protokolhplc.

Protokoll HPLC
Ziel:
Bestimmung des Coffeingehaltes in Lebensmittel mittels HPLC nach Kalibrierung mit
einem internen Standard.
1. Grundlagen zum Versuch
Anlage
HPLC = Hochdruckflüssigkeitchromatografie (auch
Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie)
Chromatografie Eine mobile Phase durchläuft eine stationäre Phase, wobei die
mobile Phase durch unterschiedliche Wechselwirkungen mit der
stationären Phase in ihre Einzelbestandteile aufgetrennt wird.
Umkehrphasen- Verwenden der Umkehrphasentechnik (stationäre Phase = unpolar;
chromatografie stationäre Phase = polar)
Kenngrößen
(Brutto-)Retentionszeit tR:
der
 Zeit, nach der ein Stoff die Apparatur durchlaufen hat
Chromatografie Totzeit t0:
 Zeit, die das Lösungsmittel braucht um die Apparatur zu
durchlaufen
Nettroretentionszeit tR,n:
 Zeit die der Stoff länger brauchte als das Lösungsmittel
 tR,n tr tn
Peakbreite w
 Breite des Peaks auf Höhe der Basislinie (oft: w0,5: Breite des
Peaks auf halber Peakhöhe
Trennstufenzahl N
 Gibt an, wie oft die Stoffe theoretische getrennt wurden
2

 tR 


N5
,54
w 
 0,5
Kapazitätsfaktor k:
 Gibt an, wie stark ein Stoff zurückgehalten wurde

k
t R,n
t0
Porosität  :
 Gibt das Volumenverhältnis zwischen mobiler und stationärer
Phase an
4vt0
 
d2 l
Auflösung R:
 Gibt an, wie gut zwei Stoffe getrennt wurden
tR

tR
2
1
R

1
,
18

w
w
0
,5
1
Kalibrierung mit
0
,5
2

Sollte größer als 1,5 sein, weil dann nur noch 0,5% der
Peakflächen überlagern

In die Berechnung fließt nur das Signalverhältnis von Analyt
1/9
internem
Standard




O
UV-Detektor mit
Diodenarray





Niederdruckvermischung


und internem Standard ein
Proben werden stets mit der gleichen Menge eines Stoffes
versehen, der möglichst gleiche chemische und
physikalische Eigenschaften hat, wie der Analyt
Bei Problemen der Probenvorbereitung eingesetzt, da das
Verhältnis zwischen internem Standard und Analyt konstant
bleibt
Hier Standard für Coffein gesucht:
Coffein:
Theobromin:
Theophyllin:
O
O
O
H
N
N
N
N
HN
N
N
N
N
O
N
O
N
N
UV-Vis Licht wird durch Elutionsstrom geschickt
Nachher an Gitter oder Prisma in einzelne Bestandteile
aufgeschlossen
Dann trifft das Licht auf einen Diodenarray, wobei eine Reihe
stets einer bestimmten Wellenlänge entspricht
Daher wird ständig das gesamte Spektrum aufgenommen
Per Computer kann man sich bestimmte Wellenlängen
heraussuchen
Eluenten werden vor der Pumpe gemischt (Gradienten leicht
herstellbar)
Hier wurden die Elution isokratisch (ohne Gradient)
durchgeführt
2. Durchführung
 Probenvorbereitung (Feststoffe)
 Eiwiegen von ca. 1g Feststoff auf Analysenwaage
 Kurzes aufkochen mit 25ml Theophyllinlösung (500mg/l)
 Durch Feinfilter ziehen
 Befüllen der Vials
 1. Vial mit 50μl Thioharnstoff Stammlösung und 950μl Wasser
(Chromatogramm „THIOH“)
 2. Vial mit 50μl Theobromin Stammlösung und 950μl Wasser
(Chromatogramm „TBRO“)
 3. Vial mit 50μl Theophyllin Stammlösung und 950μl Wasser
(Chromatogramm „TPHY“)
 4. Vial mit 50μl Theobromin Stammlösung, 50μl Theophyllin Stammlösung,
50μl Coffein und 850μl Wasser (Chromatogramm „TTCOFF“)
 5. Vial mit 50μl Coca Cola und 950μl Wasser (Chromatogramm „COLA“)
 6. Vial 20μl Coffein Stammlösung, 50μl Theophyllin Stammlösung und 930μl
Wasser (Chromatogramm „S2“)
 7. Vial 40μl Coffein Stammlösung, 50μl Theophyllin Stammlösung und 910μl
Wasser (Chromatogramm „S4“)
2/9









