NMR-Anleitung
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Praktikum Physikalische und Analytische Chemie NMR-Versuch Kontakt Martin Gaugg HCI D325, 3 41 58, [email protected] Guido Zeegers HCI D330, 3 46 68, [email protected] Version 28.Januar 2016 2 Version 28.Januar 2016 Aufgabe Im ersten Versuchsteil wird eigenhändig eine NMR-Probe einer bekannten Verbindung vorbereitet und ein 1H-Spektrum gemessen. Im zweiten Versuchsteil erhält jede Gruppe eine bereits zubereitete NMR-Probe einer unbekannten organischen Verbindung (inkl. deren Summenformel). Die Konzentration der Probe beträgt zwischen 50 und 100 mM. Ein- (1H und 13C) und zweidimensionale (COSY, HSQC und HMBC) NMR-Spektren der Probe sollen gemäss untenstehender Vorschrift aufgenommen werden. Die erhaltenen Spektren sollen auf dem eigenen Rechner prozessiert und ausgewertet werden. Die dazu notwendige Software wird zur Verfügung gestellt (PC und Mac). Ziel ist die möglichst vollständige Strukturbestimmung der Verbindung. Pro Gruppe soll ein Bericht abgeben werden. Die Anforderungen an den Bericht sind ausführlich am Ende der Versuchsanleitung beschrieben. Achtung! Das in diesem Versuch verwendete Spektrometer kostet mehrere Hunderttausend Franken und wird von allen Forschungsgruppen im LOC genutzt. Das LOC erwartet darum äusserste Sorgfalt im Umgang mit dem Gerät. Insbesondere sollen die Vorschriften zu diesem Versuch genau befolgt werden. Jacken, Taschen etc. dürfen nicht mit in den Raum genommen werden. Mögliche Defekte am Gerät oder Verschmutzung durch zerbrochene Proben etc. müssen dem zuständigen Assistenten sofort gemeldet werden. 3 Version 28.Januar 2016 Hintergrund Der Spin ist eine Komponente des Gesamtdrehimpulses dessen Ursprung nur im Rahmen der relativistischen Quantenmechanik zu verstehen ist. Der Betrag des Spins S (in kg m2 s-1) ist durch die folgende Gleichung gegeben: S= I(I +1) wobei die Spin-Quantenzahl I sowohl ganz- als auch halbzahlige Werte annehmen kann. Teilchen mit I > 0 besitzen einen intrinsischen magnetischen Dipol (µ), der direkt proportional ist zu ihrem Spindrehimpuls: m = gS wobei eine für jedes Isotop charakteristische Konstante ist, das gyromagnetische Verhältnis (s-1T-1). In einem externen Magnetfeld (B0) wirkt nun ein Drehmoment T auf den magnetischen Dipol µ, um ihn nach B0 auszurichten. Es kommt zu einer Präzessions von µ um das Magnetfeld B0 mit der Kreisfrequenz ω0, der Larmor-Frequenz. w 0 = -g B0 Fig. 1: Präzession des magnetischen Moments µ um das externe Feld B0. Für Kerne mit einem positiven gyromagnetischen Verhältnis erfolgt diese Bewegung im Gegenuhrzeigersinn. In Abwesenheit eines äusseren Magnetfelds sind die individuellen magnetischen Momente der Kerne isotrop verteilt. Für ein Ensemble von Spins in einem Magnetfeld hingegen wird sich eine Magnetisierung 𝑴 = ∑ 𝝁𝒊 parallel zum externen Magnetfeld einstellen. Wird jetzt ein Radiofrequenz-Puls angelegt, dessen Frequenz nahe genug bei der Larmor-Frequenz des zu betrachtenden Kerns liegt, wird der Summenvektor M von der z-Achse ausgelenkt und beginnt mit der Larmor-Frequenz um sie zu präzessieren. Dadurch wird eine Wechselspannung in der Emfängerspule induziert. Um ein Spektrum zu erhalten, wird das resultierende Interferogramm (FID, free induction decay) Fouriertransformiert. Obwohl das gyromagnetische Verhältnis für alle Protonen gleich ist, zeigen sie je nach chemischer Umgebung leicht verschiedene Resonanzfrequenzen. Der Grund dafür ist, dass die Kerne gegenüber B0 von den sie umgebenden Elektronen verschieden stark abgeschirmt werden. 