Mycoplasma pneumonia
Archaea
Crenarchaeota (S. solfataricus)
Euryarchaeota (H. salinarum; M. janaschii)
Eukarya (G. lamblia)
Organelles (human mitochondria)
number leaderless mRNAs
6 -8
~ 35
>
> mehrere 100
5 -10 />
4
9 -10
Leaderless mRNAs weisen keine SD Sequenz auf, sondern starten direkt mit dem Startcodon
AUG. Sie ist in allen Organismen, sowohl in Pro- als auch in Eukaryoten translatiertbar.
Sie kommen vor allem in gram+ Bakterien vor, hier vor allem bei Genen, die Resistenz gegen
selbst produzierte Antibiotika verleihen.
Bringt man leaderless mRNA in gram- Bakterien ein, so kann diese translatiert werden,
normale mRNA aus gram- Bakterien kann in gram+ Bakterien allerdings nicht translatiert
werden, da sie S1 benötigt, das viele gram+ Bakterien nicht besitzen.
Bei Archae z.B. bei Sulfolobus solfataricus sind ca. 70% aller mRNAs monocistronisch und
leaderless, es handelt sich dabei um nichtkanonische mRNA.
In Mitochondrien sind alle mRNAs leaderless, sie weisen eine bakterienähnliche translationale
Maschinerie auf.
Translation of a leaderless mRNA in heterologous translation systems
cI weist ist eine mit AUG beginnende leaderless mRNA. In Versuchen wurde konnte sie in
E.coli, Sulfolobus und Reticulocytenlysat aus Kaninchenaugen translatiert werden.
OmpA mRNA aus E.coli ist bei Versuchen im direkten Vergleich damit nur in E.coli, aber nicht
in Sulfobolus oder Eukaryoten translatierbar.
Es wird daher angenommen, dass es sich bei leaderless mRNA um eine alte Form von mRNA
handelt, bevor sich ribosomale Bindungsstellen entwickelten.
138
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
The db-adb interaction does not exist
Translation Systems
IF2 ist ein durch alle Organismen hoch
konservierter translationaler Faktor. In
Prokaryoten erhöht er die Bindungseffizienz
der fMet-tRNA an die P-site des Ribosoms.
Da die translationale Maschinerie in
Mitochondrien der bakteriellen sehr ähnlich
ist, dürfte IF2 hier dieselbe Funktion
ausüben.
In Archae und Eukaryoten dient IF2
demgegenüber der Bindung der großen
ribosomalen UE an die kleine.
Im Fall der leaderless mRNA kann ein Ribosom nur dann den Anfang der Translation finden,
wenn es über die Initiator-tRNA an an das Startcodon bindet. Zu diesem Zweck muss das
Ribosom bereits vor der Bindung an die mRNA einen Komplex mit der tRNA eingegangen
sein.
Um diese Situation zu begünstigen, kann mit Hilfe von Plasmiden die Konzentration von IF2
in der Zelle erhöht werden. Durch diese Konzentrationserhöhung sollte die Expression von
leaderless mRNA gesteigert werden.
Are leaderless mRNAs recognized by a 30S -initiator –tRNA complex?
Bei geringer IF2 Konzentration findet sich selten fMet-tRNA
Bindung an Ribosomen.
Bei hoher IF2 Konzentration findet sich
häufige fMet-tRNA Bindung an Ribosomen.
IF2: accelerates the formation of the codonanticodon interaction by promoting efficient
binding of fMet-tRNAfMet to the ribosomal PSite.
139
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Experiment: Competition Assay zur leaderless mRNA
In vitro translation competition assay with increasing concentrations of IF2
OmpA mRNA und cI mRNA werden in vitro translatiert. Abhängig von der hinzugefügten IF2
Konzentration steigt bzw. sinkt die Translation der cI mRNA, während die OmpA mRNA von
der IF2 Konzentration unabhängig konstant translatiert wird.
Die Konzentration von cI steigt proportional zur IF2 Konzentration, während OmpA von der
IF2 Konzentration unabhängig ist.
Selection of a 5'-terminal AUG and an internal canonical ribosome binding site in
the presence of IF2 and an IF2 mutant protein
Roter Punkt … normale mRNA wird in jedem
Fall translatiert.
Grüner Punkt … leaderless mRNA
-) -IF2: keine Bindung von Ribosom und
tRNA an leaderless mRNA, keine
Translation.
-) IF2 wt: Bindung an leaderless mRNA,
Translation
Es wird eine mRNA erzeugt, die mit einem
Startcodon (quasi leaderless) beginnt und
zusätzlich downstream eine SD Sequenz mit
normalem AUG Startcodon aufweist.Wird
damit ein Toeprint Assay durchgeführt
(ausreichend mRNA, 30S UE, Initiator-tRNA, anschließend reverse Transkriptase), wird sich
folgendes Geschehen auf wundersame Weise zutragen:
• ohne IF2 (Spalte –IF2) erhält man ein Toeprint Signal, das der Bildung des ribosomalen
Komplexes nur an der downstream liegenden Ribosomenbindungsstelle aufweist.
• wird IF2 hinzugefügt (Spalte IF wt), erhält man sowohl ein Toeprint Signal für die
Ribosomenbindungsstelle als auch für das einsam liegende Startcodon.
• fügt man mutiertes IF2 hinzu (IF R700T), das die Initiator-tRNA nur schlecht an das
Ribosom bindet, erhält man so gut wie kein Toeprint Signal für das einsam liegende
Startcodon.
Damit ist ersichtlich, dass IF2 für die Translation von leaderleass mRNA notwendig ist.
140
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Translational control of leaderless mRNA
•
•
•
no downstream cis-elements
IF2 (stimulates)
other components of the translational machinery?
Translation initiation factor 3
Fidelity Factor
• 70S dissociation factor
• Accelerates the rate of codon-anticodon interaction at the Psite.
• Discriminates against
- non-canonical start codons (AUU)
- 30S initiation complexes at 5' AUGs?
Sorgt dafür, dass ein Komplex nur dort gebildet wird, wo sich
tatsächlich eine Ribosomenbindungsstelle befindet.
IF3 diskriminiert gegen alle Codons außer AUG und verändert zu diesem Zweck die
Konformation des Ribosoms. Im Versuch mit leaderless mRNAs die als Startcodon AUU
benutzen, sinkt die Translation wenn IF3 hinzugefügt wird, da das Ribosom durch die
Konformationsänderung leicht von der mRNA abdiffundiert.
Experiment: Beweis, dass IF3 gegen leaderless mRNA selektioniert (Toeprint).
- Spezielle mRNA mit AUG am 5'-Ende und einem weiteren AUG mit vorgelagerter SD (siehe
vorne) 5'-AUG-SD-AUG-3'. + Ribosom + tRNAi. Ein Toeprint assay ergibt zwei Banden für
beide AUGs.
- Die Zugabe von IF3 mit anschließendem Toeprint Assay ergibt nur eine Bande für das AUG
mit SD Sequenz.
The translational efficiency of a leaderless mRNA is decreased at elevated levels of
IF3 in vivo
Relative IF2 and IF3 levels dertermine the translational efficiency of a leaderless
reporter gene in vivo
Expression von Leaderless mRNA:
+IF2, +IF3 … normale Expression
-IF2, +IF3 … niedrigste Expression
+IF2, -IF3 … höchste Expression
141
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Increased expression of a leaderless tetR-lacZ fusion in infC (IF3) mutant strains
Mittels Plasmid wird ein
leaderless tetR-LacZ
Fusionsgen eingebracht und
die Expression der ßGalactosidase überprüft.
Im Vergleich zum Wildtyp
findet sich in IF3 Mutanten
eine höhere Expressionsrate
der leaderless mRNA.
Kinetic discrimination against 30S initiation complexes at 5' AUGs
Links … leaderless mRNAs
können im Vergleich nur
schwach mit der 30S UE
interagieren.
Translation initiation pathways in Bacteria
Translation initiation of leaderless
mRNAs is not intrinsically controlled
but by components of the
translational machinery.
ad A) canonical mRNAs
ad B) leaderless mRNAs
Are non-dissociated 70S ribosomes capable of initiating translation at 5' terminal
start codons?
142
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Translation initiation with 70S ribosomes at 5'-terminal start codons but not at
internal starts!
Translation initiation with 70S ribosomes: an alternative pathway for leaderless mRNAs
Nucleic Acids Research, 2004, Vol.32, No.11 pp.3354-3363
Cross-linking of 70S monosomes results in selective translation of leaderless cI
mRNA
Upon inactivation of ribosome recycling factor the level of 70S monosomes is
increased
143
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Under these conditions the leaderless cI mRNA is preferentially translated
in vivo:
and in vitro:
Transfer of growing cells from 37 to 10-15°C triggers the cold shock response
•
•
•
Cells growth and protein synthesis stop and resume at lower rates after 1-4h.
A subset of cold shock proteins (CspA, CspB, CspG, CspI, ScdA, RbfA) is induced over 10fold.
A subset of proteins involved in housekeeping transcriptional / translational control (IF-2,
NusA, HN-S, Pnp, GyrA, RecA) is induced 2-10 fold.
Bakterien sind als Einzeller stark für Kälte anfällig und müssen sich vor den Folgen tiefer
Temperaturen schützen. E.coli besitzt beispielsweise Mechanismen, die es auch noch bei 5°10°C lebensfähig halten, auch wenn dabei der Stoffwechsel verlangsamt wird.
Zur Regulation auf Translationsebene werden bei tiefen Temperaturen sogenannte cold shock
proteins erzeugt. Es handelt sich dabei um RNA Chaperone bzw. Chaperonine, die
verhindern, dass sich RNA bei tiefen Temperaturen fehlerhaft faltet bzw. eine solche Faltung
verhindert, um die mRNA translatierbar zu halten.
Inefficient translation
Major problem: poor translation efficiency
• RBS and start codon insufficient to direct ribosome
binding
• Increased 2° structure
• Slow kinetics
144
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
CspA family
RNA Chaperon
CspA: 7kD; 10% CS protein synthesis
• five antiparallel ß strands
• RNA-binding motifs in ß2 and ß3
• binds RNA with low affinity, without sequence specificity
• aromatic residues on surface important for nucleic acid binding
• increases translation rate of mRNA
• increases suscepribility of RNA to RNase attack
CspB, CspG, CspI: related to CspA; cold shock inducible
Cold shock proteins facilitate translation (initiation) by acting as RNA chaperones
From initiation to elongation
Zu Beginn der Elongation müssen die Initationsfaktoren
vom Ribosom gelöst werden. Anschließend bindet eine
50S UE, es wird der 70S Initiationskomplex gebildet, in
dem fMet-tRNA an der P-Site gebunden und die A-Site
unbesetzt ist, da hier IF2 die Bindung von tRNAs bisher
verhindert hat.
Für die Elongation sind die Faktoren EF-Tu, EF-Ts und EFG essentiell. Diese Faktoren sind für Bakterien spezifisch,
es gibt kaum Homologien zu eukaryotischen Faktoren.
Daher wäre hier ein guter Ansatzpunkt für Antibiotika.
Viele Imidazolverbindungen stören die Interaktion
zwischen EF-Tu und EF-T, Kirromycin bindet EF-Tu an das
Ribosom, wodurch die weitere Translation unterbrochen
wird.
145
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Each ribosome has a binding site for mRNA and three binding sites for tRNA
molecules
•
•
•
The P site holds the tRNA carrying the growing polypeptide chain.
The A site carries the tRNA with the next amino acid.
Discharged tRNAs leave the ribosome at E site.
Elongation cycle
Elongation factors:
• EF-Tu
• EF-Ts
• EF-G
EF-Tu & EF-G are small GTP-binding proteins.
Colors: large ribosome subunit, cyan; small
subunit, pale yellow; EF-Tu, red; EF-G, blue.
tRNAs, gray, magenta, green, yellow, brown.
•
•
Ablauf der Elongation:
• Eine aa-tRNA (Aminoacyl-tRNA) kommt
daher und wird durch aktives EF-Tu-GTP
(rot) gebunden (Ausnahme: fMet-tRNA).
EF-Tu-GTP bringt die aa-tRNA zur A-Site
eines Ribosoms, dessen P-Site bereits
besetzt ist. Bindet eine aa-tRNA in der ASite, wird die tRNA ohne AS aus der E-Site
freigesetzt.
Das gebundene GTP wird gespalten, EF-Tu-GDP wird freigesetzt, ist in dieser Form
inaktiv und bindet deshalb aa-tRNA nicht effizient.
Um den Faktor EF-Tu wieder in die aktive Form zu überführen, wird durch den Faktor EFTs das gebundene GDP mit GTP ausgetauscht.
Nachdem eine aa-tRNA an der A-Site gebunden hat und EF-Tu sich vom Ribosom gelöst
hat, wird die Polypeptidkette von der tRNA in der P-Site mit der neuen AS der tRNA in der
A-Site verknüpft.
Es gibt keine Peptidyltransferase, die Peptidbindungen knüpft, dieser Vorgang wird von
der 50S UE durchgeführt, die rRNA dient als Ribozym. Im Detail wird ein durch das
Ribozym dirigierter nucleophiler Angriff durch die AS in der A-Site auf die C-terminale
Carboxylgruppe der Peptidkette in der P-Site durchgeführt.
