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BVT1-Praktikum für Technische Biologen
WS2008
Versuch2:
Regelung der Zufütterung von Glukose beim
Wachstum von Saccharomyces cerevisiae
Gruppe 2:
Sanja Fessl
2280488
Ingo Eisele
2189204
Maike Illner
2295868
Christine Gally
2290452
Eva-Maria Geissen
2198619
Andreas Fulterer
2233888
Maria-Luise Götz
2133027
Anja Honegger
2296401
___________________________________________________________________
Versuch 2
____________
1 Einleitung
1.1 Zielsetzung
Das Ziel des Versuches war die Regelung der Zufütterung von Glukose in einem Fed
Batch Prozess mit S.cerevisiae unter Verwendung der Regelgröße RQ
(Respirationsquotient) und eines PID-Reglers.
1.2 Grundlagen
In diesem Versuch wurde der fakultativ aerobe Organismus Saccharomyces cerevisiae
(Bäckerhefe) verwendet. Unter anaeroben Bedingungen bzw. unter Sauerstofflimitierung
verstoffwechselt diese Hefe Glukose zu CO2 und Ethanol. In diesem Fall spricht man vom
Pasteur Effekt.
Eine vollständige Oxidation des Zuckers findet unter aeroben Bedingungen statt. Dabei
wird die Glukose vollständig zu CO2 und H2O oxidiert. Die Energieausbeute ist dabei
wesentlich höher als unter anaeroben Bedingungen (36 ATP pro Glukose im Vergleich zu
2 ATP).
Jedoch kann auch unter aeroben Bedingungen Ethanolbildung stattfinden (CrabtreeEffekt). Dies ist dann der Fall, wenn die Glukosekonzentration im Fermenter über einen
kritischen Wert cs,krit von 100 mg/L steigt. Da unter diesen Bedingungen die Enzyme der
Atmungskette (Cytochromoxidase) gesättigt sind, sammelt sich Pyruvat an, welches
dann zu Ethanol verstoffwechselt wird. Dabei werden Reduktionsäquivalente regeneriert
und CO2 gebildet.
Bei der Produktion von Bäckerhefe ist die Alkoholbildung unerwünscht, da dadurch die
Zellsubstratausbeute Yx/s vermindert wird. Die Substratkonzentration cs im Medium sollte
daher unter cs,krit liegen. Gleichzeitig ist jedoch eine maximale Produktivität anzustreben.
Dies erfordert eine möglichst hohe Wachstumsrate µkrit, bei der jedoch gerade noch
keine Alkoholbildung auftritt
Mit diesen Vorgaben kann ein Zulaufverfahren (Fed Batch) realisiert werden, bei dem
das Substrat nicht vorgelegt, sondern kontinuierlich zugefüttert wird.
Bei einem Fed Batch Prozess werden dem Fermenter über einen geregelten Zulauf
kontinuierlich Substrate zugeführt. In dem hier beschriebenen Versuch ist das Substrat
im Zulauf auf Glukose beschränkt.
Die zugegebene Menge an Glukose wird über eine geschlossene Regelung kontrolliert.
Hierzu ist ein Feedback über die aktuellen Prozessdaten durch eine Online-Messung
notwendig. Als Regelgröße wird der Respirationsquotient (RQ) verwendet. Alternativ
wäre auch eine Regelung über die Ethanolkonzentration in der Abluft (gemessen im
1
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Versuch 2
____________
Flammenionisationsdetektor=FID) denkbar, allerdings wäre diese Regelung zu träge,
weshalb hier ausschließlich über den RQ regulier wird.
RQ=QCO2/QO2
Die volumenbezogenen Raten von O2 und CO2 im Fermenterabgas lassen sich
berechnen. Zwischen RQ dem Glukosestoffwechsel besteht der in Tabelle 1 beschriebene
Zusammenhang.
Tabelle 1: Zusammenhang RQ und Glukosestoffwechsel
0,6 < RQ < 1
Die
Glukosezufuhr
ist
nicht
ausreichend,
die
Zellen
wachsen teilweise vom gebildeten Ethanol
RQ = 1
Die aufgenommene Glukose wird vollständig oxidiert.