4 Version 28.Januar 2016 1H-Spektrum: Chemische Verschiebung, Kopplungskonstanten und Multiplizitäten von Protonen können herausgelesen werden, sofern die Signale gut aufgelöst sind. 13C-Spektrum: Wird typischerweise Breitband-entkoppelt aufgenommen, wodurch die Kopplung zu den Protonen während der Aufnahme unterdrückt wird. Zu jedem Kohlenstoffatom gibt es somit einen Peak im Spektrum. (ACHTUNG: Ausnahme sind Kopplungen zu anderen Kernen wie 19F und 31P). Ein modernes NMR-Spektrometer erlaubt auch die Durchführung von komplexeren zweidimensionalen Experimenten, wodurch zusätzliche Informationen über das Molekül gewonnen werden können. COSY (COrrelated SpectroscopY): Beide Frequenzachsen entspechen dem gewöhnlichen 1H-NMR-Spektrum. Ausserdiagonalelemente zeigen an, welche Protonen miteinander in Spin-Spin Wechselwirkung stehen. HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence spectroscopy): Erlaubt das Auffinden direkt gebundener C-H-Paare. Die eine (horizontale) Achse des zweidimensionalen Spektrums entspricht dem 1H-NMR-, die andere (vertikale) dem 13C-NMR-Spektrum. Die Signale des HSQC-Spektrums zeigen die chemischen Verschiebungen direkt gebundener Atompaare an. HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectroscopy): Zeigt Korrelationen zwischen 1H- und 13C-Kernen, die nicht direkt gebunden sind. Gleichzeitig werden Korrelationen direkt gebundener CH-Paare unterdrückt. Die den Kreuzpeaks entsprechenden CH-Paare sind zwei oder drei, seltener vier Bindungen voneinander entfernt. Die Korrelationen sind auch über Heteroatomen hinweg sichtbar. Die Intensität eines HMBC-Kreuzpeaks ist abhängig von der Grösse der entsprechenden 1H-13CKopplungskonstanten. Für eine ausführlichere Erklärung wird auf das Skript zur Vorlesung Analytische Chemie I & II NMR-Spektroskopie verwiesen. 5 Version 28.Januar 2016 Probenpräparation Zunächst soll eine 50 mM Lösung einer ausgewählten Substanz in deuteriertem Lösungsmittel hergestellt werden. Hierfür wird die benötigte Menge Substanz eingewogen und in einem Pillenglas in 0.6 mL deuteriertem Lösungsmittel gelöst. Das gewählte Lösungsvolumen entspricht im NMR-Röhrchen einer Füllhöhe von etwas mehr als 4.0 cm. Eine niedrigere Füllhöhe (weniger Lösungsmittel) würde das Shimmen erheblich erschweren. Zu hoch gefüllte Röhrchen (mehr Lösungsmittel) führen zu Sensitivitätsverlust, weil Teile der Lösung ausserhalb der RF-Spulen nicht mehr zum Signal beitragen. Wichtig: Die Substanz muss sich vollständig im gewählten Lösungsmittel auflösen! Anschliessend wird die Lösung über ein Kleenex-Papiertuch (siehe Abbildung) in ein NMR-Proben Röhrchen filtriert. Feine Fasern oder andere Feststoffe die während der Messung durch Rotation des Probenröhrchens aufgewirbelt werden, stören die Homogenität des Magnetfelds. Das zur Referenzierung benötigte Tetramethylsilan (TMS) wird mittels einer Hamiltonglasspritze zur Probe zugegeben. Hierbei werden 100 µL TMS aus der Gasphase, direkt über der Flüssigkeitsoberfläche aufgezogen. Nun soll ein 1H-NMR Spektrum wie im Folgenden beschrieben gemessen werden. Weiter sollen alle Signale den entsprechenden Protonen im Molekül zugeordnet werden. 6 Version 28.Januar 2016 Einloggen und Spektrometer-Software starten Als NMR Praktikum einloggen (username: nmrprakt; pwd: nmrprakt1). Öffnen der Spektrometer-Software: Doppelklick auf Topspin Icon. Der Bildschirm sollte nun folgendermassen aussehen: Sample einsetzen Auf Kommandozeile ej eingeben. Warten bis Luftstrom angeschaltet ist und Spinner mit Dummy-Röhrchen oben am Magneten erscheint (das geht einige Sekunden). Spinner entnehmen und Dummy-Röhrchen mit eigenem Röhrchen ersetzen (Dummy-Röhrchen sicher aufbewahren!). Höhe des Röhrchens im Spinner mit Gauge richtig einstellen. (Achtung: Durch falsch eingestellte Höhe kann der Probenkopf beschädigt werden!) Spinner mit Röhrchen vorsichtig wieder auf Luftstrom setzen. Auf Kommandozeile ij eingeben. 