Anschließend bindet das Motorprotein EF-G, das das Ribosom unter Hydrolyse von GTP
um ein Codon weiterschiebt, EF-G löst sich wieder vom Komplex ab. Die unbeladene
tRNA liegt jetzt in der E-Site und kann das Ribosom verlassen, die tRNA mit der
Polypeptidkette liegt in der P-Site, die A-Site ist leer.
146
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Elongation of translation in bacteria
Das Anticodon der aa-tRNA bindet an die A-Site der 30S
UE. Codon-Anticodon-WW bewirken eine
Konformationsänderung von EF-Tu und die Hydrolyse von
GTP.
EF-Tu ist in der Lage, Proofreading zu vermitteln. Bringt
EF-Tu eine aa-tRNA zur A-Site, deren Anticodon das
aktuelle Codon der mRNA nicht vollständig bindet, liegt
EF-Tu nicht korrekt in das Ribosom eingebettet, GTP wird
nicht gespalten und der Faktor dissoziiert mit der tRNA
wieder ab, bevor die AS in das Peptid eingebaut werden
kann.
Die Fehlerrate der Translation liegt bei 10-4 (alle 500010000 AS ein Fehler). Fehlerhafte Proteine werden
abgebaut, nachdem von jeder mRNA mehrfach Proteine
erzeugt werden fallen einige fehlerhafte Proteine
üblicherweise nicht ins Gewicht.
As the aa-tRNA is deliverd by EF-Tu to the A site on the
ribosome, GTP on EF-Tu is hydrolyzed to GDP + Pi, which
promotes dissociation of EF-Tu.
The hydrolysis depends on codon-anticodon recognition correctly
positioning the aa-tRNA in relation to the large ribosomal
subunit.
EF-Tu colored red.
Molecular Mimicry
Durch Röntgenstrukturanalyse ist bekannt, dass
sich die Faktoren EF-G sowie EF-Tu das aa-tRNA
gebunden hat strukturell sehr ähnlich sind. Man
spricht in diesem Zusammenhang von molecular
mimicry, die ähnliche Form ermöglicht Interaktion
mit derselben Site (A-Site).
Gemeinsamkeiten von EF-Tu und EF-G:
• sind sich strukturell sehr ähnlich.
• beide sind aktiv wenn GTP gebunden und
inaktiv wenn GDP gebunden ist.
• es kann nur entweder EF-Tu oder EF-G an
Ribosom binden.
147
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
The N on the incoming aminoacid makes a nucleophilic attack on the activated carboxyl
group of the growing chain to form the new pepride bond.
Das Peptidyltransferasezentrum liegt in der 23S rRNA der
50S Untereinheit. Hier kommen sich Amino- und
Carboxylgruppen einander physisch so nah, dass eine
Bindung mittels Konformationsänderung der umgebenden
RNA vermittelt werden kann.
Ribosome Structure and the Mechanism of Translation
Cell, Vol.108, 557-572, February 22, 2002, ©2002 by Cell Press
Drittes Bild:
Anscheinend ist die
neu mit der
Peptidylkette beladene
ehemalige AminoacyltRNA schon irgendwo
auf A- UND P-Site. EF-G-GTP sorgt für die endgültige
Translokation zur P-Site.
148
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
EF-G-GTP binds in the vicinity of the A site.
EF-G-GTP binding my push the tRNA with attached
nascent polypeptide from the A site to the P site.
Unloaded tRNA that was in the P site shifts to an
exit site.
Since rRNAs are linked to mRNA by codonanticodon base pairing, the mRNAs would move
relative to the ribosome.
Wird GTP durch das ähnliche
Molekül GMP-PCP ersetzt, ist
EF-G-GMP-PCP zwar in der
Lage an die A-Site zu binden.
Ohne die Hydrolyse von GTP
verläuft aber die
Translokation sehr langsam
und EF-G wird nicht (oder nur
schlecht?) freigesetzt.
Elongation Cycle of protein biosynthesis
Incorporation of unusual amino acids: the 21st and 22nd amino acids
Selenocysteineis the major biological form of selenium (Se)
Bei Selenocystein handelt es sich um Cystein, das mit
Selen modifiziert wurde. Selen wird im aktiven Zentrum
einiger Enzyme benötigt; z.B. Deiodinase,
Glutathionperoxidase zur Inaktivierung freier Radikale in
Säugern, Formatregulon zum Formatabbau in E.coli.
Die tRNA für Selenocystein wird folgendermassen erzeugt. Eine spezielle tRNA, sec-tRNA,
bindet zunächst über eine spezifische Aminoacyl-tRNA Synthetase Serin. Ein Enzym wandelt
die tRNA in Aminoacrylyl-tRNA um. Ein weiteres Enzym hängt Cystein und Selen an, wodurch
Selenocysteyl-tRNA entsteht, die jetzt als tRNA für Selenocystein dient.
149
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Translational recoding mechanisms
Se-Cys Insertion
Selenoprotein synthesis
A. Böck, K. Forchhammer, J.
Heider and C. Baron
TIBS (1991) 16:463
Diese Enzyme katalysieren oft
Oxidationen / Reduktionen.
Enthalten meist ein
Selenocystein, das einen Teil
des aktiven Bereichs darstellt.
The genes coding for these enzymes have stop codons!!
Selenocystein wird in der mRNA über ein
Stopcodon codiert. Im Normalfall können
diese Proteine daher nicht translatiert
werden.
In Bakterien wurde zusätzlich zu EF-Tu, EFT und EF-G ein weiterer Elongationsfaktor,
SELB, gefunden.
SELB hat dieselbe Funktion wie EF-Tu, nur
dass es einzig Selenocysteyl-tRNA bindet
und zur A-Site des Ribosoms transportiert.
Das Anticodon der sec-tRNA
komplementiert das Stopcodon der mRNA
und kann an der A-Site binden. Zur Bindung
von SELB an die A-Site des Ribosoms ist
noch ein zusätzlicher Faktor nötig, um zwischen normalen Stopcodons und für Selenocystein
codierenden Codons unterscheiden zu können.
Model of selenocysteine insertion by bacteria
Changes in codon meaning can be caused by mutant
tRNAs or by tRNAs with special properties.
The reading frame can be changed by frameshifting or
bypassing, both of which depend on properties of the
mRNA.
In Bakterien bildet die mRNA direkt nach einem
Stopcodon, das für Selenocystein codiert, eine
Sekundärstruktur (Hairpin) aus. Erst durch die Bindung an
diese Hairpinstruktur ermöglicht es SELB an die A-Site
des Ribosoms binden zu können.
In Archae und Eukaryoten bildet sich diese
Sekundärstruktur am Ende der mRNA aus, SelB bindet
daran, führt eine Konformationsänderung der mRNA
durch und fügt die Selenocysteyl-tRNA erst bei dem dafür
vorgesehenen Stopcodon hinzu.
150
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
tRNAsec and SELB
SELB unterscheidet sich von EF-Tu durch eine zusätzliche Domäne am deren C-terminalem
Ende, über welche die spezifische Sekundärstruktur der mRNA (SECIS) gebunden wird.
Insertion of selenocysteine at UGA codons requires a selenocysteine insertion
element (SECIS)
Bacteria: One protein, two functions
Mammals: Two proteins,
Archaea: one function?
Methanococcus maripaludis
Leibundgut et al. (2005) Embo J. 24:11
151
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Programmed frameshifting
+1 Frameshifting
In decoding E. coli release factor 2, the frameshifting occurs early in the coding sequence
and is required to give a functional product.
+1 frameshifting … der Leserahmen verschiebt sich um ein nt downstream.
-1 Frameshifting: E. coli dnaX
dnaX encodes two subunits (tau and gamma) of DNA polymerase III, the main replicative
polymerase. Tau results from standard decoding, and gamma from 50% of the ribosomes
shifting to the 21 frame two-thirds of the way through the coding sequence and terminating
one codon later at a UGA stop codon.
-1 frameshifting … der Leserahmen verschiebt sich um ein nt upstream.
Frame shifting ist sowohl in Pro- als auch in Eukaryoten weit verbreitet. Frameshifiting kann
der Regulation bestimmter Gene dienen, indem z.B. Stopcodons gelesen oder nicht gelesen
werden. Frame shifting wird durch Faktoren z.B. RF2 vermittelt.
+1 frameshifting
E. coli release factor 2 gene
RF2 (Release Factor) bindet in der ASite an UGA Stopcodons und
terminiert die Translation, indem die
Polypeptidkette auf ein H2O
übertragen und dadurch freigesetzt
wird.
Autoregulation: Im Beispiel
terminiert RF2 die Translation der
eigenen mRNA an einem nach
einigen Codons liegenden UGA
relativ rasch, wenn seine
Konzentration hoch genug ist.
Liegt RF2 in geringer Konzentration vor, stoppt das Ribosom am UGA, ohne dass die
Translation sofort durch RF2 abgebrochen wird. Upstream dieses UGA befindet sich eine SD
ähnliche Sequenz, das Ribosom bindet an dieser Sequenz neu und startet die Translation
neu. Durch diese Wanderung des Ribosoms kommt es zu einem +1 frameshift, wodurch das
Ribosom das Stopcodon an dem es zunächst gestoppt war, nicht mehr als UGA sondern als
GAC liest und weitertranslatieren kann.
Der reading frame stimmt hier also nicht mit dem tatsächlich synthetisierten Produkt
überein. Dieser Umstand ist bei Proteinsequenzierungen z.B. mittels Edman-Abbau zu
beachten.
Experiment: Test auf +1 frame shift:
Die SD-ähnliche Sequenz auf der mRNA wurde mit der Anit-SD Sequenz auf einer 16S rRNA,
die gegen Spectomyzin resistent ist, vertauscht. Mittels Plasmid werden beide Sequenzen
(veränderte mRNA, resistente, veränderte 16S rRNA) in Bakterien eingebracht und diese auf
ein Medium mit Spectomycin übertragen.
Nachdem man das passende Genprodukt erhält, kann man schließen, das das Ribosom
tatsächlich während der Translation erneut bindet und einen frameshift durchführt.
(Naja … kann an sich nur funktionieren, wenn man entweder wie im Bild oben angedeutet
eine leaderless mRNA hat oder auch die erste SD Sequenz auf der mRNA mit der Anti-SD
Sequenz vertauscht. Außerdem muss man noch irgendwie die RF2 Konzentration in den
Bakterien beinflussen, damit sie niedrig ist bzw den Test in vitro mit allen nötigen
Komponenten + Spectinomycin durchführen. Denk ich mir halt.)
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Experiment: Prinzipeller Test auf Frameshift:
Man baut ein Reportergen (z.B. LacZ) in das Gen ein, in dem ein Frameshift vermutet wird.
Je nachdem wie man das RG eingbaut - ob die Translation ohne oder nach erfolgtem
vermuteten frameshift stattfinden soll – kann über entstandenes Produkt ermittelt werden,
ob frameshift stattfand oder nicht.
The programmed +1 frameshifting in decoding the Escherichia coli gene for RF2
Frameshifting in the E. coli dnaX gene
The τ (normal translation) and γ subunits (–1
frameshifting) are derived from the dnaX gene
The programmed –1 frameshifting in decoding the Escherichia coli dnaX gene
Normalerweise wird das dnaX Gen vollständig
translatiert, als Produkt entsteht die γ UE der DNA
Pol III.
Es kann sich aber eine Hairpinstruktur ausbilden,
an der die Translation verzögert wird. Weiter
Upstream findet sich eine SD ähnliche Sequenz.
Wenn die 16S rRNA anti-SD Sequenz im Zuge der
Verzögerung daran bindet, kommt es zu einem -1
Frameshift. Durch den Frameshift wird ein bisher
als GAA gelesenes Codon zu einem UGA, die
Translation wird vorzeitig abgebrochen. Das so
freigesetze Protein dient als τ UE der DNA Pol III.
dnaX Frameshifting cassettes from different bacteria
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
+1 frameshifting
Mammalian antizyme gene
•
•
•
•
In Säugern werden Polyamine mittels Ornithindecarboxylase
(OCD) aus Ornithin erzeugt.
Die Konzentration von Polyaminen muss reguliert werden, da
sie an mRNA binden können und dadurch Pseudoknoten
bilden, die Ribosomen verzögern und dadurch für frameshifts
notwendig sind.
OCD wird durch ein Antizym abgebaut. Die mRNA des
Antizyms weist ein frühes Stopcodon auf, an dem die
Translation üblicherweise vorzeitig abgebrochen wird.
Ist die Polyaminkonzentration hoch, erzeugen die Polyamine
in der mRNA des Antizyms einen Pseudoknoten, der die
Translation vor dem UGA verzögert, das Ribosom führt einen
+1 frame shift durch, statt dem Stopcodon wird GAU gelesen,
die Translation kann fortgeführt und Antizym erzeugt werden.
OCD wird abgebaut, es wird kein neues Polyamin erzeugt.
Translational Introns
Unter translationalen Introns versteht man mRNA-Bereiche, die vom Ribosom während einer
laufenden Translation übersprungen werden. Dabei kann das
Ribosom im Leserahmen bleiben d.h. ganze Codons überlesen oder in einen anderen
Leserahmen wechseln.
Translational introns: an additional regulatory element in
gene expression
TIBS 18 – August 1993
Rate of translation low > frameshifting high
Test: Insert stop codons in non translated region.
Synthesis of trans-dominant inhibitor.