Wachstum:
 < krit
RQ > 1
Einsatz
von
Ethanolbildung
aufgrund
überschüssiger
Glukose  Crabtree-Effekt
Wachstum:
 > krit
2 Durchführung
Herstellen des Mediums:
In einem 3L Becherglas wurden die vorher abgewogenen Komponenten des
Mineralmediums ohne Kaliumchlorid (Angaben siehe Skript) mit 1,2 Liter VE-Wasser
gelöst. Dazu wurde 29 ml der Wuchslösung und 72 ml der Spurenelementlösung
gegeben. Anschließend wurde der pH-Wert mit 89 %-iger Phosphorsäure unter Rühren
auf pH 5,0 eingestellt. Nachdem sich die Lösung geklärt hatte, wurden 440 g
Glukosemonohydrat zugegeben und bis zur Klärung der Lösung weitergerührt. Mit VEWasser wurde auf 2 Liter Endvolumen aufgefüllt.
Inbetriebnahme des Fermenters:
Die pH- und die O2-Sonden wurden kalibriert. Dafür wurde die pH-Elektrode über die
Zweipunktmethode kalibriert. Die Sonde wurde bei 2 verschiedenen pH-Werten (6,84
und 4,04) eingesetzt und am Regelungsmodul bei Abweichungen nachgestellt.
Die pO2-Sonde wurde auf 0% und 100% kalibriert. Hierfür wurde einmal in einem Gefäß
mit Natriumsulfit (entzieht Sauerstoff) in Wasser gemessen und in einem Gefäß das
belüftetes Wasser enthielt. Bei den jeweiligen Messungen wurde wieder am
Regelungsmodul der Wert nachgestellt.
Die Hefe (333 g) wurde in 2,4 Liter physiologischer Kochsalzlösung (9 g NaCl/Liter)
aufgeschlemmt und in den Fermenter gefüllt. Mit VE Wasser wurde auf 12 Liter
Reaktorvolumen aufgefüllt.
2
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Versuch 2
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Die Feed-Flasche wurde angeschlossen, die Beheizung (auf 30°C) in Betrieb genommen,
der Druck (0,2 bar Überdruck) angelegt und der pH konstant auf pH=5,0 gehalten.
Während des Prozesses wurde die Sauerstoffsättigung durch Variation der
Rührerdrehzahl über 50 % Sättigung gehalten. Die Begasungsrate wurde auf
20 Liter/min eingestellt.
Fermentation:
Durch Starten des Feeds mit dem Computer begann der Fermentationsprozess. Zuerst
wurde die Fermentation hinsichtlich der Zufütterung vom PC aus gesteuert.
Es wurden alle 30 min Proben genommen und folgende Parameter offline gemessen:
Glukosekonzentration im Fermenter (enzymatischer Test)
Um die Konzentration des Substrates Glukose zu bestimmen, wurde dem Reaktor im
Abstand von 30 Minuten jeweils 2-3 ml zellfreies Filtrat entnommen.
Es wurden 2mal 100 µl der unverdünnten Probe zusammen mit jeweils 1000µl einer
Granutest-Reaktionslösung für 5 Minuten in einer Küvette bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Messung der Extinktion erfolgte im Photometer bei 340 nm gegen Luft. Mit
den gemessenen Extinktionen konnte die Konzentration an Glucose nach folgender
Formel errechnet werden:
cGlukose  E1  E0   F  0,3234
E0: Startkonzentration an Glucose
F: Verdünnungsfaktor
Biomassekonzentration (OD-Messung)
Die Biomasse wurde über die optische Dichte (OD) der Zellsuspension mittels eines
Photometer bei 620 nm bestimmt. Ab einer OD620 von 0,6 musste verdünnt werden. Die
erhaltenen OD620-Werte wurden in die Formel cx= OD620 * 0,3 [g/l] eingesetzt und so
auf die vorhandene Biomassekonzentration geschlossen.
Zusätzlich wurden online die Daten ODOptek [V], YO2 [%], YCO2 [%], QO2 [mol/h],
QCO2 [mol/h], RQ [ppm], VFeed [ml/min], N [rpm], pO2 [%], FID [ppm] sowie
MFeed [g/min] aufgezeichnet.
