II Methoden
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3 Inhaltsverzeichnis I Einleitung 1.1 Allgemeine Hinweise und Ablaufsplan des Versuchstages 1.2 Gruppeneinteilung und Zuordnung zu dem jeweiligen Experiment II Methoden 2.1 Übung zum Gebrauch von Mikroliterpipetten 2.2 Vorarbeiten und theoretischer Hintergrund - Nachweis von Fischsorten mittels molekularbiologischer Methoden, aber wie? 2.3 DNA-Isolierung aus Fischfilet- und Fischstäbchenproben 2.3.1 Hintergrundinformation zum Thema: Zentrifugation 2.4 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – theoretischer Hintergrund 2.5 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – praktischer Teil 2.6 Agarose-Gelelektrophorese III Ergebnisse IV Anhang 4.1 Aufgabenstellungen 4.2 Materialien 4.2.1 DNA-Präparation 4.2.2 Polymerase-Kettenreaktion 4.2.3 Agarose-Gelelektrophorese 4.3 Exemplarische Ergebnisse 4.3.1 Gelelektrophorese genomischer DNA 4.3.2 Gelelektrophorese der PCR-Produkte 4.4 Literaturverzeichnis -1- 3 I Einleitung 1.1 Allgemeine Hinweise und Ablaufplan des Versuchstages „Der am stärksten überfischte Speisefisch „ Der Kabeljau wurde in den vergangenen Jahren zum Synonym für die Krise der Fischerei. Ende der 1960er Jahre zogen die Fischer jährlich noch drei Millionen Tonnen dieser Fischart aus dem Meer. Doch bereits Anfang der 1970er Jahre war in „Grzimeks Tierleben“ zu lesen: „Die gegenwärtig erzielten Fangmengen drohen das vertretbare Maß einer biologisch sinnvollen Nutzung zu überschreiten.“ […] Die Rote Liste der Weltnaturschutzorganisation IUCN(International Union for Conservation of Nature and Natural Resources) stuft den Kabeljau (Gadus morhua) als „gefährdet“ ein. Seine Bestandsgröße ist in den vergangenen 40 Jahren um 90 Prozent zurückgegangen. In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren erlebte der Kabeljau einen der dramatischsten Einbrüche, die je in der Geschichte der Fischerei beobachtet wurden. Die kanadische Regierung musste den Kabeljaufang im Juli 1992 ganz untersagen, weil die Bestände bis zu Beginn der 1990er Jahre um 99 Prozent zurückgegangen waren. Trotz dieses noch immer gültigen Fang-Moratoriums hat sich der Kabeljaubestand vor Kanada bis heute nicht wieder erholt. In der Nordsee zeichnet sich seit Jahren eine ähnliche Katastrophe zum Kabeljaukollaps in Kanada ab. Hier sinkt nicht nur Zahl und Größe der Bestände, im Jahr 2001 erreichte auch die Biomasse der Tiere ein historisches Tief. Nur noch 30.000 bis 50.000 Tonnen so genannte Laicherbiomasse (fortpflanzungsfähige Fische) des Kabeljau sind im Jahr 2006 noch in der Nordsee vorhanden. Das bedeutet den Verlust von rund 90 Prozent der fortpflanzungsfähigen Fische innerhalb von 40 Jahren. Eine langfristig gesicherte Fischerei würde in etwa das Dreifache an Kabeljau benötigen. Eine nachhaltige Bewirtschaftung ist daher nicht mehr möglich. Der einstmals wertvollste Fisch der Nordsee befindet sich ganz deutlich außerhalb „sicherer biologischer Grenzen“, wie der Internationale Rat für Meersforschung ICES (International Council for the Exploration of the Sea) Jahr für Jahr warnt. Eine weitere Bedrohung: Neben der „offiziellen“ Überfischung dezimiert die „IUU-Fischerei“ – illegal, unreguliert und undokumentiert – die Fischbestände weltweit. Die Wissenschaftler des ICES gehen davon aus, dass seit 2002 allein in den nordostarktischen Gewässern 90.000 bis 115.000 Tonnen Kabeljau pro Jahr unregistriert entnommen wurden. Für die Ostsee werden 30 bis 45 Prozent höhere Fangmengen pro Jahr kalkuliert, als offiziell verlautbart wurden. Grundsätzlich führen die unerkannten und millionenschweren Fangerträge der Piratenfischer dazu, dass auch die wissenschaftlichen Schätzungen für Größe und Entwicklung von Beständen auf wackeligen Beinen stehen. […]“ WWF, Küsten & Meere, Artenlexikon, Kabeljau/Dorsch, o.J. http://www.wwf.de/themen-projekte/artenlexikon/kabeljau/ Zugriff am 04.01.2015 Eine weitere Problematik bei der Überwachung der Fangquote versteckt sich innerhalb der verarbeitenden Lebensmittelindustrie denn ist der Fisch erstmal zu Fischstäbchen, Fischburgern oder „Schlemmerfilet“ verarbeitet, so ist dem Nahrungsprodukt die Art des verarbeiteten Speisefisches nicht mehr anzusehen. -2- 3 Ziel des hier durchgeführten Projektes ist