Beispiel T4 Gen 60: Hier bildet sich im codierenden
Bereich der mRNA eine Sekundärstruktur. Das Ribosom
ignoriert diesen einige hundert nts langen Bereich und
translatiert nur die ungebunden vorliegenden Bereiche der
mRNA, ohne die Translation zu unterbrechen.
Beispiel Repressor trpR: Der Repressor besitzt am Nterminalen Ende eine Dimerisierungs- am C-terminalen
Ende eine DNA-Bindungsdomäne und ist als Dimer aktiv,
wenn die mRNA dieses Repressors normal translatiert
wird.
In 10-15% der Fälle wird ein Teil der mRNA (55nt) nicht
translatiert und das Ribosom geht nach em Ende des
ignorierten Stückes um -1 versetzt in einen anderen
Leserahmen über. Dem auf diese Art erzeugte Repressor
fehlt die C-terminale DNA-Bindungsdomäne. Dieser
Repressor kann mit normal translatierten Repressoren ein
Dimer bilden, das Dimer kann aber nicht mehr an DNA
binden und seine Funktion ausüben. Auf diese Art wird die
Konzentration des effektiven Repressors in der Zelle
reguliert.
No other product
154
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Experiment: Test auf Translationale Introns
Vermutet man ein Translationales Intron, führt man im Leserahmen ein Stopcodon in diese
Intronsequenz ein.
Handelt es sich tatsächlich um ein Intron, wird die Translation nicht unterbrochen, man
erhält trotz eingeführtem Stopcodon ein Produkt, da das Intron vom Ribosom übersprungen
wird.
T4 DNA topoisomerase gene 60 bypassing
Requirements:
• matching GGA codons flanking an optimally sized 50
nt coding gap
• a stop-codon
• a nascent peptide signal
Bypassing steps
Translation termination
Bacteria:
RF1: UAA / UAG
RF2: UAA / UGA
RF3: stimulates RF1 + RF2
Bei Prokaryoten finden sich drei
Releasefaktoren RF1-3. RF1 bindet
die Stopcodons UAA und UAG, RF2
bindet UAA und UGA. RF3 stimuliert
die Bindung von RF1 bzw. RF2.
Die Releasefaktoren haben
strukturelle Ähnlichkeit mit EF-Tu
und EF-G, da auch sie an der A-Site
binden (molecular mimicry).
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
A Posttermination Ribosomal Complex is the Guanine Nucleotide Exchange Factor
for Peptide Release Factor RF3
Cell, Vol.107, 115-124, October 5, 2001, Copyright ©2001 by Cell Press
ad II) Das Polypeptid
wird von der PeptidyltRNA in der P-Site auf
H2O übertragen und
dadurch freigesetzt.
Recycling of ribosomes: The ribosome recycling factor (rrf)
rrf ... ribosome recycling factor, ähnelt strukturell
den Elongations- und Releasefactoren, im
Gegensatz zu diesen wandert er aber nicht in die
A-Site, sondern interagiert außerhalb mit dem
Ribosom.
Ist RF3 vorhanden, bindet rrf an das Ribosom. EFG dringt in die A-Site ein, das Ribosom wird unter
GTP Verbrauch vorwärts geschoben, wodurch sich
die 50S UE von der 30S UE ablöst und freigesetzt
wird.
Die 30S UE ist immer noch an die mRNA
gebunden. Interagiert sie mit IF3, das ja gegen
alle tRNAs außer fMet-tRNA diskriminiert, löst sich
auch die 30S UE von der mRNA, da sich an dieser
Stelle kein AUG befindet.
rrf ist bei einer Temperatur von 28°C aktiv und
inaktiviert sich ab einer Temperatur von 42°C. Ab
einer Temperatur von 42°C können Ribosomen
somit nicht mehr von mRNA gelöst werden, die
Zelle wird absterben. rrf kommt in Prokaryoten und Archae vor, nicht aber in Eukaryoten,
hier wäre wieder eine gute Ansatzmöglichkeit für Antibiotika.
Crystal Structure of Thermotoga maritima Ribosome Recycling Factor: A tRNA
mimic
Science (1999) 286:2349
(A) RRF zeigt Ähnlichkeit mit tRNA und mit
Domäne 3-4 von EF-G.
(B) links EF-G, rechts EF-Tu + tRNA
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V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
The final steps of 70S disassembly require EF-G + IF3
Schritt 4 … RRF bindet an die A-Site.
Schritt 5 … RRF und EF-G bewirken mittels
GTP Hydrolyse die Dissoziation
der 50S UE vom 70S Ribosom.
Schritt 6 … IF3 bindet an die 30S UE und,
löst die deacetylierte tRNA ab
und verhindert eine
Reassoziierung von 30S und
50S UE.
Bläsi, Foliensatz 4
Abbau von mRNA
Transcription-Translation-Degradation
Chemical and functional half-lives of mRNA
Chemical half-lives of mRNA
transcripts correspond to 50%
decrease in the concentration of the
corresponding full-length transcripts
after transcription has been blocked,
e.g., inhibition of RNA polymerase by
rifampicin.
157
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Differential mRNA stability in E. coli
Differential mRNA stability of:
• individual monocistronic mRNAs
• segments within polycistronic transcripts
In Prokaryoten liegt die Halbwertszeit von
mRNA zwischen Sekunden und einigen
Minuten, in Eukaryoten kann sie von 30
Minuten bis zu 25 Stunden betragen. Der
hohe Turnover in Bakterien ergibt sich
durch das schnelle Wachstum.
E. coli RNases
RNasen sind für Prozessierung von RNA (insbesonders tRNA) sowie für den Abbau von RNA
verantwortlich. Exoribonucleasen bauen mRNA vom Ende her ab, Endoribonucleasen spalten
mRNA in der Sequenz.
Prokaryoten besitzen nur Exoribonucleasen, die mRNA vom 3' Ende her abbauen.
Eukaryoten haben sowohl Exoribonucleasen die mRNA vom 3' Ende, als auch solche, die vom
5' Ende her abbauen.
Endoribonucleases:
RNase E
RNase I
RNase III
RNase HI and HII
RNase P
Exoribonucleases:
PNPase
RNase II
Oligoribonuclease
RNase PH, RNase D
RNase R, RNase BN,
RNase T
Degradosom (E.coli)
• bestehend aus RNase E (Endonuclease), PNP (Polynucleotid Phosphorylase),
Helicase (RhlB), DnaK.
• RNase E ist der Hauptfaktor des Komplexes. Er schneidet Einzelstrang RNA, bevorzugt
hinter stem loop Strukturen.
• Helicase entwindet Sekundärstrukturen unter ATP Verbrauch.
• PNP (Exonuclease) baut mRNA in 3'-5' Richtung ab. Sie ist eine einzelstrangspezifische
Nuclease, ihre Funktion wird durch Sekundärstrukturen unterbunden.
• Dna K … Protein Chaperon
• RNase III ist nicht Teil des Degradosoms, schneidet Doppelstrang RNA und löst damit
Sekundärstrukturen.
Experiment: Nachweis einer bestimmten mRNA in einer Zelle
•
•
•
•
•
•
Voraussetzung ist, dass die Sequenz bekannt ist. Es werden radioaktiv markierte, zur
Sequenz komplementäre Oligonucleotide synthetisiert.
Zellen werden mit heißem Phenol lysiert, Proteine werden dadurch denaturiert.
Das Lysat wird zentrifugiert, im Überstand finden sich Nucleinsäuren.
Es werden DNasen hinzugefügt, die vorliegende DNA abbauen.
Die verbleibende RNA wird mit Formamid vermischt, wodurch die RNA denaturiert.
Die denaturierte RNA wird mit den Oligonucleotiden vermischt und über ein Gel nach
Größe getrennt, die amorphe Masse der mRNAs liegt irgendwo zwischen tRNA und rRNA.
Befindet sich die gesuchte mRNA unter der Menge der RNAs, wird man mittels
Röntgenfilm eine Bande erkennen können.
158
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Experiment: Nachweis von welchem Ende her mRNA abgebaut wird
•
•
•
•
•
•
Es werden mRNAs mit einer Mindestlänge von 2knt benötigt, da kürzere mRNAs zu
schnell abgebaut werden.
Es werden Sonden synthetisiert, die entweder an das 3' oder das 5' Ende einer mRNA
binden, bevor diese abgebaut werden.
Um eine Aussage über den Abbau von mRNA zu machen, muss die Transkription
vollständig gestoppt werden, damit keine neue mRNA mehr produziert wird. Zu diesem
Zweck wird Rifampicin verwendet.
Zu Zeitpunkt 0 wird Rifampicin hinzugefügt
Zu späteren Zeitpunkten (t=0, t=1, t=2, etc) wird die Gesamt-mRNA extrahiert und auf
ein gemeinsames Gel in verschiedenen Banden aufgetragen. Mittels Sonden die an den
Enden der mRNA binden sieht man, dass die Menge der mRNA mit fortschreitender Zeit
abnimmt.
Fügt man einer Probe Sonden dazu die entweder nur am 3' oder nur am 5' Ende binden,
sollte man nach einiger Zeit das Signal nicht mehr erhalten, von dem Ende her die mRNA
abgebaut wird, da diese Enden schlicht und ergreifend (schluchz) bereits abgebaut
wurden.
mRNA decay in E. coli: RNases
Escherichia coli RNase E
159
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Effect of 5' basepairing on the stability of ompA mRNA
E. coli polynucleotide phosphorylase (PNPase)
Stability determinants of mono-and polycistronic transcripts
160
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
5' stability determinants
3' stabilizers
3' stem-loop structures protect mRNA from 3' exonucleases
mRNA decay in E. coli
161
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Purification of the degradosome components
Beim Degradosom
handelt es sich eben
nicht um eine einzige
RNase, sondern um
einen Proteinkomplex.
E. coli RNA Degradosome
The arginine-rich RNA-binding domain of RNase E retains the target RNA until the
catalytic domain completes cleavages
162
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
RhlB helicase
Binding to RNase E
stimulates RhlB ATPase
activity
Helicase-facilitated
degradation of an
internal RNA stem-loop
structure. Without RNA
helicase activity,
progression of the exonuclease (yellow) is blocked by the stemloop structure (pausing). The RNA helicase (orange) hydrolyzes
ATP to anwind the stem-loop, facilitating RNA degradation by the
exonuclease.
E. coli Poly (A) polymerase I (PAPI)
Poly-A Sequenzen von 10-40nt
Länge fungieren in E.coli als
Bindungsstelle für Nucleasen.
Degradation of stem-loops with different length of poly (A) tails
Bei der nicht rhoabhängigen
Termination der
Transkription bildet
sich am 3' Ende der
mRNA ein stem-loop,
der der mRNA
zusätzliche Stabilität
verleiht, da
Exonucleasen keine
doppelsträngige RNA
abbauen können.
Je länger allerdings ein Poly A Schwanz nach einem Stem Loop ist, desto schneller kann die
mRNA abgebaut werden, da die Bindung des Degradosoms an das 3' Ende besser wird und in
Folge mittels Helicase den Stem Loop auflösen kann.
163
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
30S ribosomal subunits and endoribonuclease compete for 5' UTRs of E.coli
transcripts
mRNA stability and translation
1. Transcriptional decoupling (weak ribosome binding sites, T7 RNA polymerase)
2. Trans-translation
Unmasking of nucleases-sensitive sites by desynchronization of transcription and
translation
Sequence and secondary structure of the E. coli ompA 5' UTR
164
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
The ribosome protects from RNase E cleavage at the 5'-end
Experiment: Test auf Zusammenhang zwischen effizienter Translation und
mRNA Stabilität
An efficient Shine-Dalgarno sequence but not translation is necessary for lacZ mRNA stability
in Escherichia coli
Journal of Bacteriology, Mar. 1994, p.1683-1688, Vol.176, No.6
•
•
•
•
•
Die SD Sequenz eines lacZ Gens wird durch eine effizientere SD Sequenz ersetzt (gelb
markiert).
Über die effizientere SD Sequenz bildet sich ein starker ternärer Komplex, Ribosomen
sind häufig an mRNA gebunden, die mRNA wird stark translatiert.
Das Degradosom kann nicht schneiden, da translatierende Ribosomen Ansatz- und
Schnittstellen verdecken.
Im Versuch steigt die Halbwertszeit der mRNA mit einer effizienten SD Sequenz auf 2,8
Minuten.
Wird die SD Sequenz so verändert, dass Ribosomen nur schlecht daran binden können,
verkürzt sich die Halbwertszeit auf 1,3 Minuten.
Die Halbwertszeit einer mRNA steigt mit der Translationsrate, je stärker sie translatiert wird,
desto stabiler wird sie.
Mittels Chloramphenicol, das die Translation verzögert, lässt sich die Stabilität von mRNA
ebenfalls erhöhen, da Ribosomen länger an die mRNA gebunden bleiben.
165
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Trans-translation
•
•
•
mRNA weist normalerweise ein
Stopcodon am Ende der codierenden
Sequenz auf.
• Exonucleasen die vom 3' Ende her
mRNA abbauen entfernen Stopcodons,
sie stehen nicht mehr für den Abbruch
der Translation zur Verfügung.
• Wird eine mRNA ohne Stopcodon von
Ribosomen translatiert, bleiben diese am
Ende der mRNA gebunden ohne sich zu
lösen.