3
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Versuch 2
____________
Im Versuch wurde ein Sollwert des Respirationsquotienten RQ sowie der spezifischen
Wachstumsrate µ eingestellt. Am Ende des Versuchs wurden RQ und µ variiert und mit
der PID-Regelung Einfluss auf den Prozess genommen.
Größen, die für den geschlossenen Regelkreis benötigt werden, sind:
Regelgröße X:
RQist
Stellgröße Y:
F (Feed)
Führungsgröße w:
RQsoll
Reglerstellgrad YR:
cx (0-100% bzw. 0-10 Volt)
Regelabweichung e: e=w-X
Die Stellgröße besteht aus 3 Teilen: Dem Proportionalanteil, dem Integralanteil und
Differentialanteil. Das PIDout-Signal, das im Versuch durch einen PID-Regler erzeugt
wurde, lag zwischen -1 und 10 und geht wie in der folgenden Gleichung beschrieben in
die Berechnung des Feeds ein:
Zunächst wurde der Zulauf über die eingestellte Wachstumsrate gesteuert. Dabei wurde
zunächst eine Wachstumsrate von µsoll=0,08 h-1 gewählt, um die Hefezellen an die
Fermentationsbedingungen anzupassen. Nach 1 Stunden 16 Minuten wurde die
Wachstumsrate auf 0,12 h-1 erhöht. Nach 2 Stunden 52 Minuten wurde Wachstumsrate
µsoll auf µsoll=0,15 h-1 hochgestellt. Bei Prozesszeit t=3 Stunden wurde der Regler
eingeschaltet und im Folgenden wurden die Reglerparameter, die Wachstumsrate und
der RQ variiert. Daraus ergaben sich für die Fermentation die in Tabelle 3 aufgelisteten
Phasen.
4
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Versuch 2
____________
Tabelle 2: Einteilung des Fermentationsprozesses in Phasen
Phase
Prozesszeit
soll [h-1]
RQSoll [g/g]
PID-Regler
Phase 1
0,0h – 1 h 16 min
0,08
Steuerung
Phase 2
1 h 16 min – 2 h 52 min
0,12
Steuerung
Phase 3
2 h 52 min – 3 h
0,15
1,04
Steuerung
Phase 4
3 h – 3 h 50 min
0,15
1,04
P-Anteil: 1
Phase 5
3 h 50 min – 4 h 10 min
0,15
1,04
P-Anteil: 1;
I-Anteil: 0,005
Phase 6
4 h 10 min – 4 h 20 min
0,15
0,8
P-Anteil: 1;
I-Anteil: 0,005
Phase 7
4 h 20 min – 5h
0,15
1,3
P-Anteil: 1;
I-Anteil: 0,005
Phase 8
5 h – 5 h 20 min
0,2
1,3
P-Anteil: 1;
I-Anteil: 0,005
Phase 9
5 h 20 min– 5 h 30 min
0,09
1,04
P-Anteil:0
I-Anteil: 0,05
Phase 10
5 h 30 min - Prozessende
0,09
1,04
P-Anteil: 1;
I-Anteil: 0
3 Ergebnis
RQ, FID-Signal und Feed bei µ=0,2 als Funktion der Zeit:
Diagramm 1 zeigt RQ, FID, Feed und Feed bei µ=0,2 als Funktion der Zeit. Zusätzlich ist
der jeweilige Sollwert für RQ eingezeichnet.
Der Feed lag während der gesamten Messzeit unterhalb des berechneten Feed für
µ=0,2. Bei Phase 4 wurde der Regler eingeschaltet und der Feed über diesen geregelt.
Damit entsprach der Feed im folgenden Verlauf dem berechneten Wert für die aktuelle
Wachstumsrate multipliziert mit (1+PID).
Biomasse (VR*cx) als Funktion der zugefütterten Glukosemenge (ΔVFeed*cs) und
Ermittlung des Substratausbeutekoeffizienten YX/S:
Für die Bestimmung des Ausbeutekoeffizienten wurde die zugefütterte Glukose gegen
die Biomasse aufgetragen (siehe Abbildung 2). Die Glucosemenge ergab sich aus dem
zu dem jeweiligen Zeitpunkt zugeführten Feedvolumen (ΔV Feed) multipliziert mit der
Substratkonzentration cs im Feed. Die Biomasse mx wurde durch Multiplikation des
Reaktorvolumens VR mit der Biomassekonzentration cx bestimmt. (siehe Tabelle 3)
5
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Versuch 2
____________
Tabelle 3: Übersicht der Biomasse als Funktion der zugefütterten Glukosemenge.