8. Vial 60μl Coffein Stammlösung, 50μl Theophyllin Stammlösung und 890μl
Wasser (Chromatogramm „S6“)
9. Vial 80μl Coffein Stammlösung, 50μl Theophyllin Stammlösung und 870μl
Wasser (Chromatogramm „S8“)
10. Vial 100μl Coffein Stammlösung, 50μl Theophyllin Stammlösung und
850μl Wasser (Chromatogramm „S10“)
11. Vial 10μl Tee-Auszug und 990μl Wasser (Chromatogramm „P1“)
12. Vial 10μl Kaffee-Auszug und 990μl Wasser (Chromatogramm „P2“)
13. Vial mit 50μl deit Cola-Mix, 50μl Theophyllin Stammlösung und 900μl
Wasser (Chromatogramm „P3“)
14. Vial mit 50μl Schwip Schwap Cola-Mix, 50μl Theophyllin Stammlösung
und 900μl Wasser (Chromatogramm „P4“)
15. Vial mit 50μl Kinder-Cola, 50μl Theophyllin Stammlösung und 900μl
Wasser (Chromatogramm „P5“)
16. Vial mit 50μl Coca Cola, 50μl Theophyllin Stammlösung und 900μl Wasser
(Chromatogramm „P6“)
3. Totzeitbestimmung mit Gerätekontrolle
a) Auswertung mit Berechnungen
 Struktur Thioharnstoff:
S
H2N


NH2
Zur Totzeitbestimmung geeignet, da alle Bindungen polar sind und nur
unpolare Verbindungsteile zur Retention führen
3-Maliges injizieren: Bestimmung des relativen und absoluten Fehlers der
Retentionszeit und des Injektionsvolumenens
Totzeit
Präzision der Peakfläche
Peakfläche
Thioharnstoff 1033,02
Thioharnstoff 1030,76
Thioharnstoff 1033,11
Mitelwert
1032,297
s
1,332
Präzision der Retentionszeit
tr
s
Thioharnstoff
1,692
0,0015
Thioharnstoff
1,689
Thioharnstoff
1,690
Mitelwert
1,690
t-Wert
4,30
abs. Fehler rel. Fehler in %
3,31
0,3204
t-Wert
4,30
abs. Fehler rel. Fehler in %
0,00379
0,2245
 Bestimmung der Fehler mit einem Signifikanzniveau von 95%
 Beispielrechnung:
tR,1 = 1,692 s
tR,2 = 1,689 s
tR,3 = 1,690 s
xi

i
x
n
3/9
(
1
,
692

1
,
689

1
,
690
)
s
t

0
3
t0 1,690
s

x

x

(
1
,
690

1
,
690
)

(
1
,
6902

1
,
690
)

(
1
,
689

1
,
690
)
2
i
i
s


n

1
2
2
2
2
0,0015s

f
n

1

3

1

2
P

0
,95
t(
0
,95
;2
)
4
,30

t(P
;f)s 
4
,30
0
,002
m

m



1
,690


s


n
3


1
s(P=0,95)
m

,690

0
,004
abs
.
Eehler
0
,
004
rel
.
Fehler


100
%


100
%

0
,
32
%
1
,
690
x

Bestimmung der Porosität:
l = 12,5cm
d =0,2 cm v = 0,25ml/min
t0=1,69min
4

v

t
ml
ml

0
,
25

1
,
69
0 4
mob
mob

 2

1
,
08
2
ml
ml

d

l 
(
0
,
2
)