• Zur Auflösung dieser Situation werden
die speziellen RNAs tmRNA oder SsrA
verwendet. Es handelt sich dabei um
eine 10S RNA, die wie eine tRNA mit
Alanin beladen ist, weiters aber noch
eine spezielle RNA Sequenz
aufweist ("Tag Sequenz"), die vom Ribosom translatiert werden kann und mit einem
Stopcodon endet.
tmRNA tritt in die ribosomale A-Site ein (EF-Tu wird benötigt), das bereits translatierte
Polypeptid wird auf Alanin übertragen. Anschließend wird die Sequenz der 10S RNA
translatiert, über das Stopcodon werden Polypeptid freigesetzt und das Ribosom von der
mRNA gelöst.
Durch die "Tag" Sequenz ist das Polypeptid für den Abbau durch Proteasen markiert.
tmRNA structure
Potential mechanisms for SsrA recruitment
166
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Trans-Translation
Degradation of a SsrA-tagged substrate by the ClpXP complex
Model for binding, spontaneous denaturation and degradation of an SsrA-tagged
substrate by Tsp protease
Summary
167
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Regulation of Gene Expression in Eukaryotes
In Eukaryoten sind Transkription und Translation räumlich getrennt, Transkription findet im
Nucleus statt, das Transkript wird modifiziert und ins Cytosol transportiert, wo die
Translation stattfindet.
Das Transkript von Eukaryoten ist nicht direkt translationsfähig, sondern in codierende Exons
und nicht codierende Introns aufgeteilt. Diese Introns müssen zuerst aus der mRNA entfernt
werden, bevor eine Translation stattfinden kann.
mRNA processing: Nuclear Splicing
hn RNA … heterogeneous
nuclear RNA
Vor der Entfernung der
Introns wird diese so
genannte prä-mRNA
modifiziert. Am 5' Ende wird
eine so genannte CAPStruktur angebracht, am 3'
Ende werden bis zu 200 A
angehängt (PolyA-Schwanz).
Diese Modifikationen sind für
die Translation der mRNA
essentiell.
Der Vorgang bei dem die
Introns aus der prä-mRNA
entfernt und die Exons
zusammengefügt werden, wird als Spleißen (splicing) bezeichnet und durch einen Komplex
(Spliceosom) durchgeführt, der aus Proteinen und RNAs (hnRNAs, snRNAs) besteht.
hallmark of nuclear pre-mRNA introns
5' Splice Site: GT
3' Splice Site: AG
short consensus sequences at the exon-intron boundary
168
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Wird eine mRNA aus der gesamten RNA einer eukaryotischen
Zelle mittels Northern Blot untersucht und entsprechend
markiert, so findet sich nicht eine, sondern mehrere Banden, je
nachdem wie viele Introns bereits aus der prä-mRNA gespleißt
wurden.
Splicing is a two stage process involving many steps
•
•
•
Das Spliceosom erkennt
die für das Splicen
notwendigen 5' (GU) und
3' (AG) Sites auf der
mRNA, bringt sie in
räumliche Nähe und
vermittelt so eine
Transesterifizierung mit
zwei aufeinander
folgenden nucleophilen
Angriffen.
• Im Intron findet sich eine
so genannte Brach Site,
die ein A enthält. Das OH
dieses As führt einen
nucleophilen Angriff auf
die Phosphoesterbindung
der 5' Site durch. Es
entsteht die Lariatstruktur
und ein freies OH an der
5' Site.
Dieses freie OH der 5' site führt einen dirigierten
nucleophilen Angriff auf die 3' Site des Introns durch,
wodurch das Lariat freigesetzt und die beiden Exons
miteinander verknüpft werden.
Das freigesetzte Lariat wird für den Abbau wieder in
lineare Form überführt. Lariat ist mittels
Gelelektrophorese gut nachzuweisen.
169
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Spleißen ist kein enzymatischer, sondern ein
autokatalytischer, das Spliceospm bringt die miteinander
interagierenden Teil in räumliche Nähe, damit die Aktion
ablaufen kann. Der Vorgang wird durch RNAs vermittelt,
die durch gebundene Proteine korrekt positioniert werden.
hnRNAs müssen aus dem Zellkern exportiert werden, im
Cytosol binden sie an die benötigten Proteine und werden
anschließend wieder in den Nucleus importiert.
snRNAs des Spliceosoms müssen für Faltung ins
Cytoplasma transportiert werden. Für diesen Transport
werden zahlreiche Exportproteine benötigt.
Im Cytoplasma werden die snRNAs freigesetzt, die
Faltung wird durch hfq ähnliche SM Proteine und RNasen
durchgeführt.
Durch Importproteine werden die gefalteten snRNAs
zurück in den Nucleus transportiert.
(1) U1 bindet an 5' Splicestelle, U2AF
(Auxilary factor) bindet an Pyrimidin
(2) U2 bindet mittels ATP Hydrolyse an
die Branch site
(3) U5/U4/U6 Trimer bindet das Exon an
der 5' Site über U5 und U2 über U6.
(4) U1 wird freigesetzt, U5 rutscht vom
Exon zum Intron, U6 bindet an 5'
Site
(5) Durch ATP Hydrolyse wird U4
freigesetzt. Das verhindert eine
Interaktion von U6 mit U4 (da U6
Bindungsstelle schon von U4 besetzt
bzw blockiert) … siehe Fig. 22.12
Paarung von U6 mit U2
- U6/U2 katalysieren
Transesterifizierung
- U5 bindet Exon an 5' Splicestelle
- 5' Site wird geschnitten … es bildet
sich Lariat
(6) U2/U5/U6 an Lariat gebunden
3' Site wird geschnitten und Exons
ligiert.
(7) gespleißte RNA wird freigesetzt und
Lariast linearisiert (und abgebaut).
170
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Mit Ausnahme von U6, das durch LSM Proteine gebunden
wird, interagieren alle snRNAs mit SM Proteinen. SM
Proteine binden snRNAs über PuAU3-6Gpu Sequenz.
Bei Pflanzen finden sich 30
Faktoren die beim Spleißen
eine Rolle spielen.
Viele Krankheiten sind auf
fehlerhaftes Spleißen
zurückzuführen und führen zu
teils schwerwiegenden
genetischen Erkrankungen.
U1-snRNP-Synthese
Spliceosomal UsnRNP biogenesis, structure and function
Current Opinion in Cell Biology 2011, 13:290-301
Schritt 1) U1 snRNA … Capping
Schritt 2) durch Export-Faktoren
wird snRNA ins Cytoplasma
transportiert
Schritt 4) Binden der Sm Proteine an
Sm-Sequenz der snRNA
Schritt 5) Cap Hypermethylierung, 3'
Trimming
Schritt 7) Import
Schritt 8) Binden der U1 spezifischen
Proteine an U1-snRNA + SmProteine
171
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Group I and group II Introns: Organelles and bacteria fold into a typical secondary
structure
Es gibt drei Splicereaktionen:
a) Group I Introns … autokatalytisch, in Organellen und
Bakterien
b) Group II Introns … autokatalytisch, in Organellen und
Bakterien
c) nukleares Splicing … benötigt Spliceosom für Splicen
(snRNPs)
Group I Introns: self splicing
Die Exons befinden sich weit auseinander, Introns sind
relativ linear und zirkularisieren, sie bilden kein Lariat.
• 3' OH Ende eines freien G greift 5' Ende des Introns an
• 3' OH Ende von Exon 1 greift 5' Ende von Exon 2 an
• 3' Ende von Intron greift 5' von Intron an
Group II Introns: self splicing
Sie weisen eine spezielle Sekundärstruktur auf, Exons
befinden sich dadurch räumlich näher beieinander. Sie
spleißen ausschließlich autokatalytisch, es wird ein Lariat
gebildet.
• OH Gruppe eines freien A attackiert
Phosphodiesterbindung zwischen Exon 1 und Intron.
• 3' OH greift Bindung zwischen Intron und Exon 2 an.
Nuclear Splicing und Group II Splicing ähneln sich bei
der Bildung des aktiven Zentrums.
172
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Group I introns:
•
•
•
•
Nuclei of lower eukayotes
Fungal mitochondria
Phage T4
Bacteria
Self-splicing / autosplicing
Das Splicing der Group I Introns benötigt ein
monovalentes und ein bivalentes Kation sowie einen
Cofaktor. Es wird keine Energie in Form von ATP oder GTP
benötigt.
•
•
•
173
OH eines G am 3' Ende greift
3' Ende des Introns an.
OH am 3' Ende von Exon A
greift 5' Ende von Exon B an
OH am 3' Ende des Introns
greift 156 bp vor dem
eigenen 5' Ende an, es
ergeben sich zwei Produkte.
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Group I Introns weisen eine bestimmte Sekundärstruktur auf.
Die Ausbildung dieser Struktur ist für den Ablauf des Splicens
notwendig.
• 9 Helices (P1-P9) … basengepaarte Regionen
• P4 aus P und Q … aus Basenpaarungen zwischen
konservierten Sequenzen
• P7 aus S und R … aus Basenpaarungen zwischen
konservierten Sequenzen, der Teil bei P7 entspricht dem
Intron core.
• Die Region P1 enthält das 3' Ende von Exon 1.
• IGS: jener Teil des Introns, der mit Exon 1 paart.
• P3, P4, P6, P7 ist die kleinste Region, die
autokatalytisches Splicing durchführen kann.
Splicing assay in vivo
Mit diesem Verfahren wird Mutationsstudie in vivo
möglich. Man kann die Auswirkung einer Mutation
auf das Splicing anhand von X-Gal-Indikator
Platten direkt ablesen.
Es wird ein selbstsplicendes Intron in das LacZ Gen
eingebracht. Nur wenn das Intron sich tatsächlich
selbst aus dem LacZ Gen entfernen kann, wird die
Kolonie auf X-Gal-Medium blau.
174
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
3'-end formation
PAP: Poly-A-polymerase
CPSF: recognizes AAUAAA
CFI, CFII: cleavage factors
CFI + II sind Endonucleasen, CstF bindet G-U-reiche
Sequenz downstream der Schnittstelle von CFI + II.
So genannte Poly A-binding-Proteins (PBP) können an den
Poly A Schwanz und weiters an die CAP binden, wodurch
die mRNA zirkularisiert wird und sich die Stabilität erhöht,
da die Enden nicht für Exonucleasen zugänglich sind.
175
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Bläsi, Foliensatz 5
mRNA
Translation in Eukaryotes
Wie findet das Ribosom den Translationsstart?
40S UE bildet einen Komplex aus Met-tRNAi, eIF2 und
GTP. Dieser Komplex bindet an die CAP Struktur der
mRNA.
Auch in eukaryotischer mRNA finden sich in der
Umgebung des Startcodons gewisse Konsensussequenzen
(Kozak Sequenz), die dem Ribosom ermöglichen den Start
zu erkennen (obwohl eigentlich immer das erste AUG vom
5' Ende her das Startcodon ist). Im Gegensatz zu
Prokaryoten werden die Interaktionen zwischen Ribosom
und Sequenz nicht zwischen RNA-mRNA sondern ProteinmRNA gebildet.
176
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Die CAP Struktur
Die CAP Struktur befindet sich am 5' Ende der
mRNA und besteht aus einem methylierten
Guanylrest. Diese Struktur ist für die Bindung des
Ribosoms an die mRNA nötig und erhöht die
Halbwärtszeit der mRNA.
Der Guanylrest wird mittels Guanyltransferase
angebracht und an Position 7 durch eine
Methyltransferase methyliert.
In allen höheren Eukaryoten wird weiters die Base,
die auf das angebrachte Guanin folgt, an Position 2
mittels O-Methyltransferase methyliert.
Eukaryotische mRNA lässt sich über den PolyA
schwanz isolieren. Man erzeugt mittels PhenolChlorophorm ein Lysat und bindet die mRNAs über
eine Säule mit Poly T-Oligonucleotiden. Durch eine
hohe Salzkonzentration kann diese Bindung gelöst
und die mRNAs isoliert werden.
Der PolyA Schwanz ist sowohl für die Stabilität der
mRNA als auch für die Initiation der Translation
von Bedeutung.
•
•
•
•
•
•
•
•
Der eukaryotische Intitationsfaktor eIF1 sowie der Faktor aeIF1 in Archae sind homolog
dem prokaryotischen Faktor IF3 und diskriminieren somit gegen alle tRNAs außer für
Startcodon AUG bzw. unterstützen die Bindung der Initiator-tRNA an die 40S UE.
eIF2 ist ein Komplex aus drei UE und transportiert die Initiator-tRNA zum Ribosom. Durch
Spaltung von GTP kann es wie IF2 wieder aus dem Ribosom freigesetzt werden.
eIF2B recycelt eIF2 indem es bei diesem GDP mit GTP austauscht. Viren können
bewirken, dass eIF2B GDP permanent bindet und nicht mehr zur Aktivierung von eIF2 zur
Verfügung steht.
eIF3 unterstützt die Bindung der 40S UE an die mRNA.
eIF4 ist eine Helicase, die Sekundärstrukturen der mRNA aufzulösen, damit das Ribosom
die mRNA ungestört translatieren kann.
eIF4B fördert die die Aktivität der Helicase.
eIF4e bindet die CAP Struktur.
eIF4F dient als Adapterprotein mehrerer Faktoren.
177
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Translation inition in Eukaryotes
The eukaryotic 40S translation initiation complex+ Regulation
178
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
In Eukaryoten liegen die meisten mRNAs zirkulär vor. Der PolyA Schwanz wird durch PBP
(PolyA binding proteins) und das Adapterprotein 4G mit dem CAP verbunden. An 4G binden
mehrere Proteine des Initiationsfaktors 3.