7 Version 28.Januar 2016 Datei für Spektren erzeugen Dreimal auf kleines Hebelchen klicken und auf das nun sichtbare Icon (angeschrieben mit 1-50 mM Strychnin ...) doppelklicken. Auf dem Bildschirm ist nun das 13C-Spektrum von Strychnin zu sehen. Dieses dient als Vorlage für unser erstes eigenes Spektrum. Tastenkombination Ctrl-N drücken (oder auf Kommandozeile edc eingeben). Es erscheint ein Dialog-Fenster. Auf erster Zeile NAME ersetzen mit <Gruppenname>-<Samplename> (also z.B. Gruppe22-Sample5). Unter SOLVENT das richtige auswählen, den Inhalt des Feldes TITLE löschen (wir werden den richtigen Titel später hinzufügen) und alles mit OK bestätigen. Probe locken Auf Kommandozeile lock eingeben. Es erscheint eine Auswahl von Lösungsmitteln: Das richtige auswählen und mit OK bestätigen. Anzeige auf Lock-Display verfolgen: Nach erfolgreichen Locken sollte im Lock-Display eine verrauschte Linie zu sehen sein, die sich hin- und herbewegt. Unter der Kommandozeile ist am linken Rand die Meldung „lockn: finished“ zu lesen. Tuning und Matching Das Tuning und Matching ist Computer-gesteuert und geschieht auf Wunsch automatisch. Dazu auf Kommandozeile atma eingeben. Da wir ein 13C-Experiment mit 1H-Entkopplung aufgesetzt haben, geschieht das Tuning und Matching für beide Kerne. Der Vorgang ist beendet, wenn unter der Kommandozeile die Meldung „job succeeded“ angezeigt wird. Für manuelles Tuning und Matching atmm eingeben. Spinning einschalten und Probe shimmen Auf Kommandozeile bsmsdisp eingeben. Es erscheint das BSMSKontrollfenster: 8 Version 28.Januar 2016 Unter Tab Main auf Zeile Sample auf den Button Spin klicken. Nach einer Weile sollte auf dem Statusbalken das folgende Icon zu sehen sein: Die Probe rotiert nun mit konstanter Geschwindigkeit (20 Hz) um die eigene Achse. 1 Auf Kommandozeile topshim eingeben (dieser Befehl aktiviert die Gradientenshim-Routine: die Probe wird nun automatisch geshimt). Nach erfolgreichem Shimming („job succeeded“) im BSMS-Kontrollfenster auf Zeile Lock auf den Button Gain klicken und mit dem Mausrad den lock gain einstellen: Die sich hin- und herbewegende Linie soll auf die oberste Hilfslinie zu liegen kommen. BSMS-Kontrollfenster schliessen durch Klicken des kleinen Kreuzes am oberen rechten Rand des Fensters. Wir befinden uns jetzt wieder im vorbereiteten Fenster des 13C-Spektrums. Bevor wir dieses Spektrum messen nehmen wir ein Protonen-Spektrum auf. H-Spektrum aufsetzen und messen Tastenkombination Ctrl-N drücken. Unter EXPNO die Zahl 1 eingeben, unter EXPERIMENT PRO auswählen und mit OK bestätigen. Damit haben wir unter Experiment 1 den vorbereiteten Parametersatz für ein 1H-Spektrum übernommen und müssen nun noch die aktuellen Einstellungen für die verschiedenen Werte einlesen (power levels etc.). Dazu auf der Kommandozeile getprosol eingeben. (Achtung: Dieser Schritt ist wichtig. Falsche power levels können das Gerät schwer beschädigen!) Anschliessend auf der Kommandozeile rga eingeben. Der receiver gain wird nun automatisch optimiert. Warten bis dieser Vorgang abgeschlossen ist (Meldung „job succeeded“ links unter Kommandozeile). Der bestimmte Wert kann durch Eingabe von rg auf der Kommandozeile abgelesen werden. Wir notieren diese Zahl für später (siehe COSY). 9 Version 28.Januar 2016 Unter dem Tab Title einen Titel für das Experiment eingeben: <Gruppenname>-<Samplename> 300 MHz 1H Spektrum Titel durch drücken des Diskettensymbols sichern Auf der Kommandozeile ased eingeben: Die Werte für die wichtigsten Parameter werden angezeigt. Wir setzen ns (die Anzahl scans) auf 16 und lassen die übrigen Parameter unverändert. (Alle Parameter können auch durch Eintippen ihres Namens auf der Kommandozeile angeschaut werden.) Wir starten nun das Experiment: Dazu auf der Kommandozeile zg eingeben. Der Fortschritt des Experiments kann auf dem Statusbalken verfolgt werden: Nach Beendigung des Experiments starten wir die Fourier-Transformation der Daten indem wir auf der Kommandozeile den Befehl fp eingeben. Der Befehl apk startet die automatische Phasenkorrektur. Überprüfen der Shims Zoom auf die Region des Spektrums um 0 ppm durch überstreichen der Region bei gedrückter