12
,
5
stat
stat
 
b) Diskussion der Ergebnisse
Die Porosität von 1,08 entspricht einem Anteil von 52% an mobiler Phase. Die 2%
über 50% können vom Volumen der Schläuche herrühren, wonach ziemlich genau
ein Verhältnis von 1:1 mobiler zu stationärer Phase herscht. Dies ist ein akzeptabler
Wert, da bei höherem Anteil an staionärer Phase der Fluss zu stark gehindert ist und
bei höherem Anteil von mobiler Phase die Gefahr besteht, dass die Trennung zu
schlecht wird, weil weniger Kontakt zwischen mobiler und stationärer Phase besteht.
Der verwendete Thioharntoff ist zur Totzeitbestimmung geeignet, da alle Bindungen
polar sind und nur nach außen unpolare Verbindungsteile zur Retention führen.
Außerdem ist er klein genug um durch die Poren zu wandern.
Die gefundenen relativen Fehler für die Integration (0,22%) und die Retentionszeit
(0,32%) sind jeweils sehr gering. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die Anlage
reproduzierbare Ergebnisse liefert.
Der niedrige relative Fehler bei der Integration lässt auf ein sehr gutes
Injektionssystem schließen, da es immer gleiche Mengen injiziert. Da die Kurven
numerisch nach einer Polynomischen Iteration der Kurve erfolgt sind hier ebenfalls
kleine Schwankungen zu erwarten. Diese sind jedoch deutlich geringer als die hier
gemessenen Schwankungen.
Der niedrige relative Fehler bei der Rentionszeit lässt auf eine sehr konstante
Fließgeschwindigkeit in der Säule schließen
4/9
4. Wahl des internen Standards
a) Auswertung mit Berechnungen
 Chromatogramm aus „ttcoff“, „tbro“ und „tphy“
tR in min
Stoff
1,650
Wasserschlieren
2,364
Theobromin
3,254
Theophyllin
4,284
Coffein
o Hieraus würde man Theophyllin als internen Standard wählen, da die
Retentionszeit näher an der des Coffein ist, als es bei Theobromin der
Fall ist (Theophyllin ist demnach chemisch änlicher)
o Peak bei 1,650 min kommt durch Wasserschlieren zustande, da die
Proben mit Wasserverdünnt wurden, aber ein Ethanol-Wasser Gemisch
das Elutionsmittel ist (vor Totzeit, da Wasser polarer ist als
Thioharnstoff)
 Chromatogramm aus „ttcoff“ und „cola“
tR in min
Stoff
0,900
Zucker aus Cola
1,650/1,652
Wasserschlieren
2,347
Cola-Bestandteil
2,384
Theobromin
3,254
Theophyllin
4,284 (2)
Coffein
 Im Peakbereich von Theobromin liegt ein Cola-Peak, bei Theophyllin nicht
 Hieraus würde man Theophyllin als internen Standard wählen
 Theophyllin ist demnach als interner Standard geeignet
b) Diskussion der Ergebnisse
Theobromin besitzt eine nicht-methylierte Aminogruppe zwischen zwei
Carbonylgruppen. Dies lässt diese Funktionaniltät nach außen sehr polar wirken, was
eine geringe Retention bei der hier angewandten Umkehrphasen-Chromatografie zur
Folge hat. Ist die Aminogruppe jedoch methyliert, wie bei Theophyllin und Coffein,
hat das Molekül einen unpolaren Rest in dieser polaren Gruppe, weswegen es
stärker retardiert wird. Theophyllin wird trotzdem noch schwächer retardiert als
Coffein, da die weitere Amino-Funktionalität in den Molekülen beim Theophyllin nicht
methyliert ist, jedoch beim Coffein und beim Theobromin. Dort sind aber keine
weiteren elektronenziehenden Gruppen in der Nachbarschaft, weswegen der Effekt
weniger stark ist.
Das Cola-Chromatogramm zeigt einen breiten Peak von 0,9 bis 1,5. Dies ist der in
der Cola enthaltene Zucker, der hochpolar ist und deswegen so zeitig kommt.
Außerdem ist das Zuckermolekül im vergleich zu Wasser, Methanol und
Thioharnstoff relativ groß, weswegen es keine „Umwege“ über die Poren geht,
sondern auf direktem Weg durch die Säule, weswegen es noch vor Wasser und
damit auch vor Thioharnstoff erscheint.
5/9
5. Kalibrierung
a) Auswertung mit Berechnungen
 Es wurde der Mittelwert für die Integrationen (I) von Theophyllin gewählt, da
die Menge immer gleich sein sollte, aber die Messwerte Schwankungen
aufweisen
c(Coff) I(Theophyllin) I(Coffein) Quotient
mg/l
2
391,16
141,30
0,36
4
370,05
275,72
0,71
6
401,77
402,91
1,03
8
379,42
533,60
1,37
10
407,20
666,05
1,71
Mittelwert
389,92
Kalibriergerade (gegen Standard)
I(Coff)/I(Standard)
I(Coff)/I(Theoph)
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
y = 0,1676x + 0,03
R2 = 0,9999
2

Linear (I(Coff)/I(Theoph))
4
6 c in mg/l
8
10
Beispielrechnung für „Quot.“
I
141
,
30
Coffein
Quot
.