VR
cx
VR*cx
ΔVfeed cs
12
10,8
129,6
0
ΔVfeed*cs
180,3 0
12,08 11,34 136,9872 0,08
180,3 14,424
12,16 12,18 148,1088 0,16
180,3 28,848
12,26 12,3
0,26
180,3 46,878
0,3
180,3 54,09
12,3
150,798
13,02 160,146
12,53 13,92 174,4176 0,53
180,3 95,559
12,69 15
0,69
180,3 124,407
12,86 16,17 207,9462 0,86
180,3 155,058
13,04 16,05 209,292
1,04
180,3 187,512
13,14 17,1
1,14
180,3 205,542
13,35 17,85 238,2975 1,35
180,3 243,405
13,47 18,93 254,9871 1,47
180,3 265,041
190,35
224,694
Die Biomassekonzentration und die Glucosekonzentration wurden den offline-Werten
entnommen. Das Feedvolumen wurde aus den online-Werten abgelesen. Damit
errechnete sich auch das Volumen des Reaktors.
Durch die eingezeichneten Punkte wurde eine Ausgleichsgerade gelegt. Ihre Steigung
(Biomasse/Glucose) entsprach Yx/s.
Der ermittelte Ausbeutekoeffizient Yx/s hatte einen Wert von 0,45 gTS/gGlucose.
Biomasse
(VR*cx)
als Funktion
der
Zeit
und
Ermittlung
der Wachstumsrate
(halblogarithmische Darstellung):
Im Anhang ist in Abbildung 3 der graphische Verlauf µ dargestellt.
Tabelle 4: Übersicht von Konzentration und Wachstumsrate aus den offline-Daten.
Zeit Biomassekonzentration
Fermenter-
[h]
cx [mg/l]
volumen VR [l] (cx*VR)
0,0
10,80
12,00
4,86
0,5
11,34
12,00
4,91
1,0
12,18
12,16
5,00
1,5
12,30
12,25
5,02
2,0
13,02
12,30
5,08
2,5
13,92
12,53
5,16
3,0
15,00
12,69
5,25
3,5
16,17
12,86
5,34
4,0
16,05
13,04
5,34
6
ln
µsoll
Wachstums-
Phase
[1/h] rate µ [1/h]
1
0,08
0,10
2
0,12
0,11
3 bis 7
0,15
0,12
µ
___________________________________________________________________
4,5
17,10
13,14
5,41
5,0
17,85
13,35
5,47
5,5
18,93
13,47
5,54
Versuch 2
____________
9 bis 10 0,09
0,18
Cx, cGlukose und FID-Signal als Funktion der Zeit
In Abbildung 4 im Anhang ist die graphische Auswertung angefügt.
RQ als Funktion der Zeit und Ermittlung der Verzugszeit TU, der Ausgleichzeit TG, sowie
des Koeffizienten TG/TU:
In Abbildung 5 (siehe Anhang) ist RQ als Funktion der Zeit und die graphische
Ermittlung der Verzugszeit TU, der Ausgleichszeit TG sowie des Koeffizienten TG/TU zu
sehen.
4 Diskussion
RQ, FID-Signal und Feed bei µ=0,2 als Funktion der Zeit
Der Vergleich des RQ und des FID-Signals zeigt, dass das FID-Signal dem RQ zeitlich
versetzt folgt. Dies liegt darin begründet, dass das gebildete Ethanol zunächst aus der
Zelle in die Flüssigkeit und von dort in die Gasphase gelangen muss.
In den ersten drei Phasen wurde das System lediglich gesteuert. Die Zufütterung ist
allein von der Wachstumsrate abhängig. Wenn der Feed durch Erhöhung von µ
vergrößert wird, steigt die Ethanolkonzentration kurzzeitig an. Dieser temporäre
Crabtree-Effekt ist darauf zurückzuführen, dass sich die Zellen auf die neuen
Bedingungen einstellen müssen. Die Ethanolkonzentration nimmt nach einer gewissen
Zeit wieder ab, was auf den Verbrauch durch die Zellen und das Ausgasen
zurückzuführen ist.