linker Maustaste. Das TMS-Signal sollte deutlich zu sehen sein. Weiter einzoomen bis das Signal isoliert dargestellt ist. dpl (Abspeichern der dargestellten Region) mit hwcal bestimmen wir die Linienbreite des höchsten Peaks in der zuvor mit dpl abgespeicherten Region (die Linienbreite des TMS-Signals). Der Shim ist akzeptabel, wenn die Linienbreite des TMS-Signals ca. 0.5 Hz beträgt und die Siliziumsatelliten gut sichtbar sind. Abspeichern der Shimwerte: wsh <Gruppe>-<Sample>-<Wochentag> (Beispiel: wsh Gruppe22-Sample4-Mo). Diese Werte können später jederzeit wieder eingelesen werden mit rsh (Beispiel: rsh Gruppe22Sample4-Mo) Sample aus dem Magneten nehmen Rotation ausschalten: Auf Kommandozeile ro off eingeben. Lock ausschalten: Auf Kommandozeile lock off eingeben. Auf Kommandozeile ej eingeben. Warten bis Luftstrom angeschaltet ist und Spinner mit Sample oben am Magneten erscheint Spinner entnehmen und durch neues Röhrchen mit unbekannter Substanz ersetzen. Auf Kommandozeile ij eingeben. Nun nochmals zurück zu Abschnitt „Datei für Spektren erzeugen“ (Seite 6) und den Arbeitsanweisungen weiter folgen. 10 Version 28.Januar 2016 13 C-Spektrum aufnehmen Zum vorbereiteten Experiment wechseln: Auf der Kommandozeile re 2 eingeben. Auch hier aktuelle Werte für die Parameter einlesen: getprosol. Eine Titel für das Spektrum eingeben und sichern. Die totale Messzeit für das Experiment kann durch Eingabe von expt auf der Kommandozeile abgefragt werden. Die Messzeit sollte etwa 20 – 30 Minuten betragen. ns gegebenenfalls anpassen. Experiment starten: zg. (der receiver gain muss für 13C-Spektren normalerweise nicht angepasst werden) Unter dem Tab Acqu kann das akkumulierte Signal in Echtzeit angeschaut werden. Wollen wir das Signal jetzt schon Fourier-transformieren, geben wir auf der Kommandozeile tr ein. Dadurch bewegen wir die Daten in den Arbeitsspeicher. Der Befehl efp auf der Kommandozeile startet die FourierTransformation. Phasenkorrektur mit apk. Warten bis das Experiment beendet ist. Für die restlichen Experimente schalten wir das sample spinning ab. Dazu tippen wir auf der Kommandozeile ro off ein. Das Sample-Icon sollte jetzt wieder so aussehen: COSY Spektrum Ausgehend von Experiment 1 wird nun ein COSY-Spektrum aufgesetzt. Wechseln zu Experiment 1: re 1. Ctrl-N. Als EXPNO 10 eingeben. Unter EXPERIMENT COSY auswählen. Mit OK bestätigen. getprosol Titel für das Experiment eingeben. Der spektrale Bereich soll jetzt auf die in Experiment 1 gemessenen Signale eingegrenzt werden. Die zu verändernden Parameter sind O1P, 2 SW und 1 SW. (siehe Beispielspektrum und Parameterübersicht weiter unten) Geeignete Werte für NS sind 2 oder 4; für 2 TD 2048 (2k); für 1 TD 256 oder 512 Die Aquisitionszeit kann durch Eingabe von AQ auf der Kommandozeile überprüft werden. Dieser Wert soll nicht über 0.5 s liegen, ansonsten muss 2 TD oder SW entsprechend verändert werden. rg von Experiment 1 übernehmen. zg 2D-Spektren können jederzeit mit xfb prozessiert werden (kein tr notwendig). Das aufgenommene COSY ist nicht phasensensitiv. Es ist also keine Phasenkorrektur notwendig. 11 Version 28.Januar 2016 Warten bis das Experiment beendet ist. Beispielspektrum: Alle Signale liegen hier in einem Bereich zwischen –0.5 und 8.5 ppm. Idealerweise setzen wir den Transmitter in die Mitte dieses Bereichs: O1P 4 (Der Wert eines Parameters wird neu gesetzt durch Eingabe seines Namens auf der Kommandozeile gefolgt vom neuen Wert). Die spektrale Breite ist in diesem Beispiel ca. 9.00 ppm. Dieser Parameter ist in einem homonuklearen 2D-Experiment üblicherweise gleich für beide Dimensionen muss aber einzeln angepasst werden: 2 SW heisst der Parameter für die direkte Dimension und 1 SW für die indirekte Dimension. (1 SW ist keine Zuweisung sondern ein Parameter-Name!). Durch Tippen von SW auf der Kommandozeile können wir bequem beide anpassen. Wichtige