der Nachweis von Fisch verschiedener Spezies in Fischstäbchen verschiedener Anbieter mit dem Ziel, eine eventuell vorhandene Verbrauchertäuschung festzustellen. Aus aktuellem Anlass steht heute der Nachweis von eventuell vorhandenem Kabeljaufleisch in Fischstäbchen an. Die Spezies des Kabeljaus ist derzeit besonders vom Aussterben bedroht. Viele Fischer (darunter auch Piratenfischer) fischen dennoch den Kabeljau ohne auf die Gefährdung dieses Fisches Rücksicht zu nehmen. Aus diesen Gründen sollte der Kabeljau nicht zur Lebensmittelproduktion verwendet werden. Schematischer Ablauf des Versuchstages I Begrüßung und Sicherheitsbelehrung II Einleitung in die Thematik, Versuchsbesprechung Teil I III Gruppenbildung, Versuche Teil I (Pipettentest und Präparation der DNA) IV Versuchsbesprechung Teil II V Versuche Teil II (Polymerasekettenreaktion) VI Versuchsbesprechung Teil III (Agarosegelelektrophorese) - Gelerstellung - PAUSE – VII Versuche Teil III (Vorbereitung der Proben für und Beladen der Proben auf das Agarosegel) VIII Aufräumen, Bearbeitung der Aufgabenstellungen I IX Abbau der Gelelektrophorese und Überführung in die Färbelösung X Bearbeitung der Aufgabenstellungen II, Versuchsbesprechung Teil IV (Auswertung und Diskussion) -3- 3 1.2 Gruppeneinteilung und Zuordnung zum jeweiligen Experiment Je nach Kursstärke werden unterschiedlich viele Gruppen aus 4 Schülerinnen und Schülern gebildet. Innerhalb jeder Vierergruppe präparieren zwei Schüler genomische DNA aus unterschiedlichen Fischstäbchensorten (Iglo Fischstäbchen, Eskimo Fischstäbchen) und die jeweils anderen zwei Schüler genomische DNA aus je einem Fischfilet (Lachs, Kabeljau). Gruppe 1 (4 SuS) Präparation von: Iglo-Fischstäbchen-DNA (i) mit anschließender PCR mit Lachsprimern, (2 SuS) und Präparation von: Kabeljau-DNA (K) mit anschließender PCR mit Lachsprimern, (2 SuS) Gruppe 2 (4 SuS) Präparation von: Iglo Fischstäbchen DNA (i) mit anschließender PCR mit Kabeljauprimern, (2 SuS) und Präparation von: Kabeljau-DNA (K) mit anschließender PCR mit Kabeljauprimern (2 SuS) Gruppe 3 (4 SuS) Präparation von: Eskimo-Fischstäbchen-DNA (E) mit anschließender PCR mit Kabeljauprimern, (2 SuS) und Präparation von: Kabeljau-DNA (K) mit anschließender PCR mit Kabeljauprimern (2 SuS) Gruppe 4 (4 SuS) Präparation von: Eskimo-Fischstäbchen-DNA (E) mit anschließender PCR mit Lachsprimern (2 SuS) und Präparation von: Lachs-DNA (L) mit anschließender PCR mit Lachsprimern (2 SuS) Gruppe 5 (4SuS) Präparation von: Iglo-Fischstäbchen-DNA (i) mit anschließender PCR mit Lachsprimern, (2 SuS) und Präparation von: Kabeljau-DNA (K) mit anschließender PCR mit Lachsprimern, zweite PCR mit Iglo Fischstächen-DNA als Template (2 SuS) Gruppe 6 (4 SuS) Präparation von: Iglo-Fischstäbchen-DNA (i) mit anschließender PCR mit Kabeljauprimern, (2 SuS) und Präparation von: Kabeljau-DNA (K) mit anschließender PCR mit Kabeljauprimern (2 SuS) Gruppe 7 (4 SuS) Präparation von: Eskimo-Fischstäbchen-DNA (E) mit anschließender PCR mit Kabeljauprimern, (2 SuS) und Präparation von: Kabeljau-DNA (K) mit anschließender PCR mit Kabeljauprimern (2 SuS) Gruppe 8 (4 SuS) Präparation von: Eskimo-Fischstäbchen-DNA (E) mit anschließender PCR mit Lachsprimern (2 SuS) und Präparation von: Lachs-DNA (L) mit anschließender PCR mit Lachsprimern (2 SuS) -4- 3 II Methoden 2.1 Übung zum Gebrauch von Mikroliterpipetten Mikroliterpipetten gibt es für unterschiedliche Voluminabereiche. Wir benutzen am Projekttag hauptsächlich eine Mikroliterpipette, die im Bereich von 0,5 bis 10µL pipettiert und eine Pipette der Volumina von 100 bis 1000µL, wobei 1 µL einem tausendstel Milliliter (1x10-3mL) also einem Millionstel Liter (1x10-6L) entspricht. Andere Mikroliterpipetten umfassen die Voluminabereiche von z.B. 2,0 bis 20µL und 20 bis 200µL. Das zu pipettierende Volumen wird eingestellt, indem man den Kolben nach links bzw. rechts dreht. Das eingestellte Volumen kann am „Sichtfenster“ abgelesen werden. Achtung: Pipetten dürfen niemals überdreht oder unterdreht werden, d.h. bei der 0,5-10µL Pipette darf niemals unter 005 bzw. über 100 eingestellt und bei der 1000der Pipette niemals über 100 bzw. unter 010µL eingestellt werden. Übung: Mikroliterpipetten werden niemals ohne Einwegspitze benutzt, haben zwei