Regulationen auf Translationsebene laufen in der Regel über Phosphorylierung ab.
• Positive Regulation: Das Protein 4E-BP kann 4G binden, das dadurch nicht zur Bindung
der CAP zur Verfügung steht. 4E-BP dient so der Regulation der translationalen Initiation.
Durch Phosphorylierung von 4E-BP kann die Bindung an 4G wieder gelöst werden, das
dadurch zur Bindung an CAP frei wird.
• Negative Regulation: elF2α bindet tRNA und bringt sie zum Ribosom. Durch
Phosphorylierung der α-UE von eIF2B kann an eIF2 kein GDP-GTP Austausch mehr
vorgenommen werden, es wird keine Initiator-tRNA mehr zum Ribosom transportiert.
Diese Art der Regulation kann durch Virusinfektion, Hitzschock, Eisenmangel, AS Mangel
etc. induziert und weitere Translation verhindert werden.
Diese Interaktionen wurden durch Two-Hybrid System, Affinitätschromatographie oder
Coimmunpräzipitation nachgewiesen!
Ribosomal recruitment to mRNA in Pro-and Eukaryotes
•
•
•
Unter Stressbedinungen wird die α UE von eIF2
induziert.
GEF kann sich nicht mehr ablösen, durch GEF
ist keine Austausch von GTP mit GDP möglich.
Es findet keine Translation statt, da eIF2 im
inaktiven Zustand keine tRNAi liefern kann.
179
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
RNA Sensors - Regulation of IFN-gamma by negative feedback
Human IFN-γ mRNA activates PKR through a pseudoknot
sensor to inhibit its own translation.
(A) Pseudoknotin the 5'-untranslatedregion of human
interferon-γ (IFN-γ) messenger RNA. Base pairing in the
pseudoknot stem is shown in red and the start of the
open reading frame in green.
(B) Autoregulation of IFN-γ synthesis. IFN-γ mRNA
translation, which is dependent on eukaryotic initiation
factor 2 (eIF2), yields IFN-γ that can induce more RNAdependent protein kinase (PKR) expression in the cell,
creating a negative feedback loop. Inactive PKR binds to
the pseudoknot, leading to a local PKR activation.
Resulting phosphorylation of eIF2α blocks further
translation of IFN-γ mRNA.
EMBO Rep. 2003 November; 4(11): 1043–1047.
Eukaryotic ribosomes require initiation factors 1 and 1A to locate initiation codons
Nature Vol 394, 27 August 1998
180
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Mechanisms of translation initiation in eukaryotes
Scanning:
Die CAP Struktur muss für die 40S UE zugänglich
sein. Störende Sekundärstrukturen werden unter
ATP Verbrauch mittels Helicase aufgelöst.
Wenn die 40S UE an CAP gebunden ist, wandert
sie bis zu einem Startcodon oder einer Kozak
Sequenz unter ATP-Verbrauch an der mRNA
entlang. Sekundärstrukturen werden durch
Helicase entwunden.
Reinitiation:
Kommt ein Ribosom an ein Stopcodon, löst sich die
60S UE ab, die 40S UE bleibt gebunden und
wandert unter ATP Verbrauch weiter an der mRNA
entlang.
Kommt es dabei zu einem Startcodon, kann tRNAi
und im Anschluss ein 60S UE binden und
Translation erneut aufgenommen werden.
"Jumping" ... wurde bisher nicht bewiesen. Das
Ribsom bindet am CAP und springt direkt zum
AUG. Das wäre vorstellbar, wenn die mRNA nicht
linear vorliegt.
Internal Initiation:
Wurde ursprünglich bei Viren entdeckt
(Picornavirus, s.u.). Durch virale Proteasen wird
der eukaryotische Translationsfaktor elF4G
gespalten, es kann keine CAP abhängige
Translation mehr stattfinden.
Die viruseigene mRNA ist von CAP unabhängig und
initiiert Translation an einer IRES (Internal ribosom
entry site).
IRES sind Sekundärstrukturen in der 5' NCR (Non coding region, am 5' Ende der mRNA) von
Picornaviren, das Ribosom kann an dieser Sekundärstruktur andocken.
Toeprinting bei Eukaryoten:
Es werden sämtliche Faktoren gereinigt und einzeln zu mRNA, 40S UE und tRNA hinzugefügt.
Je nachdem, ob man bei einem zugegebenen Faktor ein Toeprintig Signal erhält oder nicht,
hat sich ein stabiler Komplex Ribosom-mRNA gebildet (oder nicht). Bei eIF1 beispielsweise
erhält man ein schönes Signal (hurra).
181
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Internal initiation in viral mRNAs
*Caspase (apoptosis)
viral proteases .. cleave
eiF4G: prevents cap-dependent
initiation
Caspasen spalten im Zuge der
Apoptose beinahe an derselben
Stelle.
Fig.2. Schematic
illustration of
eucaryotic mRNA
translation and major
sites of viral
regulation.
Picornaviral mRNAs have no 5'cap
182
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
IRES: Internal ribosome entry site
Interne Initiation benötigt IRES (internal ribosomal
entry site). Dabei handelt es sich um komplexe
Sekundärstrukturen der mRNA, die gemeinsam mit
Proteinfaktoren eine Ribosomenbindung
ermöglichen.
Denkbar ist, dass Ribosomen über IRES entweder
direkt an AUG binden oder von IRES aus auf der
mRNA entlang wandern, bis sie an ein AUG
gelangen.
Die 3D Struktur der IRES wird vermutlich
durch RNA-RNA und RNA-Protein
Interaktionen bestimmt.
RNA-binding Proteins binden an bestimmten
Sequenzen der mRNA, dimerisieren und
stabilisieren dadurch IRES-Strukturen.
Experiment: Nachweis interner Initiation durch IRES
•
•
mRNA mit IRES und Reportergen erzeugen und durch Ligase zirkularisieren. CAP
abhängige Initiation ist damit nicht möglich.
Da man trotzdem ein Genprodukt erhält, kann man davon ausgehen, dass interne
Initiation mittels IRES funktionert.
Noch eins:
• Es wird ein Plasmid erzeugt, das in Folge ein Thymidin-Kinase-Reportergen, die 5' NCR
mit IRES sowie anschließend ein CAT-Reportergen enthält.
• Das Plasmid wird mittels Transfektion in Polioinfizierte Kulturzellen eingebracht.
• Es kommt zu keiner Thymidin-Kinase-Synthese, da die CAP abhängige Translation durch
Polio ausgeschalten ist.
• CAT Synthese findet statt, die Translation sollte über IRES initiiert worden sein.
183
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Fig 3. Schematic representation of EMCV, FMDV
and TMEV IRES domains H-L, showing binding sites
for PTB (thick gray line) and ITAF45.
Viral mechanisms of translational reprogramming
Translational Control of Viral
Gene Expression in
Eukaryotes
Michael Gale Jr.,1,*Seng-Lai
Tan,2and Michael G. Katze2
Microbiology and Molecular
Biology Reviews, June 2000,
p. 239-280, Vol. 64, No. 2
Leaky scanning and frameshifting
184
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Control by leaky scanning, terminationand re-initiation events
Functional recoding at the MuLV gag-pol junction
Synthesis of the MuLVGag protein terminates at
the gagstop codon (top). However, approximately
5% of the time, the elongating ribosome will read
through the gag stop codon to produce the Gag-Pol
polyprotein (bottom). During this process, the
gagstop codon is redefined to encode glutamine
and is shown by the presence of tRNA Gln at the
redefined UAG codon. Stop codon redefinition is
dependent on specific downstream sequences and
a 3'-proximal pseudoknot structure.
The elongating ribosome eventually melts out the pseudoknot to complete GagPolysynthesis. Low-frequency gag-pol stop codon redefinition is essential for MuLV
replication. Figure adapted with modification from references 12 and 108.
Negative regulatory elements in the 5'-UTR of mRNA that may repress translation
185
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Translational pathophysiology: a novel molecular mechanism of human disease
Mario CazzolaandRadekC. Skoda
Blood, Vol. 95 No. 11 (June 1), 2000: pp. 3280-3288
Regulation of translation initiation in eukaryotes
Eisen ist für die katalytische Funktion
vieler Enzyme (z.B. Aconitase im
Citratzyklus) essentiell. Transferrin
dient als Eisentransporter, Ferritin
als Eisenspeicher.
Bei Eisenmangel werden TransferrinRezeptoren (TR) zur Aufnahme von
Eisen benötigt.
Hat Aconitase kein Eisen gebunden,
weil die Konzentration zu niedrig ist,
kann es stabil an das 3' Ende der TR
mRNA binden, die mRNA wird
stabilisiert, TR können translatiert
werden. Weiters bindet Aconitase bei
Eisenmangel an das 5' Ende der
Ferritin mRNA, wodurch dessen
Translation verhindert wird.
Bei Eisenüberschuss hat Aconitase
Eisen gebunden und kann nicht an
die jeweiligen mRNAs binden, Ferritin
wird translatiert, TR nicht.
186
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Coordinate regulation of transferrinreceptor and ferritinsynthesis through
translational controls operated by the iron-responsive elements (IREs) and by the
iron regulatory proteins IRP1 and IRP2.
Only one IRE is present in the 5'-UTR
of ferritin mRNA. When cellular iron
is scarce, IRP molecules are available
for binding the 5' IRE; initiation of
translation is prevented; and ferritin
synthesis is inhibited. By contrast,
presence of abundant intracellular
iron prevents binding of IRPs to the
5' IRE and allows efficient mRNA
translation to proceed (green arrow).
Five IREs are present in the 3'-UTR
of transferrin receptor (TfR) mRNA.
When cellular iron is scarce, binding
of one or more IRPs to the IREs in
the 3'-UTR stabilizes TfR mRNA and
increases TfR translation.
Conversely, when iron is abundant, very few IREs are occupied by IRPs, and TfR mRNA is
rapidly degraded.
Eukaryotic translational elongation and termination:
Minor differences between eukaryotes and prokaryotes
Eukaryotes: only one release factor
Molecular mimikry
Ribosome recycling?
Die Elongation in Eukaryoten läuft analog zu Prokaryoten ab, es exisitieren Homologe zu EFTu und EF-G.
Die Termination in Eukaryoten benötigt nur einen Releasefaktor im gegensatz zu den drei
Releasefaktoren in Prokaryoten.
Einige bakterielle Toxine können eukaryotische Elongationsfaktoren modifizieren.
z.B. das Diphterietoxin überträgt einen Ribosylrest auf die seltene AS Diphtamid, die im
Elongationsfaktor eEF2 (Homolog zu EF-G) vorkommt. Dadurch wird eEF2 inaktiviert, die
Translation wird gestoppt. EF-G im Bakterium selbst weist kein Diphtamid auf und ist daher
nicht vom Toxin betroffen.
In der eukaryotischen Translation sind noch viele Punkte ungeklärt, beispielsweise ist noch
nicht bekannt, wie Ribosomen von der mRNA dissoziieren, wenn sie das Stopcodon erreicht
haben.
187
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
mRNA stability in Eukaryotes
Eukaryoten besitzen Endonucleasen
sowie Exonucleasen, die mRNA nicht
nur vom 3' Ende sondern auch vom
5' Ende her abbauen können.
Wie schon erwähnt, ist die Stabilität
von eukaryotischer mRNA durch CAP
und PolyA im Vergleich mit
prokaryotischer mRNA erhöht.
mRNA liegt über CAP, Poly A, PABP
und eIF4G gebunden zirkulärisiert
vor. Je länger der Poly A Schwanz ist
bzw.je öfter das 3' UTR motif
vorkommt, desto stabiler wird die mRNA. Das 5' Ende ist daher üblicherweise für
Exonuclease nicht zugänglich.
Für den Abbau muss diese Zirkularisierung gelöst werden. Der PolyA Schwanz wird so weit
verkürzt, dass keine Interaktion zwischen PABP und eIF4G mehr stattfinden kann.
Anschließend wird der Methyl-7-Guanosyl-Rest des CAP durch ein decapping enyzme
entfernt.
Erst jetzt kann die mRNA vom 5' Ende oder auch vom 3' Ende her abgebaut werden.
Drei Abbauwege von mRNA in Eukaryoten:
• Deadenylierung des PolyA, Verkürzung des PolyA durch 3' → 5' Abbau
• Deadenylierungsabhängiges Entfernen des CAP mit folgendem 5' → 3' Abbau.
• Von Deadenylierung unabhängiges Entfernen des CAPs (PolyA intakt) und folgendem 5' →
3' Abbau.
Premature translational termination triggers mRNA decapping
Nature (1994) 370
T ½ … Halbwertszeit
Frühzeitige Termination führt zum Abbau
von mRNA. Wird z.B. in Hefe bei einer
mRNA mit bekannter Halbwertszeit ein
vorzeitiges Stopcodon eingefügt (2. Gel),
sinkt die HWZ der mRNA.
Wird diese Mutation in einen Hefestamm
eingebracht, der keine funktionelle 5' → 3'
Exonuclease besitzt, steigt die HWZ wieder
an (3. Gel).
Ein Abbau durch vorzeitige Stopcodons wird
demnach vom 5' Ende her initiiert.