Parameter für 2-D Experiment (Übersicht): TD: Summe der aufgenommenen Datenpunkte (imaginär und reell) in der direkten Dimension (2 TD), bzw. zweimal die Anzahl der Inkremente in der indirekten Dimension (1 TD). TD bestimmt zusammen mit SW die Aquisitionszeit AQ nach der Beziehung: (0) 1/AQ wiederum entspricht der digitalen Auflösung des Spektrums (Abstand zwischen zwei Punkten in Hz). Zwischen 0.25 und 0.5 s für AQ sind hier ausreichend (und entsprechen einer digitalen Auflösung von 2–4 Hz). Bei sehr kleiner spektraler Breite SW kann darum auch TD (und somit die Menge der zu speichernden Daten) reduziert werden. Normalerweise liegt TD zwischen 1k und 2k (1k sind 1024 Datenpunkte). Analog zur direkten Dimension bestimmt TD auch in der indirekten Dimension die Auflösung. Da für grosse Werte von 1 TD die totale Aufnahmezeit sehr lang wird, muss hier ein Kompromiss gefunden werden. Meist reichen 128 bis 256 Inkremente für ein befriedigendes Ergebnis: Das entspricht einem 1 TD von 256 bzw. 512. NS: Anzahl scans pro Inkrement. Geeignete Werte hängen im Wesentlichen von der Probenkonzentration ab. Pulsprogramme für 2-D Experimente verlangen häufig eine Potenz von 2 für NS (i.e 2, 4, 16, ...). Wichtig: Signal/Rauschen (S/N) ist proportional zu √NS. Eine Verdoppelung von NS führt also nur zu einem Anstieg von S/N um einen Faktor 1.4. DS: Anzahl dummy scans vor dem ersten Inkrement. Das aus diesen scans resultierende Signal wird nicht gespeichert. Die dummy scans dienen der Equilibrierung des Spektrometers. DS=2*NS ist meist vernünftig. D1: Relaxationszeit zwischen zwei scans. D1 bestimmt wesentlich die totale Aufnahmezeit für ein Experiment. Der Wert sollte also nicht zu lang sein. Zu kurze Werte für D1 führen allerdings zu spektralen Artefakten. Eine Zeit zwischen 1 und 2 s ist ein guter Anfangswert. Durch Eingabe von expt kann die Gesamtmesszeit abgefragt werden. Die Gesamtmesszeit wird hauptsächlich durch die gewählten Werte von NS, 1 TD und D1 bestimmt. 12 Version 28.Januar 2016 13 Version 28.Januar 2016 HSQC-Spektrum Analog zum COSY-Spektrum wird ausgehend von einem existierenden Experiment ein HSQC aufgesetzt: Ausgehend von Experiment 10 Ctrl-N drücken. Als EXPNO 11 eingeben. Unter EXPERIMENT HSQC auswählen. Mit OK bestätigen. Der eingelesene Parametersatz entspricht einem Multiplizitäts-editiertem HSQC-Spektrum mit sensitivity enhancement. getprosol Geeignete Werte für NS sind 2 oder 4; für 2 TD 2048 (2k); für 1 TD 256 oder 512 Da es sich um ein heteronukleares Experiment handelt müssen wir den spektralen Bereich in der indirekten Dimension (O2P, 1 SW) unabhängig von der direkten Dimension (O1P, 2 SW) eingrenzen. 0–160 ppm sind für 1H-tragende Kohlenstoffe meist ausreichend (also O2P 80, 1 SW 160). Achtung: Da wir während der Aquisitionszeit auf dem 13C-Kanal entkoppeln, sollte AQ 0.4 s nicht übersteigen, damit die Belastung für Verstärker, Probenkopf und Probe nicht zu hoch wird: TD also gegebenenfalls verkleinern, so dass AQ < 0.4 s (gilt für 300MHz Spektrometer). rga zg Warten bis das Experiment beendet ist. HMBC-Spektrum Ausgehend von Experiment 11 Ctrl-N drücken. Als Experiment number 12 eingeben. Unter Parameter HMBC auswählen. Mit OK bestätigen. Getprosol Geeignete Werte für NS sind 8 oder 16; für 2 TD 2048 (2k); für 1 TD 512 Spektralen Bereich (2 SW, 1 SW, O1P, O2P) in beiden Dimensionen entsprechend den 1H und 13C-Spektren anpassen (im Unterschied zum HSQC erwarten wir auch Korrelationen zu quaternären Kohlenstoffatomen wie z.B. Carbonylen!). 