Druckpunkte und meist einen weiteren Druckknopf zum Abwerfen der Spitze. Versuche zuerst die Druckpunkte der Pipetten zu identifizieren. Nehme dann die passende Pipette, um auf den Filterpapierstreifen die angezeigten Volumina innerhalb der Kreise zu pipettieren. Gehe folgendermaßen vor: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Einstellen des zu pipettierenden Volumens am Stellrad und Aufstecken der passenden Pipettenspitze durch Andrücken der Spitze. Drücken des Kolbens bis zum ersten Druckpunkt. Eintauchen der Pipettenspitze mit gedrücktem Kolben in die zu pipettierende Flüssigkeit. Den Druck vom Kolben langsam lösen, so dass dieser nach oben geht und die entsprechende Menge an Flüssigkeit angesaugt wird. Mittig über die Kreismarkierung des Filterpapierstreifens gehen und durch Drücken bis zum zweiten Druckpunkt sämtliche Flüssigkeit aus der Spitze entleeren. Pipette vom Filterpapier entfernen während der Kolben noch gedrückt bleibt. Finger vom Kolben nehmen und den Spitzenabwurf über dem Abfallgefäß betätigen. Muster: Auftrag in µL Pipettentest erwartete Größe 1 µL 2 µL 4 µL 8 µL 20 µL 40 µL 80 µL -5- 3 2.2 Vorarbeiten und theoretischer Hintergrund - Nachweis von Fischsorten mittels molekularbiologischer Methoden, aber wie? Vorlage für diesen Versuch ist die Publikation „Vertrauen ist gut, Kontrolle ist besser!“ von Katja Brinkert, Sonja V. Bergner und Michael Hippler [2013]. Primer Sequenzen Lachs forward: 5‘ ACG GGC TCC GTC TTT ACC CA 3‘ Lachs reverse: 5‘ ACT GCT GGG TTT CCT TGG GGG T 3‘ Kabeljau forward: 5‘ AGC GAG GGC CTC TGC CTC AA 3‘ Kabeljau reverse: 5‘ GCC AGG CTT CCC ACG GTG AG 3‘ 2.3 DNA-Isolierung aus Fisch- und Fischstäbchenproben Die Isolierung der genomischen Tier-DNA erfolgt zum einen aus Filet von Lachs und Kabeljau zum anderen aus Fischstäbchenproben (Iglo, Eskimo). Verwendet wird hier eine kommerzielle Methode der Firma „Peqlab“, die nach der Lyse der Zellen auf der spezifischen Absorption der DNA an einer in einer Säule gebunden Matrix beruht. Von dem Säulenmaterial wird die DNA nach einigen Waschschritten (s. u.) durch Zugabe eines Elutionspuffers und anschließender Zentrifugation in ein 1,5mL Eppendorfgefäß (Eppi) eluiert (gelöst). Infos zum „Eppi“: Unter dem im Laborslang üblichen Begriff des „Eppis“ versteht man Reaktionsgefäße für kleine Probenvolumina im Mikroliterbereich, die ursprünglich 1962 von der Firma Eppendorf Gerätebau Netheler & Hinz entwickelt wurden. Die Gefäße bestehen aus Polypropylen und werden in verschiedenen Größen und Farben angeboten. Infos zur Zentrifuge: Zentrifugiert wird unterschiedlich lang und unterschiedlich schnell. Die Umdrehungsgeschwindigkeit wird häufig in der Angabe der Erdbeschleunigung angegeben, diese ist das „g“. Sowohl Zeit als auch Zentrifugalkraft können an der Zentrifuge individuell eingestellt werden. Damit Proben nicht durcheinander geraten, sollten nur beschriftete Gefäße in die Zentrifuge gestellt werden. Wichtig: Die Zentrifuge muss immer austariert beladen werden. Da heißt, dass sich immer gleichschwere Eppis im Rotor einander gegenüber befinden müssen. -6- 3 Für die DNA-Isolierung werden die Fischstäbchen (ohne Panade) sowie die Fischfilets in 0,5cm x 0,5cm große Stückchen geschnitten. L: Lachs-DNA K: Kabeljau-DNA E: Eskimo-Fischstäbchen-DNA i: Iglo-Fischstäbchen-DNA -7- 3 2.3.1 Hintergrundinformation zum Thema: Zentrifugation (www.wikipedia.de) Die Zentrifuge ist ein technisches Gerät, das unter Ausnutzung der Massenträgheit arbeitet; die Funktionsweise beruht auf der Zentrifugalkraft, die aufgrund einer gleichförmigen Kreisbewegung des zu zentrifugierenden Gutes zustande kommt. Das wird zur Stofftrennung genutzt. Partikel oder Medien mit höherer Dichte wandern aufgrund der höheren Trägheit nach außen bzw. unten. Dabei verdrängen sie die Bestandteile mit niedrigerer Dichte, die hierdurch zur Mitte bzw. nach oben gelangen. Der Prozess ist gegenüber der Sedimentation durch die Schwerkraft wesentlich schneller oder wird überhaupt erst möglich - Gegenkräfte wie die Adhäsion, die thermische Molekularbewegung oder die Viskosität werden überwunden. Die Sedimentationszeit ist bei der Zentrifugation abhängig zum einen von der Drehgeschwindigkeit und zum anderen von der Zeit. I) Differentielle Zentrifugation