0
,
36
,
16
I
Theophylli
n 391

Fehler für I(Theoph)(Berechnung analog 3a):
Theophyllin
Theophyllin
Theophyllin
Theophyllin
Theophyllin
Mittelwert
I(Theoph)
391,16
370,05
401,77
379,42
407,20
389,92
s
13,752
t-Wert
2,57
abs. Fehler
14,43
rel. Fehler
3,70
b) Diskussion der Ergebnisse
Der Korrelationskoeffizient der Kalibriergerade ist sehr hoch, was für eine sehr gute
Kalibrierung spricht. Allerdings schwanken die Integrationswerte für Theophyllin recht
stark (rel. Fehler 3,7%), was deutlich über den gerätebedingten Schwankungen liegt
(siehe 3a). Daher muss der Fehler hierfür in der Probenvorbereitung liegen. Hierbei
gibt es mehrere Einflüsse. Zum einen hat die verwendete Mikroliterpipette einen
gewissen Spielraum beim ansaugen, aber auch beim herausspritzen, da manchmal
geringe Mengen an der Plastik hängen bleiben. Desweiteren gab es geringe
Schwankungen in der Bedienung der Pipette. Da wir zum zweiten Mal mit einer
6/9
solchen Pipette arbeiteten sind geringe unregelmäßigkeiten in der Bedienung nicht
auszuschließen. Ebenfalls ist es möglich, dass wir schlecht gespülte Vials unserer
Vorgänger verwendeten, dies ist aber unwahrscheinlich. Der Hauptgrund für die
Schwankungen liegt in der Adsorption des Theophyllins an der Glaswand des Vials.
Da nicht auf ein konsequent senkrechtes einspritzen der Reagenzien in die Vials
geachtet wurde und auch die Reihenfolge nicht immer gleich war ist manchmal mehr
und manchmal weniger Theophyllin (und auch Coffein) an der Glaswand adorbiert
worden. Einmal adsorbiertes Theophyllin geht recht langsam wieder in Lösung.
Dieser Effekt spielt bei unseren geringen Konzentrationen eine Rolle. Beim Coffein
ist dieser Effekt wegen der immer höher werdenden Konzentration nicht sichtbar.
Durch die Mittelwertbildung ist der Einfluss dieses Fehlers auf die Kalibriergerade
minimiert worden.
6. Coffeinbestimmung in den Proben
a) Auswertung mit Berechnungen
 Umstellen der Gleichung für die Kalibriergerade

x
y0,03
,
0,1676
Probe
Tee
Tchibo "Grand Cafe Melange"
deit Classic "Cola Mix Citrus"
Schip-Schwap "Cola Mix"
Kinder-Cola
Coca-Cola
I(Theoph) I(Coff) Quot.
303,82
295,42
385,31
732,33
388,88
375,91
576,26
376,48
211,70
952,66
0,00
314,03
1,90
1,27
0,55
1,30
0,00
0,84
c in Vial
in mg/l
11,14
7,42
3,10
7,58
0,00
4,81
Verdünnung c in Probe
in mg/l
100,00
1114
100,00
742
20,00
62,0
20,00
152
20,00
0,0
20,00
96,1
Anmerkunkung: Die Spalte „c in Probe“ gibt den Gehalt in der Probenlösung an,
was bei Flüssigkeiten gleich der Konzentration in der Probe ist. Für die Proben 1
und 2 muss die Konzentration in den Proben noch errechnet werden. Zur
besseren Vergleichbarkeit der Werte wurde der ungefähre Wert für die
Konzentration von Koffein in 1l Getränk errechnet.
 Zusatz für Feststoffe:
Probe
Tee
Kaffee
c in Probe V(Wasser) mCof f ein in Probe m (Probe) c in FS m für 1l Getänk mCof f ein in 1l
in mg/l
in l
in mg
in mg/g in g (ungefähr)
in mg
1113,8
0,025
27,84
0,9867
28,2
4,5
127
742,5
0,025
18,56
1,0337
18,0
40
718
Beispielrechnung:
I
(
Coff
)
576
,
26

0
,
03
0
,
03
I
(
Theoph
)
303
,
82
c
(
Vial
)



11
,
14
mg
l
0
,
1676
0
,
1676
c
(Pr
obe
)

c
(
Vial
)

Verdünnung

11
,
14

100

1114
mg
l
m
(Pr
obe
)

c

v

(
1114

0
,
025
)

27
,
84
mg
Coffein
m
(Pr
obe
)
27
,
84
Coffein
c
(
Feststoff
)