In Phase 4 wurde der P-Anteil des Reglers auf 1 gesetzt. Der Sollwert von RQ =1,04
wurde jedoch zunächst nicht erreicht. Erst nachdem der I-Anteil auf 0,005 eingestellt
wurde, konnte der Regler den RQ auf die gewünschten 1,04 regeln. Dadurch, dass der
Regler den Substratzulauf in Phase 4 nicht exakt so einstellen konnte, dass der RQ den
Sollwert
erreichte,
sondern
RQ
=
1,25
war,
produzierten
die
Zellen
mit
der
überschüssigen Glucose auch Ethanol, was man auch deutlich in der Abbildung 1 sieht.
Der RQ wurde anschließend in Phase 6 auf 0,8 herabgesetzt. Dieser RQ kann allerdings
nur erreicht werden, wenn genügend Ethanol zum Abbauen vorhanden ist. Da dies
scheinbar nicht der Fall war, konnte der angestrebte Wert nicht erreicht werden.
In Phase 7 wurde der RQ auf 1,3 hochgesetzt. Aufgrund der Regelung wurde mehr
Substrat zugefüttert und die Ethanolkonzentration und der RQ stiegen an. Der Regler
7
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Versuch 2
____________
konnte den Sollwert nicht konstant einhalten, sondern schwankte um diesen herum.
Eine zusätzliche Erhöhung von µ auf 0,2 führte zu keiner Regelung.
Deshalb wurde µ = 0,09 1/h und RQ = 1,04 gewählt. Der P-Anteil wurde wieder auf Null
zurückgesetzt. Phase 9 war jedoch zu kurz, um konkrete Aussagen über die Regelung
treffen zu können. Zuletzt wurden der I-Anteil wieder auf 0 und der P-Anteil auf 1
gestellt. In der beobachteten Zeit konnte nicht festgestellt werden, dass das System mit
diesen Einstellungen regelbar ist.
Biomasse (VR*cx) als Funktion der zugefütterten Glukosemenge (ΔVFeed*cs) und
Ermittlung des Substratausbeutekoeffizienten YX/S:
Der graphisch ermittelte Ausbeutekoeffizient Yx/s=0,45 gTS/gGlukose war kleiner als
der theoretische von 0,54 gTS/gGlukose. Die Abweichung kommt daher, dass nicht die
gesamte Glukose in Biomasse umgewandelt wird, sondern damit auch Nebenprodukte
wie beispielsweise Ethanol gebildet werden.
Biomasse (VR*cx) als Funktion der Zeit und Ermittlung der Wachstumsrate µ
(halblogarithmische Darstellung)
Die Konzentration der Biomasse nahm wie erwartet exponentiell mit der Zeit zu,
wodurch sich bei halblogarithmischer Darstellung eine Gerade ergab.
Der Wert für die Konzentration der Biomasse beim Zeitpunkt eine Stunde war allerdings
sehr hoch. Hier muss ein Messfehler bei der photometrischen Bestimmung vorliegen,
weshalb dieser Wert bei der Berechnung von µ ausgeklammert wurde.
Die Wachstumsraten µ wurden aus den Steigungen nach folgender Formel berechnet:

ln( VF  c x )  ln( VF0  c x0 )
t
Die errechneten Werte stimmen nicht ganz mit den voreingestellten Werten für die
Wachstumsrate
überein.
Biomassekonzentration
Fehler
können
entstanden
sein,
vor
allem
da
hier
bei
der
lediglich
Bestimmung
der
Einfachmessungen
durchgeführt wurden.
Die Wachstumsrate der letzten beiden Phasen lag mit 0,18 1/h deutlich höher als der
voreingestellte Wert von 0,09 1/h. Allerdings wurde kurz vorher µsoll versehentlich auf
0,2 1/herhöht, weshalb der kurz darauf gemessene Wert von 0,18 1/h noch deutlich von
der vorhergehenden Einstellung beeinflusst ist und daher viel zu hoch liegt.