Die differentielle Zentrifugation ist ein Trennverfahren, bei dem zelluläre Bestandteile durch mehrere serielle Zentrifugationen bei immer höheren Geschwindigkeiten aufgetrennt werden. Man macht sich zunutze, dass Zentrifugation Zellkomponenten auf der Basis ihrer Größe und Dichte auftrennen. Große und dichte Komponenten wandern dabei am schnellsten, setzen sich also schon bei verhältnismäßig niedrigen Geschwindigkeiten ab und bilden ein Pellet. Abbildung 1: Schematische Darstellung einer differentiellen Zentrifugation Ein Zellhomogenisat wird (1) bei niedrigen Geschwindigkeiten zentrifugiert. Das entstandene Pellet (grün) besteht aus großen schweren Bestandteilen. Der Überstand wird abgenommen und bei etwas höherer Geschwindigkeit zentrifugiert (2). Dieser Vorgang wird wiederholt und bei jeder Zentrifugation die Geschwindigkeit gesteigert. Zur Auftrennung zellulärer Bestandteile gelten die folgenden Faustregeln: Zellkerne sedimentieren bei Zentrifugation mit 1.000 g für 5 - 10 min; Mitochondrien mit 10.000 g für 15 min und Peroxisomen/Microbodies bei 100.000 g für 1h. II) Dichtegradientenzentrifugation Die Dichtegradientenzentrifugation gehört zu den physikalischen Trennverfahren von Partikeln anhand der Sedimentation in einem Dichtegradienten. Verschiedene gelöste Makromoleküle werden in einer Ultrazentrifuge anhand ihrer Bewegungsgeschwindigkeit (Sedimentationsgeschwindigkeit) oder Dichte unter dem Einfluss starker Zentrifugalkräfte sortiert. Für die Dichtegradientenzentrifugation ist ein Lösungsmittel erforderlich, das infolge eines Konzentrationsgefälles eines darin gelösten Stoffes eine von oben nach unten ansteigende Dichte aufweist (kontinuierlicher Gradient). Das Konzentrationsgefälle verläuft von unten nach oben, weil sich die unterschiedlich dichten Schichten im Schwerefeld der Erde ausrichten und die meisten für einen Gradienten verwendeten Stoffe eine höhere Dichte aufweisen als die -8- 3 Probe. Der Konzentrationsgradient wird erzeugt, indem das Zentrifugenglas mit einem ansteigenden Gradienten einer Lösung gefüllt wird. Eine Möglichkeit, einen kontinuierlichen Dichtegradienten vor einer Zentrifugation zu erzeugen, ist der Gradientenmischer. Die zentrifugierten Partikel sammeln sich hier im Bereich des Dichtegradienten an, der ihrer eigenen Dichte entspricht. Durch vorsichtiges Übereinanderschichten von Lösungen mit sinkender Dichte können auch mehrstufige Gradienten aufgebaut werden, ein Gradientenmischer wird zur Erzeugung solcher diskontinuierlicher Gradienten nicht benötigt. Die zentrifugierten Partikel sammeln sich bei geeigneter Dichte des Gradienten an einer der Grenzschichten zwischen zwei Dichtebereichen an. Die zu untersuchende Probe wird vor der Zentrifugation auf die Oberfläche dieser Lösung mit dem Gradienten gegeben. Während der mehrstündigen Trennung „sedimentieren“ die Moleküle mit unterschiedlicher Geschwindigkeit in der Lösung. Die Trennung erfolgt, solange die Dichte der Probe größer ist als die Dichte des Lösungsmittels und umso schneller, je größer der Dichteunterschied ist. Nach Einstellung des Gleichgewichts erhält man unterschiedliche Banden der Bestandteile der Probe. Bei Erreichen einer Dichte, die der des Moleküls entspricht, endet die Wanderung und die zentrifugierte Probe befindet sich im Gleichgewicht. Abbildung 2: Fuoreszenz von DNA mit Ethidiumbromid im Cäsiumchlorid-Gradienten Für jede Molekülsorte kann eine Sedimentationskonstante K bestimmt werden. Sie ist als Quotient von Sedimentationsgeschwindigkeit und Zentrifugalbeschleunigung definiert und wird als Svedberg-Einheit (S) angegeben. So besteht z. B. das bakterielle Ribosom aus zwei größeren Untereinheiten, 30 S und 50 S (zusammen 70 S) und das der Eukaryoten aus 40 S und 60 S (zusammen 80 S). Kleinere Viren wie Picornaviren haben eine Sedimentationskonstante von 150 S. -9- 3 2.4 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – theoretischer Hintergrund Die Polymerase Chain Reaction (PCR, Abb. 3) dient der exponentiellen Amplifikation (Vermehrung bzw. Anreicherung) von DNA in vitro (d. h. „im Reagenzglas“), entspricht aber im Weitesten der DNA-Replikation in der lebenden Zelle (in vivo). Benötigt werden dazu synthetische Primer, die spezifisch an das „gene-of-interest“ binden, und