Fehlerhafte Stopcodons lassen sich durch das im Vergleich mit DNA-Polymerase weniger
effiziente Proofreading der RNA-Polymerase erklären.
Es gibt zwei unterschiedliche Varianten wie der Abbau vorzeitiger Stopcodons eingeleitet
werden kann.
188
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
mRNA turnover in yeast
Translation initiation is strongly
stimulated by interactions between
Pab1p and the eIFG4 initiation
factor. Transient disruption of these
interactions may allow slow
deadenylation of the mRNA. Pab1p
also interacts with other translation
initiation factors, possibly including
Mrt1p/Pat1p/Spb10p. After
deadenylation to A10 or less, the
mRNA is degraded. In the major
pathway, Mrt1p probably recruits the
Lsm1p/Spb8p protein to the mRNA,
presumably as a component of an
Lsm complex. This interacts with
Dcp1p and Dcp2p, promoting
decapping and 5'→3' degradation by
Xrn1p. In an alternative pathway,
the mRNA is degraded 3'→5' by the
exosome complex. This also requires
cofactors - the Ski2p, Ski3p and
Ski8p proteins - but their order of
action and function in recruiting
and/or stimulating the exosome
complex are unknown.
Nonsense-mediated Decay
Bereits während dem Spleißen binden Proteinkomplexe (EJC) oberhalb der Splice sites an die
mRNA, die anschließend aus dem Nucleus transportiert wird. Im Cytosol binden weitere
Proteinfaktoren an die mRNA. Wird dabei ein Stopcodon entdeckt, wandert der Faktor hUpf1
downstream entlang der mRNA. Kommt er dabei an einen EJC, war das Stopcodon vorzeitig,
hUpf1 wird phosphoryliert und beschleunigt decapping und Abbau der mRNA.
189
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Eine weitere Variante des Abbaus von mRNA mit vorzeitigen Stopcodons ist, dass der Abbau
durch Interaktionen des Ribosoms ausgelöst wird.
Kommt das Ribosom während der Translation an ein Stopcodon, prüft es entweder selbst, ob
sich downstream cis-aktive Sequenzen befinden (downstream sequence element mit
gebundenem Protein), die anzeigen, dass es sich bei dem Stopcodon um einen Fehler
handeln muss und initiert in diesem Fall decapping und Abbau von beiden Enden her (bei
Hefe).
Bei Säugetieren wird der Faktor UPF1 vom Ribosom an einem Stopcodon rekrutiert, der wie
oben bereits beschrieben downstream wandert und den Abbau der mRNA initiert, wenn er
einen EJC erreicht.
190
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Regulatory RNAs/ siRNAs and miRNAs
Nature Biotechnology
21, 1441 -1446 (2003)
RNAi - RNA mediated interference
In Eukaroyten induziert doppelsträngige dsRNA
den sequenz-spezifischen Abbau der mRNA.
PTGS: post transcriptionalgene silencing
RNAi (RNA mediated interference)
Doppelsträngige RNA hat im Cytosol nix zu suchen,
es stammt vermutlich von Viren und wird daher
durch einen speziellen Proteinkomplex (Dicer) in
21nt lange Stücke zerschnitten. But wait, there's
more! Die Teile der dsRNA werden in die
Einzelstränge aufgetrennt und von einem weiteren
Proteinkomplex (RISC) gebunden. Zumindest eine
Hälfte dieser gebundenen RNA ist komplementär
zu der von ihr transkribierten mRNA. Der Komplex
kann auf diese Art an die sich im Cytosol
befindliche mRNA des Virus binden und diese
zerschneiden. Man spricht in diesem
Zusammenhang auch von PTGS (post
transcripitional gene silencing).
Unter Gen Knockdown versteht man den
Vorgang, die Translation des Zielgens durch
RNAi auszuschalten. Dazu bringt man DNA
in den Organismus ein, dessen Transkript
RNA einerseits einen Teil der mRNA des
Zielgens enthält und andererseits so weit
mit sich selbst bindet (Antisense RNA), dass
dadurch eine scheinbare dsRNA entsteht,
die durch RNAi erkannt, geschnitten und
verwendet wird, um die mRNA des Zielgens
zu zerschneiden.
191
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
siRNA Expression
•
•
•
For transient expression: duplex RNA can be delivered to the cell
For a stable expression: a vector containing the DNA to produce a hairpin RNA
The vector may be plasmid, retrovirus, adenovirus
siRNA Delivery
•
•
•
•
•
For cell culture
– Lipid-based transfection
– Electroporation
In vivo
– Lipid-based
– Conjugations
Bacterial phage RNA
Cholesterol
Atelocollagen
– Viral systems (ieretrovirus & adenovirus)
siRNA Delivery & Processing
Applications for siRNA
•
•
Basic research
– Determining protein function
– Easier than a knockout and may be used for partial knockdowns
Clinical research
– You name it
– Cancer, hypercholesterolemia, infections, developmental defects
192
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
RNAi= Big Money?
Nature Biotechnology 21, 1441 -1446 (2003)
What is the Difference between miRNA and siRNA?
•
•
•
•
•
•
Function of both species is regulation of gene expression.
Difference is in where they originate.
siRNA originates with dsRNA.
siRNA is most commonly a response to foreign RNA (usually viral) and is often 100%
complementary to the target.
miRNA originates with ssRNAthat forms a hairpin secondary structure.
miRNA regulates post-transcriptional gene expression and is often not 100%
complementary to the target.
193
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
miRNA processing
Mammalian microRNAs: a small world for fine-tuning gene expression
194
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Another View
Processing bodies are sites of storage and/or degradation of mRNA
What are the functions of miRNA?
•
•
•
•
Involved in the post-transcriptional regulation of gene expression.
Important in development.
Metabolic regulation (miR-375 & insulin secretion).
Multiple genomic loci (different expression patterns?).
195
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Differences in miRNAMode of Action
Human miRNA function?
196
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
miRNARegistry
•
•
•
•
•
http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml
Latest release contains 1620 2909 predicted and verified miRNAs
227 321 predicted and 131 223 experimentally verified in Homo sapiens
Mouse and human are highly conserved
Human is not conserved with plants
Out of 198 hmiRNAs known, 20% are linked to fragile sites and 50% are in cancer associated
regions.
197
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Translation in Archaea
Translation initiation factors in the 3 kingdoms
Translational initiation pathways in Pro-and Eukaryotes
mRNA (SD+) /30S interaction at high and low temperatures
198
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Binary complex formation with S. solfataricus
30S ribosomes is SD-dependent
Leaderless mRNA does not bind to ribosomes at 65°C
Translation of leaderless mRNAs in S. solfataricus?
199
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Purification and reconstitution of the trimeric aIF2 with purified subunits
Stimulation of
35
S-Met-tRNAi binding to ribosomes by aIF2
In contrast to Eukaryotes, binding of tRNAi requires the α-γ subunits of S.
solfataricus aIF2
Paola Londei, David Hasenöhrl
200
Sonnbert
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Bläsi, Foliensatz 6
Intracellular protein transport
Post-translationale Vorgänge:
Viele synthetisierte Proteine müssen nach
der Translation an ihren Bestimmungsort
(Organellen, Nucleus- und Zellmembran,
extrazellulärer Raum) transportiert werden.
Zu diesem Zweck weisen weisen diese
Proteine Peptidequenzen auf, die von
Transportproteinen und Proteinen am
Bestimmungsort erkannt werden.
Es gibt zwei verschiedene Arten: Proteine
die zunächst vollständig translatiert und
anschließend gefaltet und transportiert
werden, und Proteine, deren Translation
gestoppt, mitsamt gebundenem Ribosom
ans ER transportiert und in das ER hinein
fertig translatiert werden.
Passage through the membrane
Die Phospholipid-Bilayer von Membranen sind im Inneren
hydrophob und an der Außenseite hydrophil. Proteine benötigen
demnach Poren, um Membranen durchqueren zu können. Die
Proteine müssen zu diesem Zweck möglichst linear vorliegen, da
sie im gefalteten Zustand nicht durch die Poren passen würden.
Diesem Zweck dienen Protein-Chaperone, die sowohl in Pro- als
auch Eukaryoten vorkommen.
Protein Chaperones
Hsp … heat shock protein, Hsp70, Hsp40, GrpE sind
Protein Chaperone, Hsp60 und Hsp10 Chaperonine.
Hsp70 bzw. Hsp40 kommen in Eukaryoten vor, Dank bzw.
DnaJ sind die bakteriellen Homologe.
Chaperone sorgen dafür, dass ein Protein eine bestimmte
Konformation annimmt oder in einer Konformation bleibt.
Zu diesem Zweck binden die
Chaperone bereits während der
Translation an die entstehende
Polypeptidkette. Es ist nicht bekannt,
wie Chaperone "ihre" Proteine
erkennen.
Dna J und anschließend DnaK binden
das Polypeptid und Falten es unter
ATP Hydrolyse.
GrpE (nucleotide exchange factor) setzt DnaK und DnaJ wieder frei.
201
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
GroEL
GroEL ist ein Chaperonin, das
aus aus mehreren
Untereinheiten besteht. Jede
dieser UE benötigt für die
Funktionalität ATP.
Die Untereinheiten schließen
sich gemeinsam um ein
ungefaltetes Protein und
falten es mittels ATP
Hydrolyse.
Durch Bindung des
zusätzlichen Faktors GroES
und weiterer ATP Hydrolyse
zerfällt der Komplex und setzt
das gefaltete Protein frei.
GroEL ist für das Überleben
einer Zelle essentiell, wird es
ausgeknockt, stirbt die Zelle
ab.
GroEL/GroES Function
202
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Protein export in bacteria
Proteins may be targeted to the
• inner or outer membrane
• periplasmic space
• extracellular medium
Proteins exported across a membrane have in general a signal sequence
Ein zu sezernierendes Protein trägt eine so genannte Leader Sequenz, damit klar ist, wo das
Protein hintransportiert werden muss. Nach der Passage durch die Membran wird diese
Sequenz üblicherweise von einer Leader Peptidase abgespalten. Diese Sequenz ist in Pround Eukaryoten hoch konserviert, sie lassen sich beispielsweise zwischen Prokaryoten und
Hefezellen tauschen.
Die Leader Sequenz ist etwa 20-25 AS lang und weist basische AS am N-Terminus sowie eine
hydrophobe Sequenz in der Mitte auf. Am C-Terminus befinden sich unterschiedliche
Sequenzen für die Leaderpeptidase.
Leader Sequenzen von Proteinen, die in Mitochondrien und Chloroplasten importiert werden:
• meist hydrophil.
• aus ungeladenen AS-Sequenzen, die von basischen AS Sequenzen unterbrochen sind.
• keine sauren AS.
General mechanism of protein transport
•
•
•
Leader Sequenz initiiert die Interaktion des
Vorläuferproteins mit Organellenmembran.
Proteintransport durch die Membran.
Proteolytische Abspaltung der Leader Sequenz
ins Innere der Organelle.
203
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Bacteria: The sec pathway through the cytoplasmic membrane
Sezernierung bei Bakterien:
Als Protein Chaperon dient SecB. Als
Transportkomplex des zu
sezernierenden Proteins dienen SecY
und Sec E.
SecB erkennt ein Zielprotein an der
Leadersequenz und transportiert es
vom Ribosom an die Membran, wo es
mit dem über SecY an der Innenseite
der Membran befestigten SecA
interagiert. SecA schiebt das Protein
unter ATP Hydrolyse in den aus SecY
und SecE gebildeten Kanal. Der
weitere Transport wird durch die PMF
(Proton motif force) vermittelt.
Nachdem das Protein die Membran durchquert hat, wird die Leadersequenz durch eine mit
dem Komplex gebundene Leaderpeptidase vom Zielprotein abgespalten.
Wieso ist das Leaderpeptid am N-Terminus basisch/ positiv geladen:
In Bakterienzellen findet sich zur ATP Erzeugung über die Membran ein elektrochemischer
Gradient bzw. ein Membranpotential. Innen ist die Ladung negativ, außen positv. Der
basische Bereich des Leaderpeptids erleichtert Interaktionen an der negativ geladenen
Innenseite der Membran, um zum Transportapparat zu gelangen (so richtig???).
Experiment um Gen für Proteintransport zu finden:
1) ein bestimmtes Protein auswählen … z.B. OmpA (sitzt in äußerer Membran).
2) OmpA auf Plasmid klonieren und OmpA Antikörper dazu.
3) Gel-PAGE, man kriegt zwei Banden, eins für das Protein und eins für das Prä-Protein.
Components of the Sec pathway: SecB
High selectivity with low specificity: how SecB has solved the paradox of chaperone binding
TIBS (1995) 20:65
SecB liegt im Cytosol als Tetramer mit negativer
Oberflächenladung vor, das mit Proteinen mit
längeren positiv geladenen Bereichen interagieren
kann. Als Beispiele weisen das Maltose- und das
Galactosebindeprotein (kommen beide im
Periplasmaraum vor) lange Sequenzen positiver
Ladungen auf und können darüber mit SecB
interagieren.
204
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
SecA Promotes Preprotein Translocation by Undergoing ATP-Driven cycles of
Membrane Insertion and Deinsertion
Cell, Vol 78, September 9, 1994, Copyright © 1994 by Cell Press
SecA dient als Motorprotein für die Translokation
des Zielproteins aus dem Cytoplasma durch die
Membran. SecA interagiert mit SecYE, SecB liefert
das Zielprotein an das SecA Protein.