2 TD ist hier nicht mehr kritisch, weil wir während der Aufnahme nicht Entkoppeln. Mehr als 0.5 s für AQ sind aber nicht sinnvoll. Also TD eventuell erniedrigen. rga zg Warten bis das Experiment beendet ist. 14 Version 28.Januar 2016 Sample aus dem Magneten nehmen Lock ausschalten: bsmsdisp. Unter Tab Main auf Zeile Lock auf den Button OnOff klicken. Auf Kommandozeile ej eingeben. Warten bis Luftstrom angeschaltet ist und Spinner mit Sample oben am Magneten erscheint Spinner entnehmen und eigenes Röhrchen mit Dummy-Röhrchen ersetzen. Höhe des Dummy-Röhrchens im Spinner mit Gauge richtig einstellen. (Achtung: Durch falsch eingestellte Höhe kann der Probenkopf beschädigt werden!) Spinner mit Dummy-Röhrchen vorsichtig wieder auf Luftstrom setzen. Auf Kommandozeile ij eingeben. Transfer der Daten auf den Server Die Daten sind bis jetzt nur auf dem Computer des Spektrometers gespeichert. Für den weiteren Gebrauch kopieren wir sie auf einen Server, um sie von dort auf den eigenen Computer herunterzuladen. Dazu starten wir das Programm gFTP durch Doppel-Klick auf das entsprechende Icon am unteren Rand des Bildschirms: Es öffnet sich folgendes Fenster: Unter dem Menü Bookmarks wählen wir nmroc: Die Verbindung zum Server wird nun hergestellt. Im linken Teilfenster wählen wir den zu kopierenden Ordner mit den NMR-Daten aus (z. B. Gruppe22-Sample4) und starten den Kopiervorgang durch Klicken auf den nach rechts gerichteten Pfeil: 15 Version 28.Januar 2016 Eine Kopie der Daten befindet sich jetzt auf nmroc.ethz.ch unter dem Verzeichnis /home/nmrprakt/data und kann von dort mit Filezilla, winscp o. ä . auf den eigenen Rechner kopiert werden (username: nmrprakt; pwd: prakt$3nmr). Prozessieren und Auswerten der Spektren in MestreNova Installation Auf der Website des NMR-Service (www.nmrservice.ethz.ch/intranet/license-files) muss zuerst das Lizenz-File für MestreNova heruntergeladen werden (Login mit nethzPasswort erforderlich). Anschliessend auf http://mestrelab.com die neueste Version (10.0.1) der Software herunterladen (Link oben auf der Seite unter Download & Trial). Installieren und Starten der Software. Es erscheint folgende Meldung (hier in der Mac-Version): Auf den Button Install Klicken, den Ort des Lizenzfiles angeben und Lizenzierung abschliessen. Die Software muss jetzt neu gestartet werden und ist danach betriebsbereit. Öffnen eines Spektrums Wenn die obige Vorschrift befolgt worden ist, sollten alle zu einem Sample gehörigen Spektren in einem Ordner mit Namen <Gruppenname>-<Samplename> gespeichert sein. In den nur mit Zahlen bezeichneten Unterordnern befinden sich die einzelnen Spektren. So entspricht z. B. der Ordner 1 dem 1H-Spektrum und der Ordner 11 dem HSQC- 16 Version 28.Januar 2016 Spektrum. Die eigentlichen Daten befinden sich in diesen Unterordnern in den mit fid (für 1D-Experimente) oder ser (für 2D-Experimente) bezeichneten Dateien. Nach dem Start von MestreNova müssen jetzt die fid oder ser Dateien nur noch auf die Arbeitsfläche des Programms gezogen werden und werden so automatisch prozessiert und dargestellt. Die Spektren oder Ausschnitte aus den Spektren können nach dem Bearbeiten direkt gedruckt oder als pdf, jpeg etc. für die weitere Verwendung im Bereicht abgespeichert werden. Vor dem Beenden des Programms nicht vergessen die Spektren auch im Mnova-Format abzuspeichern (Disketten-Symbol), damit die Phasenkorrekturen, Beschriftungen etc. erhalten bleiben! Erste Schritte in MestreNova Nach dem öffnen eines 1H-, 13C- und eines HSQC-Spektrums sieht der Bildschirm so aus (Mac-Version): In der folgenden Anleitung wird sehr häufig Gebrauch von Tastenkürzeln (Shortcuts) gemacht. +P bedeutet dabei z. B. das gleichzeitige Drücken der Shift und der P-Taste. Ein bestimmter Modus (z.B. für die Integration) kann durch drücken von Esc wieder verlassen werden. 