das zu amplifizierende DNA Fragment – hier die Acrosin-DNA - flankieren. Neben den Primern, dem DNA-Fragment (auch Matrize oder template genannt) werden für die PCR-Reaktion weiterhin eine thermostabile DNA Polymerase (z.B. die DNA Polymerase von Thermophilus aquaticus; die TaqPolymerase), Desoxynukleotidtriphosphate (dATP + dTTP + dCTP + dGTP = dNTPs) und ein geeigneter Reaktionspuffer der divalente Metall-Ionen enthält, die für die Aktivität der Polymerase notwendig sind, benötigt. Die PCR wird ermöglicht durch die Tatsache, dass DNA bei hohen Temperaturen „denaturiert“ (d.h. der Doppelstrang trennt sich in zwei Einzelstränge), die TaqPolymerase aber dennoch ihre Aktivität behält. Der Reaktionsansatz wird einer Folge von zyklischen Temperaturänderungen unterworfen (Abb. 4). In der ersten Phase wird das Gemisch auf 95°C aufgeheizt, dadurch werden die Wasserstoffbrücken, die die zwei Stränge der DNA Doppelhelix zusammenhalten, aufgebrochen und es entstehen DNA-Einzelstränge („Denaturierung“). In der zweiten Phase eines Zyklus wird die Temperatur gesenkt, was eine Bindung komplementärer DNA Stränge wieder erlaubt. Im Reaktionsgemisch werden die Primer im Überschuss zugegeben, so dass die meisten freiwerdenden DNA Stränge der Template-DNA sich nun mit den Primern paaren („Annealing“). Die Temperatur des Annealing-Schrittes ist oft kritisch. Wenn die Temperatur zu hoch ist, kommt es nicht zur Bindung der Primer, ist die Temperatur aber zu niedrig, können die Primer auch unspezifisch binden, sich also an Bereiche des templates anlagern, dessen Sequenz nicht vollständig komplementär zur Primersequenz ist. In diesem Fall würde es zur Amplifikation unerwünschter DNA Fragmente kommen. Je nach Länge und GC-Gehalt der Primer (und der damit korrelierenden Anzahl an Wasserstoffbrückenbindungen) liegt die Annealing-Temperatur meist zwischen 50 und 60°C. In der dritten und letzten Phase eines Zyklus wird das Gemisch auf 72°C aufgeheizt, da diese Temperatur das TemperaturOptimum der TaqPolymerase darstellt. In dieser Phase werden die Primer verlängert und die zur Template komplementären DNA Stränge synthetisiert („Elongation“). Dann werden die DNA Moleküle wieder getrennt und der Zyklus wiederholt. Das führt zu einer exponentiellen Amplifikation von DNA Fragmenten, deren Sequenzen von einem Primer zum andern reichen. „Es war ein Geistesblitz – bei Nacht, unterwegs auf einer mondbeschienenen Bergstraße, an einem Freitag im April 1983. Ich fuhr gemächlich mit meinem Wagen zu den Mammutbaumwäldern im Norden Kaliforniens, als aus einem unglaublichen Zusammentreffen von Zufällen, Naivität und glücklichen Irrtümern plötzlich die Eingebung kam: zu jenem Genkopierverfahren, das heute als Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bekannt ist." Mit diesen Worten beschrieb Karry B. Mullis seine Entdeckung der Polymerase-Kettenreaktion (Saiki et al., 1988). Dieser Geistesblitz revolutionierte in den nächsten Jahren die Molekularbiologie und bescherte Mullis 1993 den Nobelpreis für Chemie. Heute ist die Methode aus der Molekularbiologie nicht mehr wegzudenken, da mittels der PCR zum einen größere Mengen an DNA für Klonierungszwecke hergestellt werden können, Methoden wie der Vaterschaftstest und die Täterüberführung mittels DNA-Spur auf ihr beruhen, zum anderen aber auch physiologische Prozesse bzw. genregulatorische Prozesse mit der PCR nachvollzogen werden können (s. real-time PCR, quantitative PCR, reversetranskriptions PCR). - 10 - 3 Nach 25 – 36 Zyklen ist die Zielregion millionenfach amplifiziert Abbildung 3: Ablauf einer Polymerase-Kettenreaktion - 11 - 3 2.5 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – praktischer Teil Alle „Zutaten“, die ihr für die PCR benötigt bis auf die von euch präparierte template-DNA (s. Methode 2.3), befinden sich in den mit einem Deckel versehenen Kühlracks, die die Temperatur der in ihnen befindlichen Flüssigkeiten für mehrere Stunden bei 4°C hält. Die Stoffe (s. u. „Pipettierschema“) werden nacheinander – natürlich immer mit einer neuen Spitze an der Pipette - in das farblose 0,2mL Eppi pipettiert. Hierbei ist es sinnvoll das Eppi aus dem Rack zu nehmen und den Pipettiervorgang in Augenhöhe zu betrachten. Sollte der Inhalt der Eppis aus den Kühlracks