28
,
2
mg
g
Coffein
m
(Pr
obe
)0
,
9867
7/9
b) Diskussion der Ergebnisse
Beim herstellen der Proben wurde genauso verfahren, wie bei den
Kalibrierstandards, daher sind hier die gleichen Fehler und Schwankungen zu
erwarten. Diese werden beim Vergleich der Integrationen für Theophyllin bei den
Proben 3, 5 und 6 auch sichtbar. Aus diesem Grund wurden die Ergebnisse auf eine
Stelle nach dem Komma (bei den Feststoffen bis zur letzten Stelle vor dem Komma)
gerundet um keine höhere Genauigkeit vorzutäuschen. Andere Einflüsse auf die
Genaigkeit (Temperaturfehler, Volumenkontraktion, u.ä.) können vernachlässigt
werden.
Bei den Proben 1 und 2 fällt auf, dass das Integral für Theophyllin beide male relativ
niedrig
ausfällt.
Dies
kann
man
damit
erklären,
dass
sich
ein
Verteilungsgleichgewicht zwischen den Kaffeeteilchen (bzw. Teeteilchen) und dem
Theophyllin einstellt, genauso wie für Coffein. Des weiteren ist es möglich, dass das
Theophyllin (und Coffein) an den Kaffee/Teeteilchen adsorbiert und damit zusammen
mit den Teilchen vom Filter zurückgehalten wird.
Bei Probe 4 fällt auf, dass die Werte für Theophyllin und Coffein abnorm hoch sind.
Dies lässt sich nur auf einen groben Fehler in der Probenvorbereitung zurückführen
(doppelte Zugabe der Probe oder/und des Theophyllins, zu wenig Wasser...). Da
dieser nicht mehr rekonstruierbar ist kann keine Korrektur des Ergebnisses erfolgen,
was eine Wiederholungsmessung nötig machen würde, was allerdings nicht möglich
ist. Dem Ergebnis von Probe 4 (Schipp Schwapp Cola-Mix) ist demnach nicht zu
trauen.
Schwarzer Tee hat einen höheren Koffeingehalt als Kaffee, da man allerdings für 1
Liter Kaffee deutlich mehr Kaffee (ca. 40g nach eigener Messung) als Tee (ca. 4,5g
bei 3 Beuteln á 1,5g) nimmt, ist Kaffee das Getränk mit dem deutlich höheren
Koffeingehalt. Weiterhin ist festzustellen, dass 1l schwarzer Tee immernoch einen
höheren Koffeingehalt als Coca-Cola hat. Bei der Kinder-Cola wurde erwartungsgemäß kein Coffein gefunden. Das Produkt hat den Titel „Kinder-Cola“ also zurecht.
Der deit Cola-Mix hat einen geringeren Koffein-Gehalt als Coca-Cola. Dies ist
logisch, da beim deit Cola-Mix der Cola noch Orangenlimonde beigemengt ist,
welche normalerweise kein Koffein enthält.
7. Bestimmung von chromatografischen Größen für Theophyllin und Coffein
a) Auswertung mit Berechnungen

Beispielrechnungen:
tr
t0
w0,5
Einheit
s
s
s
Theophyllin 3,25 1,69 0,173
Coffein
4,28 1,69 0,185
k
--0,92
1,53
N
--1955
2965
R
--3,39

t
,
25

1
,
69
R
,
n 3
k


0
,
92
Theophylli
n
t
1
,
69
0

2


t
3
,
25


R


N

5
,
54

5
,
54

1955
 
Theophylli
n


w
0
,
173


0
,
5


2

t

t
4
,
28

3
,
25
R
R
2
1
R

1
,
18

1
,
18
w

w
0
,
173

0
,
185
0
,
5
0
,
5
1
2
b) Diskussion der Ergebnisse
8/9
Die Auflösung von 3,9 ist gut im optimalen Bereich, da alle Werte über 1,5 für eine
gute Trennung stehen. Dies zeigt, dass Theophyllin immernoch unterschiedlich
genug gegenüber Coffein ist und für die HPLC als interner Standard verwendet
werden zu können, da um die Peakflächen ins Verhältnis sezten zu können, diese
auch getrennt sein müssen.
Die Kapazitätsfaktoren für Theophyllin und Coffein sind in Ordnung. Die
Kapazitätsfaktoren sollten nicht zu hoch sein um den Peak nicht zu stark zu
verbreitern, jedoch sollten sie hoch genug sein um eine gute Auflösung zu erhalten,
was hier der Fall ist.
Trennstufen von 1000-8000 sind normale Werte für die HPLC, womit Theophyllin mit
1955 und Coffein mit 2965 in diesem Bereich liegen, wenn auch am im unteren
Segment. Eine höhere Trennstufenzahl ist gleichbedeutend mit einer besseren
Trennleistung der Säule und bedeutet eine höhere Auflösung. Da die Auflösung hier
aber ausreicht, ist die Trennstufenzahl genügend.
___________
Jens Gaitzsch
___________
Axel Gottwald
___________
René Hedrich
9/9
___________
Markus Laube