17 Version 28.Januar 2016 Phasenkorrektur Als Erstes stellen wir die Phase im 1H-Spektrum richtig ein. Dazu benutzen wir +P. Wir platzieren die violette Linie (durch Verschieben des Position Cursers im Phase Correction Fenster) auf einem gut separierten Signal am einen Rand des spektralen Bereichs und korrigieren PH0 für dieses Signal durch Auf- oder Abwärtsbewegung der Maus bei gedrückter linker Taste (Instruktionen im Phase Correction Fenster beachten): Allfällige Phasenverzerrungen am anderen Ende des spektralen Bereichs (hier gut zu sehen für das TMS-Signal) werden mit PH1 korrigiert (analog zu PH0 aber mit rechter Maustaste). Das Ergebnis sieht jetzt so aus: 18 Version 28.Januar 2016 Durch Schliessen des Phase Correction Fensters ist der Vorgang abgeschlossen. Referenzierung Als nächstes müssen wir das Spektrum richtig referenzieren. Im vorliegenden Fall setzen wir dafür das TMS-Signal auf 0 ppm. Dazu zoomen wir auf den Bereich um 0 ppm (Zoomen: Z. Der gezoomte Bereich kann verschoben werden mit P und anschliessender Mausbewegung. Auszoomen mit +Z. Ganzes Spektrum mit F) und benutzen L. Bei gedrückter -Taste aber ohne die Maustaste zu drücken verschieben wir das Fadenkreuz auf das Maximum des TMS-Signals. Ein anschliessender Linksklick öffnet das Referenzierungsfenster. Dort setzen wir bei Auto Tuning ein Häckchen und geben 0.0 ppm als neue Verschiebung des TMS-Signals ein. Bestätigen mit OK. 19 Version 28.Januar 2016 Für das 13C-Spektrum analog wie für das 1H-Spektrum vorgehen. Wichtig ist, dass die 1D Spektren korrekt referenziert wurden bevor man mit der Referenzierung der 2D Spektren fortfährt. Traces in 2D-Spektren Oben und links vom HSQC-Spektrum sind sogenannte Traces abgebildet. Es handelt sich im Moment noch um Projektionen in Richtung f1 bzw. f2. (Falls die Traces nicht abgebildet sind können sie über einen Rechtsklick auf das Spektrum und anschliessender Auswahl von Show Traces, angezeigt werden.) Nützlicher ist es, die entsprechenden 1H- und 13C-Spektren als Traces zu verwenden. Dazu ziehen wir einfach mit der Maus die entsprechenden Spektren an den oberen bzw. linken Rand des HSQCSpektrums. 20 Version 28.Januar 2016 Phasenkorrektur im HSQC-Spektrum Shortcut: +P. Wir korrigieren zuerst die Phase in der direkten Dimension (f2): Feld f2 auswählen, falls es noch nicht aktiv ist, und die vertikale violette Linie auf ein gut separiertes Signal am einen Rand des spektralen Bereichs bewegen. Die Phase kann jetzt wie oben für das 1H-Spektrum beschrieben korrigiert werden. Für eine Phasenkorrektur in der indirekten Dimension Feld f1 auswählen und analog vorgehen. Das Ergebnis sieht danach so aus: Referenzierung des HSQC-Spektrums R und bei gedrückter Shift-Taste Fadenkreuz auf das Zentrum eines gut separierten Signals bewegen. Links-Klick. 21 Version 28.Januar 2016 Das nun erscheinende zweite Fadenkreuz (im folgenden Bild rot dargestellt) mit der Maus auf die gewünschte Position im Verhältnis zu den Traces bewegen. Anschliessend Links-Klick. Für das COSY und das HMBC Spektrum analog wie für das HSQC Spektrum vorgehen. COSY und HMBC sind nicht Phasensensitiv, deshalb ist keine Phasenkorrektur notwendig. Um 2D Spektren schön darzustellen ist der Contour Plot dem Bitmap Plot vorzuziehen. Dazu Rechtsklick auf das Spektrum und anschliessend 2D Plot Method gefolgt von Contour Plot auswählen. 22 Version 28.Januar 2016 Integrale im 1H-Spektrum: Zum 1H-Spektrum wechseln durch Auswahl der entsprechenden Seite im linken Bereich des Displays. Integralkurven darstellen (nur beim ersten Mal nötig): In das Spektrum klicken und anschliessend durch Rechtsklick das Properties Menu aufrufen. Unter Integrals bei Curve ein Häckchen setzen, auf den Button Set as Default klicken und mit OK bestätigen. Integrieren: Shortcut I. Danach gewünschte Regionen bei gedrückter linker Taste mit der Maus überstreichen. 