gefroren sein, muss dieser zwischen zwei Fingern kurz aufgetaut werden. Alle „Zutaten“ müssen sich nachher zusammen am Grunde des Eppis befinden! Zwischendurch und am Ende das Eppi wieder in das Kühlrack stellen! Die Deckel der Primer-Eppis der einzelnen Gruppen sind nochmals farblich markiert. Rot steht für die beiden Lachsprimer (1+4+5+8) und blau für forward und rerverse Primer von Kabeljau (Gruppen 2+3+6+7). Bitte kontrollieren! Erst wenn alle Gruppen ihre PCR-Ansätze fertig gestellt haben, werden sämtliche Proben zum Thermocycler gebracht und die PCR (Programm s. u., Abbildung 4) gestartet. Pipettierschema für die PCR-Ansätze Was? DNA-template dNTPs Forward Primer Reverse Primer 10x Reaktionspuffer Wasser taq-DNA-Polymerase Summe Wodrin? 1,5 mL Eppi gelbes Eppi grünes Eppi rosa Eppi orange Eppi blaues Eppi pinkes Eppi farbl. Eppi (0,2 mL) (0,2 mL) (0,2 mL) (0,2 mL) (0,2 mL) (0,2 mL) (0,2 mL) Wieviel? 2,0 µL 5,0 µL 5,0 µL 5,0 µL 2,5 µL 3,5 µL 2,0 µL 25 µL Achtung: Wie bei allen Arbeiten mit Nukleinsäuren (DNA oder RNA) ist beim Pipettieren der PCR-Reaktionen auf größte Sauberkeit am Arbeitsplatz zu achten. Des weiteren sollten Handschuhe getragen werden, um Kontaminationen mit DNAsen und RNAsen von menschlichen Hautschuppen zu vermeiden. Weiterhin muss sehr achtsam gearbeitet werden, da schon kleine Ungenauigkeiten beim Pipettieren das Gelingen des gesamten Experiments gefährden können. Abbildung 4: Fotografie des Temperatur-Zeitprogramms der hier verwendeten PCR-Methode. - 12 - 3 2.6 Agarose-Gelelektrophorese Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine analytische Methode, bei der DNA-Fragmente ihrer Größe nach (entspricht der Anzahl der Nukleotide bzw. der Basenpaare [bp]) aufgetrennt werden. Im Praktikum wird die Methode genutzt, um die PCR-Ansätze zu analysieren. Dazu wird zunächst ein 2%iges Agarosegel hergestellt. Agarose ist eine Reinform von Agar, der wiederum aus Algen gewonnen wird. Agarosegele besitzen eine siebartig-poröse Struktur, durch die die negativ geladenen DNA-Fragmente im elektrischen Feld wandern. Entsprechend ihrer Größe wandern die DNA-Fragmente dabei unterschiedlich schnell im Gel in Richtung Pluspol. Nach Beendigung der Elektrophorese erscheinen die DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe als distinkte Bereiche (Banden) im Gel. Kleinere DNA-Fragmente befinden sich weiter unten und größere DNA-Fragmente dementsprechend weiter oben im Gel. Die genaue Größe bzw. Länge der doppelsträngigen DNA-Fragmente (PCR-Produkte) kann im Vergleich mit einem kommerziellen Größenstandard (s. u.) in Form der Anzahl der vorhandenen Basenpaaren ermittelt werden. Abbildung 5: Schematische Darstellung einer Elektrophorese ( http://www.biokurs.de/skripten/13/bs13.html) und DNA-Größenstandard (100bp-Leiter und 500bp-Leiter, Firma Roth) Methode: Für das 2%ige Agarosegel werden 100mL Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE-Puffer) abgemessen und zusammen mit abgewogenen 2g Agarose in der Mikrowelle im 300mL Erlenmeyerkolben erhitzt, bis die Agarose geschmolzen ist. Die Flüssigkeit wird, nachdem sie sich auf ca. 55°C abgekühlt hat, in den abgedichteten Gelschlitten mit einem Kamm für je 10 Taschen gegossen. Nach Erstarren der Agarose werden die Dichtungen und der Kamm entfernt und das Gel in die mit TAE-Puffer gefüllte Laufkammer gegeben. Protokoll: Auftrag der PCR-Ansätze Zu den PCR-Ansätzen werden je 3µL Gelladepuffer (blaugefärbt, klares 0,5 mL Eppi) pipettiert, die Stoffe durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vermischt, und anschließend 13µL der angefärbten PCR-Ansätze sowie 13µl des DNA-Größenstandards in jeweils eine Tasche des Gels pipettiert. Die Auftragung der Proben erfolgt entsprechend des Musters (Abb. 6). Gelelektrophorese, Anfärbung und Auswertung Die Elektrophorese erfolgt für 45 Minuten bei 100 Volt. Das Gel bzw. die DNA wird anschließend mit Ethidiumbromid angefärbt. Bei Ethidiumbromid handelt es sich um ein starkes Mutagen. Alle Arbeiten mit Ethidiumbromid dürfen nur vom Betreuer durchgeführt werden!!! - 13 - 3 Das Gel wird zum Anfärben für 10 Minuten in verdünnter Ethdiumbromidlösung gefärbt, anschließend muss es um Hintergrundstrahlung zu minimieren für 2 mal 5 Minuten in Wasser entfärbt werden. Anschließend