Zusätzlich wurde anhand der Steigung der Kurve der Biomassekonzentration die
Wachstumsrate der gesamten Fermentation µges bestimmt. Sie lag bei 1,25 1/h und
damit zwischen der maximalen und minimalen Einstellung von µsoll.
8
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Versuch 2
____________
RQ als Funktion der Zeit und Ermittlung der Verzugszeit T U, der Ausgleichzeit
TG, sowie des Koeffizienten TG/TU:
Aus der grafischen Ermittlung für TU bzw TG aus Abb.5 ergaben sich die Werte 4 min
bzw. 4,8 min, woraus sich ein TG/TU-Koeffizient von 1,2 ergibt. Hieraus lässt sich
schließen, dass sich der Prozess schlecht regeln lässt.( TG/TU<3), was bei Abbildung 1
schon diskutiert wurde.
9
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Versuch 2
____________
5 Anhang
RQ, FID-Signal und Feed bei µ=0,2 als Funktion der Zeit
 Abbildung 1
Biomasse (VR*cx) als Funktion der zugefütterten Glukosemenge (ΔVFeed*cs) und
Ermittlung des Substratausbeutekoeffizienten YX/S:
 Abbildung 2
Biomasse (VR*cx) als Funktion der Zeit und Ermittlung der Wachstumsrate µ
(halblogarithmische Darstellung)
 Abbildung 3
Cx, cGlukose und FID-Signal als Funktion der Zeit
 Abbildung 4
RQ als Funktion der Zeit und Ermittlung der Verzugszeit TU, der Ausgleichzeit TG, sowie
des Koeffizienten TG/TU
 Abbildung 5
10
RQ, FID, Feed und Feed bei µ=0,2 als Funktion der Zeit
Phase 1
Phase 2
3
Phase 4
5
6
7
8
9
10
2
9
1,5
6
1
RQ
ppm / ml/min
12
Feed sp [ml/min]
3
0,5
FID [ppm]
Feed bei µ=0,2 [ml/min]
RQ
0
0
60
120
180
Zeit [min]
240
300
0
360
RQ soll
Abbildung 1: Phaseneinteilung und Feedstrom, FID, theoretischer Feed, RQ und RQ soll in Abhängigkeit von der Prozesszeit
___________________________________________________________________
Versuch 2
____________
Biomasse in Abhängigkeit der Glucosemenge
300
250
y = 0,45x + 132,19
Biomasse in g
200
150
100
50
0
0
50
100
150
Glucose in g
Abbildung 2: Biomassekonzentration in Abhängigkeit der Glukosekonzentration.
1
200
250
300
___________________________________________________________________
Versuch 2
____________
Zeitlicher Verlauf von Biomassekonzentration und
Wachstumsrate
5,6
0,16
5,5
5,4
0,12
5,3
0,08 µ [1/h]
ln (cx*VF) 5,2
y = 0,1253x + 4,8544
5,1
5
0,04
4,9
4,8
0
1
2
3
4
5
Prozesszeit [h]
Abbildung 3: Biomassekonzentration und Wavhstumsrate in Abhängigkeit von der Prozesszeit.
2
0 ln (cx*VF)
6
µ [1/h]
Steigungsgerade
___________________________________________________________________
Versuch 2
____________
cx, cs und FID in Abhängigkeit der Zeit
20
Phase 2
Phase 1
3 Phase 4
5
6
Phase 7 8
9
Phase 10
0,12
18
0,1
14
0,08
12
10
0,06
8
0,04
6
4
0,02
2
0
0
0
50
100
150
200
250
300
Zeit in min
Abbildung 4: Biomasse-, Substratkonzentration und FID in Abhängigkeit von der Zeit.
3
350
400
cs in mg/l
FID in ppm und cx in g/l
16
(cx (g/l
(FID (ppm
(cs (mg/l
___________________________________________________________________
Versuch 2
____________
4,5
1,9
Feed sp[ml/min]
TG=4,8 min
1,8
3,5
1,7
3
1,6
2,5
1,5
2
1,4
1,5
1,3
1
1,2
0,5
1,1
0
95
97
99
101
103
105
107
Prozesszeit[m in]
109
111
Abbildung 5: Respirationsquotient und Feedstrom in Abhängigkeit von der Prozesszeit.
4
113
1
115
RQ
TU=4 min
4