23 Version 28.Januar 2016 Peak-Picking Shortcut K. bei gedrückter Maustaste gewünschten Bereich überstreichen und mit der horizontalen Linie die untere Schwelle für das Picking definieren (Peaks, die kleiner sind als diese Schwelle, werden ignoriert). Messen von Peakabständen Shortcut C. Vertikale Linie des Fadenkreuzes auf einem Peakmaximum platzieren, bei gedrückter Maustaste zu einem anderen Peakmaximum fahren. Der entsprechende Abstand wird in einem Fenster angezeigt: 24 Version 28.Januar 2016 Verwendete Shortcuts Bewegung Z Einzoomen +Z Auszoomen P Zoombereich verschieben (panning) F Ganzes Spektrum anzeigen Sonstige +P Phasenkorrektur L Referenzieren 1D R Referenzieren 2D I Integration P Peak Picking C Fadenkreuz (cross hair) Esc Verlassen eines Modus 25 Version 28.Januar 2016 Bericht zum NMR Versuch Generelles Es wird ein kurzer, präzis geschriebener Bericht verlangt. Damit genügend Platz für Korrekturen bleibt, sollte ein Zeilenabstand von 1.5 verwendet werden. Inhalt des Berichts ist nur der zweite Versuchsteil, d.h. die Strukturaufklärung der unbekannten Substanz. Ausschlaggebend für die Bewertung der Berichte ist die ausreichende Beschreibung der Resultate sowie deren Diskussion. Die korrekte Identifizierung der Substanz ist keine Voraussetzung für die Annahme des Berichts. Aufbau Der Bericht sollte in folgende Teile gegliedert sein: Titelblatt: • Praktikum Physikalische und Analytische Chemie / NMR Spektroskopie • Assistent: Carla Rigling, Robert Steinhoff oder Guido Zeegers • Gruppen Nr. • Namen (alphabetisch) und E-Mail-Adressen aller Personen • Version Nr., Ort, Datum A Einleitung: Aufgabenstellung, kurze Beschreibung der durchgeführten Experimente und verwendete Messinstrumente. B Ergebnisse und Diskussion: Abbildung der 1H-,13C- und HSQC-Spektren, so dass alle Signale gut sichtbar sind (falls nötig, bestimmte Ausschnitte als Vergrösserungen separat darstellen). Im 13C Spektrum sind alle Peaks von tiefem nach hohem Feld durch zu nummerieren. Diese Nummern sollen auch zur Beschriftung des 1H- und des HSQC-Spektrums verwendet werden. Weiter eine Tabelle (siehe Beispiel–Tabelle) mit den 1H und 13C chemischen Verschiebungen, wenn möglich inklusive der Multiplizitäten und entsprechenden Kopplungskonstanten der 1H Signale. Tabelle 1 1H- und 13C-NMR chemische Verschiebungen und Kopplungskonstanten in CDCl3 Nummer 1 2a 2b 3 3-OH 4 δC, typ 146.3, CH 110.8, CH2 δH, mult. (J in Hz) 5.99, dd (17.4, 10.7) 5.20, dd (17.4, 1.2) 4.98, dd (10.7, 1.2) 71.08, C 29.4, 2 CH3 26 2.17, s 1.31, s Version 28.Januar 2016 Diskussion der Vorgehensweise zur Strukturaufklärung der unbekannten Substanz. Die Argumente sollen dabei durch Ausschnitte der gemessenen Spektren und die darin enthaltenen Korrelationen (siehe HMBC und COSY) unterstützt werden. Am Ende soll ein Strukturvorschlag für die gemessene Substanz mit entsprechender Nummerierung der Kohlenstoffatome gemacht werden (siehe unten). 1 2 OH 3 4 4 Abbildung 1 Strukturvorschlag des untersuchten Moleküls C Literatur: Angabe der verwendeten oder zitierten Literatur: Referenzen in der Reihenfolge auflisten, in welcher sie im Text zitiert werden. Die Namen aller Autoren der zitierten Publikation sollen aufgeführt werden. Die Namen der Zeitschriften und die Nummern der Bände werden kursiv geschrieben. Beispiele von Referenzen zu Artikeln in Zeitschriften [1], Buchkapiteln [2], Büchern [3], Patenten [4], Computerprogrammen [5] und Dissertationen [6]. [1] G. R. Fulmer, A. J. M. Miller, N. H. Sherden, H. E. Gottlieb, A. Nudelman, B. M. Stoltz, J. E. Bercaw, K. I. Goldberg Organometallics 2010, 29, 2176. [2] H. A. Krässig, in 'Cellulose Structure, Accessibility and Reactivity', Ed. M. B. Huglin, Gordon and Breach Science Publishers, Yverdon, 1992, Vol. 11, p. 6 [3] J. D. Dunitz, 'X-Ray Analysis and the Structure of Organic Molecules', Verlag Helvetica Chimica Acta, Basel, and VHC, Weinheim, 1995. [4] T. Kamata, N. Wasada, Jap. Pat. 2-204469, 1990, p. 381-384. [5] G. M. Sheldrick, SHELXL97, Programm for the Refinement of Crystal Structures, University of Göttingen, Germany, 1997. [6] B. R. Peterson, Ph.D. Thesis, University of Califonia at Los Angeles, 1994. D Anhang: Liste der verwendeten Abkürzungen. Kontakt Martin Gaugg HCI D325, 3 41 58, [email protected] Guido Zeegers HCI D330, 3 46 68, [email protected] 27