erfolgt die Visualisierung des an die DNA gebundenen Ethidiumbromids durch Anregung mit UV-Licht. Mithilfe der Kamera wird das Gel dokumentiert und ein Ausdruckerstellt. M Gruppe DNA Primer 2 3 4 5 1 i M Gruppe DNA Primer 1 1 i K i Lachs 2 3 5 K i Lachs 6 7 8 M1 2 K i 4 5 K i K i Kabeljau 6 7 6 K i Kabeljau 2 3 4 5 6 3 K 8 K E K E Kabeljau M1 2 3 7 E K E Kabeljau 7 8M 4 K E 4 5 K E L E Lachs 6 7 8 L E Lachs L 8M L Abbildung 6: Vorlage zur Auftragung der PCR-Proben auf das Agarosegel, M= DNA Größenstandard III Ergebnisse Klebe hier ein Foto des fertigen Agarosegels der Gelelektrophorese ein Erläuterungen: ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ _______________ - 14 - 3 IV Anhang 4.1 Aufgabenstellungen 1. Erkläre, was das Besondere an der sogenannten TaqPolymerase ist und aus welchem Lebewesen (Gattung Art) diese ursprünglich gewonnen wurde. _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2. Die Agarose-Gelelektrophorese trennt DNA-Fragmente ihrer Größe nach auf. Erkläre kurz das zugrundeliegende Trennprinzip und erläutere wo sich in einem Agarosegel nach Elektrophorese die kleinen bzw. großen DNA-Fragmente befinden. _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ _______________________________________ 3. Erkläre, warum die Annealing-Temperatur bei der PCR von Versuch zu Versuch variiert. _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ ___________________________________________________ 4. Erkläre die Bedeutungen der Abkürzungen: bp, g, µL _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 5. Zu welchem Pol wandert die DNA während der Elektrophorese? ___________________________________________________________________________ 6. Leite von dem folgenden DNA-Stück die Primer (10 Nukleotide) für eine PCR ab. 5´- GGATCGATGGCTCGATCGATCGATGGATCGGATCGAGTCAGCTATGATCTAGC -3´ 3´- CCTAGCTACCGAGCTAGCTAGCTACCTAGCCTAGCTCAGTCGATACTAGATCG - 5´ Primer 1: __________________________________________________________________ Primer 2: __________________________________________________________________ 8. Wieso ist es möglich mit der Methode der PCR Fleisch einer bestimmten Spezies in Fleischprodukten mit Fleisch unterschiedlicher Herkunft zu identifizieren? - 15 - 3 _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ ___________________________________________________ 9. Wer bekam wann den Nobelpreis für die Idee der Methode der PCR? ___________________________________________________________________________ 10. In einem Lehrbuch steht: “Nukleotid-Polymerasen arbeiten unidirektional“. Erläutere die Bedeutung dieser Aussage. _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ ___________________________________________________ 11. In wie fern kann die PCR mit sich anschließender Agarosegelelektrohorese dazu genutzt werden, um z. B. potentielle Väter zu identifizieren? _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ ___________________________________________________ 12. Wie ist die „Svedberg“-Einheit definiert? Welche Svedbergzahl haben die Ribosomen von Pro- und Eukaryoten? _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ ___________________________________________________ - 16 - 3 13. Wer ist der Vater – eins, zwei oder drei? Aufgetrennt sind hier mittels Agarose-Gelelektrophorese bestimmte Bereiche eines menschlichen Gens, die mittels PCR mit aus Körperzellen extrahierter DNA als Template amplifiziert wurden. ________________________________________________________________________ ? Vater 1 ? Vater 2 ? Vater 3 Mutter Kind Wieso ist bei dem potentiellen Vater Nr. 1 nur eine Bande zu sehen und bei den anderen Personen zwei? _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 14. Bei der PCR wird die DNA zunächst denaturiert. Erläutere, warum der Begriff „Denaturierung“ eigentlich unpassend ist und wie die „Denaturierung“ bei der DNA-Replikation in der Zelle erfolgt. _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ ___________________________________________________ 15. Die Enden eines DNA-Stranges werden mit 3´- und 5´- bezeichnet. Erläutere den Unterschied dieser Enden und die Bedeutung der Zahlen „3“ und „5“. _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ ___________________________________________________ __________________________________________________________________________ - 17 - 3 16. Sortiere folgende Zellorganellen aufsteigend entsprechen ihrer Dichte: Mitochondrien, Peroxisomen, Zellkerne 17. Beschrifte folgendes Diagramm und beschreibe die Bedeutung des hier angewendeten PCR-Programms (Abb. 5) in eigenen Worten. _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ _______________ 18. Berechne die Anzahl der amplifizierten DNA-Fragmente bei einem Template-Molekül und 37 PCRZyklen. 