Ein Teil von SecA wird durch ATP Hydrolyse sehr
flexibel und schiebt das Zielprotein so in den
Kanal.
Um die Interaktion von SecA + SecB nachzuweisen wird das Zweihybridsystem verwendet.
(siehe S38)
Experiment: Nachweis, dass Leadersequenz den Transport durch die
Membran induziert.
Mittels eines speziellen Verfahrens ("French press") werden Bakterien unter hohen Druck
gesetzt, die Zellen platzen und es bilden sich so genannte "inside out" Vesikel. Teile der
Zellwand können sich in verkehrter Ausrichtung zu Vesikeln zusammenschließen, wodurch
auch SecYE mit SecA in verkehrter Ausrichtung in der Vesikelmembran sitzt.
Man benötigt die vermutete Leadersequenz an einer nachfolgenden Proteinsequenz, zu der
Antikörper existieren, die diese Sequenz binden können.
Fügt man SecB, ATP und die modifizierten Proteine hinzu, sollte das Proteinkonstrukt in das
Vesikel hineintransportiert werden, wenn die Leadersequenz wie vermutet funktioniert.
Anschließend werden mittels Peptidasen alle Peptide außerhalb der Vesikel abgebaut, dann
die Vesikel geöffnet und mittels Antikörpern überprüft, ob sich die modifizierten Proteine
tatsächlich in den Vesikeln befanden.
Escherichia coli translocase: the unravelling of a molecular machine
Molecular Microbiology (2000) 37(2), 226-238
Der Sec pathway kommt sowohl bei gram+ als auch bei gram- Bakterien vor.
205
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Two major pathways
•
•
•
two major pathways for translocation in
bacteria: Sex and SRP pathways
both converge at SecYEG translocon and
use SecA, a peripherally-bound ATPase
that supplies the energy for
translocation.
SecB binds to nascent chains containing
a signal sequence and maintains the
preprotein in translocation-competent
form, then binds SecA; SRP docks with
membrane receptor, FtsY (simpler
homologues of eukaryotic SRP and SRP
receptor).
Membrane targeting and translocation of bacterial hydrogenases
Arch Microbiol (2000) 173:319-324
Twin Arg motif at the N-terminus of
the signal sequence.
TAT pathway: Twin Arginine
Translocation.
Crossing the cytoplasmic membrane
without the sec translocon.
Große, bereits gefaltete Proteine wie bakterielle Hydrogenasen können nicht über den SecPathway durch die Membran gebracht werden und müssen auf andere Weise exportiert
werden.
Für diesen weiteren Pathway ist ein Twin-Arg-Motif (immer zwei aufeinander folgende
Arginine) in den zu transportierenden Proteinen typisch. Für den Transport durch die
Membran ist ein großer Proteinkomplex aus den Proteinen TatA, E, B, ... nötig, durch den die
Zielproteine transportiert werden, der genaue Mechanismus ist nicht geklärt.
206
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Model of Tat targeting and transport
In the membrane TatA is
depicted in red, TatB in blue,
and TatC in yellow. (a) Upon
emerging from the ribosome
the preprotein must avoid
targeting to other pathways such as Sec,
which is aided by the characteristics of the
signal peptide and mature protein and/or
the binding of Tat-specific chaperones (red
circles) (70, 129). (b) After folding, any
cofactors and/or additional subunits are
added prior to targeting to the TatBC
receptor complex (c) (d).
The proton motive force drives the
formation of an active translocaseand the
substrate is transported through a pore
consisting mainly of TatA (1, 52, 85). (e)
Upon removal of the signal peptide the
mature protein is released on the
periplasmic side of the membrane.
Protein export pathways in Bacteria
Die meisten Proteine können mittels Sec pathway durch die Membran transportiert werden.
Gram- Bakterien besitzen neben der inneren noch eine äußere Membran, durch die Proteine
ebenfalls hindurch transportiert werden müssen.
Dazu sind vier verschiedene Sekretionssysteme bekannt.
207
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Type I secretion (Sec independent)
E. coli: Hemolysine
Typ I Sekretionssysteme sind Sec independent und aus drei
Proteinkomplexen aufgebaut.
• ABC Transporter als Pore in der IM
• Membran fusion proteine
• Channel forming proteins als Pore in der OM
Typ I ist typisch für Hämolysine, Toxine, die Erythrozyten
lysieren. Am C-Terminus der Hämolysine befindet sich eine AS
Sequenz, die als Exportsignal dient. Durch dieses Exportsignal
werden die Hämolysine mittels der Proteine HylB und HylD vom
Cytoplasma nach Außen transportiert.
Wird die Sequenz vom C-Terminus entfernt, wird das Toxin nicht
mehr über die Membranen transportiert.
Type II secretion (Sec dependent)
Pullulanase in K. oxytoca
Proteine des Typ II
Sekretionsmechanismus müssen
zunächst über den Sec Pathway über
die innere Membran in den
periplasmatischen Raum
transportiert werden. Hier können
die Proteine noch modifiziert werden
(die endgültige Konformation von
Pullanase z.B. wird durch Einführung
von Disulphidbrücken mittels DsbA
erzeugt). Aus dem Periplasma
werden die Proteine über eigene
Transportsysteme nach Außen
transportiert.
Experiment: Prinzipielle Funktion des Sec Pathways
Das protein Pullulanase baut außerhalb der Zelle Stärke ab, damit die Monomere der Stärke
in die Zelle aufgenommen werden können.
Die Zellkultur wird auf reinem Stärkemedium gezogen und kann daher nur überleben, wenn
Pullulanase nach außen transportiert wird.
Wird die Leadersequenz der Pullulanase oder Proteine des Sec Apparates mutiert, kann
ermittelt werden, welche Bestandteile für den Transport essentiell sind, die entsprechenden
Kolonien werden auf Stärkemedium absterben.
208
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Type II secretion
Das Choleratoxin kann nur
freigesetzt werden, wenn das
Bakterium vom Phagen CTXΦ
befallen ist, da ein
Transportkanal des Phagen in
der äußeren Membran zur
Freisetzung nötig ist.
Die Komponenten A und B
des Toxins werden über den
Sec abhängigen
Sekretionsweg in den
periplasmatischen Raum
transportiert. Hier werden sie
mittels DsbA gefaltet und
lagern sich zu AB5-Komplexen
zusammen.
AB5 wird vom Eps
Sekretionsapparat erkannt
und durch wiederholte
Polymerisierung
Depolymerisierungsreaktionen
von EpsG durch die aus EpsD
gebildete Pore in den
extrazellulären Raum
geschoben.
Type III secretion (Sec independent)
The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting eukaryotic cells
Molecular Microbiology (1997) 23(5) 861-867
Typ III erzeugt einen direkten Kanal
vom bakteriellen Cytoplasma über IM
und OM ins Cytoplasma einer
eukaryotischen Zelle. Im Fall von
Yersinia Pestis werden so
beispielsweise Proteine
eingeschleust, die in der
eukaryotischen Zelle Apoptose
auslösen.
An der Bildung des Kanals sind mehr
als 20 Proteine beteiligt. Vom
prinzipiellen Vorgang her bindet das
bakterielle Protein YopN an einen
Rezeptor einer eukaryotischen Zelle.
Das dient als Auslöser dafür, dass
die bakterielle Zelle an die
eukaryotische Zelle herangezogen
und der Kanal ausgebildet wird.
209
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Type IV secretion
Dieses Sekretionssystem dient der Übertagung bakterieller DNA
ins Cytoplasma von Eukaryoten und kann sowohl Sec abhängig
als auch Sec unabhängig sein.
• Chaperon VirE1 bindet VirE2 und verhindert dessen Bindung
an T-DNA im eigenen Cytoplasma.
• VirE2 sowie mittels VirD2 gebundene T-DNA werden über den
P-Pilus zur Zielzelle transportiert.
• VirE2 bildet zunächst einen Kanal durch die eukaryotische
Zellmembran, weiteres VirE2 und VirD2 mit T-DNA werden in
die Zielzelle transportiert.
• Im Cytoplasma der Zielzelle liegt VirE2 frei vor und bindet an
T-DNA, die auch VirD2 gebunden hat und kann so in den
Nucleus wandern.
Import of proteins into the ER
Es gibt Proteine, die Zwecks Modifizierung oder
Verwendungszweck in das ER transportiert werden
müssen.
Während der Synthese dieser Proteine wird eine Sequenz
translatiert (15-30 AS mit hydrophobem Kern), die von
einem Protein-RNA Komplex (7S RNA + 6 Proteine), dem
SRP (signal recognition particle), erkannt und gebunden
wird. Die Bindung verhindert eine weitere Translation des
Proteins durch das Ribosom und vermittelt den Transport
zum ER. Am ER wird SRP von einem in der ER Membran
sitzenden passenden SRP-Rezeptor gebunden. Der
Rezeptor wiederum ist mit einer Pore verbunden, in die
das bisher translatierte Protein eingeführt wird. Die
Translation wird wieder gestartet, die Energie der
Translation ist ausreichend, um die Polypeptidkette durch
die Pore in das Innere des ER zu schieben. Die
Signalsequenz auf dem Peptid wird abgeschnitten, sobald
sie im Inneren des ER ankommt.
Zur Freisetzung von des SRP vom SRP Rezeptor ist
Hydrolyse von GTP notwendig.
210
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Insertion of proteins into the ER
Struktur von SRP
In Bakterien wurde ein
homologer Vorgang
entdeckt, der Proteine
an und durch die
Zellmembran
transportiert.
Das Homolog zu SRP wird als Ffh Protein, das Homolog zum SRP
Rezeptor als FtsY bezeichnet. FtsY ist dabei nicht mit einem
eigenen Porenkomplex sondern mit dem Sec-Apparat assoziiert,
um das Zielprotein durch die Membran zu schleusen. In
Bakterien wird dieser Pathway vor allem von Membranproteinen
verwendet.
Mitochondrial import of proteins
Alle mitochondriale Proteine werden im Nucleus
transkribiert, im Cytosol translatiert und müssen
anschließend ins Mitochondrium importiert werden.
Mitochondrien besitzen eine doppelte Zellmembran
zwischen der sich ein Intermembranraum befindet, es
findet sich zur ATP Erzeugung ein elektrisches Potential
über die innere Membran.
Proteine können sowohl für den Intermembranraum als
auch für das Lumen des Mitochondrions vorgesehen sein
und benötigen dafür unterschiedliche Leadersequenzen.
Proteine, die in die Matrix transportiert werden sollen und dort bleiben sollen haben nur ein
Matrix targeting Signal. Proteine, deren Zielort der Intermembranraum ist haben zu der
Matrixsequenz eine zusätzliche Signalsequenz. Beide Proteinarten werden zunächst in die
Matrix transportiert und erst anschließend an ihren tatsächlichen Bestimmungsort weiter
transportiert. Sobald ein Protein im Matrixraum angelangt ist, wird die Leadersequenz für
den Matrixraum abgeschnitten. Findet sich danach eine weitere Leadersequenz, wird das
Protein weitertransportiert.
Um Proteine durch die beiden Membranen zu schleusen, dienen so genannte Tom
(translocase of the outer mitochondrial membran) und Tim Proteine.
211
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Mitochondrial biogenesis: The Tom and Tim machine
Current Biology 1997, 7:R100-R103
•
•
•
Die cytosolischen Chaperone MSF oder
cHsp70 binden an eine positiv geladene
Leader Sequenz und transportieren das
zugehörige Preprotein zu Rezeptoren in der
äußeren Mitchondrienmembran. MSF und
cHsp70 binden dabei unterschiedliche UE
desselben Proteinkomplexes (Tom).
Das Preprotein wird mittles der Tom Proteine durch die OM in den Intermembranraum
gebracht, wo es an den Tim Proteinkomplex übergeben wird, der es über die IM in den
Matrixraum bringt. Bei dem Transport über die Innere Membran hilft der positive
Gradient im Intermembranraum dabei, die positive Leadersequenz des Preproteins in die
Matrix zu bringen. mtHsp70 nimmt das Protein in der Matrix in Empfang und zieht es
mittels ATP Hydrolyse vollständig in die Matrix.
In der Matrix wird die Leadersequenz durch MPP abgeschnitten, das Protein durch
mtHsp70 gefalten und anschließend freigesetzt.
Import through the IM into the mitochondrial lumen requires the pmf and mtHsp70
212
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Common principles of protein translocation across membranes
Science (1996) 271:1519
Import into and export from the nucleus
Proteine können durch NPCs (nuclear pore complex) importiert und exportiert werden.
Proteine wie z.B. Spleißproteine oder Transkriptionsfaktoren müssen importiert werden. An
dieser Stelle kann die Transkription eines Gens reguliert werden, je nachdem, ob und wie
effizient ein Faktor importiert wird.
rRNAs, tRNAs und mRNAs müssen aus dem Kern ins Cytosol exportiert werden.
213
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Mit dem Nucleus assoziierte Proteine weisen entweder
eine NES (nuclear export sequence) oder eine NLS
(nuclear localisation sequence) auf, je nachdem ob sie
exportiert oder importiert werden.
Eine NLS ist eine Abfolge positiv geladener AS am NTerminus über die Importproteine (Importine) binden können.
Es gibt einfache Diffusion, kleine Moleküle z.B. Ionen können
durch die Kernmembran gelangen. Aktiver Transport von
Proteinen > 50kDa wird durch NPCs erledigt.