19. Warum ist es so „schlimm“, wenn Kabeljaufleisch zu Fischstäbchen verarbeitet wird? _______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 20. In welchem Dichtebereich sammeln sich die zentrifugierten Partikel im Dichtegradienten an? ___________________________________________________________________________ - 18 - 3 4.2 Materialien 4.2.1 DNA-Präparation (pro Vierergruppe) Geräte Pipetten: 1 x 100-1000µL 2 x 0-10µL, 2 x 10- 100µL Pipettenständer 1x Eppi-Ständer 2x Mikropistill 2x Tischmülleimer 2x (pro Kurstag) Summe 8 Stück 16 Stück 8 Stück 16 stück 16 Stück 16 Stück Zentral: Tischzentrifuge, Wasserbad oder Heizblock Chemikalien und Verbrauchsmaterialien: Eppis mit Gewebe 1 x Fischfleisch, 1 x Fischstäbchen Puffer FS1 2 x 500µL Puffer FS2 2 x 500µL Proteinase K 2 x 30µl Puffer FS3 2 x 500µL Waschpuffer 1 2 x 1100µL Waschpuffer 2 2 x 1300µL Elutionspuffer 2 x 300µL Säule im 2.0mL Eppi 2 x 1 Stück Pipettenspitzen Eppendorfgefäße 2 x 100-1000µL 2 x 0-10µL 2 x 10- 100µL 2 x 1,5mL Zentral: Latex-Handschuhe 4.2.2 im im im im im im im im 1,5mL Eppi 1,5mL Eppi 1,5mL Eppi 1,5mL Eppi 1,5mL Eppi 1,5mL Eppi 1,5mL Eppi 1,5mL Eppi 8x2= 16 Stück 16 Stück 16 Stück 16 Stück 16 Stück 16 Stück 16 Stück 16 Stück 16 Stück Box 16 Stück Box beschriftet mit: i, E, K oder L 16 Stück 16 Stück 1 x S, M, L Polymerase-Kettenreaktion (pro Vierergruppe) Geräte Pipetten: Pipettenständer Eppi-Kühlracks Tischmülleimer 2 x 0-10µL 1x 2x 2x 16 Stück 8 Stück 16 Stück 16 Stück Zentral: Thermocyler, Zentrifuge Chemikalien und Verbrauchsmaterialien DNA-Template 2 x Fischfleisch und Fischstäbchen im 1,5mL Eppi (aus Versuch 2.3) dNTP´s 2 x 15µL im gelben 0,2mL Eppi forward Primer 2 x 15µL im grünen 0,2mL Eppi reverse Primer 2 x 15µL im rosanen 0,2mL Eppi 10 x Puffer 2 x 5µL im orangenen 0,2mL Eppi taqPolymerase 2 x 6µL im pinken 0,2mL Eppi Wasser 2 x 100µL im blauen 0,2mL Eppi Gelladepuffer 2 x 10µL im klaren 0,5mL Eppi PCR-Eppis 2 x 2 Stück im klaren 0,2mL Eppis - 19 - 16 Stück 16 Stück 8x(L,K) 8x(L,K) 16 Stück 16 Stück 16 Stück 16 Stück 32 Stück 3 4.2.3 Agarose-Gelelektrophorese (pro Vierergruppe) Geräte 300mL Erlenmeyerkolben (4 Stück), 100mL Messzylinder (4 Stück), Thermometer (4 Stück), Hot-Hands (4 Stück), Löffelspatel (4 Stück) Powersupply, Gellaufkammer, Färbeschalen, Wagen, Geldokumentation (UV-Transilluminator, Foto-apparat, PC und Drucker) Chemikalien und Verbrauchsmaterialien TAE-Puffer, bp-Marker, Gelladepuffer, Agarose, Wägeschälchen, Ethidiumbromid Alle Materialien für die Agarose-Gelelektrophorese stehen zentral zusammen auf einem Tisch! 4.3 4.3.1 Exemplarische Ergebnisse Gelelektrophorese genomischer DNA M 1 2 3 Abbildung 7 (exemplarisch): Agarosegelelektrophorese von genomischer DNA. Spur 1: Pferd, Spur 2: Lamm, Spur 3: Rind. 0,6%iges Agarosegel, Aufgetragen wurden jeweils 10 µL DNA, M = Marker (100 bp-Leiter), Ethidiumbromid gefärbt. - 20 - 3 4.3.2 Gelektrophorese der PCR-Produkte Abbildung 8: Agarosegelelektrophorese von PCR-Produkten mit genomischer Fisch DNA bzw. Fischstäbchen DNA als Matrize. 2%iges Agarosegel, Aufgetragen wurden jeweils 6 µL DNA, M = Marker (500 bp-Leiter), Ethidiumbromid gefärbt. M 1 Marker L+Lp 2 K+Kp 3 E+Kp 4 i+Kp 5 E+Lp 6 i+Lp 7 8 M L+Kp K+Lp Marker L = Lachs DNA Lp = Lachs-Primer K = Kabeljau DNA Kp = Kabeljau-Primer i = Iglo-Fischstäbchen DNA E = Eskimo-Fischstäbchen DNA (Discounter) 4.4 Literaturverzeichnis WWF, [o.J.] http://www.wwf.de/themen-projekte/artenlexikon/kabeljau/ letzter Zugriff am 04.01.2015 Saiki, R.K.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; Scharf, S.J.; Higuchi, R.; Horn, G.T.; Mullis, K.B.; Erlich, H.A. (1988) Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239, 487-491 Publikation von Brinkert, Bergner, Hippler – “Vertrauen ist gut, Kontrolle ist besser!” [2013] - 21 -