Im Cytoplasma findet sich mehr RanGDP, im Kern mehr RanGTP.
α + β-Importin dienen als Importproteine. Sie binden an Cargoproteine und Nucleoporine,
die wiederum den Import in den Kern selbst vornehmen.
Das Trimer α-β-NLS ist in Anwesenheit von RanGDP und damit im Cytosol stabil, während es
im Nucleus zerfällt.
Exportin-NLS ist hingegen ist in Anwesenheit von RanGTP und damit im Nucleus stabil,
während es im Cytosol zerfällt.
214
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Prüfungsfragen
Bläsi:
1) wie kann man beweisen, dass die Bindungsstelle des ribosomalen Proteins S1 upstream
der Shine Dalgarno Sequenz auf der prokaryotischen mRNA liegt?
2) Wie kann man Interaktion (2 Möglichkeiten) und Funktionsweise der eukaryotischen
Translations-Initiationsfaktoren nachweisen?
Decker:
1) Wie führt man eine Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) durch und welche Erkenntnisse
kann man daraus gewinnen?
2) Skizzieren oder beschreiben sie, wie sich Phosphorylierung der CTD der eukaryotischen
RNA Pol II im Laufe des Transkriptionszyklus auswirkt.
Bläsi:
1) Wie können sie gentechnisch und biochemisch nachweisen, dass IF3 gegen alle
Startcodons außer AUG (GUG) diskriminiert (Skizze)
2) Wie können sie nachweisen (2 Methoden), ob ein translationaler Repressor auf der ShineDalgarno-Sequenz sitzt?
Decker:
1) Zwei Komponenten systeme in Bakterien: Response regulator nennen und Zielgene
(Skizzen)
2) Wie viele RNA Polymerase gibt es in eukaryotischen Zellen? Welche Gene werden von
deisen Polymerasen transkribiert? Wie sehen die typischen Promotoren aus? (skizzen)
Bläsi:
1) Welche Parameter beeinflussen die Stabilität prokaryotischer mRNA? wie können sie
nachweisen, dass mRNA vom 5' bzw vom 3' Ende her abgebaut wird?
2) Wie können Sie feststellen, ob ein aufgereinigtes Protein als RNA-"molecular chaperone"
wirkt?
Decker:
1) - Beschreiben sie kurz den Aufbau eines Nukleosoms (Skizze)
- Beschreiben sie die Aktivität des chromatin remodelling complexes
- Was hat die (De-)Acetylierung der Histone zur Folge
2) Skizzieren sie den kompletten Initiationskomplex bei Transkription durch RNA Polymerase
II. Welche dieser Proteine assoziieren mit DNA-bindenden Faktoren.
Bläsi:
1) Wie können sie nachweisen, dass der prokaryotische Translationsfaktor IF3 gegen nicht
AUG Startcodons diskriminiert? (Toeprint, Plasmid)
2) Wie wird Selenocystein in die wachsende Proteinkette inseriert (Skizzen)
Decker:
1) Kurze Beschreibung der Initation der Transkription (Phasen der Initiation)
2) Diffundiert die RNA Polymerase frei zum Promotor? Andere Erklärungsversuche für
Promotorauffindung.
3) Wie beeinflusst der Sigma Faktor die Assoziation der RNA Polymerase mit dem Promotor?
215
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Bläsi:
1) Erklärung zweier Experimente die zur Aufklärung des genetischen Codes geführt haben.
Wie lässt sich "Recoding" erklären?
2) Erklärung der Funktion von regulatorischen RNAs in prokaryotischer Genexpression. Zwei
Nachweise (biochemischer und genetischer) für positive Regulation.
Decker:
1) Welche Fragestellung beantworten sie mit ChIP, wie funktioniert das.
2) Aktivierung von Adenylatcyclatase, welche andere Genexpressionswege werden auch
durch Adenylatxcyclatase aktiviert?
Bläsi:
1) Zwei Ansätze um nachzuweisen, dass IF3 nicht gegen AUG diskriminiert.
2) Skizze wie Translation in Eukaryoten von CAP abhängig ist, wie können Viren dies
zerstören?
3) Small regulatory RNAs; Beispiel; Biochemischer und genetischer Nachweis der positiven
Kontrolle der Translation.
Bläsi:
1) Die RNA III wirkt als translationaler Aktivator des hla-Gens in S.aureus. Wie würden sie
das experimentell nachweisen.
2) Die zirkularisation der Hefe-mRNA bewirkt Stabilität (Skizze)
3) Gemeinsamkeiten / Unterschiede in mRNA Abbau in Pro- und Eukaryoten.
Decker:
1) Präinitiationskomplex der Eukaryoten bei der Transkription (Skizze). welche Proteine
interagieren mit proximalen und distalem Bereich.
2) Mit welchem Experimenten würden sie nachweisen:
- TR rate eines Gens im Kontext genomischer DNA
- Aktivität eines isolierenden Promotors
- Bildung eines TF an DNA
- genaue Position der TF Bindungsstelle
- für die Bildung wichtiger Basen
- TR Start eines Gens
Prüfung vom 05.07.2002
Bläsi:
1) Autoregulation von mRNA Bsp: Transkription von rRNA / Translation von ribosomalen
Proteinen (in Ecoli im Kontext mit Komponenten des Translationsapparates, Skizze)
2) Wirkungsweise von sRNA als translationalem Aktivator Bsp: Experiment vür Nachweis in
vitro / Nachweis in vivo.
Decker:
1) Isolieren eines Promotors aus Säugerzelle und Analyse desselben (notwendige Schritte in
Stichworten)
2) Regulation des Schilddrüsenhormons TR: Struktur der DNA Bindedomäne, Struktur des
TR, Dimerisiernug, Mechanismus der Genaktivierung und -repression.
216
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Prüfung vom 25.10.2002
Bläsi:
1) Welche Parameter beeinflussen die Stabilität von mRNA in Prokaryoten? Wie können sie
nachweisen, ob ein Transkript in Bakterien vom 5' bzw. vom 3' Ende her abgebaut wird?
2) Wie würden sie nachweisen, ob ein Protein, das sie gereinigt habe als RNA Chaperon
fungiert?
Decker:
1) Welche spezifische fragestellung beantworten sie mit folgender Methodik: Nuclear run on
assay, real time PCR, Southern Blot, Primer extension, DNase I footprint, Hefe 2 Hybrid
System.
2) Welche Mechanismen zum Abschalten eines Gens auf Ebene der Transkription kennen Sie
in Pro- und Eukaryoten Organismen? (in Stichworten beantworten und Beispiele nennen).
Prüfung vom 03.10.2003
Bläsi:
1) a) Erklären sie die Funktionen von ncRNAs (non coding RNAs) bei Pro- und Eukaryoten
und nennen sie Beispiele.
b) Erklären sie wie sie nachweisen können, ob eine ncRNA als translationaler Repressor
dient?
2) Wie können sie feststellen, ob ein Protein das sie gereinigt haben RNA Chaperon Aktivität
hat.
Decker:
1) Erklären sie die Begriffe positive und negative Regulation der Transkription und nennen
sie je ein Beispiel.
2) Inwiefern unterscheiden sie die drei eukaryotischen RNA Polymerasen (Struktur,
biochemische Funktion, Promotorstrukturen,...)
Prüfung vom 19.03.2004
Bläsi:
1) Welche Parameter beeinflussen die Stabilität prokaryotischer mRNA? Wie können sie
nachweisen, dass mRNA vom 5' bzw. vom 3' ende her abgebaut wird?
2) Wie können sie feststellen, ob ein gereinigtes Protein als RNA Chaperon wirkt.
Decker:
1) Beschreiben sie kurz den Aufbau eines Nukleosoms (Skizze)
- Beschreiben sie die Aktivität des chromatin remodelling complexes
- was hat die (De-)Acetylierung der Histone zur Folge?
2) Skizzieren sie den kompletten Initiationskomplex bei Transkription durch RNA Polymerase
II. Welche Proteine assoziieren mit DNA bindenden Faktoren?
217
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Prüfung vom 02.07.2004
Bläsi:
1) Wie kann man Interaktion zwischen SD und anti-SD nachweisen? a) genetischer Ansatz b)
biochemischer Ansatz
2) Zwei Experiement skizzieren zum Nachweis, dass ein Protein als translationaler Repressor
wirkt.
Decker:
1) Y2H a) am Beispiel c-Fos-cJun skizzieren, wie schauen die Fusionsgene aus? b) kann man
mit Y2H Interaktion von STATS nachweisen + Begründung.
2) a) Wie bzw. von welchem Co-Faktor wird CREB aktiviert und von welchem Pathway
stammt das Signal? b) welcher Co-Aktiviator ist erforderlich und wie wirkt dieser?
Prüfung vom 24.09.2004
Bläsi:
1) Wie können sie nachweisen, dass der prokaryotische Translationsfaktor IF3 gegen nicht
AUG Startcodons diskriminiert? (Toeprint, Plasmid)
2) Wie wird Selenocystein in die wachsende Proteinkette inseriert (Skizzen)
Decker:
1)a) was sind die speziellen Funktionen von TFIIH Komplexen?
b) welche Proteinkomplexe vermitteln die Interaktion zwischen RNA Polymerase II und
Transkriptionsfaktoren, die spezifische Bindungsstellen eines Promotors erkennen?
2) Welche enzymatischen Aktivitäten von zelloberflächenrezeptoren kennen sie (Bsp). Wie
sind die Signaltransduktionswege beschaffen, die diese enzymatische Aktivität letztlich in
veränderte Genexpression übertragen (jeweils ein Beispiel in Form einer Skizze).
Prüfung vom 19.11.2004
Bläsi:
1) Beschreiben sie zwei experimentelle Ansätze, die zur Aufklärung des genetischen Codes
geführt haben. Durch welche Mechanismen kann es während der Translation zu "Recoding"
kommen d.h. zu einer nicht ko-linearen Translation des genetischen Codes.
2) Beschreiben sie die Funktion von regulatorischen RNAs in der Genexpression bei
Prokaryoten. Wie können sie genetisch und biochemisch nachweisen, dass ein bestimmtes
Gen durch eine solche RNA auf translationaler Ebene positiv reguliert wird.
Decker:
1) a) Welche Phasen lassen sich bei der Initiation der Transkription unterscheiden (in
Stichworten)
b) lässt sich das Auffinden eines Promotors durch RNA Polymerase durch freie Diffusion
beschreiben? Welche alternativen Erklärungen kommen in Frage?
c) Wie beeinflusst der Sigma-Faktor die Assoziation der prokaryotischen RNA Polymerase mit
Promotoren?
2) Erklären sie wie entfernt von der Initiationsstelle der Transkription bindende
Transkriptionsfaktoren die Bindung der RNA Polymerase beeinflussen können.
218
V1.6.22
Genexpression (Decker, Bläsi) – Sommersemester 2006 (mit Update SS 2008)
Sonnbert
Prüfung vom 21.01.2005
Bläsi:
1) Zwei Ansätze um nachzuweisen, dass IF3 nicht gegen AUG diskriminiert.
2) Skizze wie Translation in Eukaryoten von CAP abhängig ist, wie können Viren dies
zerstören?
Decker:
1) Welche Fragestellung beantworten sie mit ChIP, wie funktioniert das.
2) Aktivierung von Adenylatcyclatase, welche andere Genexpressionswege werden auch
durch Adenylatxcyclatase aktiviert?
Prüfung vom 13.05.2005
Bläsi:
1) Wie können sie biochemisch und genetisch nachweisen, dass der IF3 bei der
Translationsinitiation gegen alle Startcodons außer AUG diskriminiert?
2) Wie können sie die Interaktion und die Funktionsweise von Proteinen des
Initiationsapparates nachweisen.
Decker:
1) DNA Microarray in stichworten, Ablauf, Was sind die Vorteile gegenüber anderen
Methoden.
2) Drei verschiedene Mechanismen der positiven Transkriptionskontrolle durch
Transkriptionsfaktoren.
Prüfung vom 23.09.2005
Bläsi:
1) Small regulatory RNAs? Beispiele; genetischer und biochemischer nachweis der positiven
Kontrolle der Translation.
2) Man soll die Abbauwege von mRNAs in Prokaryoten vergleichend gegenüberstellen;
Nachweis, von welchem Ende her abgebaut wird.
Decker:
1) Warum ist die Phosphorylierung der RNA Pol II wichtig.
2) ?
Prüfung vom 20.01.2006
Bläsi:
1) Wie können sie mit Hilfe einer molekularbiologischen Methode nachweisen, wo der
prokaryotische Initiationsfaktor IF1 an die kleine ribosomale Untereinheit bindet (Skizze)
2) Skizzieren sie die drei Ereignisse im bereich der Ribosomenbindunsstelle einer
prokaryotischen mRNA, welche die Bindung von Ribosomen verhindern können (Skizze). Wie
können sie diese "Mechanismen" mit Hilfe von molekularbiologischen Untersuchungen
nachweisen?
Decker:
1) Skizzieren Sie die Ereignisse die von der Bindung eines Wachstumsfaktors z.B. EGF an
seinen Rezeptor zur Induktion von Genexpression führen. Benennen sie Komponenten und
relevante Modifikationen die an der Signaltransduktion beteiligt sind.
2) Worin unterscheiden sich Nucleosomen und Enhancosomen? Welche funktionelle
Bedeutung hat die Bildung eines Enhanceosoms?
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